Medios Lquidos y Bio React Ores 2009

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Dpto. Biología VegetalFACULTAD DE AGRONOMÍA

MEDIOS LÍQUIDOS Y SISTEMAS AVANZADOS DE

MICROPROPAGACIÓN

Características de los medios líquidos

Hiperhidricidad

Bioreactores

Reactores de Inmersión Temporaria

Micropropagación de plantas




Medios líquidos

• Menores costos

• Mejor calidad de planta

• Mecanización del proceso

Técnica ideal paraproducción masiva deplantas





Ventajas

• Mayores tasas de crecimiento

• Mayor superficie de contacto

• Toma de nutrientes y reguladores mas eficiente

• Dispersión mas efectiva de metabolitos tóxicos

• Facilidad de limpieza del material de vidrio






Medios líquidos

Curtis, 2005.

• Formación de una capaestacionaria (“Nernst”).

• Tasa de absorción de ioneslimitada.

• Espesor depende de laagitación.

• Medios líquidosestáticos/agitación





Medios líquidos

Curtis, 2005.

• Concentración de oxígeno,principal factor limitante delcrecimiento.

• Heterotrofia de tejidos vegetalesen cultivo.

• Oxidación de azúcaresdeterminante principal de lademanda biológica de oxígeno(BOD).

• Baja solubilidad del oxígeno enel medio de cultivo.

• Principal demanda: meristemos.





Shaker rotatorio paraErlenmeyer.

Rotor para tubos de ensayo.

Medios líquidos




Principal problemática:VITRIFICACIÓN O HIPERHIDRICIDAD

Desorden fisiológico, metabólico y morfológico

en condiciones de cultivo in vitro .






•Apariencia turgente

•Superficie acuosa

•Órganos translúcidos•Coloración menos verde

•Brotes frágiles, se quiebran fácilmente

•Capacidad de enraizamiento reducida o nula

Características de los brotes hiperhídricos:




Condiciones adversas

• Altas concentraciones de citoquininas

• Alta HR en el recipiente de cultivo

• Recipientes herméticos

• Bajas concentraciones de agar





Principales síntomas

Menor contenido de Ca+2Ausencia de parénquima enempalizada

Hojas mas gruesas,elongadas, arrugadas

Mayor actividad deglutamato deshidrogenasa

Hipertrofia del parénquimacortical y médular

Tallos de mayor diámetro

Menor contenido declorofila

Estomas anormales y en menornúmero

Menor peso seco

Menor capacidadfotosintética

Color anormal

Mayor absorción de aguaMenor desarrollo del sistemavascular

Hojas translúcidas yquebradizas

Menor contenido decelulosa

Grandes espaciosintercelulares

Arrosetamiento

HipolignificaciónEpidermis y cutícula delgadasEntrenudos cortos

Bioquímicos AnatómicosMorfológicos





Planta normal Planta vitrificada


Vaccinium corymbosum




NORMALVITRIFICADO


Achyrocline flaccida




NORMAL VITRIFICADO


NORMAL

VITRIFICADO




VÍA DE SÍNTESIS DE LIGNINAY FLAVONOIDES REDUCIDA

POR VITRIFICACIÓN

Phenylalanine

Ác.coumárico

Ác. cinamico

P-coumaryl-CoA

LIGNINAFLAVONOIDES

P-coumarato:CoA

ligasa

(Adaptado de George, 1993)

HIPOLIGNIFICACIÓN






Cambios morfológicos y anatómicos en Vanilla planifolia

Sreedhar et al., 2009.







Tejidos vasculares

Endodermis

Tejidos vasculares

Parénquima en empalizada





A) Superficie del tallo, B) Sistema vascular, C) Aumento de B, mostrandoengrosamiento de las paredes de los vasos, D) Estructura de estomas.






Aireación cultivo Densidad del medio

HR Disponibilidad PGRs Disponibilidad nutrientes

Constituyentes

Pared Celular

Estrés aireación

Producción etileno

ETILENO

Actividad enzimática

Pared Celular

Elasticidad Pared

Celular

Propiedades mecánicas

Pared Celular

Forma de la célula

Efecto sobre

microtúbulos

Tamaño de la célula

Engrosamiento

Pared Celular Orientación

microfibrillas

FuncionamientoCélula Guarda Aerénquima ehiperhidratación

VITRIFICACIÓN




Como prevenirla

• Medio de cultivo:

– Incrementar la concentración de agar – Disminuir concentración de citoquinina

• Tapado de recipientes: – Permitir intercambio gaseoso

• Condiciones ambientales: – Enfriamiento basal – Incrementar la aireación

• Otras medidas





COMPUESTOS QUECONTRARESTAN LA

VITRIFICACIÓN

Phloroglucinol

Phloridzin

VÍA DE SÍNTESIS DE LIGNINAY FLAVONOIDES REDUCIDA

POR VITRIFICACIÓN

Phenylalanine

Ác.coumárico

Ác. cinamico

P-coumaryl-CoA

LIGNINAFLAVONOIDES

P-coumarato:CoA

ligasa

(Adaptado de George, 1993)

HIPOLIGNIFICACIÓN






Curtis, 2005.

Bioreactores

• Requerimientos fisiológicos delos tejidos vegetales pueden seincompatibles con el diseño yfuncionamiento de bioreactorestradicionales.

• Amplia gama de diseños, enfunción del tejido a propagar,escala de producción, etc.

• Basados en los mismos

principios de agitación,demanda y transferencia de O2,etc.





Bioreactores para la propagación de plantas:

•De inmersión temporal:

•BIT ®

•RITA ®

•De inmersión permanente

•Nalgene ®

•Life reactor ®

, Osmotek




Bioreactor de Inmersión Temporal (BIT®)

Centro de Bioplantas, Cuba.





Sistema BIT®


Centro de Bioplantas, Cuba.







• Volumen de medio/explanto

• Tiempo de inmersión

• Frecuencia de inmersión




EJEMPLOS DE APLICACIÓN

Coeficiente de multiplicación se incrementó de 2 a 8 (promedio).

28 días

Multiplicación de Musa sp; sistema BIT®

Escalona, 2005.






Nápoles et al. 2009.

Multiplicación de Psidium guajava en BIT®

Efecto del volumen de medio y frecuencia de inmersión.

El tiempo de inmersión fue de 3 min. en todos los tratamientos.Se utilizaron 20 explantos por recipiente, de 1,5 litros.




Sistema RITA®

Reactor de Inmersión Temporal Automatico (RITA®)

CIRAD, Francia.




Dpto. Biología VegetalFACULTAD DE AGRONOMÍASistema RITA®

Reactor de Inmersión Temporal Automatico (RITA®)

CIRAD, Francia.





Las principales ventajas

del sistema Rita®

Disminución del costo de mano de obra , debido ala facilidad de manipulación de los explantes y del

cambio de medio. Permite una mejor nutrición mineral. Uncontacto estrecho entre la superficie de los explantes yel medio durante la fase de inmersión. Por capilaridad,una fina película de medio se mantiene sobre losexplantes. Fuerte disminución de los problemas de asfixia ovitrificación de los tejidos en comparación con unainmersión permanente.

Renovación completa del aire dentro delrecipiente durante cada inmersión. Mejor separación de los tejidos o células bajo elefecto de las burbujas. Control de los procesos morfológicos debido a la

frecuencia y la duración de inmersión. Protección de cada recipiente contra lacontaminación por los filtros. Manipulación individualfácil. Abolición de los riesgos de contaminacióncruzada.





• Café, tasa de multiplicación en medio sólido: 6-7 cada 3 meses.En RITA igual tasa en 5 semanas.

• Banana, 700 a 1000 embriones somáticos por RITA.

• Eucalyptus grandis, tasa de multiplicación 11,5 contra 3,5 ensistemas convencionales.

• Otros: papa, ananá, Phalaenopsis, etc.





Multiplicación de Musa sp ; sistema RITA®





Regeneración de frutilla transgénica por organogéneis,sistema RITA.

Hanhineva, 2007.





Embriogénesis somática de Hevea brasiliensis , sistema RITA.

Etienne, 1997.Embriones/g de callo:

En medio sólido: 36

Sistema RITA: 255






Bioreactores de inmersión permanente




Bioreactores de inmersión permanente


Nalgene ®





Multiplicación de Vaccinium corymbosum , BR de inmersión permanente.

Ross, 2006.

La tasa de multiplicación se incrementó de 4 a 28 (promedio).





Multiplicación de Achyrocline flaccida , BR de inmersión permanente.

Ross, 2006.

La tasa de multiplicación se incrementó de 4 a 11 (promedio).





RESULTADOS

ExplantosInstalación

30 días 60 días


Ross, 2006.




BIOREACTOR

10 explantos

Tasa mult: 12/yema

480 microestacas

2 meses

MEDIO SÓLIDO

Tasa mult: 4/explanto

10 explantos

40 explantos

160 microestacas

30 días

30 días





AA B

m

x

m

x

RESULTADOS

Cortes histológicos

Cortes transversales de tallo: (A) Sin phloroglucinol; (B) 40 mg.L-1 dephloroglucinol; m: médula; x: xilema


Ross, 2006.




Enraizamiento


Ross, 2006.





Lifereactor ® , Osmotek

Recipiente descartable depolietileno preesterilizado, 1,5 o 5litros.

Sistema airlift.

Accesorios para manteneresterilidad del sistema,purificación y humidificación delaire.

Soporte.





Escalado

Panax ginseng

Paek et al., 2005.





Escalado

a) y b) Manzana

c) Chrysantemum

d) Ajo

e) Vid

f) Bulbos de Lilium

Paek et al., 2005.





Embriones somáticos de Clematis sp .

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