MetabolmicaQUIMICA DE LOS PRODUCTOS NATURALES

Qu veremos?

Bases de la Metabolomica.

Limitaciones de Metablomica.

Puntos a considerar cuando usemos metabolomica para nuestra investigacin.

Definiciones y Antecedentes.

Metaboloma = pool total de los metabolitos.

Todas las moleculas organicas quetengan bajo peso molecular (< 2000 Da) en una muestra como hojas, semillas, frutas, etc.

AzcaresNuclesidosAc. OrgnicosCetonasAldehidosAminas

Aminoacidos

PeptidosLipidosEsteroidesTerpenosAlcaloides

Metabolmica: anlisis de alto rendimiento de los metabolitos.

Definiciones

Es el estudio cientfico sistemtico de molculas pequeas, llamadas metabolitos, yque son el producto del metabolismo de seres. Este estudio deja seales de losprocesos celulares especficos en su paso (metabolitos)

Metabolito

Excepciones:

Pueden detectarsecon confianza enestudiosmetabolmicos deplasma a travs de laespectroscopa RMN.

El metaboloma forma una gran red de reaccionesmetablicas donde las salidas de una reaccin qumicaenzimtica son entradas para otras reacciones del mismo tipo.

1 kDalton de tamao.

Tipos de MetabolitosEn la metabolmica de plantas, es comn referirse a los metabolitos comometabolitos "primarios" y "secundarios".

SECUNDARIOSPRIMARIOS

Historia Perfilado de metabolitos utilizando muestras de sangre y orina para la deteccin clnica de las enfermedades humanas se ha llevado a cabo durante siglos.

1506 por Ullrich Pinder, en su libro EpiphanieMedicorum.

Nicholson, J. K. & Lindon, J. C. Nature 455, 10541056 (2008).

Antecedentes.

En China se empleaba alas hormigas comosistema de deteccin deniveles de azucar

Historia

Antecedentes.

1960 Tcnicas de separacin cromatogrficas avanzadas.

1971

Linus Pauling:"Anlisis cuantitativo de vapor de orina y aliento mediante Cromatografia de particin Gas-Lquido

1973 - 1977

Chuck Sweeley ayud a desarrollar perfiles metablicos mediante cromatografa de gases / espectrometra de masas (GC-MS)

1986-1994

Bioqumicos metablicos de la planta (por ejemplo, LotharWillmitzer) estaban entre otros los primeros lderes en el campo.

Tamao del Metaboloma en las Plantas.

Se estima que todas las especies vegetales contienen 90.000 - 200.000 compuestos.

Cada especie de planta contiene alrededor de 5.000 - 30.000 compuestos.

Ejemplo ~ 5,000 en Arabidopsis

Antecedentes.

~ 90% de las mutaciones knockout en Arabidopsis son silenciosas- es decir, no tienen fenotipo visible y as no ofrece ninguna pista a la funcin del gen.

Lo central es que ya no se aslan compuestos individuales, sino que se realiza un anlisis ms o menos completo de un organismo.

PODER DE LA METABOLMICA

Limitaciones de la metabolmica

Definiciones y Antecedentes.

Alta Variacin biolgica en los niveles de metabolitos.

Amplia gama de estructuras qumicas y las propiedades. Sus pesos moleculares abarcan dos rdenes de magnitud (20-2000 Da).

Las concentraciones de los distintos metabolitos pueden variar de mMa concentraciones de pM.

Algunos metabolitos son lbiles y no sobreviviran para la extraccin y anlisis.

Problemas con la cromatografa, la deteccin y anlisis de datos

MetabolomicaPasos

Preparacin de la muestra. Extraccin

Cromatografa.

DeteccinAnlisis de Datos

Preparacin de la muestra

Tamao de muestra

Cultivar plantas en condiciones idnticas

Seleccin aleatoria de los grupos de tratamiento

Asegrese de que los efectos que est midiendo se deben a la variable de prueba

Nmero de rplicas ... depende de lo que desea

Grandes diferencias = pequea replicacinPequeas diferencias = gran replicacin

En general, se necesitan seis repeticiones para cada tratamiento (debido a la alta variabilidad biolgica)

Coleccin de la muestra.

Tamaos de muestra uniforme (por ejemplo, hojas perforadoras/daadas)

Sea consistente - tejido parecido- La hora del da

Preparacin de la muestra

Congelar rpidamente la muestra en nitrgenolquido y almacenarlo a -80C

Extraccin de la Muestra

Eleccin del metodo de extraccin.

No existe un mtodo universal de extraccin

Algunos disolventes pueden degradar ciertos compuestos.

Es bueno tener una idea de lo metabolitos que desea extraer.

El mtodo debe ser consistente y reproducible.

Una extraccin adicional puede ser necesaria (por ejemplo, la extraccin en fase slida)

SPEX SamplePrep Grinder

Extraccin de la Muestra

YCromatografa

Introduccin

Inventado en 1900 por Mijail Tsvet (utilizado para separar pigmentosde las plantas)

Hay varios tipos de cromatografa, pero todos consisten en una fase estacionaria y una fase mvil. Los compuestos se separan sobre la base de particin diferencial entre las dos fases.

Los tipos incluyen:- TLC (cromatografa en capa fina)- GC (cromatografa de gases)- LC (cromatografa lquida)

GC y LC se utilizan habitualmente en la metabolmica

Cromatografa

Cromatografa Gaseosa

GC = good chromatography

limitaciones:- Altas temperaturas pueden destruir compuestos lbiles- Compuestos polares no pueden "volar" en las columnas de GC y primero deben ser derivados.

Optimizado durante variasdcadas

~ 5 columnas utilizan rutinariamente

(5% de difenilo / 95% de siloxanode metilo)

alta reproducibilidad

La identificacin basada en RT

18

1) metoximacin de grupos aldehdo y cetona (principalmente para la apertura de anillo de azcares reductores)2) La sililacin de hidroxi polar, tiol, grupos carboxi y amino con el agente de sililacin MSTFAUn compuesto nico con mltiples grupos activos dar lugar a mltiples picos (1TMS, 2TMS, 3TMS)

Paso 1) metoximacin Paso 2) Sililacin

La cromatografa de gases requiere compuestos voltiles (dos derivatizacinpaso en vial)

estrone minor_RI 950990 estrone major_RI 948753

80 110 140 170 200 230 260 290 320 350 380 410 440 470 500

0

50

100

50

100

91

91

96

96

107

107

115

115

128

128

141

141

147163

163

177

189

193

205

207

218

218

231

231

244

244 257

267

271

283

283

298

298

312

312

340

340

356

356

371

371

383

388401 415

415

435 457 475 489

m/z

Abundance

estrone minor_RI 950990 estrone major_RI 948753

80 110 140 170 200 230 260 290 320 350 380 410 440 470 500

0

50

100

50

100

91

91

96

96

107

107

115

115

128

128

141

141

147163

163

177

189

193

205

207

218

218

231

231

244

244 257

267

271

283

283

298

298

312

312

340

340

356

356

371

371

383

388401 415

415

435 457 475 489

m/z

Abundance

Ismero tienen el mismo espectro de masaspero difieren 2 segundos en el tiempo de retencin

Anal Chem. 2009 Dec 15;81(24):10038-48. doi: 10.1021/ac9019522.FiehnLib: mass spectral and retention index libraries for metabolomics based on quadrupole and time-of-flight gas chromatography/mass spectrometry.Kind T, Wohlgemuth G, Lee do Y, Lu Y, Palazoglu M, Shahbaz S, Fiehn O.

Cromatografa

Derivatizacin de la muestra

Cromatografa lquida

LC = Lousy chromatography

ventajas:- El compuesto se puede recoger despus de la separacin- Lo es necesario la derivatizacin.- Un protocolo de separacin puede ser optimizado para casi cualquier compuesto

Cromatografa

Bastante nuevo, avances recientes.

miles de columnas disponibles

Fase normal

Intercambio inico

Fase inversa

Infinidad de Sistemas de Solventes posibles.

baja reproducibilidad

Deteccin

Espectrometra de masas Es una tcnica utilizada para medir la masa de los iones (m/z)

Todas los espectrometros de masas realizan tres tareas principales

1) Ionizan moleculas.

2)

Utiliza los campos elctricos y magnticos para acelerar iones y manipular su vuelo.

3) Detectar iones (convertir en seal electrnica)

Deteccin

Espectrometra de masas.

Ejemplo del espectro de masas:

m/z

rela

tive

ab

un

dan

ce

Time [min]

Normalized

Intensity

m/z

Normalized

Intensity

Chromatogram (GC-MS)

100

0

50

75

25

0 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00

100

0

50

75

25

30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170

166

971298361

47

35

11911270

Mass spectrum (EI)

Peak selector

Deteccin

Espectrometra de masas.

Quad TOF

Espectrmetro de masas.

Hay varios tipos de espectrmetros de masas:

TOF (tiempo de vuelo)

Q, QQQ (cuadripolo)

Ion Trap Orbitrap

FTICR (transformada de Fourier de resonancia ciclotrn de iones)

Espectrometra de MasasPropiedades de los diversos espectrmetros de masas.

TOF Quad Ion Trap Orbitrap FT-ICR

Resolucin Muy bueno razonable razonable Muy bueno excelente

Rango Dinmico Muy bueno excelente razonable razonable razonable

Sensibilidad excelente excelente excelente excelente excelente

Velocidad excelente bueno excelente bueno razonable

Costo 150-300K 100K 100K 500K 1M

Mantenimiento Periodico Periodico Periodico Periodico Muy alto

Resonancia Magntica Nuclear

Los ncleos deben tener un momento magntico distinto de cero.

Esta condicin no la cumplen los ncleos con nmero msico y nmeroatmico par (como el 12C, 16O, 32S). Los ncleos ms importantes en qumicaorgnica son: 1H, 13C, 31P, 19F y 15N.

Otros ncleosimportantes: 7Li, 11B, 27Al, 29Si, 77Se, 117Sn,195Pt, 199Hg, 203Tl, 205Tl, 207Pb

Es una tcnica empleada en la elucidacin de estructuras

moleculares, aunque tambin se puede emplear con finescuantitativos y en estudios cinticos y termodinmicos

Algunos ncleos atmicos sometidos a un campo magntico externoabsorben radiacin electromagntica en la regin de las frecuencias deradio. Como la frecuencia exacta de esta absorcin depende del entornode estos ncleos, se puede emplear para determinar la estructura de lamolcula en donde se encuentran stos.

Por eso, uno de los ms tiles en laelucidacin de estructuras es el 1H,dando lugar a la Espectroscopia deResonancia Magntica Nuclear delProtn. Tambin es importante enqumica orgnica el 13C, aunque se tratade un ncleo poco abundante y pocosensible.

Anlisis de DatosObjetivos

Identificar todos los picos

En la prctica esto es muy difcil, si no imposible.

Cuantificacin o Semi-cuantificacin de compuestos

A menudo implica la comparacin de muestras o grupos de muestras.

Diversas pruebas estadsticas para buscar diferencias en los grupos de tratamientopor ejemplo ACP, ACM, ANOVA

Anlisis de DatosIdentificacin de picos

Tener el dato de la masa precisa puede ayudar a determinar la frmula qumica:

Ejemplo: sacarosa (C12H22O11)Masa monoisotpico = 342.116211

http://www.alchemistmatt.com/mwtwin.html

Calculadora de peso molecular

Anlisis de DatosLa identificacin de los picos.

Las bibliotecas de EM pueden identificar los picos (en su mayora de GC / MS), especialmente cuando se combina con la informacin RT (GC / MS solamente):

Ejemplo: biblioteca de NIST

Anlisis de Datos

Ejemplo del resultado de un experimento de la metabolmica.

Los estudios fitoqumicos han avanzado mucho en losltimos aos pero todava la informacin disponible esinsuficiente para evaluar la calidad, eficacia y seguridad dela mayora de las plantas medicinales que se utilizan en lossistemas mdicos locales y tradicionales.

Alguna Pregunta?GRACIAS POR SU ATENCIN