Modelos Para Bioensayos

II Congreso Nacional de Ingeniería Sanitaria y Ambiental

Ciudad de Guatemala, 8 - 12 de octubre de 2001 “La Ingeniería Sanitaria y Ambiental en el Cumplimiento

de los Acuerdos de Paz”

Microbioensayos ecotoxicológicos para monitoreo ambiental y otras aplicaciones

Lic. Pablo Mayorga Sagastume Servicios y Productos Ambientales (SEPRA)

20 avenida A 3-35 B zona 15 VH1 01015 Guatemala, Guatemala

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___________________________________________________________________ II Congreso Nacional de Ingeniería Sanitaria y Ambiental

Ciudad de Guatemala, 8 - 12 de octubre de 2001 Microbioensayos ecotoxicológicos para monitoreo ambiental y otras aplicaciones

Pablo Mayorga - Servicios y Productos Ambientales

Contenido LA CRISIS GLOBAL DEL AGUA.................................................................................................................................................1

MICROBIOENSAYOS ECOTOXICOLÓGICOS.......................................................................................................................2

LOS TOXKITS..................................................................................................................................................................................4

PROTISTAS: EL CILIADO TETRAHYMENA THERMOPHILA.........................................................................................5

ALGAS VERDES UNICELULARES DE AGUA DULCE: SELENASTRUM CAPRICORNUTUM (= RAPHIDOCELIS SUBCAPITATA)...............................................................................................................................................................................6

ROTÍFEROS......................................................................................................................................................................................7

CRUSTÁCEOS..................................................................................................................................................................................9

SISTEMA DE CLASIFICACIÓN DE LA CONTAMINACIÓN...............................................................................................15

SISTEMA DE CLASIFICACIÓN PARA AGUAS NATURALES ..................................................................................................... 16 SISTEMA DE CLASIFICACIÓN PARA DESECHOS VERTIDOS EN AMBIENTES ACUÁTICOS ............................................. 18

SISTEMA DE CLASIFICACIÓN DEL POTENCIAL EUTROFICANTE...............................................................................21

SISTEMA DE CLASIFICACIÓN PARA AGUAS NATURALES ..................................................................................................... 22 INDICE DE EUTROFICACIÓN PARA DESECHOS VERTIDOS EN AMBIENTES ACUÁTICOS................................................ 22

LITERATURA CITADA.................................................................................................................................................................24




La crisis global del agua La crisis global del agua ha sido anticipada por hidrólogos durante varias décadas. No fue, sin embargo, hasta después de las conferencias de Dublín en 1992 y de las Naciones Unidas en 1997, y de acciones subsecuentes, que la crisis del agua adquirió una prioridad a nivel político (Ongley, 2001). La escasez de agua afectará a 3 billones de personas para el año 2025, pero la situación empeorará debido a que la contaminación seguirá aumentando si no se toman medidas adecuadas al respecto. La eutroficación y contaminación de aguas superficiales, subterráneas y costeras se sumarán a la escasez de agua, reduciéndose las posibilidades de usar el agua contaminada para otros usos beneficiosos. Esta crisis tiene ya efectos en la producción de alimentos, en el desarrollo social y en la salud publica especialmente en algunos países del Sudeste de Asia y Europa de Este (y en menor grado en América Latina). Por esto es prioritario remediar y proteger los cuerpos y fuentes de agua, con programas adecuadamente diseñados (Ongley, 2001). Un problema que enfrentan la mayoría de los países menos desarrollados, respecto de la calidad del agua, es la incapacidad de evaluar significativamente el estatus de la calidad del agua para propósitos de su manejo como recurso. Los programas de monitoreo de agua se llevan a cabo utilizando técnicas y parámetros físicoquímicos no adecuados. En muchos países esto se debe a la ineficiencia de los programas de monitoreo y su poca relevancia para el manejo de la calidad del agua. Por lo tanto, la modernización de los programas de calidad del agua deben incluir aspectos políticss, de legislación, institucionales y técnicos (Ongley, 2001). Entre los aspectos técnicos se puede mencionar la necesidad de adquirir información sobre la presencia, niveles y significancia potencial de patógenos y contaminantes. Las determinaciones del estatus de patógenos en agua potable falla en muchos países debido a la incapacidad de laboratorios nacionales (centralizados) de comunicar los resultados rápidamente a las comunidades. En el caso de otros tipos de contaminación (p.ej., química), la mayoría de los países menos desarrollados no tienen la capacidad tecnológica para medirlos con exactitud (Ongley, 2001). Existen técnicas modernas de bioensayos que permiten obtener información de calidad de manera eficiente. Existen incluso kits [de análisis bacteriológico] para uso en el campo1, así como otras metodologías bien conocidas, cuyos resultados finales son fáciles de aplicar e interpretar. Queda en manos de agencias gubernamentales pero, especialmente, en las de agencias internacionales y donantes, que técnicas de 1 En SEPRA utilizamos ColiBag y ColiPlate para detectar la presencia/ausencia y cuantificar coliformes totales y/o Escherichia coli. Estas pruebas rápidas no requieren asepsia ni mayor entrenamiento, y se basan en las tecnologías del X-Gal y MUG, respectivamente. Ver detalles sobre estas pruebas en nuestro sitio web http://www.sepra-gt.com o escríbanos a [email protected].




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bioensayos sean incorporados en sus programas de calidad de agua (Ongley, 2001). Debe asegurarse también que estos programas sean sostenibles. A continuación se presenta información general sobre bioensayos ecotoxicológicos, así como la tecnología utilizada y propuesta por SEPRA. Microbioensayos ecotoxicológicos La determinación de los peligros resultantes de la contaminación accidental o deliberada de ambientes terrestres y acuáticos está, en la mayoría de países, aún limitada a la detección y cuantificación de los presuntos contaminantes por análisis químicos (Persoone et al., 2000). Desafortunadamente, esta metodología se ve limitada por los siguientes factores: • los costos y dificultades técnicas de analizar cada sustancia química individual que

pueda estar presente en la muestra, y • la dificultad de calcular o valorar los peligros y riesgos de la contaminación ambiental a

partir de un conjunto de datos químicos (Persoone et al., 2000). Durante las últimas décadas la comunidad científica y reguladora se ha dado cuenta gradualmente que se deben considerar metodologías biológicas para una valoración de la significancia ecológica de los peligros toxicológicos de los contaminantes. Las evaluaciones de efectos obtenidas con técnicas biológicas integran el impacto de todos los contaminantes a los que la biota está expuesta (Persoone et al., 2000). Bioensayos con especies experimentales selectas, representantes de comunidades biológicas de los ambientes considerados se utilizan en la actualidad (más o menos rutinariamente [en algunos países industrializados]) para determinar efectos tóxicos y genotóxicos. Considerando la especificidad de la toxicidad respecto de las especies y de los químicos, la necesidad de un enfoque con una “batería de ensayos” con especies de distintos niveles tróficos, generalmente se acepta e implementa en la actualidad (Persoone et al., 2000). Entre los organismos que se utilizan o se han utilizado para efectuar bioensayos (“tradicionales”) se pueden mencionar, varias especies de: bacterias; algas azulverdosas; levaduras; hongos; protistas flagelados y ciliados; algas microscópicas; plantas vasculares; celenterados; nemátodos; rotíferos; lombrices de tierra; moluscos; crustáceos; insectos; erizos de mar; peces; ranas y; mamíferos (ratones, ratas, cobayos, conejos y otros) (Kaiser y Palabrica, 1991).




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Debe quedar claro que un balance entre análisis químicos, biológicos, toxicológicos y microbiológicos es siempre la mejor estrategia para generar la base de información más amplia sobre peligros ambientales (Persoone et al., 2000). La necesidad de pruebas biológicas se ha topado con el problema de costos asociados con las pruebas ecotoxicológicas, especialmente las utilizadas para control rutinario y monitoreo. Un problema mayor (si no el mayor problema) que limita la aplicación de bioensayos a un número restringido de laboratorios especializados, es la necesidad intrínseca y los altos costos de cultivo y mantenimiento continuo de “stocks” de organismos vivos para los ensayos (Persoone et al., 2000). Intensa investigación se ha llevado a cabo en las últimas dos décadas en varios laboratorios para desarrollar microbioensayos alternativos para permitir llevar a cabo pruebas rutinarias de bajo costo, y con equipo y materiales básicos de laboratorio (Persoone et al., 2000). Entre las principales características con las que debe contar un microbioensayo, se pueden mencionar: • debe ser poco caro o rentable; • generalmente no requiere de trabajo intensivo; • potencialmente debe poder procesarse un alto número de muestras; • los cultivos de organismos deben ser fáciles de mantener o no requerir mantenimiento

del todo; • debe utilizar un modesto espacio de laboratorio e incubación; • bajo costo de consumibles (p.ej., recipientes para los bioensayos); • requiere de poco volumen de muestra (Blaise, 1991). La reciente publicación de Persoone et al. (2000) evidencia la gran variedad de bioensayos en pequeña escala desarrollados y la diversidad de aplicaciones que tienen. Algunos ejemplos del tipo de materiales o muestras que se puede analizar con los bioensayos de toxicidad son los siguientes: • aguas naturales (subterráneas, superficiales, intersticiales), efluentes industriales (con

o sin tratamiento), lixiviados (p.ej., de vertederos de desechos), lluvia, nieve • suelos, sedimentos, lodos, compost, deposiciones atmosféricas • sustancias químicas sintéticas o naturales (puras o mezclas), productos de consumo

(doméstico o industrial), materias primas, biocidas, reactivos de laboratorio, pinturas preservantes para buques, medicamentos, extractos vegetales, alimentos, biotoxinas (algas, hongos, bacterias)

Entre las determinaciones que se pueden efectuar con los bioensayos se pueden mencionar las siguientes:




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• evaluación de reducción de toxicidad (p.ej., en plantas de tratamiento) • dosis/concentración letal/efectiva/inhibitoria media (p.ej., DL50, CE50, CI50; en

toxicidad aguda y crónica) • dosis/concentración mínima inhibitoria • concentración sin efecto observado • riesgo ecotoxicológico de aguas naturales, efluentes y otras matrices (ver detalles

sobre el Sistema de Clasificación de la Contaminación más adelante) • potencial de eutroficación de aguas naturales o de efluentes líquidos (ver detalles

sobre el Sistema de Clasificación de la Eutroficación más adelante) Para procesar los resultados de los efectos observados y obtener los datos numéricos de las determinaciones de toxicidad aguda mencionadas anteriormente, existen paquetes de cálculos estadísticos para computadora (p.ej., Dunnett, Spearman-Karber, Probit y otros) y métodos manuales de interpolación gráfica. Los Toxkits Los Toxkits son los microbioensayos utilizados por SEPRA. Estos son “kits” que contienen todos los materiales necesarios para efectuar una prueba de toxicidad, incluyendo: stocks concentrados (sales prepesadas disueltas) de los medios estándar; recipientes para incubación/lectura de resultados; y los organismos de prueba. Con estos se pueden efectuar bioensayos simples, rápidos, sensibles y reproducibles, a un costo muy por debajo del costo de bioensayos tradicionales. Los Toxkits disponibles (F=agua dulce, M=marino/estuarino, y lo que se mide) son:

• protozoos: Protoxkit F (inhibición, densidad ópitca = DO, espectrofotómetro) • algas verdes unicelulares: Algaltoxkit F (inhibición, DO) • rotíferos: Rotoxkit F acute o chronic (mortalidad o reproducción,

estereomicroscopio), Rotoxkit M (mortalidad) • crustáceos anacostracos: Thamnotoxkit F, Artoxkit M (mortalidad) • crustáceos cladóceros: Daphtoxkit F magna, Daphtoxit F pulex, Ceriodaphtoxkit

F (inmovilización, con una mesa de luz y una lupa) • crustáceos ostrácodos: Ostracodtoxkit F (toxicidad crónica de contacto de

sedimentos; mortalidad y elongación corporal, estereomicroscopio) Debe mencionarse que todos los Toxkits han sido desarrollados por los grupos de investigación dirigidos por el Prof. Dr. Guido Persoone (en el Laboratorio de Investigación Biológica en Contaminación Acuática, Universidad Estatal de Ghent, Bélgica), excepto:

• Protoxkit F, desarrollado por el grupo de investigación del Dr. W. Pauli, del Instituto de Bioquímica y Biología Molecular (Universidad Libre de Berlín,




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Alemania) y adaptado al concepto de Toxkit por el grupo del Prof. Dr. G. Persoone, y

• Rotoxkit F, Rotoxkit F chronic y Rotoxkit M, desarrollados en colaboración del grupo del Prof. Dr. G. Persoone y el Prof. Dr. T.W. Snell, de la Universidad de Tampa, Florida, Estados Unidos.

Para los cálculos de toxicidad aguda con los Toxkits se pueden utilizar hojas de interpolación gráfica (“efecto porcentual” en el eje x vrs “log concentración” en el eje y, según el método USEPA/600/485/013, 1985) incluidas en los kits, o un método computarizado en DOS (USEPA. 1985. Methods for measuring the acute toxicity of effluents to fresh water and marine organisms. 3rd ed. Toxdat. Multimethod program: binomial, moving average and Probit method.), que hace lo mismo que el método de interpolación gráfica, obteniendo resultados de DL50 casi idénticos. Una desventaja del método de interpolación gráfica frente al método computarizado es que el primero no indica niveles de confianza de los resultados obtenidos. Para las pruebas con protozoos, algas, el ostrácodo y las otras pruebas de toxicidad crónica, existen hojas de cálculo diseñadas especialmente por el fabricante de los Toxkits. El diskette con estos programas es distribuido junto con los kits. Cada lote de organismos de los Toxkits tiene una LC50 específica (poco variable en el tiempo) con dicromato de potasio y un rango de límites de confianza. Como control de calidad, cada laboratorio utilizando Toxkits debe efectuar periódicamente determinaciones de LC50 con K2Cr2O7 para saber si está siguiendo las metodologías adecuadamente y, por lo tanto, si sus resultados son confiables o no. Los Toxkits son utilizados en más de 40 países alrededor del mundo, incluyendo México, Argentina, Chile, Colombia y Guatemala en América Latina. A continuación se presentan algunos detalles sobre la biología y ecología de los organismos, aspectos metodológicos de los Toxkits y las especies utilizadas. Protistas: el ciliado Tetrahymena thermophila Los protistas son, en su inmensa mayoría, microscópicos y se encuentran siempre en lugares donde haya humedad. Sin embargo, son primariamente acuáticos y viven en agua dulce o salada, desde charcos hasta en los océanos. Algunos viven en suelo húmedo, en la capa de agua que rodea cada partícula del suelo. Algunos protozoarios forman, como consecuencia de cambios graduales en su ambiente, esporas o quistes inactivos que pueden resistir la desecación (Villee, 1988; Barnes, 1984). El filo Ciliophora es el más grande y homogéneo de los principales grupos de protozoarios Se han descrito unas 8000 especies y todavía hay grupos que no están bien estudiados. Difícilmente hay un lugar en la tierra donde no se encuentren protozoos ciliados. Los




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ciliados se encuentran ampliamente distribuidos en aguas dulces o marinas y la mayoría son solitarios y de vida libre (Barnes, 1984). Como un grupo constitutivo de la cadena alimenticia, juegan un rol importante en los ecosistemas como purificadores y recicladores de la materia en los ambientes acuáticos naturales y en las plantas de tratamiento de aguas residuales. Su alimentación a base de bacterias resulta en una mayor transparencia (i.e., contenido de cargas orgánicas menores en los efluentes del tratamiento) (Pauli y Berger, 2000). El género Tetrahymena es y ha sido un microorganismo modelo para estudios de biología celular de eucariotas. “...[un] ciliado de interés biológico general es el género Tetrahymena que puede cultivarse en un medio químicamente definido. Como las vías metabólicas en todos los organismos tienen varias similitudes básicas, el estudio de Tetrahymena ... está aclarando problemas similares en otros organismos, incluso el hombre“ (Villee, 1988). Cabe mencionar que el único parásito ciliado del ser humano es Balantidium coli (Pelczar et al., 1982). Actualmente se está desarrollando un lineamiento metodológico prioritario por la OCDE. Como resultado de extensos y diversos estudios (ahora muy aceptados y estandarizados internacionalmente) con el género Tetrahymena ha conllevado a que sea recomendado por la Agencia Ambiental Federal Alemana como uno de los organismos para análisis de riesgo ambiental (Pauli y Berger, 2000). Algas verdes unicelulares de agua dulce: Selenastrum capricornutum (= Raphidocelis subcapitata) Hay unas 7000 especies de algas verdes (uni- o multicelulares) distribuidas en medios muy variados, desde agua salada, agua dulce, suelo húmedo, y sobre rocas, cortezas de árboles, plantas y animales (Villee, 1988; Pelczar et al., 1982). Lo conspicuo y la importancia de las plantas flotantes microscópicas (fitoplancton) en los sistemas acuáticos (que puede ser desde un acuario hasta los océanos, es que son más importantes productores de alimento [para los consumidores primarios] que las plantas macroscópicas (Villee, 1988). Las algas son de importancia económica debido a: su rol en la fertilidad del suelo (fijación de nitrógeno); síntesis de vitaminas; su uso como alimento o aditivo de alimentos para humanos y animales; y por su rol en algunas enfermedades. Respecto de ésto último, se sabe que hay algunas especies de algas patógenas al hombre (p.ej., Prototheca sp.) y otras (p.ej., Cepheleuros sp.) que parasitan ciertas plantas superiores de importancia económica. Algunas algas microscópica secretan productos metabólicos potencialmente medicinales (p.ej., similares a antibióticos) y, en contraste, hay otras que producen toxinas letales para peces y otros animales. Estas toxinas pueden ser secreciones extracelulares,




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pero también pueden encontrarse intracelularmente y ser liberadas por la ruptura de las paredes de células muertas en descomposición. Los dinoflagelados marinos Gymnodinium y Gonyaulax producen una neurotoxina de alto peso molecular que puede causar la muerte de animales acuáticos. El alga Prymnesium parvum ha causado muerte masiva de peces en aguas saladas. Las toxinas producidas por las algas verdeazules de los géneros Microcystis y Anabaena pueden matar aves y mamíferos que beban aguas donde se encuentren dichos organismos (Pelczar et al., 1982). Selenastrum capricornutum no es un alga tóxica, por lo que ha sido utilizada como un control negativo (= no tóxico) en ensayos para la detección de toxinas de cianobacterias (algas verdeazules), mediante microbioensayos ecotoxicológicos, en Hungría (Törökné, 2000). Entre las metodologías estándar para ensayos ecotoxicológicos con algas utilizando, entre otras, la especie que aquí nos ocupa, se pueden mencionar:

• APHA (1998), • ASTM, método E 1218-90 (1990, citado en un panfleto sin fecha sobre

Algaltoxkit F), • ISO método ISO/DIS 10253.2 (1987, citado en un panfleto sin fecha sobre

Algaltoxkit F) y • OCDE, método 201 (1984). Este método es el utilizado en el Algaltoxkit F

(1996). Rotíferos Los rotíferos es un grupo conformado por animales acuáticos comunes y abundantes. Se han descrito unas 1800 especies y se encuentran en aguas marinas, estuarinas, dulces, suelos, sedimentos y musgos. La mayor parte residen en agua dulce y forman parte del zooplancton (Barnes, 1984; Snell y Janssen, 1998). En la actualidad se conocen unas 3000 especies, muchas de las cuales tienen una amplia distribución geográfica (Snell y Janssen, 1998). Un objetivo importante de la ecotoxicología acuática es determinar los efectos de compuestos tóxicos en organismos que juegan un papel central en las comunidades acuáticas. En ambientes de agua dulce y marino-costeros, los rotíferos tienen un impacto de grande en varios procesos ecológicos importantes. Como se alimentan, mediante filtración, de plancton y bacterias, los rotífereos ejercen una presión de forrajeo substancial excediendo a veces la ejercida por los crustáceos que conforman el zooplancton de mayor tamaño (Gilbert y Bogdan, 1984; Bogdan y Gilbert, 1987, citados en Rotoxkit F, 1992). Muchas especies de rotíferos planctónicos influyen la composición de especies de algas por forrajeo selectivo. También pueden influir en la coexistencia de competidores y en la




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calidad general del agua (Diner et al., 1986, citados en Rotoxkit F, 1992; Snell y Janssen, 1998). La contribución de los rotíferos a la producción secundaria en muchas comunidades acuáticas es substancial (Edmondson, 1974; Bogdan y Gilbert, 1982; Hernroth, 1983; Heinbockel et al., 1988, citados en Rotoxkit F, 1992). En aguas dulces, estos organismos constituyen a menudo, la mayor fracción de la biomasa de zooplancton en ciertas épocas del año (Makarewicz y Likens, 1979; Pace y Orcutt, 1981, citados en Rotoxkit F, 1992). Como las poblaciones de rotíferos pueden alcanzar densidades de > 10/ml, los rotíferos conforman cantidades substanciales de biomasa disponibles para niveles tróficos superiores (Snell y Janssen, 1998). Los rotíferos y otro zooplancton son una fuente significativa de alimento para muchos peces “larvarios”, peces adultos planctívoros (O’Brien, 1979; Evans, 1986, citados en Rotoxkit F, 1992) y varios depredadores invertebrados (Williamson, 1983; Stemberger, 1985; Egloff, 1988, citados en Rotoxkit F, 1992). Entre los depredadores de los rotíferos se incluyen otros rotíferos, copépodos y larvas de insectos y peces. Por ello los rotíferos son utilizados ampliamente en acuicultura, como alimento de estadíos “larvarios” de varios peces (Snell y Janssen, 1998). La elevada tasa metabólica de los rotíferos contribuyen a su rol en el ciclo de los nutrientes, el cual puede ser más importante que el rol de los crustáceos en ciertas comunidades (Esjmont-Karabin, 1983, 1984, citados en Rotoxkit F, 1992). Además de la importancia de su rol ecológico en comunidades acuáticas, los rotíferos son organismos atractivos para estudios ecotoxicológicos por la extensa base de datos existente sobre su biología básica. Por ejemplo, existen publicaciones (todas citadas en Rotoxkit F, 1992) sobre: • técnicas de cultivo de muchas especies de rotíferos (Pourriot, 1977; Stemberger,

1981), • el ciclo de vida de estos organismos (el cual está ya bien definido) (Birky y Gilbert,

1971; King y Snell, 1977), y los factores que lo regulan (que se comprenden razonablemente bien) (Gilbert, 1980, 1983; Snell, 1986; Snell y Boyer, 1988),

• estudios detallados sobre varios aspectos sobre su comportamiento (Gilbert, 1963; Snell y Hawkinson, 1983; Clement et al., 1983; Snell et al., 1987),

• caracterización de la biogeografía de muchas especies de rotíferos (Pejler, 1977; Dumont, 1983) y descripciones de la sistemática del grupo (Ruttner-Kolisko, 1974; Koste, 1978).

Los rotíferos del género Brachionus son particularmente útiles para toxicología ambiental por su rápida reproducción, corto tiempo de generación, sensibilidad y disponibilidad comercial de huevos durmientes (quistes) (Halbach, et al., 1983, citado en Rotoxkit F, 1992). Este género tienen una distribución cosmopolita que abarca los 6 continentes (Dumont, 1983, citado en Rotoxkit F, 1992) y son miembros importantes de muchas comunidades acuáticas impactadas por contaminación. El uso de B. plicatilis en ensayos




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de toxicidad agudos de corto plazo para ambientes marinos y estuarinos y B. rubens en agua dulce ha sido descrito por Snell y Persoone (1988a y b, citados en Rotoxkit F, 1992). La especie planctónica Brachionus calyciflorus se encuentra en hábitats lénticos en todos los continentes y es un componente ecológicamente significativo de muchos cuerpos de aguas naturales. Por lo tanto, los resultados de ensayos ecotoxicológicos pueden ser comparados con mucha relevancia ecológica. Los rotíferos se utilizan desde la década de 1970 en experimentos toxicológicos y en los últimos 5 años de forma rutinaria para los mismos propósitos (Snell y Janssen, 1998). • El rotífero de agua dulce Brachionus calyciflorus El método utilizado se adhiere al método estándar ASTM E1440-91 (toxicidad aguda) (Rotoxkit F, 1992). La prueba de toxicidad crónica de 48 h (Rotoxkit F chronic, 1999) se propone en APHA (1998) y sigue los lineamientos franceses de AFNOR. El material biológico del Rotoxkit F está siendo considerado para aprobación en la norma ISO/CD 20666 (com. pres., MICROBIOTESTS, Inc., 2001). • El rotífero estuarino/marino Brachionus plicatilis El método usado se adhiere al método estándar ASTM E-1440-91 (Rotoxkit M, 1994). Crustáceos Los crustáceos de la Clase Branchiopoda son pequeños y mayormente habitan agua dulce. Se denominan branquiópodos pues tiene apéndices corporales que son “pies de branquias”. Estos actúan, además de órgano de intercambio gaseoso, como filtros de alimento y sirven para su locomoción. Esta Clase está compuesta por varios grupos u ordenes: Anostraca, Notostraca y Diplostraca (compuesto por los subórdenes Conchostraca y Cladocera). La mayor parte de los branquiópodos tienen unos pocos milímetros de longitud y algunos son tan pequeños que no pasan de los 0.25 mm. Los más grandes son los anostráceos, que pueden alcanzar hasta 10 cm. Casi todos los branquiópodos son pálidos o transparentes, pero a veces se observa color rosado o rojo por la presencia de hemoglobina cuando hay poco oxígeno disuelto en su hábitat. Algunos cladóceros y concostráceos son pardos o negros (Barnes, 1984). Los branquiópodos viven casi sólo en agua dulce, excepto algunos cladóceros que son marinos. Sin embargo, sólo los cladóceros habitan arroyos, lagos y lagunas. Los otros grupos están restringidos a charcas temporales, manantiales y pequeñas lagunas. La única excepción es el camarón de agua salobre Artemia, un anostraco que se encuentra en lagos de aguas saladas en todo el mundo. Los branquiópodos, excepto los cladóceros, se caracterizan porque con frecuencia no se encuentran en algunas lagunas pero sí están presentes en otras cercanas. También pueden desaparecer sin explicación de una laguna




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y aparecer varios años más tarde. Muchas especies son efímeras y sólo aparecen brevemente durante la existencia limitada de charcos formados por deshielos o lluvias. La restricción de los branquiópodos más grandes a los cuerpos pequeños de agua dulce puede deberse a la ausencia de peces en estos hábitats (Barnes, 1984). Con pocas excepciones, los branquiópodos son filtradores, utilizando finas cerdas localizadas en los bordes de sus apéndices del tronco. El material filtrado es dirigido por diversas maniobras al surco alimenticio, llegando finalmente a la boca. Los branquiópodos planctónicos se alimentan de plancton y las formas bentónicas de detritus. Algunas especies de Daphnia se alimentan de bacterias (Barnes, 1984). La partenogénesis es frecuente en los branquiópodos y en algunas especies los machos son raros o inexistentes. En los cladóceros, los huevos partenogenéticos eclosionan en el interior de las hembras por varias generaciones, hasta que ciertos factores (cambios de temperatura o menos disponibilidad alimenticia por aumentos de población) inducen la aparición de machos, dándose lugar a la fecundación de huevos. Las paredes de la cámara de incubación [de los huevos] se transforman en una cámara protectora en forma de silla de montar (efipio). Los efipios flotan, se hunden hasta el fondo o se adhieren a objetos y son capaces de tolerar la desecación, el congelamiento e incluso el paso a través del tracto digestivo de peces o aves y mamíferos piscívoros. Por medio de estos huevos latentes protegidos, los cladóceros pueden dispersarse por acción del viento, por diversos animales o sobrevivir durante las sequías estivales (Barnes, 1984). La producción de huevos latentes puede verse estimulada por factores externos como la densidad de población, temperatura y fotoperíodos. La latencia (o diapausia) puede ocurrir después de un periodo inicial de desarrollo [del embrión], por lo que los huevos pueden estar listos para eclosionar rápidamente cuando se presenten condiciones favorables. Factores que interrumpen la latencia son: oxígeno, salinidad, temperatura e iluminación (Barnes, 1984). Algunos huevos pueden permanecer viables por varios cientos de años en la naturaleza (Fryer, 1997). Algunos branquiópodos presentan uno (p.ej., con pico poblacional en primavera y disminución en verano), dos (con picos en primavera y otoño) o ningún ciclo de población, dependiendo de la especie y de las condiciones, pero no es predecible. Algunas especies de Daphnia presentan estos tres comportamientos poblacionales (Barnes, 1984). • El anostraco de agua dulce Thamnocephalus platyurus Los anostracos (o anacostracos) de agua dulce, a menudo llamados camarones hadas (“fairy shrimp”), son uno de los muchos grupos de crustáceos. Estos microcamarones son habitantes típicos de ambientes acuáticos temporales, donde hay pocos depredadores, que se secan totalmente de forma periódica o presentan cambios drásticos en el nivel de agua (Thanmotoxkit F, 1995).




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Los camarones hada tienen una distribución geográfica muy amplia, desde el ártico o regiones altas, hasta estanques creados por la lluvia en áreas subtropicales. Sin embargo, estos ocurren principalmente en áreas localizadas y, a menudo, remotas (Thanmotoxkit F, 1995). Como en los camarones de mar (“brine shrimp”) del género Artemia, que son los “parientes” marinos de los camarones hada, la supervivencia durante períodos adversos se asegura por la producción de huevos resistentes, llamados quistes. Cuando el hábitat se torna favorable nuevamente, los quistes eclosionan, dando lugar a la salida de nauplios que rápidamente crecen hasta llegar al estadío de adulto, asegurando así la siguiente generación activa (Thanmotoxkit F, 1995). En contraste con Artemia, que es una fuente importante de alimento vivo para estadíos larvarios de crustáceos y peces en acuacultura comercial, y que son utilizados extensamente en investigación biológica fundamental, los camarones hada han sido considerados, hasta recientemente, “curiosidades científicas” (Thanmotoxkit F, 1995). Sin embargo, durante los últimos años, como resultado del creciente interés de los camarones de mar para aplicaciones ecotoxicológicas (Persoone y Wells, 1987, citado en Thanmotoxkit F. 1995), se iniciaron investigaciones en el Laboratorio para Investigación Biológica en Contaminación Acuática en la Universidad de Ghent, Bélgica, para determinar el potencial del camarón hada como una especie candidata para ensayos de toxicidad de agua dulce (Brendonck y Persoone, 1992, citado en Thanmotoxkit F, 1995). Estas investigaciones condujeron al desarrollo de un bioensayo sencillo y rentable de toxicidad aguda con nauplios del camarón hada Streptocephalus proboscideus (Centeno et al., 1992, citado en Thanmotoxkit F, 1995). Organismos vivos pueden ser eclosionados, según la necesidad de hacer pruebas, a partir de quistes de dicha especie, que son producidos bajo condiciones controladas (Brandonck et al., 1990, citado en Thanmotoxkit F, 1995). Análogamente con otros ”ensayos de toxicidad basados en quistes” desarrollados por el mismo laboratorio: 1) con nauplios de Artemia (Van Steertegem y Persoone, 1992, citado en Thanmotoxkit F, 1995), y 2) con rotíferos (Snell y Persoone, 1989a,b, citado en Thanmotoxkit F, 1995), el bioensayo con una especie de camarón hada se miniaturizó en un Toxkit, llamado Streptoxkit F (Thanmotoxkit F, 1995). Recientemente se descubrió que las larvas del camarón hada Thamnocephalus platyurus son, en general, más sensibles a sustancias químicas y residuos que las de S. proboscideus. Además, el éxito de eclosión [viable] de la primera especie resultó ser más predecible y consistente que la segunda especie (Centeno et al., 1993, citado en Thanmotoxkit F, 1995). Como resultado, el Streptoxkit F fue sustituido por el Thamnotoxkit




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F, para tamizaje rutinario de la toxicidad aguda de sustancia químicas y residuos en agua dulce (Thanmotoxkit F, 1995). El Thamnotoxkit F es un bioensayo estandarizado y muy rentable. De hecho, al igual que otros Toxkits basados en quistes, este bioensayo supera uno de los principales “cuellos de botella” en pruebas de toxicidad: la necesidad de cultivo y mantenimiento continuo de stock vivo de organismos para los ensayos (Persoone, 1991, citado en Thanmotoxkit F, 1995). Este organismo ha resultado ser especialmente susceptible a las biotoxinas de algas azul verdosas. Detalles sobre esta aplicación se encuentran en el trabajo de Törökné (2000). • El anostraco estuarino/marino Artemia salina (= A. franciscana) El camarón de agua salobre (o de mar), Artemia, se encuentra en lagos de aguas saladas en todo el mundo (Barnes, 1984). El camarón de mar (“brine shrimp”) Artemia produce, bajo ciertas condiciones ambientales, huevos durmientes (quistes) que pueden almacenarse en condiciones secas por largo tiempo, sin perder su viabilidad. Al sumergirse en agua de mar, larvas (instar I) de nado libre eclosionan de los quistes en aproximadamente 24 horas. La disponibilidad permanente de quistes de este organismo, que se usa extensamente en acuacultura para la producción de alimento vivo para larvas de crustáceos y peces [incluso en ventas de acuarios y peces], es hasta la fecha una gran ventaja para el uso rutinario de esta especie en toxicología acuática. El uso de quistes como material biológico inicial resuelve uno de los principales problemas biológicos, tecnológicos y financieros de la ecotoxicología rutinaria. Esto es, que evita la necesidad de cultivar y mantener continuamente stock vivo de estos organismos, en estado saludable y en números suficientes. Además, el hecho que todos los investigadores puedan obtener y usar quistes estándar (de referencia) puede contribuir significativamente a la estandarización de los métodos de bioensayos y la repetibilidad de los resultados (Artoxkit M, 1990). Como se indica en el documento “Artemia en toxicología acuática” (Persoone y Wells, 1987, citado en Artoxkit M, 1990), las ventajas de estos camarones como organismos de prueba, gradualmente condujeron al aumento en la utilización de esta especie en investigaciones fundamentales y aplicadas de ecotoxicología. Actualmente, Artemia se utiliza como especie de bioensayo para una variedad de objetivos tales como: investigación de la fuente de toxicidad en mezclas de sustancias químicas y muestras ambientales, tamizaje de toxicidad aguda de sustancias químicas, detección de toxinas naturales en comestibles y farmacéuticos, estudios de modelos de acción tóxica de sustancias, y estudios de la transferencia trófica de contaminantes (Artoxkit M, 1990; Solís, 1995). Artemia ha probado ser un organismo versátil y valioso en pruebas de toxicidad




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con un sólo organismo, particularmente si es estudiado con otras especies endémicas (Artoxkit M, 1990). Algunos investigadores se han opuesto (y quizás aún se oponen) al uso de Artemia en ecotoxicología argumentando que, como la especie no se encuentra en el mar ni en estuarios, no es una especie verdaderamente marina y no puede ser un representante de la biota marina. Este argumento es poco fundamentado, pues la única razón que estos camarones se encuentran principalmente en biotopos de alta salinidad es porque son ecológicamente no competitivos con otro zooplancton marino (Artoxkit M, 1990). La capacidad de esta especie de vivir en condiciones ultrasalinas le ha permitido tener gran éxito en el establecimiento de poblaciones muy grandes en todo el mundo, ya que la salinidad es una barrera muy efectiva contra depredadores y otros competidores (Sam, 1993; Artoxkit M, 1990). Como Artemia se puede cultivar en rangos de salinidad de 5 a 150 ppt, es una de las especies más euriplásticas [referente al rango de toxicidad que tolera] y que se puede adaptar fácilmente a un amplio rango de condiciones ambientales (Artoxkit M, 1990). El potencial de Artemia para investigación y aplicaciones en toxicología acuática se ha explorado dese 1975 en el Laboratorio de Investigación Biológica en Toxicología Acuática de la Universidad Estatal de Ghent, Bélgica (Sorgeloos et al., 1978, citado en Artoxkit M, 1990). En 1981 se desarrolló el primer ensayo estandarizado de ecotoxicología marina: el ensayo ARC, que es un ensayo de 24 [ahora de 48] horas para determinar la concentración letal media (CL50) en nauplios de ínstares II y III. La confiabilidad y precisión de este ensayo fue investigada durante un extenso ejercicio de calibración involucrando a 80 laboratorios americanos y europeos, dando resultados muy satisfactorios (Persoone y Vanhaecke, 1981, citado en Artoxkit M, 1990). La experiencia obtenida desde entonces con el predecesor del presente Artoxkit ha abierto el camino para mejorar uno de los ensayos de tamizaje más sencillos, más reproducible y rentable en toxicología acuática (Artoxkit M, 1990). Un ejemplo de una aplicación de esta especie en farmacología es la prueba de letalidad para el pretamizaje de extractos de especies vegetales medicinales (Sam, 1993), p.ej., contra Trypanosoma cruzi (Zani et al., 1995). Se ha publicado mucha literatura al respecto correlacionando la actividad anti-Artemia contra otros patógenos humanos, pero no se incluye aquí. • Los cladóceros de agua dulce Daphnia magna, D. pulex y Ceriodaphnia dubia Los cladóceros representan el segundo suborden de los diplostracos branquiópodos. Se conocen comúnmente como pulgas de agua, y su representante más conocido es el género Daphnia. Además de algunas característica comunes a los branquiópodos, a continuación se mencionan algunas características específicas. Algunas especies de Daphnia pueden alimentarse de bacterias debido a la eficiencia de sus cerdas filtrantes.




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Usualmente son organismos transparentes en agua bien aireada pero pueden tornarse rosados en aguas estancadas, debido a la presencia de hemoglobina. Esta puede transferirse a los ovarios y huevos o el hierro resultante de la degradación de la hemoglobina puede ser excretado por glándulas especiales. Los brotes o ciclos poblacionales anuales de Daphnia no son previsibles y pueden ser monocíclicos, dicíclicos o acíclicos, según el lago o laguna (Barnes, 1984). Como los rotíferos y copépodos, los cladóceros son miembros ecológicamente importantes de las comunidades acuáticas. Daphnia magna y Ceriodaphnia dubia son los crustáceos de agua dulce más utilizados para determinar los efectos de sustancias xenobióticas en los consumidores primarios de ecosistemas dulceacuícolas (Ceriodaphtoxkit F, sin fecha). Los Toxkits utilizando Daphnia spp. siguen los lineamientos del método estándar OCDE 202 (que puede adaptarse a lineamientos de ISO, DIN, US-EPA y ASTM) (Daphtoxkit F magna, 1996; Daphtoxkit F pulex, 1996). Ceriodaphnia dubia es el organismo empleado en la prueba de toxicidad aguda de 24 h en el Ceriodaphtoxkit F. Este bioensayo se apega al método estándar de la USEPA (com. pers., MICROBIOTESTS, Inc., 2001). El Toxkit del bioensayo de toxicidad crónica con C. dubia está en sus etapas finales de desarrollo. Además, el uso de efipios de este organismo como fuente de material biológico, también está considerado en la propuesta de norma ISO/CD 20665, para el bioensayo estándar de toxicidad crónica (com. pres., MICROBIOTESTS, Inc., 2001). • El ostrácodo de agua dulce Heterocypris incongruens Los ostrácodos son crustáceos pequeños (menos de 1 mm hasta 3 cm) ampliamente distribuidos en el mar y todo tipo de aguas dulces. Su cuerpo está cubierto por un caparazón bivalvo que se mantiene cerrado por músculos (Barnes, 1984). La mayor parte de los ostrácodos viven cerca de los fondos de los cuerpos de agua, donde nadan intermitentemente o aran la capa superior de los sedimentos. Algunas especies viven asociadas a algas u otros animales (como comensales) y hay 2 especies terrestres. Su alimentación es diversa: herbívoros, carnívoros, carroñeros o filtradores, y las algas son un alimento común (Barnes, 1984). La partenogénesis es común en los Cyprinidae de agua dulce y hay especies en las que no existen machos. Los huevos son liberados al agua o depositados en alguna superficie (Barnes, 1984).




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El ostrácodo Heterocypris incongruens es utilizado en el Ostracodtoxkit F (2000). Este es el primer Toxkit de “contacto directo” para evaluar la toxicidad de sedimentos o suelos [y otras matrices sólidas o pastosas]. Es una prueba crónica de 6 días que determina la “toxicidad total” de los contaminantes disueltos (en el agua intersticial) y no disueltos (asociados a la materia sólida). La toxicidad es reflejada en la elongación corporal de los neonatos y la mortalidad (en comparación con un control estándar no tóxico). La susceptibilidad de este ensayo es comparable con la prueba de 10 días con el crustáceo amfípodo Hyallela azteca y es mucho más susceptible que el ensayo con larvas del díptero Chironomus riparius (Ostracodtoxkit F, 2000). Heterocypris incongruens es omnívoro (puede sobrevivir de algas, pequeños crustáceos y detritus orgánico), tiene una distribución mundial y puede encontrarse en hábitats bénticos de agua dulce en todos los continentes (Ostracodtoxkit F, 2000; Fryer, 1997). Más detalles sobre su biología y ecología pueden encontrarse en Fryer (1997). A continuación se presentan los aspectos más importantes de los Sistemas de Clasificación de la Contaminación y Eutroficación, mencionados anteriormente en este documento. Fueron traducidos y editados del documento original (FITA4 Programme, 2000). Sistema de clasificación de la contaminación Se proponen dos diferentes sistemas de evaluación/clasificación: uno para la determinación “bruta” del grado de contaminación tóxica de sistemas

acuáticos naturales, y - otro para la “cuantificación” de la toxicidad de desechos antes de ser vertidos a

ambientes acuáticos Ambos sistemas se basan en la aplicación de una batería de microbioensayos de corto tiempo de exposición (1-3 días). La batería está compuesta de especies experimentales pertenecientes a diferentes grupos filogenéticos, incluyendo [al menos] las siguientes categorías de biota: - Microalgas (Algaltoxkit F) (72h) - Protistas (Protoxkit F) (24h) - Rotíferos (Rotoxkit F acute) (24h) - Crustáceos (Daphtoxkit F magna (48 h) o Thamnotoxkit F (24 h)) Si es posible, esta batería debería ampliarse con un microbioensayo utilizando bacterias. NOTA: Debido al “corto” tiempo de exposición, las clasificaciones de riesgo/toxicidad expresan únicamente efectos “agudos”.




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Sistema de clasificación para aguas naturales Principio del sistema de clasificación Este sistema se basa en la determinación, en un paso, del riesgo de toxicidad aguda de aguas naturales con muestras no diluidas, utilizando una batería de microbioensayos. Sistema de evaluación El sistema de clasificación se basa en dos valores: 1. la jerarquización en 5 clases de riesgos de toxicidad aguda, y 2. en un punteo ponderado para cada clase de riesgo. Clases de riesgos agudos Después de la determinación del efecto porcentual (EP) obtenido con cada uno de los microbioensayos aplicados a muestras no diluidas, el agua analizada se coloca en uno de los 5 rangos de clases, basados en la más alta toxicidad encontrada en al menos uno de los ensayos efectuados. Estas clases son:

Clase I: no hay riesgo agudo = ninguno de los ensayos mostró efectos tóxicos (i.e., un efecto significativamente mayor que los controles)

- Clase II: riesgo agudo leve = un EP estadísticamente significativo se obtuvo en al menos un ensayo, pero el nivel de efecto es menor al 50%

NOTA:. Para determinar si el EP observado en la muestra de agua es significativamente diferente del EP en el control, se deben analizar los datos con un programa estadístico. Alternativamente, se puede utilizar el nivel de efecto del 20% como el EP más bajo con un efecto tóxico significativo.

- Clase III: riesgo agudo = el EP50 es alcanzado o excedido en por lo menos un ensayo, pero el nivel de efecto está por debajo del 100%

- Clase IV: riesgo agudo alto = el EP100 es alcanzado en por lo menos un ensayo - Clase V: riesgo agudo muy alto = el EP100 es alcanzado en todos los ensayos Punteos ponderados




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Un punteo ponderado se calcula para cada clase de riesgo para indicar la importancia cuantitativa (ponderación) de la toxicidad en esa clase. El punteo ponderado se expresa en %, en el rango de 25% (si sólo un ensayo en la batería alcanzó el nivel de toxicidad de esa clase) a 93 % (si todos los ensayos excepto uno alcanzaron el nivel de toxicidad para esa clase). NOTA: La base lógica para este punteo adicional es que mientras más alto el punteo ponderado, esto expresa un mayo riesgo de toxicidad del agua en la clase en cuestión. Cálculo de los punteos ponderados 1. Asignación del punteo de un ensayo para los resultados de efecto de cada microbioensayo de la batería. - Efecto tóxico no significativo = punteo 0 - Efecto tóxico significativo pero < EP50 = punteo 1 - > EP50, pero <EP100 = punteo 2 - EP100 = punteo 3 2. Cálculo de los punteos ponderados de clase Punteo ponderado de clase = ∑ punteos de todos los ensayos n donde n = número de ensayos efectuados. 3. Cálculo del punteo ponderado de clase en % Punteo ponderado de clase en % = Punteo de clase x 100 Punteo ponderado de clase máximo




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Ejemplo práctico Ensayo % efecto Punteo del ensayo

Bacterias < 20 0 Microalgas 35 1 Protistas 72 2 Rotíferos 60 2 Crustáceos 100 3

Clasificación: La muestra de agua del ejemplo pertenece a la clase IV (riesgo agudo alto), pues el nivel de efecto de 100% se obtuvo en al menos un ensayo (crustáceos). Punteo ponderado de clase: 0 + 1 + 2 + 2 + 3 = 8 = 1.6 5 5 Punteo ponderado de clase en %: 1.6 x 100 = 53% 3 COROLARIOS: 1. En caso que se utilicen 2 microbioensayos con crustáceos, sólo se deberá tomar en

cuenta para los cálculos el ensayo con el más alto valor de efecto. 2. Cuando se de un estímulo de crecimiento en vez de inhibición de crecimiento de

algas, los puntos se deben asignar al potencial de eutroficación del agua analizada, por tanto a un “riesgo indirecto.

Sistema de clasificación para desechos vertidos en ambientes acuáticos Principio del sistema de clasificación Determinación y cuantificación en dos pasos, de la toxicidad aguda de los desechos líquidos o lixiviados con una batería de microbioensayos. - En el primer paso, se determina la toxicidad de muestras no diluidas. - En el segundo paso, se efectúan pruebas de toxicidad en una serie de diluciones de

las muestras, con los microbioensayos que presentaron más de 50% de efecto con la muestra no diluida.




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Sistema de evaluación El sistema propuesto se basa en dos valores: una jerarquización de toxicidad aguda en 5 clases, y un punteo ponderado para cada clase de toxicidad. Clases de toxicidad aguda Los resultados de efectos obtenidos con cada microbioensayo se transforman en Unidades Tóxicas (UT) con la fórmula: UT = [1/CL50] x 100 (o [1/CE50] x 100) Las muestras se clasifican en una de las siguientes categorías, en base al número más alto de UT encontrado en uno de lo ensayos de la batería. - Clase I: no hay toxicidad aguda = ninguno de los ensayos presentó efectos tóxicos

(i.e., un valor de efecto significativamente más alto que en los controles) - Clase II: toxicidad aguda leve = el efecto porcentual observado en por lo menos un

ensayo de toxicidad es significativamente más alto que en el control, pero está por debajo del 50% (< 1 UT).

NOTA: Para determinar si el efecto porcentual observado en la muestra de desecho es significativamente diferente al control, se deberían analizar los datos con un programa estadístico. Alternativamente, se puede utilizar el un nivel de efecto del 20% como el EP más bajo que se considera que tiene un efecto tóxico significativo.

- Clase III: toxicidad aguda = la CL50 o CE50 es alcanzado o excedido en por lo

menos un ensayo, pero en la dilución 10x de la muestra, el efecto es menor que 50% ( = 1-10 UT)

- Clase IV: toxicidad aguda alta = la CL50 o CE50 es alcanzado en la dilución 10x en

por lo menos un ensayo, pero no en la dilución 100x ( = 10-100 UT) - Clase V: toxicidad aguda muy alta = la CL50 o CE50 es alcanzada en la dilución

100x en por lo menos un ensayo ( = >100 UT) Punteos ponderados Un punteo ponderado se calcula para cada ensayo de toxicidad para indicar la importancia cuantitativa (ponderación) de la toxicidad en esa clase. Este punteo ponderado se expresa en % y su rango va desde 25% (si sólo un ensayo en la batería alcanzó el nivel de toxicidad de esa clase) a 93% (si todos los ensayos, excepto uno, alcanzaron el nivel de toxicidad de esa clase).




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NOTA: El principio lógico para este segundo tipo de punteo es que, mientras más alto el punteo ponderado de clase, expresa un más alto el riesgo de toxicidad la muestra de desecho en la clase en cuestión. Cálculo de los punteos ponderados de clase 1. Asignación de un punteo de ensayo o de resultados del efecto de cada microbioensayo de la batería. - Efecto tóxico no significativo = punteo 0 - Efecto tóxico significativo, pero < L(E)C50 ( = < 1 UT) = punteo 1 - 1 - 10 UT = punteo 2 - 10 – 100 UT = punteo 3 - > 100 UT = punteo 4 2. Cálculo de los punteos ponderados de clase Punteo ponderado de clase = ∑ punteo de todos los ensayos n donde n = número de ensayos efectuados. 3. Cálculo del punteo ponderado de clase en % Punteo ponderado de clase (en %) = Punteo ponderado de clase x 100 Punteo máximo de clase Ejemplo práctico Ensayo UT Punteo del ensayo

Bacterias 12 3 Microalgas 2 2 Protistas < 1 1 Rotíferos 55 3 Crustáceos 27 3

Clasificación La muestra de agua de interés se clasifica en la clase IV (toxicidad aguda alta) porque el número de UT en la prueba más sensible se sitúa entre 10 y 100. Punteo ponderado de clase: 3 + 2 + 1 + 3 + 3 = 12 = 2.4




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5 5

Punteo ponderado de clase (en %): 2.4 x 100 = 80% 3 Sistema de clasificación del potencial eutroficante Antecedentes y base lógica La determinación del efecto tóxico de muestras contaminadas en “productores primarios” (plantas) suele llevarse a cabo con un bioensayo con microalgas midiéndose la “inhibición de crecimiento” después de 72 h. Regularmente se determina, sin embargo, que en vez de “inhibición de crecimiento” uno detecta “estímulo de crecimiento” de las algas. Este estímulo de crecimiento se debe a factores que provocan el “crecimiento adicional” de las algas en el “medio de cultivo” de las algas. Como las microalgas en el control se multiplican por un factor de al menos 16 veces durante el tiempo de exposición, el “medio de cultivo” de las algas no limita su crecimiento, por lo que la muestra analizada debe contener “compuestos adicionales que favorecen el crecimiento de las algas”. Estimulación del crecimiento más allá del crecimiento normal en los controles indica entonces un “potencial de eutroficación” de la muestra analizada, que es una forma “indirecta” de contaminación (por los aspectos básicos de la eutroficación de aguas naturales por explosiones poblacionales de algas y sus consecuencias). Como una extensión de esos sistemas de clasificación de “toxicidad”, se propone un sistema adicional de clasificación, para la detección y cuantificación del “potencial de eutroficación” de aguas naturales por un lado, y el de desechos descargados hacia el ambiente acuático por el otro. Observación importante: Los sistemas de clasificación de la eutroficación propuestos no necesitan análisis adicionales al microbioensayo Algaltoxkit que se efectúa junto con otros ensayos con Toxkits en el marco (por laboratorios específicos) del programa FITA4. Los sistemas de clasificación de la eutroficación se basan, de hecho, en un análisis y manejo de datos diferentes al de datos del Algaltoxkit F de muestras mostrando “estimulación de crecimiento” de algas en vez de “inhibición de crecimiento” de las mismas. [NOTA: Sin embargo, como el sistema de clasificación de la eutroficación no puede diferenciar si hay un efecto tóxico de inhibición leve aún cuando haya un efecto de crecimiento, se ha acordado aplicar este sistema cuando no se detecte toxicidad aguda




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en ninguno de los otros ensayos utilizados en la batería de ensayos del sistema de clasificación de la contaminación.] Sistema de clasificación para aguas naturales Principio del sistema de clasificación Este sistema se basa en la determinación del “porcentaje de estimulo de crecimiento de algas (ECA)”con el microbioensayo Algaltoxkit en muestras de agua no diluidas, en comparación al crecimiento obtenido en el control. El porcentaje de estimulación del crecimiento se calcula fácilmente de la siguiente manera:

% ECA = Ns – Nc x 100 Nc

donde Ns = número de algas en la muestra y Nc = número de algas en el control [después de 72 h de incubación]. Jerarquización de la muestra en clases de eutroficación Las aguas naturales analizadas pueden clasificarse en una de las 4 categorías siguientes de “potencial de eutroficación” en base a su % ECA: Clase I: sin potencial de eutroficación = no hay crecimiento (significativo) adicional en la muestra en comparación al control (el límite del “nivel de significancia” puede establecerse en 20% ECA) Clase II: potencial de eutroficación leve = se alcanza un % ECA estadísticamente significativo, pero el % está por abajo del 50% Clase III: potencial de eutroficación substancial = se alcanza o excede el 50% ECA pero el % extra de crecimiento de algas es menor que 100% Clase IV: potencial de eutroficación alto = el % ECA alcanza o excede el 100%. Indice de eutroficación para desechos vertidos en ambientes acuáticos Principio




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Este se basa en una determinación y cuantificación en “dos pasos” del potencial de eutroficación de desechos líquidos o lixiviados con el microbioensayo Algaltoxkit. • En el primer paso se determina el estímulo de crecimiento de algas (ECA) en muestras

no diluidas (como en el sistema de clasificación de la eutroficación para aguas naturales).

• En el segundo paso, se efectúan pruebas con el Algaltoxkit en una serie de diluciones con las muestras para las que se detectó más del 50% ECA en la muestra no diluida.

Sistema de evaluación – Unidades de Eutroficación El % ECA obtenido se transforma en “Unidades de Eutroficación” (UE) con la fórmula:

UE = (1 / 50% del nivel ECA*) x 100 * El 50% del nivel ECA es la dilución en la cual ocurre un 50% de estímulo de crecimiento de algas. Indice de Eutroficación El siguiente Indice para el potencial de eutroficación de muestras de desechos puede ser considerado: Indice 1: sin potencial de eutroficación = el % ECA no es significativo (e.g., menos de 20% de crecimiento adicional en el desecho no diluido) Indice 2: potencial de eutroficación leve = el % ECA es mayor al 20% pero menor que 50% en el desecho no diluido (< 1 UE) Indice 3: potencial de eutroficación sustancial = el % ECA es > 50% en la muestra no diluida, pero no alcanza el 50% en la muestra diluida 10 veces (1 – 10 UE) Indice 4: potencial de eutroficación muy alto = 50% ECA se alcanza en la muestra diluida 10 veces, pero no en la muestra diluida 100 veces (10 – 100 UE) Indice 5: potencial de eutroficación extremo = 50% ECA se alcanza o excede en la muestra diluida 100 veces (> 100 UE)




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