EEE sss ccc ooo bbb aaa rrr CCC ,,, ÄÄÄ rrr iii aaa sss JJJ LLL MMM ooo nnn ooo ggg rrr ... EEE lll eee ccc ttt rrr ooo nnn ... PPP aaa ttt ooo lll ... VVV eee ttt ... 222 000 000 666 ;;; 333 ((( 111 ))) ::: 222 000 --- 333 222

20

Biomineralización: Una inspiración biomimética para el diseño de nuevos materiales de uso médico Biomineralization: a biomimetic inspiration for new biomedical material design Carla Escobar*, José Luís Arias Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile Centro para la Investigación Interdisciplinaria Avanzada en Ciencias de los Materiales (CIMAT) *cescobar@uchile.clFinanciado por FONDAP 11980002

ÍNDICE Resumen......................................................................................................................................................................................................................... 20 Abstract .......................................................................................................................................................................................................................... 21 Introducción ................................................................................................................................................................................................................... 21 Biomineralización.......................................................................................................................................................................................................... 22 Biomineralización y biomimética.................................................................................................................................................................................. 23 Discusión........................................................................................................................................................................................................................ 29 Conclusiones .................................................................................................................................................................................................................. 29 Referencias..................................................................................................................................................................................................................... 30

Resumen La naturaleza es capaz de crear estructuras con formas y propiedades mecánicas tan diversas como las conchas de moluscos y crustáceos, las cáscaras de huevos, los corales y las perlas utilizando un mismo compuesto inorgánico: carbonato de calcio. Las diferencias que existen entre estas estructuras fabricadas del mismo material se explican por el componente orgánico que cada una de ellas posee y que es capaz de regular y dirigir su formación. Además, estas estructuras presentan propiedades mecánicas excepcionales y son fabricadas de una manera energéticamente eficiente. Por esto ha surgido el deseo de imitar el proceso de fabricación de las biocerámicas en la síntesis de compuestos cerámicos, utilizando nuevos enfoques que permitan desarrollar compuestos con mejores propiedades mecánicas y estrategias de fabricación más eficientes, posibilitando nuevas aplicaciones. Esta monografía presentará algunos de los principios y de las aproximaciones biomiméticas que derivan de diversos estudios en materiales biocerámicos. También se mostrarán algunas aplicaciones biomédicas de los materiales inspirados en los procesos de biomineralización.

EEE sss ccc ooo bbb aaa rrr CCC ,,, ÁÁÁ rrr iii aaa sss JJJ LLL MMM ooo nnn ooo ggg rrr ... EEE lll eee ccc ttt rrr ooo nnn ... PPP aaa ttt ooo lll ... VVV eee ttt ... 222 000 000 666 ;;; 333 ((( 111 ))) ::: 222 000 --- 333 222

21

Abstract Nature is able to create structures with defined forms and mechanical properties as diverse as bones, spider silk, wood and biological membranes that perform in particularly efficient ways and have found no parallel in the laboratory. For example, mollusk’s and crustacean’s shells, eggshells, corals and pearls are made of the same compound: calcium carbonate. The differences among these structures made out of the same inorganic material are explained by the organic component that each one of them has, and which is able to regulate and direct their formation. Additionally, these structures display exceptional mechanical properties compared with the pure inorganic material and are fabricated in an energetic efficient way. For this reason some scientists intend to imitate the process of bioceramic formation for man made ceramic fabrication, using new approaches that allow the development of compounds with better mechanical properties and more efficient strategies of manufacture, making possible new applications. In this article a description of some principles derived from studies in bioceramic materials and biomimetic approaches developed is presented. Also, some biomedical applications of biomineralization-inspired materials are described. Palabras claves: biomineralización, biomimética, matriz extracelular Key words: biomineralization, biomimetic, extracellular matrix Introducción La naturaleza nos da, ya fabricados, muchos materiales como los huesos, la madera, la arena, las conchas de los moluscos, las telas de araña y las membranas biológicas que se comportan de una manera particularmente eficiente y que no han encontrado un paralelo en el laboratorio, por lo que existe el deseo de imitar los mecanismos que conducen a la formación de estos materiales. La biomimética consiste en la imitación en el laboratorio de algunos procesos biológicos mediante el examen de los conocimientos que la naturaleza nos brinda. Así, hay muchos científicos en el mundo que están dedicados a estudiar la estructura y los mecanismos de formación de estos compuestos, con el objetivo de desarrollar nuevos materiales, mediante estrategias de fabricación más eficientes y con propiedades optimizadas, para su posterior aplicación tanto en el área biomédica, como la ingeniería.

Por ejemplo, la tela de araña es un material de características excepcionales, que probablemente constituye la fibra natural de mayor resistencia mecánica en relación a su diámetro y que no tiene un equivalente sintético. Un hilo de tela de araña es capaz de soportar una tensión mucho mayor que una fibra de acero de igual grosor e incluso supera en algunas cualidades a la fibra orgánica llamada kevlar 49 de la casa Dupont, empleada en la fabricación de los chalecos antibalas y en los trajes de los desactivadores de explosivos (Hinman et al., 2000; Seidel et al., 2000; Gosline et al., 2002). Por esto, existe interés en estudiar cómo se forman estos hilos y sus propiedades: resistencia, deformabilidad, consistencia, durabilidad y soportabilidad a los cambios de temperatura, humedad y otras variables físicas. La idea es imitar el proceso natural de formación de esta fibra, consiguiendo un material de características mecánicas

EEE sss ccc ooo bbb aaa rrr CCC ,,, ÁÁÁ rrr iii aaa sss JJJ LLL MMM ooo nnn ooo ggg rrr ... EEE lll eee ccc ttt rrr ooo nnn ... PPP aaa ttt ooo lll ... VVV eee ttt ... 222 000 000 666 ;;; 333 ((( 111 ))) ::: 222 000 --- 333 222

22

mejoradas, que pueda ser utilizado en la fabricación de los chalecos antibalas y en los trajes de los desactivadores de explosivos, entre otras aplicaciones. Otro ejemplo lo constituyen los tejidos mineralizados formados por organismos vivos, como los huesos, dientes, conchas de moluscos y crustáceos, cáscaras de huevo, espículas, corales y perlas, entre otros, que se caracterizan por ser materiales compósitos, notablemente fuertes y tenaces, fabricados de una manera energéticamente eficiente, a partir de compuestos comunes como CaCO3, Ca2(OH)PO4, FeO(OH), SiO2, Fe3O4, etc. (Lowenstam y Weiner, 1989; Mann et al., 1989; Simkiss y Wilbur, 1989; Suga y Nakahara, 1991; Heuer et al., 1992; Slavkin y Price, 1992; Weiner, 1997), por lo que han sido objeto de numerosos estudios con el deseo de imitar sus mecanismos de formación. Esta monografía presentará algunos de los principios y de las aproximaciones biomiméticas que derivan de diversos estudios en materiales biocerámicos. También se mostrarán algunas aplicaciones biomédicas de los materiales inspirados en los procesos de biomineralización. Biomineralización En la naturaleza, los organismos vivos desarrollaron un tipo de química que conduce a la síntesis y construcción de materias duras y blandas para el diseño de materiales funcionales inorgánicos-orgánicos (Mann, 2001). El proceso que da origen a estas estructuras biológicas de base inorgánica es conocido como biomineralización. Hay antecedentes que indican que este proceso se encuentra presente en la tierra desde hace 3.500 millones de años (la tierra

tiene aproximadamente 4.200 millones de años) (Mann, 2001). Durante este tiempo, ha habido una rápida proliferación en el número y tipos de conchas o caparazones y microesqueletos hechos de minerales como carbonato de calcio, fosfato de calcio o sílica, lo que ha tenido implicancias de gran alcance a escala global. La biomineralización es, por lo tanto, un proceso que tiene importancia en el contexto de muchas áreas de las ciencias de la tierra como el ciclo global de los elementos, la sedimentología, la fosilización (paleontología y taxonomía), la química marina y la geoquímica. La biomineralización ha provisto a los organismos de un material de construcción híbrido inorgánico-orgánico o biocompósito con propiedades mecánicas particulares debido a la unión cooperativa de las propiedades particulares de los materiales orgánicos y los inorgánicos, lo que otorga ventajas desde el punto de vista de las propiedades mecánicas y la conservación de energía (Mann, 2001). De este modo, los organismos vivos forman tejidos duros como los huesos, dientes, cáscaras de huevos, conchas de moluscos y crustáceos, espículas, corales, perlas, etc. Estas estructuras biomineralizadas brindan soporte estructural y fuerza mecánica, además de constituirse en herramientas para desarrollar funciones biológicas como la protección, locomoción, alimentación, flotación, percepción óptica, magnética y de gravedad, almacenaje, etc (Mann, 2001). La característica principal de este proceso es la participación de células especializadas que producen un componente orgánico, conocido como matriz orgánica, que regula el lugar, el

EEE sss ccc ooo bbb aaa rrr CCC ,,, ÁÁÁ rrr iii aaa sss JJJ LLL MMM ooo nnn ooo ggg rrr ... EEE lll eee ccc ttt rrr ooo nnn ... PPP aaa ttt ooo lll ... VVV eee ttt ... 222 000 000 666 ;;; 333 ((( 111 ))) ::: 222 000 --- 333 222

23

momento y el modo en que la mineralización ocurrirá, controlando la nucleación, agregación y crecimiento cristalino, de modo que se forman biocompósitos cerámicos consistentes en capas de pequeñas cantidades de macromoléculas orgánicas, con fases inorgánicas, ricas en calcio (Lowenstam y Weiner, 1989; Mann, 2001; Arias y Fernández, 2003), lo que involucra la extracción selectiva de los elementos desde el ambiente local y su incorporación en estas estructuras funcionales, bajo un estricto control biológico (Mann, 2001). En las últimas dos décadas, el enfoque de los estudios en biomineralización ha cambiado hacia una perspectiva química, primero como una nueva rama de la química bioinorgánica y recientemente como una importante materia del emergente campo de la química de materiales biomiméticos. El propósito de la investigación de la biomineralización en el contexto de la química bioinorgánica incluye: la caracterización estructural y composicional de los biominerales, la comprensión de las propiedades funcionales de los biominerales y la dilucidación de los procesos a través de los cuales macromoléculas y estructuras orgánicas controlan la síntesis, construcción y organización de los materiales inorgánicos de base mineral (Mann, 2001). Biomineralización y biomimética Como ya se mencionó, en los últimos años ha habido un creciente interés en los principios que gobiernan la composición, arquitectura y métodos de ensamblaje de una variedad de cerámicas biológicas como huesos, dientes, conchas de moluscos y crustáceos y cáscaras de huevos. Mucho de este interés radica en el deseo de crear nuevas cerámicas sintéticas, imitando el proceso de formación de las biocerámicas,

proveyendo el potencial para enfoques alternativos para la síntesis de polvos, formación de películas delgadas y procesos novedosos de generación de estructuras de formas variadas (Mann et al., 1989; Simkiss y Wilbur, 1989; Suga y Nakahara, 1991; Heuer et al., 1992; Slavkin y Price, 1992; Weiner, 1997). Mediante diversas técnicas se ha estudiado en distintos modelos de mineralización, como la cáscara del huevo y conchas de moluscos y crustáceos, las interacciones célula-concha, la microestructura cristalina del componente inorgánico, la localización de macromoléculas particulares y la capacidad de distintas macromoléculas de afectar la cristalización. Así se ha logrado establecer que el proceso de formación de estos compósitos inorgánico-orgánicos es finamente controlado por el componente orgánico presente en pequeñas cantidades, lo que resulta en formación de partículas de tamaño uniforme, nueva morfología de los cristales, orientaciones cristalográficas específicas e interesantes propiedades (Lowenstam y Weiner, 1989; Simkiss y Wilbur, 1989; Belcher et al., 1996; Falini et al., 1996; Weiner, 1997; Nys et al., 1999; Mann, 2001; Orme et al., 2001). Por ejemplo, en nuestro laboratorio hemos visto que la cáscara del huevo tiene cuatro capas que se forman durante el paso del huevo por el oviducto (Heuer et al., 1992; Arias et al., 1993). Asociado a la formación de cada una de estas capas existen macromoléculas orgánicas, como proteínas y proteoglicanos, que participan en el control y regulación del proceso de formación de la cáscara. Una de ellas es el colágeno tipo X, presente en las fibras de las membranas de la cáscara que corresponden a la capa más

EEE sss ccc ooo bbb aaa rrr CCC ,,, ÁÁÁ rrr iii aaa sss JJJ LLL MMM ooo nnn ooo ggg rrr ... EEE lll eee ccc ttt rrr ooo nnn ... PPP aaa ttt ooo lll ... VVV eee ttt ... 222 000 000 666 ;;; 333 ((( 111 ))) ::: 222 000 --- 333 222

24

interna no mineralizada y que actúa como un sustrato para el depósito de la siguiente capa (Arias et al., 1991a; Arias et al., 1997). Otra molécula que participa en este proceso es un proteoglicano de queratán sulfato (mamilán) que se encuentra en las mamilas, conglomerados orgánicos que actúan como centros de nucleación y forman la segunda capa de la cáscara (Arias et al., 1992; Fernández et al., 1997; Fernández et al., 2001). En la siguiente capa, la capa en empalizada, existe un proteoglicano de dermatán sulfato llamado ovoglicán que afecta la morfología y orientación de los cristales de calcita (Fernández et al., 1997; Fernández et al., 2001). Finalmente, hemos identificado proteínas, como la osteopontina, que parecen estar relacionadas con la detención de la mineralización y la formación de la cuarta capa de la cáscara llamada cutícula (Nys et al., 1999; Fernández et al., 2003). Las conchas de los moluscos presentan una capa de cristales prismáticos de calcita y/o una capa de cristales de aragonita dispuestos como una pared de ladrillos (capa de nácar) (Lowenstam y Weiner, 1989; Simkiss y Wilbur, 1989; Mann, 2001). También se han descrito macromoléculas orgánicas que controlan su polimorfismo (Belcher et al., 1996; Falini et al., 1996; Feng et al., 2000). La nucleación de los cristales ocurre sobre una hoja orgánica, que posiblemente corresponde a β-quitina, cubierta por proteínas hidrofílicas ricas en aspartato y el crecimiento cristalino ocurre asociado a un gel rico en proteínas acídicas (Falini et al., 1996; Levi-Kalisman et al., 2001). La detención de la mineralización es regulada por la secreción de macromoléculas hidrofóbicas como las que forman el

periostraco o el andamiaje de la capa de nácar (Arias y Fernández, 2003). La concha del picoroco está compuesta por capas de cristales de calcita que quedan entre hojas de quitina cubiertas por proteoglicanos de queratán sulfato, que probablemente actúa como punto de nucleación (Fernández et al., 2002). El crecimiento cristalino ocurre en un gel polianiónico de proteoglicanos de dermatán sulfato y condroitín 4 sulfato (Fernández et al., 2002). La detención de la mineralización ocurre por el depósito de una nueva hoja de quitina (Arias y Fernández, 2003). Además, en el laboratorio hemos determinado la universalidad del rol de proteoglicanos en el proceso de biomineralización (Arias et al., 2004) y estamos estudiando el proceso de formación de biocerámicas patológicas como los cálculos urinarios, para compararlo con la formación de las biocerámicas ya estudiadas. Preliminarmente hemos visto que los cálculos urinarios tienen queratán sulfato y condroitín 4 sulfato (figura 1) y estamos evaluando el efecto de las moléculas sulfatadas sobre la cristalización del oxalato de calcio in vitro (figura 2) (datos no publicados).

EEE sss ccc ooo bbb aaa rrr CCC ,,, ÁÁÁ rrr iii aaa sss JJJ LLL MMM ooo nnn ooo ggg rrr ... EEE lll eee ccc ttt rrr ooo nnn ... PPP aaa ttt ooo lll ... VVV eee ttt ... 222 000 000 666 ;;; 333 ((( 111 ))) ::: 222 000 --- 333 222

25

Figura 1. Reacción de inmunoperoxidasa en cálculo canino de estruvita. a) reacción positiva a condroitín 4 sulfato con el anticuerpo monoclonal 2B6 y b) reacción positiva a queratán sulfato con el anticuerpo monoclonal 5D4. Barra = 50 µm.

Figura 2. Microscopía electrónica de barrido de una mineralización in vitro de oxalato de calcio en presencia (DS/R) o ausencia (control) de dermatán sulfato. Se puede observar que la presencia de la molécula sulfatada estabiliza el polimorfo termodinámicamente menos estable del oxalato de calcio (COD). Barra = 20 µm.

EEE sss ccc ooo bbb aaa rrr CCC ,,, ÁÁÁ rrr iii aaa sss JJJ LLL MMM ooo nnn ooo ggg rrr ... EEE lll eee ccc ttt rrr ooo nnn ... PPP aaa ttt ooo lll ... VVV eee ttt ... 222 000 000 666 ;;; 333 ((( 111 ))) ::: 222 000 --- 333 222

26

Figura 3. Esquema del modelo de biomineralización propuesto por Arias y Fernández (2003). El depósito de la fase cristalina durante el proceso de biomineralización es regulado por el componente orgánico producido por células, que es depositado en etapas: Fabricación de un sustrato inerte que puede ser quitina o colágeno X, sobre el que se depositan macromoléculas polianiónicas que actúan como centros de nucleación, luego se secreta un gel compuesto por proteínas acídicas o proteoglicanos, que controla el crecimiento de la fase cristalina. La mineralización se detiene por el depósito de una capa de proteínas hidrofóbicas o inhibitorias particulares o de una capa de sustrato inerte que permite la repetición de un nuevo ciclo.

EEE sss ccc ooo bbb aaa rrr CCC ,,, ÁÁÁ rrr iii aaa sss JJJ LLL MMM ooo nnn ooo ggg rrr ... EEE lll eee ccc ttt rrr ooo nnn ... PPP aaa ttt ooo lll ... VVV eee ttt ... 222 000 000 666 ;;; 333 ((( 111 ))) ::: 222 000 --- 333 222

27

De la información que se ha obtenido y del estudio comparativo de los distintos modelos, se ha propuesto un mecanismo de cuatro etapas para describir el proceso de biomineralización (figura 3). La primera consiste en la fabricación de un sustrato laminar inerte que compartimentaliza un microambiente en el que ocurrirá la mineralización. La segunda etapa es la síntesis de macromoléculas polianiónicas particulares, como proteínas ricas en aspartato o glutamato o proteoglicanos ricos en queratán sulfato, las que se depositan sobre el sustrato inerte previamente formado y donde la nucleación de cristales de calcio tiene lugar. La tercera etapa consiste en la fabricación de un gel compuesto por proteínas acídicas parecidas a las que se encuentran en la seda o proteoglicanos de dermatán sulfato. Este gel controla el polimorfismo, la difusión del crecimiento, la tasa de crecimiento de las distintas caras del cristal y la forma del cristal recién formado. La cuarta etapa corresponde a la detención de la formación de cristales y está asociada a la síntesis de un nuevo sustrato inerte o al depósito de proteínas hidrofóbicas o inhibitorias particulares, como la osteopontina (Arias y Fernández, 2003; Fernández et al., 2003). La elaboración de este modelo de biomineralización abre una puerta para desarrollar tecnologías modernas con nuevas aproximaciones para la fabricación de materiales cristalinos de formas complejas y nuevas propiedades. Utilizando el diseño de materiales inspirado en los procesos biológicos se ha logrado la producción de compósitos avanzados con propiedades optimizadas (Veis, 1982; Arias y et al., 1991b; Calvert, 1992; Wu et al., 1992; Burdon y Calvert, 1994; Mann, 1997;

Wang et al., 1997; Tang et al., 2003). Es así como recientemente Tang et al. (2003) han desarrollado películas delgadas de nácar nanoestructurado artificialmente, mediante la incorporación alternada de polvos de tiza y polímeros sintéticos. El estudio de la biomineralización ha generado principios que rigen el proceso y que pueden ser usados como punto de partida para el desarrollo de estrategias análogas en la síntesis de materiales inorgánicos. Por ejemplo el uso de ensamblajes supramoleculares previo a la biomineralización está inspirando ideas basadas en el confinamiento espacial de reacciones químicas y sus productos materiales. De un modo semejante, el concepto de reconocimiento molecular de la interfase está motivando a muchos científicos a la búsqueda de sistemas sintéticos análogos en los que superficies orgánicas funcionales sean usadas en el control de la nucleación y arquitectura dirigidas por un molde en varias escalas. Del mismo modo, la regulación vectorial de la morfogénesis y de los patrones de formación de los biominerales, está estimulando aproximaciones a la morfosíntesis de materiales inorgánicos de formas complejas. Finalmente, nociones del procesamiento multinivel en la tectónica de los biominerales están relacionadas al desarrollo de estrategias para la construcción química de estructuras organizadas desde bloques de construcción preformados como las nanopartículas inorgánicas. Está aproximación es conocida como tectónica cristalina (Mann et al., 1986; Mann, 1993; Aksay et al., 1996; Mann y Ozin, 1996; Mann et al., 1997; Mann, 2001).

EEE sss ccc ooo bbb aaa rrr CCC ,,, ÁÁÁ rrr iii aaa sss JJJ LLL MMM ooo nnn ooo ggg rrr ... EEE lll eee ccc ttt rrr ooo nnn ... PPP aaa ttt ooo lll ... VVV eee ttt ... 222 000 000 666 ;;; 333 ((( 111 ))) ::: 222 000 --- 333 222

28

Mediante el uso de las aproximaciones biomiméticas es posible crear biomateriales, aquellos materiales implantables en el cuerpo humano destinados a evaluar, tratar, aumentar, sustituir o reparar tejidos, órganos o funciones del organismo. Actualmente el objetivo de los científicos se centra en la ingeniería de tejidos, es decir, en el diseño de materiales que cumplan en sí mismos algún tipo de función biológica. Esto implica aprovechar el conocimiento de la biología celular y la biología molecular, para saber cómo interactúa la célula con su entorno. Este conocimiento puede permitir a los científicos controlar el crecimiento y la proliferación de células sobre un sustrato, y por lo tanto, poder elaborar in vitro, tejidos que se podrán implantar en el paciente y que serán tratados por el organismo como propios (Griffith y Naughton, 2002; Hench y Polak, 2002). La liberación controlada de fármacos es otro de los objetivos científicos en el campo de los biomateriales. Los científicos trabajan para diseñar materiales que puedan traer asociado química o físicamente un fármaco específico para suministrarlo a un punto determinado del organismo. Por lo tanto, es posible diseñar un material que pueda interactuar fácilmente con las células o tejidos que se quieren tratar, por ejemplo siendo biodegradable en el ambiente biológico donde se quiere que actúe. Esto puede significar incluso en el interior de la célula (Hench y Polak, 2002). Para conseguir todos estos objetivos, los científicos apuestan por las nanotecnologías, que permiten tratar los materiales a nivel molecular y pueden ayudar a resolver en este ámbito, muchos problemas no resueltos

hasta ahora. Las nanotecnologías pueden permitir ensamblar moléculas como lo hacen los tejidos naturales y, por lo tanto, pueden ayudar a controlar la elaboración de tejidos idénticos a los naturales por la vía biomimética (Mann, 1993; Aksay et al., 1996; Mann y Ozin, 1996). Por ejemplo, hay investigadores que trabajan en la elaboración de materiales biodegradables como cementos óseos de fosfatos de calcio, vidrios solubles y materiales compósitos, que sirvan como andamio para el cultivo de células en ingeniería de tejidos. También se trabaja en la modificación de superficies metálicas de titanio, para que sean bioactivas y sobre las cuales pueda crecer tejido óseo sano, la idea es conseguir crear una capa de material idéntico al del hueso sobre la superficie metálica que permita el crecimiento de este tejido cuando se implanta. Otros estudios se centran en el diseño de materiales con memoria de forma para aplicaciones óseas, dentales y maxilofaciales. También se trabaja en la simulación por computador de tejidos y prótesis, así como de su crecimiento. En esta línea, el Centro para la Investigación Interdisciplinaria Avanzada en Ciencias de los Materiales (CIMAT) de la Universidad de Chile, mediante el Programa de Materiales Biocerámicos, está estudiando los mecanismos que operan en el proceso de formación de las biocerámicas, para establecer principios generales que permitan sintetizar cerámicas artificiales con propiedades específicas, imitando los procesos biológicos. Los principales proyectos en ejecución de este programa son:

EEE sss ccc ooo bbb aaa rrr CCC ,,, ÁÁÁ rrr iii aaa sss JJJ LLL MMM ooo nnn ooo ggg rrr ... EEE lll eee ccc ttt rrr ooo nnn ... PPP aaa ttt ooo lll ... VVV eee ttt ... 222 000 000 666 ;;; 333 ((( 111 ))) ::: 222 000 --- 333 222

29

• Caracterización de las propiedades mecánicas de las biocerámicas

• Estudio de la mineralización controlada por células

• Aislamiento y caracterización de las propiedades funcionales y naturales de las macromoléculas involucradas en procesos de biomineralización

• Fabricación de matrices naturales o reconstituidas

Discusión Si bien, hoy existen muchos científicos que realizan importantes esfuerzos encaminados a estudiar y comprender la biomineralización, aun no se entiende bien cómo ocurren estos procesos y mediante qué vías las macromoléculas orgánicas regulan estos fenómenos. Por esto es necesario encaminar los esfuerzos a diseñar experimentos que permitan dilucidar efectivamente los mecanismos por los cuales las macromoléculas orgánicas son capaces de controlar la nucleación y crecimiento de la fase cristalina de las biocerámicas. Sin embargo, conocer el efecto de distintas macromoléculas por separado no es suficiente para entender como ellas influyen en el proceso de biomineralización, ya que en los sistemas biológicos ellas actúan en conjunto y en un orden espaciotemporal específico, por lo tanto, también es necesario diseñar experimentos que permitan evaluar el efecto cooperativo, espacial y temporal, de las distintas macromoléculas orgánicas que se encuentran presentes en las estructuras biomineralizadas. Una vez que se haya establecido esto, es necesario idear rutas mediante las cuales se pueda imitar este proceso, generando nucleación y crecimiento de fases

inorgánicas distintas y novedosas, que puedan ser utilizadas en una amplia gama de aplicaciones industriales y biomédicas. Conclusiones Eventos de mineralización biológica son los responsables de la formación de gran variedad de biocerámicas, a menudo materiales compuestos y nanoestructurados con magníficas propiedades mecánicas. Estos son formados en una serie de reacciones controladas por células que proveen la fábrica para la deposición mineral, el medio para almacenar y concentrar mineral y la catálisis para controlar la formación y destrucción de las matrices en las cuales el proceso de mineralización tiene lugar. Esto es logrado combinando fases orgánicas con redes cristalinas inorgánicas. Adicionalmente, esta red celular regula la tasa de formación cristalina controlando el microambiente en que estos procesos de mineralización ocurren, es decir, regulando el lugar, el momento y el modo en que la mineralización ocurrirá. Un detalle muy importante es que estas células realizan todos estos procesos a temperaturas y presiones relativamente bajas. Materiales con características mecánicas y estructurales similares a las de las biocerámicas pueden ser manufacturadas comercialmente por el hombre, pero usualmente a temperaturas muy elevadas, 1.500 a 2.000 °C. Desde el punto de vista de conservación de energía o de una perspectiva tecnológica, surge entonces la pregunta de si se pueden formar estas sustancias extremadamente duras a temperaturas bajas, siguiendo los principios adquiridos de la evolución biológica, como en el caso de procesos de formación de

EEE sss ccc ooo bbb aaa rrr CCC ,,, ÁÁÁ rrr iii aaa sss JJJ LLL MMM ooo nnn ooo ggg rrr ... EEE lll eee ccc ttt rrr ooo nnn ... PPP aaa ttt ooo lll ... VVV eee ttt ... 222 000 000 666 ;;; 333 ((( 111 ))) ::: 222 000 --- 333 222

30

tejidos duros regulados por células. Las características de procesos de fabricación a bajas temperaturas de materiales duros también permitirían la inclusión de moléculas orgánicas que podrían mejorar drásticamente las propiedades mecánicas de tales materiales cerámicos. Estos compuestos no sobrevivirían a las altas temperaturas usualmente utilizadas en los procesos ordinarios de formación de las cerámicas. Por último, la generación bioinspirada a baja temperatura de compuestos cerámicos podría dar lugar a materiales con propiedades físicas y mecánicas difíciles de lograr bajo las metodologías de fabricación actuales, lo que abre caminos para utilizar estos compuestos en nuevas aplicaciones. Para lograr esto, es necesario concentrar los esfuerzos de investigación en establecer cómo actúan las macromoléculas orgánicas para regular el proceso de mineralización que ocurre durante la formación de las biocerámicas naturales. Referencias Aksay IA, Trau M, Manne S, Honma I, Yao N, Zhou L, Fenter PM, Eisenberger PM, Gruner SM. Biomimetic pathways for assembling inorganic thin films. Science 1996; 273:892-898. Arias JL, Fernández MS. Biomimetic processes through the study of mineralized shells. Mat Charact 2003; 50:189-195. Arias JL, Fernández MS, Dennis JE, Caplan AI. Collagens of the chicken eggshells membranes. Connect Tissue Res 1991a; 26:37-45. Arias JL, Fernández MS, Laraia VJ, Heuer HA, Janicki J, Caplan AI. The

avian eggshell as a model of biomineralization. En: Materials Synthesis Based on Biological Processes. (eds. M. Alper, P.D. Calvert, R. Frankel, P.C. Rieke, D.A Tirrel). Material Res Soc Symp Proc 1991b; 218:193-201. Arias JL, Carrino DA, Fernández MS, Rodríguez JP, Dennis JE, Caplan AI. Partial biochemical and immunochemical characterization of avian eggshell extracellular matrices. Arch Biochem Biophys 1992; 298:293-302. Arias JL, Fink DJ, Xiao SQ, Heuer HA, Caplan AI. Biomineralization and eggshells: cell-mediated acellular compartments of mineralized extracellular matrix. Inter Rev Cytol 1993; 145:217-250. Arias JL, Nakamura O, Fernández MS, Wu JJ, Knigge P, Eyre DR, Caplan AI. Role of type X collagen on experimental mineralization of eggshell membranes. Connect Tissue Res 1997; 36:21-33. Arias JL, Neira-Carrillo A, Arias JI, Escobar C, Bodero M, David M, Fernández MS. Sulfated polymers in biological mineralization: a plausible source for bio-inspired engineering. J Mat Chem 2004; 14:1-8. Belcher AM, Wu XH, Christensen RJ, Hansma PK, Stucky GD, Morse DE. Control of crystal phase switching and orientation by soluble mollusc-shell proteins. Nature 1996; 381:56-58. Burdon J, Calvert P. Nanosized ceramic powders and polymer-ceramic composites by biomimetic routes. Elsevier Science BV 1994, pp. 1537-1541.

EEE sss ccc ooo bbb aaa rrr CCC ,,, ÁÁÁ rrr iii aaa sss JJJ LLL MMM ooo nnn ooo ggg rrr ... EEE lll eee ccc ttt rrr ooo nnn ... PPP aaa ttt ooo lll ... VVV eee ttt ... 222 000 000 666 ;;; 333 ((( 111 ))) ::: 222 000 --- 333 222

31

Calvert P. Biomimetic ceramics: What, why and how? Materials Res Soc 1992, pp. 539-546. Falini G, Albeck S, Weiner S, Addadi L. Control of aragonite or calcite polymorphism by mollusk shell macromolecules. Science 1996; 271:67-69. Feng QL, Pu G, Pei Y, Cui FZ, Li HD, Kim TM. Polymorph and morphology of calcium carbonate crystals induced by proteins extracted from mollusk shell. J Cryst Growth 2000; 216:459-465. Fernández MS, Araya M, Arias JL. Eggshells are shaped by a precise spatio-temporal arrangement of sequentially deposited macromolecules. Matrix Biol 1997; 16:13-20 Fernández MS, Moya A, López L, Arias JL. Secretion pattern, ultrastructural localization and function of extracellular matrix molecules involved in eggshell formation. Matrix Biol 2001; 19:793-803 Fernández MS, Vergara I, Oyarzún A, Arias JI, Rodríguez R, Wiff JP, Fuenzalida VM, Arias JL. Extracellular matrix molecules involved in barnacle shell mineralization. Mater Res Soc Symp Proc 2002; 724:3-9. Fernández MS, Escobar C, Lavelin I, Pines M, Arias JL. Localization of osteopontin in the oviduct tissue and eggshell during different stages of the avian egg laying cycle. J Struct Biol 2003; 143:171-180. Gosline J, Lillie M, Carrington E, Guerette P, Ortlepp C, Savage K. Elastic

proteins: biological roles and mechanical properties. Phil Trans R Soc Lond B 2002; 357:121-132. Griffith LG, Naughton G. Tissue engineering-current challenges and expanding opportunities. Science 2002; 295:1009-1014. Hench LL, Polak JM. Third-generation biomedical materials. Science 2002; 295:1014-1017. Heuer AH, Fink DJ, Laraia VJ, Arias JL, Calvert PD, Kendall K, Messing GL, Rieke PC, Thompson DH, Wheeler AP, Veis A, Caplan AI. Innovative materials processing strategies: A biomimetic approach. Science 1992; 255:1098-1105. Hinman MB, Jones JA, Lewis RV. Synthetic spider silk: a modular fiber. Tibtech 2000; 18:374-379. Levi-Kalisman Y, Falini G, Addadi L, Weiner S. Structure of the nacreous organic matrix of a bivalve mollusk shell examined in the hydrated state using cryo-TEM. J Struct Biol 2001; 135:8-17. Lowenstam HA, Weiner S. On Biomineralization. Oxford University Press, New York, 1989, 324 pp. Mann S. Molecular tectonics in biomineralization and biomimetics materials chemistry. Nature 1993; 365:499-505. Mann S. The biomimetics of enamel: a paradigm for organized biomaterials synthesis. Ciba Found Symp 1997; 205:261-274.

EEE sss ccc ooo bbb aaa rrr CCC ,,, ÁÁÁ rrr iii aaa sss JJJ LLL MMM ooo nnn ooo ggg rrr ... EEE lll eee ccc ttt rrr ooo nnn ... PPP aaa ttt ooo lll ... VVV eee ttt ... 222 000 000 666 ;;; 333 ((( 111 ))) ::: 222 000 --- 333 222

32

Mann S. Biomineralization principles and concepts in bioinorganic materials chemistry. Oxford University Press, UK, 2001, 198 pp. Mann S, Ozin GA. Synthesis of inorganic materials with complex form. Nature 1996; 382:313-318. Mann S, Hannington JP, Williams RJP. Phospholipid vesicles as a model system for biomineralization. Nature 1986; 324:565-567. Mann S, Webb J, Williams RJP. Biomineralization. VCH Publishers, New York, 1989, 490 pp. Mann S, Burkett SL, Davis SA, Fowler CE, Mendelson NH, Sims SD, Walsh D, Whilton NT. Sol-gel synthesis of organized matter. Chem Mater 1997; 9:2300-2310. Nys Y, Hincke MT, Arias JL, Garcia-Ruiz JM, Solomon SE. Avian eggshell mineralization. Poult Avian Biol Rev 1999; 10:142-166. Orme C, Noy A, Wierzbicki A, Mcbride MT, Grantham M, Teng HH, Dove PM, De Yoreo JJ. Formation of chiral morphologies through selective binding of amino acids to calcite surface steps. Nature 2001; 411:775-779. Seidel A, Liivak O, Calve S, Adaska J, Ji G, Yang Z, Grubb D, Zax DB, Jelinski LW. Regenerated spider silk: processing, properties and structure. Macromolecules 2000; 33:775-780.

Simkiss K, Wilbur KM. Biomineralization: cell biology and mineral deposition. Academic Press, San Diego, 1989, 337 pp. Slavkin H, Price P. Chemistry and Biology of Mineralized Tissues. Experta Medica, Amsterdam, 1992, 550 pp. Suga S, Nakahara H. Mechanisms and Phylogeny of Mineralization in Biological Systems. Springer Verlag, Japan, 1991, 517 pp. Tang Z, Kotov NA, Magonov S, Ozturk B. Nanostructured artificial nacre. Nature Mat 2003; 2:413-418. Veis A. Chemistry and Biology of Mineralized Connective Tissues. Elsevier/North Holland, New York, 1981, 680 pp. Wang RZ, Addadi L, Weiner S. Design strategies of sea urchin teeth: structure, composition and micromechanical relations to function. Philos Trans R Soc B Biol Sci 1997; 352:469-480. Weiner S, Addadi L. Design strategies in mineralized biological materials. J Material Chem 1997; 7:689-702. Wu TM, Fink DJ, Arias JL, Rodríguez JP, Heuer HA, Caplan AI. The Molecular Control of Avian Eggshell Mineralization. In: Chemistry and Biology of Mineralized Tissues. (eds. H.C. Slavkin, P. Price). Elsevier Sci Publ, Amsterdam, 1992, pp 133-141.

Recibido 08/mayo/2006 Aceptado 30/junio/2006 Editor Responsable Jorge Luis Tórtora