8/15/2019 Mediciones Hormonales Inmunoanálisis y Métodos Afines

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA DE LABORATORIO CLINICO EHISTOPATOLOGICO

NOMBRE:

ERIKA CUIJIGUALPA

TANIA QUINZO

JESSICA ROJAS

SANDRA SATAN

CURSO: SEXTO SEMESTRE

CATEDRA: ENDOCRINOLOGIA

TEMA: MEDICIONES HORMONALES

INMUNOANÁLISIS Y MÉTODOS AFINES 

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MEDICIONES HORMONALES INMUNOANÁLISIS Y MÉTODOS AFINES

Entre los métodos de medición hormonal, los de más uso son el

radioinmunoanálisis (RIA), el enzimoinmunoanalisis (ELISA) y el análisis

inmunoradiométrico (IRMA). Todos ellos tienen la ventaja de poder cuantificar

pequeñísimas concentraciones de sustancias de la sangre, orina u otras mediosorgánicos, lo que han transformado a estas metodologías en una palanca de

desarrollo de la endocrinología.

Todos ellos se basan en la especificidad de la reacción antígeno-anticuerpo. Por

esta razón, miden la actividad inmunológica de los analitos, lo que no siempre

coincide con su actividad biológica. Se pueden clasificar en análisis por

competencia, y análisis no competitivos.

Concepto de inmunoensayo

Se denominan técnicas inmunoquimicas aquellas técnicas de laboratorio queutilizan la reacción antígeno-anticuerpo o algunas de sus propiedades o

consecuencias para medir elementos, sustratos o enzimas.

Si en una situación de exceso de anticuerpo cuantificamos la cantidad de complejo

antígeno-anticuerpo formado, esta candidad será directamente proporcional al

antígeno presente.

La relación antígeno-anticuerpo es indetectable por si misma in vitro; se requiere

la puesta en marcha de una segunda fase o fase indicadora: una segunda

reacción o una consecuencia de ella para que podamos detectarla.

Análisis por competencia

Radioinmunoanálisis (RIA)

En 1956 el RIA fue introducido en los Estados unidos por Berson y Yalow y en la

Inglaterra por Ekins. Se inició en el área de la endocrinología, pero actualmente es

de utilidad para medir vitaminas, drogas enzimas, neutransmisores, etc.

El análisis radioinmunológico se beneficia de la gran sensibilidad que otorga el uso

de isótopos radiactivos y de la notable especificidad con que ocurre la unión entremoléculas afines como son un antígeno y su anticuerpo, una hormona y su

transportador, o una hormona y su receptor celular especifico.

El RIA se basa en la especificidad de la reacción entre una hormona que

llamaremos antígeno y su anticuerpo. La hormona marcada con un isotopo

radiactiva compite con su forma no radiactiva para unirse a un anticuerpo que les

es específico.

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La reacción hormona-anticuerpo se efectúa en condiciones establecidas de pH y

temperatura del medio, es reversible y obedece a la ley de acción de masas. De

este modo se establece un equilibrio, por lo que la razón de los productos de las

concentraciones a que ambos lados de la ecuación será constante.

La reacción hormona-anticuerpo puede ser expresada como sigue:

Dónde:

H* = Hormona Radiactiva Libre(No Unida Al Anticuerpo)

AB = Anticuerpo Especifico

H* AB = Hormona Radiactiva Unida Al Anticuerpo.

K1 = Constante De Velocidad De Asociación.

K2 = Constante De Velocidad De Disociación.

 Así, cuando se llega al equilibrio de la reacción,

K eq( constante de equilibrio) = K1 [H* AB]K2[H*][Ab]Si a esta de agrega hormona (H) no radioactiva ya sea de una solución o de unamuestra biológica en estudio, esta desplazara, según sea su concentración, a lahormona marcada unida al anticuerpo, produciendo una disminución de lacantidad del complejo antígeno radiactiva- anticuerpo.

 Al mantener constante con la concentración de anticuerpo y de H*, la cantidad del

complejo dependerá solo de la cantidad de H que se agrega al sistema. Asi, si laconcentración de H es alta, la cantidad de H* Ab será pequeña y viceversa.Disponiendo de soluciones de concentraciones conocidas y crecientes de H sepuede construir una curva de calibración (curva estanadar) en la cual se interpolanlas muestras desconocidas para determinar su concentración.Una etapa esencial del método RIA lo constituye la separación de antígeno libre(hormona) de complejo antígeno-anticuerpo (hormona-anticuerpo).Los procedimientos más comunes para ello son:

  Adsorción de la hormona libre por carbón cubierto con dextrán.

  Precipitación de la hormona unidad al anticuerpo por medio de un segundoanticuerpo dirigido contra el primer anticuerpo.

  Separación en la fase solida: cuando el anticuerpo específico para lahormona a medir está que se realiza la reacción.

Elementos necesarios para el radioinmunoanálisisHormona marcada con un isótopo radiactivo: los isótopos más unidos son 125I

(hormonas tiroideas, proteicas, y algunas esteroidales); 3H y 14C (esteroides y

drogas)

Hormona pura no reactivas: es necesario para construir la curva de calibración.

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 Anticuerpo específico: se obtiene de animales inyectándoles riteractivamente la

hormona pura. Las hormonas peptídicas inducen una buena respuesta

inmunológica, pero las esteroidales y tiroideas debido a su pequeño tamaño,

deben ser conjugadas con albúmina antes de ser inyectadas.

Método de separación

Muestra problema: las determinaciones hormonales puede3n realizarse en suero,

plasma, orina, saliva, líquidos cefalorraquídeos, etc.

Equipos para medir radiactividad. Cuando el isótopo empleado es; 3H y 14C se usa

un contador de centelleo líquido que cuantifica radiaciones beta; mientras que

para medir 125I se requioere un contador de centello gamma.

Radioinmunoensayo

Si marcamos el inmunoensayo con un compuesto radiactivo, hablamos deradioinmunoensayo (RIA). Los marcadores usados en RIA son de dos tipos, según

la reacción que produzca:

  Radiación beta: tritio (3H), carbono 14 (14C) y fosforo 32(32C)

  Radiación gamma: iodo 125 (125I) iodo131 (131I) y cobalto (58C).

Los RIA son esencialmente ensayos competivos. Existen dos tipos: de equilibrio o

secuenciales.

En el ensayo de equilibrio (el usado habitualmente en RIA), ambos, el antígeno

marcado yl antígeno no marcado de la muestra, se enfrentan simultáneamentepara competir por los lugares de ligazón del anticuerpo hasta llegar a una fase de

equilibrio (la ley de acción de masa). Se presume que tanto el marcado como el

no marcado tienen la misma afinidad por anticuerpo. En este punto, el antígeno

(marcado y no marcado) ligado al anticuerpo es separado del antígeno (marcado y

no marcado): la proporción ligado/libre (B/F) del antigenbo es inversamente

proporcional a la concentración de antígenos (no marcado) presente en la

muestra.

Un antisuero ideal debería tener una alta concentración de afinidad, dado que la

recíproca de la constante afinidad (1/K) es una medidad de la sensibilidad delensayo.

 Así, antisueros con una K de 1012I/mol puede medir 10-12 mol/l.

Existen dos aproximaciones gráficas para para presentar los resultados del

ensayo y calcular los valores:

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  Diagrama de Scatchard. Se presenta la proporción B/F frente a laconcentración de antígeno marcado. Si la gráfica es lineal, ello implica que

que todos los sitios de ligazón tiene la misma afinidad por el antígeno

marcado. La pendiente de la recta no daría el valor de  –K(constante de

afinidad)   Graficva de Odell. Se representa la cantidad de complejo (antígeno-

anticuerpo) marcado frente a la concentración total de ligando marcado

añadido a una concentración fija de anticuerpo. La gráfica que resulta es

una hipérbole. La concentración de afinidad coincidiría con la recíproca de

la concentración de ligando libre marcado a una concentración de

anticuerpo del 50 por 100 de saturación. 

En la saturación secuencial, el antígeno no marcado se expone al anticuerpo para

su saturación. Posteriormente, se añade el antígeno, que reaccionaría con los

lugares que han quedado libre, separándose después del antígeno marcado no

unido.

El postulado básico de este sistema es que la reacción antígeno anticuerpo en las

condiciones del ensayo sea virtualmente irreversible.

Separación del antígeno anticuerpo marcado del no marcado.-  Existe unavariedad de sistemas para conseguir esa separación: el carbón activado cubierto

de dextrano captura el antígeno libre marcado. Una centrifugación posterior deja el

antígeno marcado ligado en el sobrenadante.

Técnica de doble anticuerpo.- Se trata de un segundo anticuerpo dirigido contrael anticuerpo al que se ha ligado el antígeno y que, unido por ejemplo una fasesólida, permite retenerlo.

BIBLIOGRAFIA

Libro de Laboratorio clínico de Prieto