OBTENCIÓN DE ETANOL POR SACCHAROMYCES CEREVISIAE INMOVILIZADA EN AGAR
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Métodos de purificación de enzimasenzimas
Enzimas de productos marinosDr. José Luis Cárdenas López
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Purificación de Proteínas
• Es un arte (las proteínas tienen personalidad irritable)
• Requiere conocimiento de la proteína– De qué célula proviene– De qué célula proviene– Qué parte de la célula– Qué hace
• Muy importante– Tamaño– Composición
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Estrategia
• Mover de un organismo a proteína pura en los menos pasos posibles con la mínimapérdida de actividad (medible en un ensayo)ensayo)– Tiempo y temperatura son factores
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Protocolos para Purificación de Proteinas
• Altamente específicos para cada caso• Usar un enfoque común
– Fraccionar el extracto crudo de tal manera que la proteína de interés se vaya al que la proteína de interés se vaya al precipitado o al sobrenadante
– Seguir el progreso con un ensayo funcional
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Lactato Deshidrogenasa
• NADH + H+ + Piruvato �=�NAD+ + Lactato• La fuente obvia para la enzima es el tejido
muscular (corazón o esquelético, son isómeros)• Se ensayaría la habilidad de convertir piruvato a
lactatolactato
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Comenzar con tejido intacto• Romper el tejido
– Licuadora, homogenizador
• Remover contaminantes– Centrifugación
• Precipitar/concentrar– Sulfato de Amonio
• Remover sales– diálisis
• Purificar– Cromatografía
• Analizar– Actividad, peso molecular, cantidad de proteína
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Pp Sulfato de Amonio
• Amplio rango de aplicaciones• Se basa en que las proteínas pierden
solubilidad al incrementarse la concentración de salsal– Es característico para cada proteína particular– Resulta en una purificación partial de las proteínas
con características similares de solubilidad– Se debe determinar empíricamente la [sulf amonio]
que precipita la proteína de interés
• Produce “cortes de sal”
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Salting in / Salting out
• Salting IN• A bajas concentraciones,
la sal añadida, normalmente incrementa la solubilidad de macromoléculas
• Salting OUT• A altas concentraciones
la sal añadida baja la solubilidad de las macromoléculas poreque compite por el solvente macromoléculas
cargadas porque la sal incrementa las interacciones carga-carga
• Por lo que las bajas [sal] previenen agregación y por lo tanto la precipitación y “salida”
compite por el solvente (H2O) necesario para solvatar las macromoléculas
• Por lo que las altas [sal] remueven la esfera de solvatación de las proteínas y “salen” de solución
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Cosmótropo vs. Caótropo
• Sulfato de Amonio• Incrementar conc
causa a las proteinas precipitar de manera
• Urea• Incrementar conc
desnaturaliza las proteinas; cuando precipitar de manera
estable• Ion cosmotrópico =
ion estabilizante
proteinas; cuando finalmente precipitan, es de manera aleatoria y agregadas
• Ion Caotrópico = ion desnaturalizante
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Diálisis
• Paso de solutos a través de una membrana semi-permeable
• Los poros en la membrana de diálisis son de cierto tamaño (controlable)
• La proteina se queda; el agua, las sales, los • La proteina se queda; el agua, las sales, los fragmentos de proteína y otras moléculas que sean menores que el poro salen
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Cromatografía de Columna
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Disponibles en cualquier volumen
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Filtración en Gel
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Principios de la filtración en gel (malla molecular )
106 Da3x105 Da105 Da
1. Aplicar una mezcla de proteínas a la columna de filtración en gel (Sepharose,
Sephacryl, etc)
2. Colectar fracciones,tipicamente 120 en
una columna de 1.5x100 cm No cambiar composición del buffer
3. Macromoléculas mas grandes eluyen primero
(mayor radio de Stoke)
4. Determinar proteina en
5. Estimar peso molecular aproximadode las proteínas desconocidas o de
los complejos proteicos con estándares de calibración de peso molecular conocido y la formula:
Kav = Ve -VoVt - Vo
Ve – volumen de eluciónVo – volumen vacíoVt – volumen total
105 Da104 Da
4. Determinar proteina en la fracción eluída con
un ensayo adecuado
Kav
Log Peso Mol.
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Intercambio Iónico
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Chromatografía de afinidad
Usar Adenosina-5’-monofosfato-5’-monofosfatoEsto es parte del NAD+. La LDH se unirá. Liberar la LDH añadiendo NADH
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NAD+
AMP
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Afinidad
• Recordar: NADH es un co-sustrato para lactato dehidrogenasa.
• Usar AMP-Sepharose: AMP está unido covalentemente al gel de afinidad, no pasará a través del filtrotravés del filtro
• LDH se unirá al AMP porque parece la mitad del NADH.
• Por lo que la LDH se queda inmovilizada en la columna hasta que se le añada NADH que se une más fuertemente que la LDH.
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gráfica
Actividad
A280
NADH
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Concentración de Proteína
• Lowry • A280
• Bradford• BCA• BCA• Starcher
Muy importante: proteína en solución, no absoluta
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Lowry
• Paper más citado en biología• Ensayo colorimétrico• Proteínas se acomplejan con Cu2+ en solución
alcalina (rx de Biuret) y son inestables en el reactivo Folin Ciocalteureactivo Folin Ciocalteu
• Muchos interferentes (detergentes, HEPES, BME, agentes reductores)
• Más tardado que otros, pero es ensayo barato
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A280
• Usa absorbancia intrínseca• Detecta residuos aromáticos
– Enlaces de resonancia
• Depende de la estructura de la proteina, • Depende de la estructura de la proteina, estado nativo y composición de AA
• Regla muy general: 1 mg/mL de BSA= valor de DO 1
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Bradford
– Cuando la proteína se une a azul de commassie G 250 la Amax del colorante cambia de 465nm a 595nm
– Muy rápido (2 min), poca variación entre proteínas, tiene algunos interferentes como detergentes (triton X, SDS)
– Hay micrométodos (hasta .01 µg )– Hay micrométodos (hasta .01 µg )
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BCA (Ácido bicinchonínico)
– Modificación de Lowry: ensayo breve (10 min),mayor sensibilidad (0.5 µg) y consistencia, resiste presencia de detergentes
– Proteínas se acomplejan con Cu2+ en solución alcalina, los iones del complejo se reducen a Cu+, que forman el color violeta con el BCAque forman el color violeta con el BCA
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Starcher
• Es mas reciente (2001)• Proteína soluble e insoluble• Muy sensible, aunque muchos pasos• Poco afectada por diferencias entre • Poco afectada por diferencias entre
proteína (gelatina…..)• 2 pasos (rx ya muy antiguas y conocidas):
– hidrólisis (24 horas en HCl)– Rx con ninhidrina
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Típico diagrama de flujo Ground sirloin(or alternative LDH source)
Place in blender, add buffer,homogenize
Initial meat suspension
Centrifuge
(save 1 ml)
Discard precipitate
Llevar contabilidad de todo (volumenes, gramos, etc)para cálculos de rendimientos, etc.
Ammonium sulfate precipitation, Centrifuge
Precipitate
Supernate
Step 2b
Remove dialysate,Store at -20oC
Cleared meat extract
(save 1 ml)precipitate
(save 1 ml)
Step 1
Discard remainder
Resuspend in buffer
Add PMSF,Dialyze
Step 2a
(save 1 ml)
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Ejemplo de cromatograma
A280 V0
contaminant protein
LDH
A280 V0
fraction (tube) number (approximate only)
NADH added
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
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Cómo saber qué tan pura es la proteína
Tabla de Purificación (1ra parte)Volumen total
(ml)
V0 unidades por
ml
V0 unidades
TotalesUnidades
remanentes o
Rendimiento
(% del total)
Concentración
de Proteina
(mg/ml)
Proteína neta
(mg)
Actividad
específica
(V0/mg
proteina)
Step A B C D E F G
1. EC 100 mL 20 U 16 mg/mL 100 x 16 = 1600 mg
2. 10 mL 180 U 8 mg/mL 10 x 8 = 80 2. (NH4)2SO4
10 mL 180 U 8 mg/mL 10 x 8 = 80 mg
3. diálisis/ solucióninyectada a la columna
12 mL 140 U 7 mg/ mL 12x7= 84 mg
4. tuboscolectadosde la columnaafinidad
3 mL 200 U 1.3 mg/mL 1.3 x 3= 3.9 mg
Columna C = (Columna A)(Columna B)Columna F = (Columna A)(Columna E)Columna G = Columna C/Columna F = Columna B / Columna EColumna D = Columna C/primer valor en Columna C
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Cómo saber qué tan pura es la proteína
Tabla de Purificación (1ra parte)Volumen total
(ml)
V0 unidades por
ml
V0 unidades
TotalesUnidades
remanentes o
Rendimiento
(% del total)
Concentración
de Proteina
(mg/ml)
Proteína neta
(mg)
Actividad
específica
(V0/mg
proteina)
Step A B C D E F G
1. EC 100 mL 20 U 100 x 20= 2000 U
100 % (2000/2000) x100
16 mg/mL 100 x 16 = 1600 mg
2000 U/ 1600 = 1.25 U/mg
2. (NH4)2SO4
10 mL 180 U 10 x 180 = 1800 U
(1800/2000)x100 = 90 %
8 mg/mL 10 x 8 = 80 mg
1800/80= 22.5 U/mg
3. diálisis/ solucióninyectada a la columna
12 mL 140 U 12 x 140= 1680 U (1680/2000)x
100= 84%
7 mg/ mL 12x7= 84 mg
1680/84= 20 U/mg
4. tuboscolectadosde la columnaafinidad
3 mL 200 U 3 x 200= 600 U (200/2000) x 100 =10%
1.3 mg/mL 1.3 x 3= 3.9 mg
600/3.9 = 154 U/mL
Columna C = (Columna A)(Columna B)Columna F = (Columna A)(Columna E)Columna G = Columna C/Columna F = Columna B / Columna EColumna D = Columna C/primer valor en Columna C
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Tabla de Purificación (2da parte)
Total de actividad
(unidades)
Rendimiento(%)
Actividadespecifica
(V0/mg proteina)
Purificación(X)
Paso A B C D
1. EC 100 x 20= 2000 U
2000 U/ 1600 = 1.25 U/mg
2. (NH4)2SO4 10 x 180 = 1800 1800/80= 22.5 2. (NH4)2SO4 10 x 180 = 1800 U
1800/80= 22.5 U/mg
3. diálisis/
solución
inyectada a la
columna
12 x 140= 1680 U
1680/84= 20 U/mg
4. tubos
colectados de la
columna afinidad
3 x 200= 600 U 600/3.9 = 154 U/mL
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Tabla de Purificación (2da parte)
Total de actividad
(unidades)
Rendimiento(%)
Actividadespecifica
(V0/mg proteina)
Purificación(X)
Paso A B C D
1. EC 100 x 20= 2000 U
100 % (2000/2000) x100
2000 U/ 1600 = 1.25 U/mg 1
x1002. (NH4)2SO4 10 x 180 = 1800
U(1800/2000)x100 = 90 %
1800/80= 22.5 U/mg 18
3. diálisis/
solución
inyectada a la
columna
12 x 140= 1680 U (1680/2000)x
100= 84%
1680/84= 20 U/mg
16
4. tubos
colectados de la
columna afinidad
3 x 200= 600 U (200/2000) x 100 =10%
600/3.9 = 154 U/mL 123
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• En el directorio compartido de la computadora JOSELUISC pueden encontrar los manuales de GE (antes Pharmacia) de purificación de proteínas
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¿Cómo verifico que efectivamente mi proteína está pura?
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Separación de proteína usando SDS-PAGE(Laemmli systema)
Stackinggel
Resolvinggel
1. Aplicar muestra de proteina/colorante a los pozos del gel
2. Correr la electroforesis hasta que el colorante llegue al final del gel
3. Remover el gel delaparato y teñir las proteinas
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SDS PAGE del proceso de purificación
1. Extracto crudo2. Precipitado con SA3. Intercambio Iónico3. Intercambio Iónico4. Filtración en gel 5. Afinidad
10 microgramos en cada carril
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Por enfoque isoeléctrico
La proteína tiene una carga neta, al colocarla en un gradiente de pH, la proteína viaja hasta donde se descarga (pI)Luego se tiñe y da un patrón característico
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Ejemplo
SDS PAGE (electroforesis)
¿Suficiente?
3 10
IEF (enfoque isoeléctrico)
¿Suficiente?
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electroforesis de dos dimensiones
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Pes
o m
olec
ular
Enfoque isoelectrico
Pes
o m
olec
ular
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Pes
o m
olec
ular
Enfoque isoelectrico
Pes
o m
olec
ular
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EXIEXITO
Pes
o m
olec
ular
ÉXITO
Enfoque isoelectrico
Pes
o m
olec
ular
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Ese es el enfoque tradicional…proteína por
proteína…proteína…
Estudiar una a la vez…funciona…aunque
tardado…tesis doctoral…
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Que tal si las estudiamos desde el punto de vista de la
PROTEÓMICA (o la PROTEÓMICA (o la metabolómica…)
ES decir, en conjunto…
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• Tomar esa proteína del gel• Hidrolizarla (tripsina, una opción)• Secuenciar los péptidos (Sanger)• Buscar en las bases de datos péptidos
similares que coincidansimilares que coincidan• % similitudes• Identificar• Ver diferencias (secuencia, pesos
moleculares, etc)
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Herramientas de bioinformática
• http://www.expasy.org/tools/
• http://prowl.rockefeller.edu/Secuencia: Secuencia: AFSTTGAMEG QQFRKTGKLV
SLSEQNLVDC SRPEGNEGCN GGLMDQAFQY IQDNAGLDTE ESYPYVGTDE DPCHYKPEFS AANETGFVDI PSGKEHAMMK AVAAVGPVSV AIDAGHESFQ FYESGIYYEK ECSSEELDHG VLVVGYGFEG EDVDGKKYWI VKNSWSEKWG DKGYIYMAKD RKNHCGIATA SSYPLV
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• Probar peptide cutter• Probar peptide mass• Otros
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• Gran cantidad de información en muy poco tiempo
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Ventajas? Desventajas?