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Universidad de Chile

Programa Doctorado en Ciencias Silvoagropecuarias y Veterinarias

N. Galarce

BACTERIFAGOS LTICOS: UNA NUEVA ALTERNATIVA DE TERAPIA FRENTE A PATGENOS DE ANIMALES Y DE AQUELLOS ASOCIADOS A ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS

LYTICS BACTERIOPHAGES: A NEW TOOL FOR THERAPY OF ANIMAL PATHOGENS AND FOR CONTROL OF FOOD-BORNE PATHOGENS

Nicols GalarcePrograma de Doctorado en Ciencias Silvoagropecuarias y VeterinariasCampus Sur Universidad de Chilenicogalarce@gmail.com

ndiceResumen y palabras claves3Abstract and keywords3Introduccin4Estado actual del problema5Discusin23Conclusiones25Bibliografa26

RESUMENActualmente existe gran inters en el uso de bacterifagos como agentes teraputicos frente a patgenos exclusivos de animales y patgenos asociados a enfermedades transmitidas por alimentos. Este inters nace no slo por su prevalencia e impacto econmico sino tambin por la aparicin de cepas con multiresistencia antimicrobiana que impide su oportuno control. Esto, en su conjunto, explica que en diferentes poblaciones animales y tambin en la poblacin humana su presencia siga siendo frecuente. En la constante bsqueda de alternativas teraputicas, la fagoterapia ha tomado relevancia en las ltimas 2 dcadas, encontrndose promisorios resultados y destacando las enormes ventajas del uso de estos virus. En este documento, se revisarn los antecedentes y estado actual de diversos estudios sobre el uso de estos virus en la reduccin de la presencia de bacterias patgenas en diversas especies animales, causantes de enfermedad en ellas o asociadas a enfermedades transmitidas por productos alimentarios derivados, referencias que hacen de esta estrategia una alternativa cada vez ms promisoria. Palabras Claves: inocuidad alimentaria, fagoterapia, bacterifagos, patgenos bacterianos alimentarios

ABSTRACTCurrently there is great interest in the use of bacteriophages as therapeutic agents against exclusive animal pathogens and associated foodborne diseases pathogens. This interest arises not only because of its prevalence and economic impact but also by the emergence of strains with antimicrobial multiresistance, points that prevents their proper control. This, taken together, explains that in different animal populations and also in the human population remains frequent. In the constant pursuit of therapeutic alternatives, the phagotherapy has gained importance during the last two decades, finding promising results and highlighting the enormous benefits of using these viruses. In this document, we review the history and current status of various studies on the use of these viruses in reducing the presence of pathogenic bacteria in several animal species, including disease-causing or associated with food-borne diseases, references that make this strategy an increasingly promising alternative. Keywords: food safety, phagetherapy, bacteriophages, bacterial food-borne pathogens INTRODUCCINLa bsqueda de un mecanismo que permita el adecuado control de diversos patgenos de importancia Mdico Veterinaria, y que involucre un impacto en la poblacin animal y tambin en la poblacin humana ha sido objeto de importantes investigaciones. Dentro de los patgenos importantes de controlar, se encuentran las bacterias. Las enfermedades bacterianas en los animales domsticos causan efectos detrimentales pudiendo generar prdidas econmicas directas e indirectas en los sistemas productivos y, en el caso de animales de compaa, un costo difcil de cuantificar, cual es el costo afectivo. Adems de lo anterior, existen patgenos bacterianos que causan enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) con un elevado impacto para la salud Pblica. Desde el descubrimiento de la penicilina por Alexander Fleming en 1928 y de las sulfas por Gerhard Domagk en 1932, numerosas drogas con efectos antimicrobianos han sido producidas y utilizadas como terapia para el tratamiento de las infecciones bacterianas, con gran xito en el control de estos patgenos. A pesar de la rapidez con que se han introducido nuevos agentes antimicrobianos en el mercado, las bacterias han mostrado una notable capacidad para desarrollar resistencia a dichos frmacos. Actualmente, a nivel mundial, se reconoce la emergencia de patgenos resistentes a las drogas, situacin que ha originado el inters por descubrir nuevas alternativas teraputicas y de control frente a las enfermedades bacterianas, sobre todo en aquellas asociadas a ETA. En este contexto, la investigacin en torno al uso de bacterifagos como mtodo de control bacteriano en medicina veterinaria constituye un rea que ha tomado cada vez mayor relevancia por sus resultados promisorios como agentes teraputicos y profilcticos en animales, como agentes biocontroladores en alimentos contaminados, biopreservantes en alimentos procesados y biosanitizantes en equipos industriales. En este documento se revisar la historia del uso de los bacterifagos, sus ventajas y desventajas comparativas, y su aplicacin especficamente como herramienta de terapia en diversas especies.

ESTADO ACTUAL DEL PROBLEMAActualmente las enfermedades infecciosas que afectan a diversas especies animales, tanto de abasto, compaa o trabajo, constituyen un tema de gran relevancia para la labor del mdico veterinario, debido al alto impacto econmico y social que pueden conllevar (por prdida de masa animal, disminucin de productividad, costos econmicos y afectivos). Dentro las enfermedades infecciosas, las enfermedades de origen bacteriano son unas de las ms relevantes, tanto por su gran diversidad, su alta incidencia y prevalencia en algunos casos, como por la severidad de los cuadros que generan (1, 2). Por esto, es de vital importancia prevenir y controlar estas enfermedades, ms an si estas pueden ser transmitidas a las personas, sea la transmisin por contacto directo, indirecto (como la va area), o por alimentos elaborados con productos animales contaminados.Desde su descubrimiento, los antimicrobianos han constituido la primera lnea de accin frente a enfermedades bacterianas, ayudando a disminuir su impacto -tanto en las personas como en distintas poblaciones animales- encontrndose disponible una variada gama de sustancias, con diferentes mecanismos de accin e indicaciones teraputicas. Sin embargo, desde hace ya varios aos se ha observado la presencia y aumento de la resistencia bacteriana a diversos antimicrobianos, constituyendo un tema de gran preocupacin mundial tanto en medicina humana como veterinaria (3).Debido a la aparicin de diversas cepas bacterianas resistentes a variados antibiticos, la necesidad de contar con nuevas herramientas que permitan complementar o suplir su funcin se ha convertido en imperiosa. Dentro de estas herramientas se encuentran los bacterifagos, agentes virales descritos y utilizados antes del advenimiento de la poca de los antibiticos, los que en la actualidad han vuelto a concentrar el inters de la comunidad cientfica internacional (4, 5).

Los bacterifagos son virus que infectan y lisan especficamente bacterias; son inocuos para las clulas eucariotas, son econmicamente rentables y se encuentran distribuidos en diversos ecosistemas, caractersticas que permiten su utilizacin en toda la cadena de produccin de alimentos.

1. CARACTERSTICAS GENERALES DE LOS BACTERIFAGOS

Los bacterifagos o fagos son virus que slo invaden clulas procariotas (bacterias y arqueas) y producen su lisis, siendo esta actividad la piedra angular que sustenta la idea de usarlos como agentes teraputicos (6, 7). El descubrimiento de los fagos ha sido sujeto de variadas controversias para decidir cual investigador los descubri primero. En 1896 un bacterilogo ingls, Ernest Hankin, sugiri que una sustancia no identificada en las aguas de ros en India, era responsable de una actividad antimicrobiana que evitaba la diseminacin de una bacteria (actualmente Vibrio cholerae). Dos aos despus, Gamaleya, bacterilogo ruso, observ un fenmeno similar mientras trabajaba con Bacillus subtilis. Actualmente se acepta que fueron descritos por Frederick Twort en 1915 y Flix dHerelle en 1917 (8), siendo este ltimo, el primero que utiliz bacterifagos con finalidad teraputica (9).En esencia, los fagos transfieren su genoma desde una bacteria susceptible a otra, donde dirigen la produccin de la progenie viral. Los hospederos para cada fago son un grupo especfico de bacterias: este grupo es a menudo slo una especie bacteriana, pero varias especies relacionadas pueden a veces ser infectadas por el mismo fago. El ciclo infectivo fgico sigue un nmero de etapas programadas, dependiendo fuertemente su eficiencia y coordinacin del estado metablico de la clula hospedera (7). Sobre los mecanismos moleculares de infeccin de sus hospederos bacterianos, los bacterifagos pueden seguir dos destinos diferentes. Los denominados bacterifagos lticos o virulentos siguen el ciclo infectivo ltico, donde el genoma fgico se inyecta al interior de la bacteria, se multiplican en la clula bacteriana y alteran su metabolismo, produciendo la lisis al final del ciclo debido a la accin de una lisozima viral, para liberar la progenie viral formada. Por otra parte, los bacterifagos lisognicos o templados utilizan la va lisognica, donde el genoma fgico, despus de ser inyectado al citoplasma bacteriano, se integra (profago) y replica como parte del genoma del hospedero, permaneciendo en estado de latencia por extensos periodos de tiempo; si la bacteria hospedera se enfrenta a condiciones ambientales adversas este profago puede activarse y retomar el ciclo ltico, al final del cual las partculas fgicas recin formadas son liberadas tras la lisis bacteriana (6). La integracin del genoma viral en el genoma de la bacteria es la razn de que los fagos del tipo lisognico no son utilizados como herramienta para la fagoterapia.El ciclo infectivo de un bacterifago ltico consta de las siguientes etapas (6, 7): 1. Adsorcin del bacterifago a la clula bacteriana a travs del reconocimiento de estructuras especficas por parte de receptores virales ubicados en sus fibras o espculas de la cola. Para este propsito, los fagos pueden valerse de cpsulas bacterianas, diferentes partes del LPS, flagelos, fimbrias y algunas otras protenas de superficie, oligosacridos y lipopolisacridos.2. Inyeccin del genoma fgico al interior de la bacteria hospedera: esto es facilitado por una enzima presente en la punta de la cola fgica que degrada al peptidoglicano. Esta introduccin del genoma viral es energa-dependiente, la que se obtiene del ATP disponible o del potencial de membrana de la bacteria (10).3. Expresin de genes fgicos tempranos y sntesis de protenas tempranas, involucradas en la intervencin de los sistemas enzimticos bacterianos y la replicacin del genoma viral. 4. Replicacin del genoma fgico.5. Expresin de protenas fgicas tardas, involucradas en la formacin de nuevas partculas virales, conformacin de la cpside viral y en la lisis de la bacteria hospedera.6. Ensamblaje de las cabezas y colas fgicas, y compactacin del genoma viral.7. Lisis de la bacteria hospedera y liberacin de la nueva progenie fgica. Esta lisis es producida por la accin de dos enzimas que degradan la pared celular y la membrana interna, una endolisina y holina respectivamente. La accin de ellas hace que la clula se lise debido a la incapacidad estructural de resistir la presin osmtica interna. Esta ruptura de la pared celular y membranas permite la liberacin al medio de la progenie viral anteriormente formada, posibilitando as una posterior infeccin a otras bacterias.

Otras caractersticas, adems de la lisis bacteriana, que los convierte en atractivos mecanismos de control bacteriano son: i) Su elevada especificidad de hospedero, disminuyendo las probabilidades de generar disbiosis; ii) Replicacin en el sitio de infeccin, lo que permite su presencia en los momentos ms necesarios de la infeccin; iii) Inocuidad clnica en organismos mayores; los bacterifagos han sido administrados por va oral, rectal, drmica, aerosol y parenteral (intramuscular, intravenosa e intraperitoneal), tanto en animales como seres humanos, sin registrarse efectos nocivos en ellos (considerando que muchos de los fagos son comensales en los mismos); iv) Menores posibilidades de generar resistencia bacteriana in vivo, situacin que puede ser reducida an ms con la aplicacin de varios fagos (cctel) en forma simultnea; y v) Su seleccin y multiplicacin son procesos relativamente sencillos, rpidos y de bajo costo (9, 11).Los fagos son altamente ubicuos, ocupando todos los ecosistemas donde las bacterias logran desarrollarse con xito. Estos agentes han sido aislados desde ambientes acuticos superficiales y profundos, suelos, cavidad oral, sangre e intestino de animales y seres humanos sanos (12). A modo de ejemplo, en el suelo se han encontrado concentraciones de 0,7 Unidades formadoras de Placa (UFP) a 2,7x108 UFP/g, donde la relacin fago: bacteria puede llegar a ser 100, mientras que en el intestino de seres humanos sanos, los ttulos pueden llegar a ser mayores a 107 UFP/g (12). Tambin han sido aislados desde una gran variedad de alimentos como hojas de lechuga, cangrejos refrigerados y congelados, carne de vacuno y de cerdo, ostras, mejillones, setas, tartas, masa de galletas y pan, pollo y pavo crudos y asados, leche, queso, yogur, mantequilla y sardinas (13, 14, 7). Esto sugiere que el consumo diario de fagos puede ser una importante estrategia natural de repoblar la poblacin intestinal de fagos y de regular el microbalance del colon (15).

2. CONSIDERACIONES GENERALES DE LA FAGOTERAPIA EN MODELOS ANIMALES: VENTAJAS Y DESVENTAJAS

Desde su descubrimiento los fagos lticos se utilizaron primeramente como agentes teraputicos y, posteriormente, como agentes profilcticos en animales y biocontroladores en alimentos. As, su primer uso data del ao 1919 donde DHerelle comprob su eficacia en nios que sufran Disentera por Shigella spp. en un Hospital Peditrico Francs (8, 9) y, seis aos despus, el xito se repiti frente a pacientes afectados de peste bubnica en Egipto y frente a pacientes con clera en India donde se redujo de 30 a 0% la mortalidad (16, 17). Paralelamente, Bruynoghe y Maisin (1921) utilizaron fagos para el tratamiento de infecciones drmicas por Staphylococcus spp (9, 18). Pese a lo anterior, los buenos resultados de DHerelle no siempre se repitieron. Luego de estos promisorios resultados, se contino su utilizacin tanto en medicina humana como veterinaria, usando variadas preparaciones comerciales disponibles en esa fecha. Sin embargo, con el pasar del tiempo se presentaron algunos inconvenientes, como: presencia de contaminantes txicos incluyendo endotoxinas en los preparados, deficiencia de estabilidad y viabilidad de los fagos y fenmenos de resistencia de las bacterias frente a ellos (9). Junto con todos estos problemas y, sumado al descubrimiento y eficacia de los antibiticos, a la fagoterapia se le rest importancia como medida teraputica. Los estudios continuaron casi exclusivamente en Europa del este, principalmente en la ex Unin Sovitica (destacndose el Instituto Eliava, en Georgia, considerado como el pionero en la aplicacin y subsecuente investigacin de la fagoterapia) y Polonia, donde se trabaj con fagoterapia en nios con disentera, demostrando una disminucin de 3,8 veces en la incidencia del grupo tratado, comparado con el grupo que solo recibi un placebo (16, 17). En aquella poca, se estudiaron tambin fagos contra Shigella spp, Klebsiella spp, Pseudomonas spp, Proteus spp, E. coli, Staphylococcus spp, Streptococcus spp y Salmonella spp, todos ellos demostrando relativo xito en pacientes. Por otra parte, el estudio de los fagos en los pases occidentales fue dejado de lado por la inconsistencia de los resultados de muchos ensayos teraputicos con bacterifagos. Actualmente es aceptado que la mayor causa de estas fallas fue el pobre entendimiento de la biologa de estos agentes y de otros asuntos, como el control de calidad durante la preparacin de los stocks teraputicos (17). Junto a esto, el descubrimiento de los antibiticos y su subsecuente utilizacin masiva desplaz las investigaciones.Con el paso del tiempo, el abuso de antimicrobianos en el rea de la salud pblica y de la produccin animal hizo inevitable el desarrollo a gran escala de resistencia bacteriana a estas sustancias y con ello, la imperiosa necesidad de encontrar nuevas sustancias, qumicas o biolgicas, que pudieran controlar las enfermedades sin inducir nuevamente resistencia. Frente a esta disyuntiva, la antigua idea de utilizar fagos como terapia frente a enfermedades bacterianas renaci. Los pioneros en realizar fagoterapia en modelos animales, fueron William Smith y sus colegas, del Institute for Animal Disease Research in Houghton, Gran Bretaa. Ellos iniciaron sus estudios en ratones experimentalmente infectados con E. coli, donde observaron que una dosis nica de fagos redujo el recuento de esta bacteria. Posteriormente lo repitieron en terneros, corderos y cobayos infectados con una cepa diarreognica de E. coli, donde la fagoterapia logr reducir la presencia de dicha bacteria en el tracto digestivo y adems, sntomas asociados como, prdidas de fluidos. Obtuvieron, en este estudio una sobrevivencia del 100% de los animales infectados (9). Estos resultados marcaron un hito importante en los estudios de Europa occidental, impulsando as la investigacin cientfica sobre fagoterapia en animales infectados con bacterias multiresistentes, tales como Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp y Klebsiella spp. La fagoterapia, como cualquier otro mtodo teraputico, presenta diversas ventajas y desventajas, fundamentalmente en relacin a la antibioticoterapia. Dentro de las ventajas se describen:1. Capacidad exclusivamente bactericida: las bacterias que han sido exitosamente infectadas por fagos lticos son incapaces de recuperar su viabilidad. En contraste, algunos antimicrobianos poseen slo una accin bacteriosttica, y como consecuencia pueden permitir la evolucin bacteriana hacia su resistencia (19).2. Crecimiento exponencial de las partculas virales: los fagos durante el proceso de muerte bacteriana son capaces de aumentar su nmero especficamente donde se ubique el hospedero, con algunas limitaciones como su dependencia a relativamente altas concentraciones bacterianas (19). El tipo de cintica de los fagos se diferencia de los antimicrobianos en su capacidad de autorreplicacin, con lo cual se logran efectos slo con un pequeo inculo inicial (20).3. Efectos mnimos sobre la microflora normal: debido a su estrecha especificidad de hospedero, que puede abarcar la capacidad de infectar unas pocas cepas o una especie bacteriana a, ms raramente, la capacidad de infectar ms de un gnero, estrechamente relacionados entre ellos. En contraste, muchos antimicrobianos qumicos, que poseen una actividad de amplio espectro, son propensos a generar superinfecciones, como la colitis por Clostridium difficile asociada a antibiticos, o las infecciones por Candida albicans (19).4. Reducido potencial para inducir resistencia bacteriana: las bacterias pueden generar mutaciones que expresen resistencia frente a los fagos lticos (21). Respecto a este tema, Skurnik y Strauch (2006) (6) sealan que en una poblacin bacteriana de 106 a 108 bacterias, hay una alta posibilidad de encontrar bacterias mutantes fago resistentes, cuyo receptor mutado no es reconocido por el virus. Esta situacin no siempre es desventajosa, ya que si el receptor mutado correspondiera a un factor de virulencia (por ejemplo LPS), la bacteria podra disminuir e incluso perder su virulencia, al igual que si se modificasen factores asociados a su adaptabilidad al medio (6, 22). Se ha desarrollado la estrategia de administrar mezclas de fagos, con lo cual se minimiza la posibilidad de que la bacteria desarrolle resistencia a un bacterifago en particular y a su vez de encontrar alguna bacteria fago resistente. (19). En relacin a este tema, los antibiticos tienen una clara limitacin, ya que son estables, qumicos inmutables, y por lo tanto no son capaces de adaptarse a mutaciones bacterianas (21), junto con la evidencia innegable de que ya la mayora de las sustancias antibiticas han generado resistencia bacteriana.5. Carencia de resistencia cruzada con antibiticos: debido a que los fagos infectan y matan bacterias utilizando mecanismos diferentes a los de los antimicrobianos, mecanismos especficos de resistencia a ellos no se traducen en mecanismos de fago resistencia. Consecuentemente, los fagos pueden ser efectivamente utilizados para tratar infecciones resistente a antibiticos, como las producidas por Staphylococcus aureus multirresistente (19). Esto difiere considerablemente de la resistencia a los antibiticos, ya que muchos mecanismos de resistencia para alguna familia de antimicrobianos en particular tambin puede afectar la efectividad de otros grupos de antibiticos diferentes.6. Alta especificidad frente a clulas bacterianas: algunos estudios de toxicidad realizados con fagos en animales de experimentacin, como pollos y ratones, no han exhibido efectos txicos ni reacciones adversas en los animales (23, 24). Adems, se le reconoce ser inocuo para el hombre y animales, toda vez que recientemente se aprob su uso como aditivo en alimentos de consumo humano y su uso directamente en animales (25). Durante el 2006, el preparado comercial LMP-102 de la empresa Intralytics (www.intralytics.com), consistente en una mezcla de seis fagos con accin sobre Listeria monocytogenes, fue aprobado por la Food and Drug Administration(FDA), para su uso en productos crnicos y avcolas listos para el consumo. Otro producto con accin sobre L. monocytogenes, aprobado por la FDA es LISTEX, de la empresa Micreos Food Safety (http://www.micreosfoodsafety.com/), que durante el ao 2007 ampli su uso a todos los alimentos de riesgo de contaminacin con esta bacteria, adquiriendo la categora de producto GRAS (del ingls Generally Recognized as Safe) (25, 26). OmniLyticsInc.(www.omnilytics.com) recibi la aprobacinde la FDA parasuproducto a base de fagos contra E. colipara tratar a los animalesvivos, antes de susacrificio,ya sea en base a ducha (ganado) o nebulizacin (aves de corral) (27). Para dilucidar la gran duda del potencial efecto de los fagos sobre clulas eucariotas se han realizado diversos estudios de ingeniera gentica. En los resultados de ellos, un fago hbrido logr ingresar a la clula mamfera, pero no fue capaz de replicarse, con lo que se pudo concluir que la especificidad del fago no es dada slo por un receptor especfico, sino tambin por la maquinaria enzimtica bacteriana (28). Por otro lado, algunos antibiticos si exhiben efectos txicos, como tetraciclinas y gentamicina, en administraciones prolongadas, en individuos jvenes o en estados fisiolgicos determinados.7. Posible transferencia de fagos entre individuos: esto es esencialmente la infeccin cruzada de los fagos desde sujetos o ambientes tratados a individuos no tratados, lo que puede ser potencialmente til en aplicaciones agrcolas (29, 30, 19).8. Bajo impacto ambiental: debido a su composicin qumica y a su estrecho rango de hospederos, fagos eliminados post tratamiento, a diferencia de los antibiticos de amplio espectro, en el peor de los casos slo tendrn un impacto en un pequeo grupo de bacterias ambientales (19).9. Bajo costo: la produccin de los fagos predominantemente involucra el crecimiento en su hospedero y una posterior purificacin. Mientras que el valor de crecer al virus en su hospedero vara dependiendo del tipo bacteriano, el costo de su purificacin parece ir disminuyendo a medida que las tecnologas mejoran. En general los costos de la produccin de los fagos, por unidad, no se comparan con los costos de la produccin farmacutica, mientras que el costo del descubrimiento, aislamiento y caracterizacin pueden ser relativamente bajos (19).

Por otra parte, dentro de las principales preocupaciones y desventajas del uso de fagos como agentes teraputicos se describen: 1. Existencia de bacterias fago-resistentes: las bacterias pueden desarrollar resistencia a bacterifagos a travs de una variedad de mecanismos., los que incluyen el bloqueo de la adsorcin viral (31, 32) (mediante bloqueo o prdida de receptores, produccin de matriz extracelular y/o produccin de inhibidores competitivos), inhibicin de la inyeccin del genoma viral (31, 32, 33) (mediante el mecanismo de exclusin a la superinfeccin de fagos), sistemas de restriccin-modificacin (34, 35, 36, 37) (mediada por enzimas que degradan los cidos nucleicos virales o por el sistema CRISPR-Cas), y sistemas de aborto de la infeccin (32, 35) (resistencia conferida por el sistema Abi). Estudios de monocultivos in vitro han demostrado que la resistencia bacteriana a los fagos puede generarse en horas o das. Sin embargo, a la fecha an no se esclarece si el desarrollo de esta resistencia in vitro es relevante bajo condiciones in vivo. Una de las principales estrategias para prevenir y disminuir este fenmeno es el uso de mezclas de diferentes bacterifagos, lo que ha exhibido buenos resultados (38; 19).2. No todos los fagos son buenos agentes teraputicos: los buenos fagos teraputicos deben poseer un alto potencial en alcanzar y luego matar las bacterias, junto con un bajo potencial de modificar negativamente los ambientes en los cuales son aplicados. Estas caractersticas pueden ser aseguradas si los fagos utilizados son estrictamente lticos, estables bajo condiciones y temperaturas de almacenamiento, sometidos a apropiados estudios de eficacia e inocuidad, e, idealmente, ser completamente secuenciados para confirmar la ausencia de genes no deseados como los de toxinas. La caracterizacin de los fagos puede incluir morfologa de los viriones, perfiles proteicos, o caracterizacin genotpica diferente de la secuenciacin, etc., aunque los costos asociados a esta exhaustiva caracterizacin pueden ser restrictivos. El objetivo principal, por lo tanto, debera ser identificar aquellos fagos que exhiben favorables caractersticas farmacodinmicas (esto es eficacia antibacteriana), y buenas caractersticas farmacocinticas (habilidad de llegar a la bacteria in situ). Aquellos fajos que no cumplan adecuadamente con este criterio no deberan ser utilizados como agentes teraputicos (19). En el caso de las bacterias de vida intracelular, como Salmonella, sta al invadir su clula blanco es protegida de la accin de los bacterifagos por la vacuola contenedora de Salmonella, por esta razn se sugiere que la bacteria debe ser eliminada antes de que logre invadir las clulas eucariotas del hospedero animal (39). 3. Reducido rango de hospederos: lo estrecho del rango de hospederos de los fagos constituir, como mnimo, limitaciones para el tratamiento presuntivo. Sin embargo, como los fagos a veces pueden ser utilizados en combinacin con otros agentes antimicrobianos, incluyendo otros fagos, el espectro ltico de estas partculas puede ser mucho ms amplio que el espectro de actividad de un fago nico (19).4. Necesidad de una concentracin bacteriana alta: esto constituye un requerimiento obligatorio para que los fagos puedan replicarse y lisar las bacterias. Si se administran de forma apresurada tendern a inactivarse por falta de bacterias y se necesitarn mayores concentraciones posteriores (20). Al respecto, Joerger (2003) (40) seala que el uso de la fagoterapia necesariamente requiere de multiplicidades de infeccin (MOI) altas, es decir mayor ttulo de fagos comparados con el ttulo de su bacteria blanco. As, la utilizacin de una MOI de al menos 10000 veces ha sido sustentada por trabajos previos realizados a nivel nacional, los cuales utilizando la misma cepa bacteriana, obtuvieron exitosos resultados usando estas proporciones bacterifagobacteria en aves de corta edad (41, 42, 43).5. Capacidad de los bacterifagos de inducir respuesta inmune humoral y celular en los organismos: se han encontrados anticuerpos neutralizantes contra bacterifagos en el suero de distintas especies animales y calostro de vacas que no han sido estimuladas por fagoterapia. Slo algunos bacterifagos son antignicos y presentan altas frecuencias de anticuerpos anti-fago, situacin que parecera ser una desventaja en la fagoterapia. La reaccin fago-anticuerpo depende del tiempo y la dosis de fagos (28). Por esta razn, Carlton (1999) (21) sugiri su administracin en altas dosis para compensar la neutralizacin por los anticuerpos.6. Interaccin de los bacterifagos con el sistema inmune innato: esta interaccin es muy importante para su remocin en organismos superiores, pudiendo dar origen a baja eficiencia de la fagoterapia (28). Se reconoce que este puede ser el mayor problema en la eficacia de la terapia ya que se ha demostrado que una vez administrados los fagos, stos se reducen en ms del 90% en el sistema circulatorio y, aunque se ha postulado que los anticuerpos pueden ser el mayor factor de eliminacin de los fagos, se ha determinado en ratones nunca expuestos a bacterifagos, que el sistema retculo-endotelial es suficiente y altamente efectivo en la remocin de los bacterifagos (44).7. Existencia de barreras fsico-qumicas que disminuyen la interaccin bacteria-fago: un ejemplo de ello se ha observado en fagoterapias administradas por la va oral, donde el ambiente gastrointestinal determina una disminucin en el encuentro efectivo entre el bacterifago y la cepa desafo (39), ya que el virus puede sufrir problemas estructurales por las enzimas digestivas y condiciones de pH que se encuentran en el tracto gastrointestinal (45). Adems de lo anterior, estudios han demostrado que la translocacin de los bacterifagos a la sangre es menos efectiva cuando provienen del estmago que cuando provienen de otras secciones del tracto gastrointestinal. Se conoce que algunos bacterifagos no pueden persistir si se exponen a pH 2 y frente a pH 3 a 7 disminuyen su ttulo. Sin embargo, la sensibilidad a bajos valores de pH depender del tipo de bacterifago (28). De todas formas, la neutralizacin cida del estmago con sustancias anticidas antes de la administracin de los bacterifagos parece ser un importante factor para la mantencin de ellos (45, 46, 47, 48). Otra barrera fsica que debe tenerse en cuenta en las fagoterapias administradas por la va oral es la viscosidad. Joerger (2003) (40) describe que la viscosidad del contenido intestinal parece disminuir la probabilidad de encuentro entre bacterias y bacterifagos. Adicionalmente, el gran nmero de bacterias presentes en ciertos segmentos del tracto intestinal podra ser una barrera mecnica para la difusin de los bacterifagos. No obstante, es presumible que el efecto fsico de estas barreras podra compensarse, en parte, aumentando la cantidad numrica de los fagos administrados. De hecho, el uso de la fagoterapia necesariamente requiere de multiplicidades de infeccin (MOI) altas.8. Escaso conocimiento acerca de la cintica de los fagos: esto resulta ser otro gran problema (28), ya que se deben considerar ciertos parmetros crticos para la fagoterapia, tales como la tasa de adsorcin del fago, la cantidad de replicaciones, el periodo de latencia, la dosis inicial de fagos y su eliminacin por el sistema retculo endotelial, entre otros (6).9. Problemas en la percepcin de los consumidores: esta desventaja se relaciona con el uso de estos agentes como biocontroladores de patgenos en alimentos y no al uso de ellos como fagoterapia propiamente tal. La presencia de un virus en los alimentos podra causar que los consumidores se mostrasen reacios a consumir alimentos que fueron tratados en diferentes momentos de su produccin con bacterifagos. Esta situacin estara siendo resuelta mediante la educacin a los consumidores sobre la inocuidad del consumo de bacterifagos, y tambin a travs de la utilizacin de nuevas molculas derivadas de los fagos, como endolisinas o lisozima purificadas (49).

3. FAGOTERAPIA EN MEDICINA VETERINARIA

En Medicina Veterinaria, el primer trabajo publicado data del ao 1941, donde Slanetz y Jawetz aislaron y caracterizaron fagos contra estafilococos desde la leche de vaca, para estudiar su efectividad contra la mastitis causada por dicho patgeno, utilizando como modelo experimental gatos y conejos. Los resultados de esta pionera investigacin permitieron sugerir a priori, la ineficacia de los fagos frente a una mastitis clnica por Staphylococcus spp.

3.1. Fagoterapia contra enfermedades producidas por cepas patgenas de E. coliCepas patgenas de E. coli son conocidas por causar enfermedad en diversas especies animales, como pollos y gallinas, ganado bovino, ovino y caprino, as como en animales de compaa. Dentro de estas cepas destaca la cepa E. coli O157:H7, no por su potencial patgeno para los animales, si no por su potencial impacto en las personas que consuman sus productos contaminados. Las enfermedades causadas por este grupo de bacterias en las especies de abasto poseen un gran impacto econmico, por la disminucin de la eficiencia de conversin alimentaria y mortalidad producidas, junto con ser una fuente potencial de infeccin para las personas (u otros animales) que consuman sus productos derivados. Existen diversos estudios de fagoterapia en pollos infectados experimentalmente con cepas patgenas de E. coli (23, 51, 52) causantes de diarrea, septicemia, meningitis, y su consecuente mortalidad. En estos estudios, la aplicacin de estos virus logr disminuir la incidencia de las enfermedades, y an ms importante, disminuciones en la tasa de mortalidad de hasta 79%. En estas experiencias se utilizaron diferentes MOI, diferentes vas de administracin (va intramuscular y va oral), coincidiendo en su mayora en que la va intramuscular produce reducciones mayores en el recuento bacteriano o en la mortalidad/morbilidad, al igual de lo que ocurre aumentando la concentracin de los fagos y la MOI.En relacin al tratamiento potencial de cuadros producidos por este patgeno en animales de compaa, Freitag et al. (2008) (53) investigaron la factibilidad de la fagoterapia para combatir las infecciones del tracto urinario provocadas por E. coli en perros y gatos. Para ello, midieron la eficiencia, in vitro, de 40 fagos sobre 53 cepas uropatognicas de E. coli (UPEC por sus siglas en ingls). En total, el 94% de las cepas UPEC fueron destruidas por uno o ms fagos. Por lo tanto, estos resultados indican que la mayora de las cepas UPEC son susceptibles a la lisis por fagos, convirtindose as los bacterifagos en una promesa teraputica para el tratamiento de infecciones del tracto urinario en caninos y felinos. Una de las principales especies de abasto considerada como reservorio de cepas patgenas de E. coli, especficamente de E. coli O157:H7, es el ganado bovino. Diversos estudios sobre la eficiencia de los fagos en la eliminacin o disminucin en la portacin intestinal de esta bacteria han sido realizados (30, 54). Junto con los bovinos como reservorios, donde los estudios concluyen que una fagoterapia continua puede ser un mtodo efectivo para reducir la portacin y eliminacin de E. coli O157:H7, logrando reducciones in vivo significativas de hasta 1,5 log menor en comparacin con el grupo control (54), se encuentran otros rumiantes como ovejas y cabras. En relacin a los estudios realizados en ovinos, se encuentran las experiencias de Bach et al., 2003; Callaway et al., 2006; Raya et al., 2011, entre otros (55, 56, 57). En estas se intent disminuir/eliminar este patgeno de su sistema gastrointestinal. La eliminacin ruminal mostr buenos resultados, al igual que la realizada en tracto intestinal y deposiciones (logrando reducciones incluso >99% en comparacin con animales sin tratamiento fgico). Si bien es cierto, las partculas alimentarias ruminales pueden afectar la efectividad de los fagos, los resultados obtenidos hasta la fecha permiten concluir que fagos apropiadamente seleccionados pueden ser usados para reducir E. coli O157:H7 en animales de abasto, junto con la cierta posibilidad del uso de fagos en los programas de control de este patgeno alimentario.

3.2. Fagoterapia contra enfermedades producidas por Salmonella spp.Uno de los patgenos ms importantes en los sistemas de produccin animal lo constituyen cepas del gnero Salmonella. Ciertas cepas o serotipos pueden causar graves daos econmicos por la enfermedad que produce, y eventual mortalidad, junto con las graves consecuencias para la salud pblica que puede tener el producir un alimento contaminado con esta bacteria. En relacin al control de Salmonella spp. en planteles porcinos, Lee y Harris (2001) (58) realizaron un estudio en el cual un fago ltico especfico contra Salmonella (Felix-O1) fue probado como posible candidato para el control de este Salmonella Typhimurium. En esta investigacin el tratamiento fgico redujo significativamente el recuento bacteriano desde tonsilas y contenido cecal en comparacin con los del grupo control. En un subsecuente estudio (59), se configur un protocolo de mltiples dosis administradas 24 horas antes del embarque y beneficio, demostrando que esta administracin puede reducir las concentraciones de S. Typhimurium en varios rganos y tejidos, aunque la administracin intramuscular puede llegar a no ser prctica en los sistemas modernos de produccin porcina (60). Siguiendo esta lnea, Wall et al. (2010) (61) desarrollaron una serie de pruebas para medir si la fagoterapia poda limitar las infecciones con Salmonella serovar Typhimurium en cerdos durante el periodo de transporte y mantencin previa al beneficio, considerada una de las etapas de mayor probabilidad de contaminacin de los animales. Los resultados de esta investigacin demostraron que el uso de una mezcla de fagos permiti reducir significativamente la concentracin cecal (1,5 log UFC/mL versus 2,9 log UFC/mL) de este patgeno reduciendo tambin su concentracin en leon (1,7 log UFC/mL versus 2,7 UFC/mL). Estos resultados indican que el uso de fagos como agentes para prevenir la contaminacin de las canales porcinas con Salmonella spp. constituye una promisoria y til herramienta. Por otra parte, la mayora de los estudios para tratar de disminuir la portacin intestinal de este patgeno se han realizado en aves comerciales, como pollos (29, 42, 48, 62, 63), pavos (45) y gallinas de postura (43).En los estudios realizados en pollos por Fiorentin et al. (2005) y Toro et al. (2005) (29, 62) la administracin de una mezcla de bacterifagos en las aves previamente inoculadas con Salmonella Typhimurium permiti obtener menores recuentos bacterianos a nivel cecal (hasta seis veces menor). Sin embargo, Toro et al. tuvieron resultados dismiles trabajando con fagos en la disminucin del recuento bacteriano desde leon, bazo, hgado y ciegos. En esta experiencia el uso de los fagos a temprana edad (11 das) produjo una reduccin significativa en los recuentos cecales de Salmonella, aproximadamente 10 veces respecto al grupo control de infeccin; no obstante, no se lograron reducciones significativas en las muestras de los otros tejidos. Utilizando fagos contra S. Enteritidis, Filho et al. (2007) (63) lograron reducir significativamente el recuento bacteriano (en hasta un 65%) del patgeno desde tonsilas cecales a las 24 horas post tratamiento en relacin al grupo control de infeccin en pollitos de 1 da. La fagoterapia en pollos de mayor edad tambin ha sido investigada. Atterbury et al. (2007) (48) infectaron va oral pollos broiler de 36 das con Salmonella Enteritidis o Salmonella Typhimurium. Dos das post infeccin, las aves fueron tratadas con bacterifagos. Las aves tratadas con bacterifagos mostraron una significativa reduccin ( 4,2 log UFC) en el recuento cecal promedio de S. Enteritidis y S. Typhimurium respecto a los grupos controles de infeccin 24 horas post tratamiento, avalando la efectividad del uso de fagos tambin en pollos de mayor edad.Por otra parte, Higgins et al. (2007) (45) evaluaron la eficacia de una mezcla de bacterifagos adaptados al pH gastrointestinal en la reduccin de S. Enteritidis en ciegos de pavos de 2 das, a dos concentraciones virales y bacterianas diferentes. Como resultado se obtuvieron reducciones en el recuento bacteriano a nivel cecal, sin embargo estas reducciones en ambas experiencias no fueron estadsticamente diferentes.En el 2008, en un estudio realizado por Borie et al. (41), se evalu el efecto preventivo de una mezcla de tres bacterifagos, dosificados por aspersin y por agua de bebida, para reducir la colonizacin de Salmonella Enteritidis en pollos SPF. Los pollos tratados con fagos y las aves del control positivo (infectados y no tratados con fagos), fueron desafiados va oral con S. Enteritidis. Al dcimo da post-infeccin, todas las aves fueron eutanasiadas para obtener muestras de intestino y un pool de rganos (corazn, hgado y bazo) para recuento bacteriano. La incidencia de contaminacin con Salmonella en intestino y en la mezcla de hgado, bazo y corazn se vio reducida significativamente mediante el tratamiento de bacterifagos a travs de aspersin, junto con mostrar una reduccin del patgeno a nivel intestinal. Por otro lado, la incidencia de S. Enteritidis en pollitos tratados con bacterifagos va agua de bebida no vari significativamente con respecto al grupo control positivo, aun cuando s produjo una disminucin en su recuento intestinal. El grupo control positivo mostr un recuento promedio de 5,67 log UFC/g, mientras que los pollitos tratados mediante aspersin 4,04 log UFC/g y los tratados por agua de bebida 4, 25 log UFC/g. Estos resultados indican que algunos tratamientos con bacterifagos pueden reducir la incidencia de infeccin y el recuento intestinal de la bacteria. Adems, se determin que la ruta de administracin de los fagos juega un rol importante en el xito del tratamiento. En el mismo ao, Borie et al., (42) evaluaron el efecto de la administracin nica de un bacterifago en la prevencin de la colonizacin intestinal de pollas White Leghorn en un protocolo similar al anterior, demostrando que la concentracin viral y la MOI son fundamentales para reducir significativamente los recuentos bacterianos.Adems de evaluar la efectividad en pollos jvenes, Borie et al. (2011) (43) analizaron la capacidad de una mezcla de tres bacterifagos para disminuir la incidencia de infeccin y los recuentos de Salmonella Enteritidis en el tracto reproductivo de gallinas. Los resultados mostraron que, a pesar de que los bacterifagos son capaces de llegar a ovario y oviducto, stos no logran reducir la incidencia de colonizacin bacteriana a nivel local. En cuanto al recuento del patgeno, slo se logr una leve disminucin significativa de los recuentos a nivel del tejido ovrico, comparado con los recuentos del grupo control. En el estudio, no se logr aislar bacterifagos en los huevos de las gallinas infectadas y tratadas, por lo indica que an no est clara su efectividad al ser dosificados por la va oral.Recientemente Lim y colaboradores (2012) (64) midieron la efectividad de la administracin de fagos, como aditivos en el alimento, en pollitos de un da para la reduccin la infeccin con Salmonella Enteritidis. En este estudio, utilizando diferentes concentraciones virales, slo la administracin de una alta concentracin de fagos (109 UFP/g) logr recuentos de este patgeno desde tejido cecal significativamente menores que el grupo control (5,48 log UFC/g en comparacin con 6,55 UFC/g). Estos resultados indican que la invasin tisular en pollitos altamente susceptibles expuestos a S. Enteritidis puede ser reducida marcadamente con la administracin de fagoterapia.

3.3. Fagoterapia contra enfermedad producida por Campylobacter spp.Otro patgeno bacteriano que posee una gran importancia en los planteles de produccin avcolas, bsicamente por su potencial impacto en los consumidores, corresponde a cepas del gnero Campylobacter.Dentro de las experiencias realizadas para comprobar la eficiencia del uso de bacterifagos en la reduccin de la portacin intestinal de C. jejuni y C. coli, se encuentran los estudios de Wagenaar et al., 2005; Loc-Carrillo, 2005; Carvalho et al., 2010; entre otros (65, 66, 67). En estos estudios se comprob un efecto en la reduccin de la colonizacin bacteriana (con disminuciones de 0,5 log UFC/g a incluso 5 logUFC/g de contenido cecal, en comparacin con los animales sin tratamiento con estos agentes), aunque no en eliminarla de la flora intestinal. Estos resultados avalan el uso de estos virus para tratar de disminuir la contaminacin de las canales que se produce en las plantas faenadoras de aves, proveniente de su contenido intestinal, disminuyendo as la probabilidad de comercializacin de productos contaminados.

DISCUSIN

En base a la informacin expuesta, el uso de bacterifagos como agentes teraputicos en animales y para el control de enfermedades transmitidas por alimentos constituye una nueva herramienta de gran potencial. Sus propiedades in vitro han demostrado ser lo suficientemente slidas como para respaldar su uso (5, 19, 68), incluso su comercializacin a gran escala, pero an son necesarios nuevos ensayos in vivo para complementar la gran cantidad de informacin generada de estudios in vitro. Esta necesidad radica fundamentalmente en las diferencias en la eficiencia que la fagoterapia ha demostrado en ciertos modelos experimentales, donde el uso de estos agentes en animales de corta edad resulta eficiente, siendo esto no necesariamente concordante con estudios realizados en animales adultos, como las gallinas (43). Estos resultados no desacreditan el uso de estos virus como agentes biocontroladores, pero s recalca la existencia de muchos otros factores que pueden impedir su adecuada funcin. Dentro de estos factores puede incluirse la va de administracin, la dosis bacteriana inicial, la concentracin del fago, etc., elementos que deben ser completamente entendidos en cuanto a su injerencia o interferencia dentro de la eficacia de los bacterifagos.Otro aspecto importante de considerar es el estrecho rango de hospederos de los fagos. En funcin de desarrollar herramientas teraputicas o de biocontrol, el desarrollo de bacterifagos con un espectro de accin ms amplio debe ser una prioridad en la investigacin de estos agentes. A pesar de esto, esta debilidad de los fagos, puede ser subsanada mediante la utilizacin de mezclas virales, para as ampliar su espectro de accin.El aseguramiento de calidad en la utilizacin masiva de esta herramienta es, tanto en su funcin como en su inocuidad, un aspecto muy relevante de considerar. Este punto puede ser un gran freno para su desarrollo, debido al tiempo que requiere y a los recursos que se deben invertir en, entre otros, secuenciar todo su genoma y estudiar sus propiedades farmacocinticas y farmacodinmicas (19).A pesar de esto, la aprobacin de ciertas formulaciones comerciales en base a fagos, como los de empresa Intralytics (www.intralytics.com) y de Micreos Food Safety (http://www.micreosfoodsafety.com/) auguran un futuro cierto para su uso.En un momento en que la resistencia bacteriana a los antibiticos se encuentra en aumento, el uso de bacterifagos posee diferentes ventajas, junto con relativamente pocas desventajas. Los grandes avances en los conocimientos cientficos sobre la biologa de estos agentes junto con el desarrollo de gran nivel que la investigacin mdica ha alcanzado a la fecha, pueden hacer que el verdadero potencial de la fagoterapia sea comprendido y eficientemente utilizado. A modo de resumen final sobre las consideraciones previas al uso de la fagoterapia se pueden exponer las conclusiones realizadas por Skurnik y Strauch (2006) (6): 1- No debe intentarse la aplicacin de la fagoterapia, mientras la biologa del bacterifago involucrado no sea lo suficientemente comprendida.2- Las preparaciones de bacterifagos deben cumplir todos los requisitos de bioseguridad, debiendo ser libres de bacterias y sus componentes.3- Las preparaciones de fagos deben contener partculas fgicas infectivas, por lo cual el almacenamiento de las preparaciones debe ser validado.4- Idealmente, el receptor del bacterifago debe ser conocido. En una poblacin bacteriana de 106108 bacterias, hay una alta probabilidad de existencia de mutantes espontneas fago resistente, deficiente del receptor o con una alteracin de ste.5. La eficacia de la fagoterapia debe ser comprobada en un modelo animal, ya que cada bacterifago puede comportarse en forma diferente in vivo

CONCLUSIONES

Los estudios presentados en esta revisin, muestran el gran inters que se ha ido generando sobre la terapia y el biocontrol con fagos a travs de los aos, y tambin en su efectividad en la reduccin de la colonizacin de variados patgenos en diversos tejidos . Si bien las investigaciones comenzaron hace ya varias dcadas, estas se han intensificado en los ltimos aos, debido a la aparicin de cepas bacterianas multirresistentes y, por supuesto, a la mayor informacin que existe respecto de estos agentes virales, lo que permite trabajar sobre una base mucho ms slida de conocimientos. A pesar de lo anterior, la terapia con fagos sigue siendo controversial, lo cual, ms all de ser un punto de detencin de las investigaciones, debe ser un incentivo para las nuevas generaciones de cientficos, quienes tienen la responsabilidad de ahondar en el estudio de los bacterifagos, para as definir con total seguridad, si estos virus son o no una herramienta complementaria ptima al uso de otros mtodos de control del crecimiento bacteriano, como los antimicrobianos.

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