Microscopia de contraste de fase
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Microscopia de Microscopia de contraste de fasecontraste de fase
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Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase Contraste: diferença de iluminação entre amostras e os arredores ou o plano de fundo.
LUZLUZ
absorçãoabsorção
Transmissão = Transmissão = luz + fluorescência – (absorção + refração luz + fluorescência – (absorção + refração + reflexão)+ reflexão)
reflexãoreflexão
fluorescênciafluorescência
refraçãorefração
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Tipos de contraste de faseTipos de contraste de fase1) 1) PositivoPositivo: amostra é mais escura do que o plano de fundo;: amostra é mais escura do que o plano de fundo;
2) 2) NegativoNegativo: amostra é mais clara do que o plano de fundo.: amostra é mais clara do que o plano de fundo.
EquaçãoEquação
I = intensidade de luz do campo (f) ou da amostra (a).I = intensidade de luz do campo (f) ou da amostra (a).
Contraste = (If - Ia) x 100 If
Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase
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Tipos de amostraTipos de amostra1) 1) AmplitudeAmplitude: alteram a intensidade da luz transmitida. Amostras transparentes coradas : alteram a intensidade da luz transmitida. Amostras transparentes coradas
causam o mesmo efeito.causam o mesmo efeito.
2) 2) FaseFase: não absorvem luz, mas causam mudança de fase nos comprimentos de onda que : não absorvem luz, mas causam mudança de fase nos comprimentos de onda que a atravessam.a atravessam.
Amostra transparente
Amostra tipo amplitude
Amostra tipo fase
Amostra tipo misto (maioria)
Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase
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Contraste em amostra Contraste em amostra com baixo retardo de fasecom baixo retardo de fase
Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase
- Os raios não desviados são - Os raios não desviados são retardados cerca de ¼ de l em retardados cerca de ¼ de l em relação aos raios não desviados;relação aos raios não desviados;- a diferença de intensidade de luz - a diferença de intensidade de luz não é percebida pelo olho humano não é percebida pelo olho humano (não dá contraste).(não dá contraste).
amostra
Distânciafocal
condensador
Lente do tubo
Plano da imagem
ocular
objetiva
Raios não desviados
Raios desviados
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O que o contraste de fase faz?O que o contraste de fase faz?1) 1) Contraste de fase positivoContraste de fase positivo
-- Acelera os raios não desviados em ¼ de Acelera os raios não desviados em ¼ de elevando a diferença de fase total para ½ de elevando a diferença de fase total para ½ de ;;
- a amostra fica - a amostra fica escura,escura, circundada por halo claro, sobre um fundo mais claro (menos claro que o halo). Dá contraste. circundada por halo claro, sobre um fundo mais claro (menos claro que o halo). Dá contraste.
2) 2) Contraste de fase negativoContraste de fase negativo
-- Retarda os raios não desviados em ¼ de Retarda os raios não desviados em ¼ de elevando a diferença de fase total para ½ de elevando a diferença de fase total para ½ de ;;
- a amostra fica - a amostra fica clara, clara, circundada por halo escuro, sobre um fundo mais escuro (menos escuro que o halo). Dá contraste.circundada por halo escuro, sobre um fundo mais escuro (menos escuro que o halo). Dá contraste.
Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase
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Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase
ConfiguraçãoConfiguração
objetiva
amostra
condensador
Raios desviados90º fora de fase
Não desviados
não desviados + 90º Raios desviados180º fora de fase
Anel de fase
Anel de fase
Trabalha-se nos planosTrabalha-se nos planosda imagem conoscópicada imagem conoscópica
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Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase
ConfiguraçãoConfiguração
Parte central do anel mais fina que a periferia
Contraste positivo
Parte central do anel mais fina que a periferia
Contraste negativo
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Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase
Dados técnicosDados técnicos1)1) AAcessórios obrigatórioscessórios obrigatórios: anel de fase para condensador e objetivas com anéis de : anel de fase para condensador e objetivas com anéis de
fase;fase;
2) 2) Acessório extraAcessório extra: filtro verde. Isto porque os o sistema é projetado para funcionar : filtro verde. Isto porque os o sistema é projetado para funcionar melhor no centro do espectro visível (cor verde).melhor no centro do espectro visível (cor verde).
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Técnicas e contrasteTécnicas e contraste
Amostra Técnica Contraste
Transparente Campo claro 2-5% Corada Campo claro 25%
Transparente Contraste de fase 15-20% Transparente Contraste diferencial
de interferência 15-20% Transparente Campo escuro 60-75% Transparente Fluorescência 60-75%
Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase
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Alinhamento dos anéis de faseAlinhamento dos anéis de fase- Usar telescópio de fase (o mesmo usado para ver a imagem conoscópica) para ver os anéis pela ocular;Usar telescópio de fase (o mesmo usado para ver a imagem conoscópica) para ver os anéis pela ocular;- Alinhar os anel do condensador movimentando os parafuso de ajuste no condensador próprio para a técnica;Alinhar os anel do condensador movimentando os parafuso de ajuste no condensador próprio para a técnica;- Sem alinhamento a técnica não funciona.Sem alinhamento a técnica não funciona.
Anéis não alinhados Anéis alinhados
Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase
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Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase
IndicaçõesIndicações- Amostras vivas ou fixadas não coradas;- Amostras vivas ou fixadas não coradas;
- Melhorar contraste para visualização de detalhes em - Melhorar contraste para visualização de detalhes em amostras coradas (ex.: estriações transversais de músculos)amostras coradas (ex.: estriações transversais de músculos)
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Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase
LimitaçõesLimitações
- os halos podem obscurecer os detalhes que circundam a amostra;os halos podem obscurecer os detalhes que circundam a amostra;
- os anéis de fase reduzem a resolução da objetiva;os anéis de fase reduzem a resolução da objetiva;
- não é adequada para amostras espessas.não é adequada para amostras espessas.
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Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase
Contraste de fase positivo Contraste de fase negativo
ImagensImagens- Células de ovário de hamster- Células de ovário de hamster
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Osso de dinossauro fossilizadocom quartzo no canal de HaversPreparo por desgaste
Contraste de fase Osso compacto humanoPreparo por desgaste
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Contraste de fase + coloraçãoAterosclerose (placa de colesterolna parede da artéria)
Contraste de fase + coloraçãoPneumonia brônquica
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Contraste de fase + HELíngua humana
Contraste de fase + HECartilagem hialina
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Contraste de fasePólen de plantasc
Contraste de fase + HENeurônio multipolar