8/17/2019 Microscopio de Fluorescencia

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Microscopio de Fluorescencia 

INTRODUCCION

Microscopía de fluorescencia: Descubierto en 1908 por Köhler y Siedentopf, y se basa

en que una sustancia natural en las células o un colorante fluorescente aplicado al cortees estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la ener!a absorbida como rayos

luminosos"

Siendo escasas las moléculas autofluorescentes, su aplicaci#n m$s difundida es para

re%elar una fluorescencia areada, como en la detecci#n de ant!enos o anticuerpos"

&ambién se puede inyectar moléculas fluorescentes espec!ficas en un animal o

directamente en células y usarlas como marcadores"

Fluorocromos: 'ueden usarse directamente, apro%echando la propiedad de unirse a

determinadas moléculas u or$nulos" 'ero lo m$s habitual es que estos colorantes se

empleen con(uados a otras moléculas, como anticuerpos, que son capaces de unirse de

modo espec!fico a estructuras concretas de la célula" )lunos colorantes denominados

fluorocromos tienen la propiedad de ser e*citados +pasar a un ni%el superior de ener!a

cuando absorben luz ultra%ioleta +luz de lonitud de onda corta"

Problema: -a utilizaci#n de fluorocromos pierde randes intensidades de luz

empleadas, entonces no pueden obser%adas durante laros periodos de tiempo debido a

la desaparici#n de la fluorescencia"

Fluorescencia: ) medida que las moléculas e*citadas reresan a su estado normal

liberan el e*ceso de ener!a en forma de luz %isible de mayor lonitud de onda que la

radiaci#n e*citante" -os ob(etos fluorescentes aparecen brillantemente iluminados

contra un fondo oscuro, se.n el color del colorante usado"

Epifluorescencia: /oy d!a se utiliza mucho un microscopio de fluorescencia en el cualla luz es emitida desde arriba del preparado" 'or lo tanto, el ob(eti%o del microscopio

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act.a como lente iluminadora y de imaen"

CONSTITUCION FUNDMENT!:

Fuen"e luminosa +l$mpara de mercurio o hal#ena Debe emitir la mayor cantidad de

luz ultra%ioleta en el l!mite del espectro %isible, que atra%iesan el material de la

 preparaci#n de la misma forma en que lo hace un microscopio #ptico com.nOb#e"i$os: Suelen ser de cuarzo ya que el %idrio absorbe la radiaci#n ultra%ioleta"

Fil"ros: 2etienen la radiaci#n ultra%ioleta, pelirosa para el o(o humano, de(ando pasar

solamente la radiaci#n %isible, que no es pelirosa" 3*isten un ran n.mero de (ueos de

filtros de e*citaci#n y de emisi#n para los diferentes fluorocromos

%El de e&ci"aci'n: 4bicada entre la fuente de luz y el preparado" 'ermite el paso de

ondas de luz con lonitud que caia en el rano azul con el fin que el preparado sea

alcanzado e*clusi%amente por la luz azul y produzca emisi#n de luz fluorescente"

%El de barrera: 4bicada antes del ocular para pre%enir da5os retinianos que podr!an

ser causados por rayos ultra%ioleta que escapan el espe(o dicr#mico" 6orta

completamente la luz de e*citaci#n no deseada, es decir selecciona la lonitud de onda

de emisi#n del fluorocromo"%Espe#o Dicroico: 'ermite la separaci#n de la luz de e*citaci#n y la fluorescencia"

'osicionado en 7 respecto al e(e #ptico, la lonitud de onda m$s corta es refle(ada y la

lonitud de onda m$s lara lo atra%iesa"

COMPRCION CON MICROSCOPIO CON(ENCION!

3ste microscopio es similar al microscopio con%encional, a e*cepci#n de que la luz

incidente que procede de una potente fuente atra%iesa un primer filtro que selecciona la

lonitud de onda capaz de e*citar al fluorocromo"

:tra diferencia radica en que la luz de iluminaci#n +e*citaci#n no est$ in%olucrada en

la formaci#n de la imaen" 3n este sentido la microscop!a de fluorescencia difiere de la

microscop!a normal en la cual la imaen es formada por la luz de iluminaci#n"

FUNDMENTO FISICO

-a luz de una fuente de lonitud de onda m.ltiple se mue%e a tra%és de un filtro

e*citador que solo permite que pase la radiaci#n e*citada de la lonitud de onda

deseada" 3sta radiaci#n es refle(ada por el filtro dicrom$tico y enfocada por la lente del

ob(eti%o sobre la muestra, las moléculas fluorescentes de la muestra se e*citan y emiten

luz +por fluorescencia de una lonitud de onda espec!fica y mayor" 3sta luz es enfocada

 por el ob(eti%o y la mayor parte pasa a tra%és del filtro dicrom$tico y no se refle(a" 4n

filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de la radiaci#n de

e*citaci#n" 3(emplo

)* Primer fil"ro de e&ci"aci'n: selecciona la luz de la lonitud de onda incidente" 3n elesquema est$ seleccionando luz de lonitud de onda entre 70 y 790 nm +azul

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+* Espe#o dicroico: 2efle(a la luz de ciertas lonitudes de onda y de de(ar pasar otras"

3n este caso refle(a luz de lonitud de onda menos de 10 nm +por ello refle(a la luz

incidente azul y de(a pasar la luz de lonitud de onda superior a 10 nm, de(ando pasar

la luz %erde emitida por el fluorocromo"

,* Se-undo fil"ro de barrera: 3s el filtro que selecciona la luz de lonitud de onda

fluorescente" 3n este caso de(a pasar la luz de lonitud de onda ;0 a