Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293

Co nta cto :Co nta cto : digital@bl.fcen.uba.ar

Tesis de Posgrado

Mecanismos involucrados en laMecanismos involucrados en laadquisición de la hormono-adquisición de la hormono-

independncia : interacción entreindependncia : interacción entrereceptores de progesterona y otrasreceptores de progesterona y otras

vías de señalizaciónvías de señalización

Lamb, Caroline A.

2003

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasBiológicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis FedericoLeloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the correspondingcitation acknowledging the source.

Cita tipo APA:Lamb, Caroline A.. (2003). Mecanismos involucrados en la adquisición de la hormono-independncia : interacción entre receptores de progesterona y otras vías de señalización.Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3612_Lamb.pdf

Cita tipo Chicago:Lamb, Caroline A.. "Mecanismos involucrados en la adquisición de la hormono-independncia :interacción entre receptores de progesterona y otras vías de señalización". Tesis de Doctor.Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2003.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3612_Lamb.pdf

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

"Mecanismos involucrados en la adquisición de la hormona­

independencia: interacción entre receptores de

progesterona y otras vías de señalización"

Autora: Caroline A. Lamb

Directora: Dra. Claudia L.M.Lanari

Tesis presentada para optar por el títqu de Doctor de Ia Universidad :

de Buenos Aires

Laboratorio de Carcinogénesis Hormonal

Instituto de Biología y Medicina Experimental

Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas

Buenos Aires, Argentina

2003

A Héctor, Cande y Tommy!

Agradecimientos

A todas las personas que forman parte del laboratorio:

A Claudia por ser mi directora de Tesis en todo el sentido de la palabra, por su paciencia y

comprensión, por su incondicionalidad, por la discusión de resultados, por estar presente

para las cosas grandes y pequeñas hasta el último minuto...(y la lista podria continuar:

Graciasl).

A Alfredo por ser mi co-director no inscripto y por ayudarme no solo en el desarrollo de los

experimentos sino también con la finalización de este trabajo de Tesis.

A ambos les agradezco profundamente darme la oportunidad de inicianne (ya hace muchos

años) en el camino de la ciencia y por darme un "espacio" en el laboratorio y en sus vidas.

A todo el resto de los integrantes del laboratorio en estricto orden alfabético: Alejo, Ceci,

Giselle, Juli, Luisa, Maria, Marina, Pablo, Rocio, Silvia y chy por todo el tiempo

compartido, las charlas interminables, por los almuerzos en el comedor y

fundamentalmente por aguantarrne todos estos años (algunos tuvieron que soportar más

que otros). Obviamente, debo agradecer por responder a todas, o casi todas mis preguntas

personales y por escuchar todo lo que tenía para contar aún cuando no tuvieran ganas de

escuchar

A Marina,Rocio y chy por haber corregido este manuscrito.

Al laboratorio de la Dra. Elizalde, en especial a Leticia por haberme ayudado con la Técnica de Mobility

Gel Shift.

A Ia Dra Isabel Luthypor su constante apoyo y por permitirme imprimiralgunas figuras en su impresora.

A todos los integrantes del laboratorio de la Dra. Becú y del laboratorio Beta por acceder a los

interminables pedidos.

A todo el personal de maestranza y del Bioterio del lByMEsin el cual este trabajo no se podria haber

realizado.

A las “chicas de la facu": Andy, Mara y Ale con quienes comparti toda mi carrera y luego continuamos

compartiendo vivencias en lo personal fuera de la facultad.

A mis amigas del colegio que siguen aIIia pesar del tiempo transcurrido: Chiara, Ale,chy, Tati y Caro.

Ala Fundación Sales por su apoyo economico con subsidios para el desarrollo de esta investigación.

Ala Agencia Nacional de Promoción Cientifica y Tecnicológica por el subsidio BID 1201/OC-AR PICT

99 05-06389.

AICONICETpor su apoyo económico con una beca interna de formación de postgrado.

AIInstituto de Biología y Medicina Experimental donde realice este trabajo de investigacion.

A Ios laboratorios Gador y Rontag por proveer el MPA,el tamoxifeno y eI ranxifeno.

AIlaboratorio Schering por proveer el ZK 98.299.

A mis padres que me dieron Ia vida. Especialmente a mamá que me brindó su apoyo en todo momento.

A mis hermanos Claudia y John.

A Maria por cuidar tan bien de mis hijos que son Io más importante que tengo.

A mi familia... Héctor, Cande y Tommy por estar siempre alli en las buenas y en las malas y por

aguantanne todos estos años. Ustedes son miWda, los quiero mucho!!!

Atodos los que contribuyeron en alguna medida con su granito de arena ala realización de este trabajo

de Seminan'o.

MUCHAS GRACIAS!

RESUMEN

En este trabajo de Tesis se evaluaron las siguientes hipótesis:

1. El receptor de progesterona (RP) está involucradoen el crecimiento tumoral progestágeno­

independiente (Pl).

2. Vias preliferativas activadas por factores de crecimiento activan al RP.

3. Factores del estrema tumoral participan en la transición hacia la honnono-independencia

activando RP.

4 Los receptores de estrógenos affa (REa) tienen un rol en el crecimiento tumoral

pregestágeno-dependr'ente (PD).

Los ensayos se realizaron en un modelo experimental de inducción de cáncer de mama por

administración prolongada de acetato de medroxiprogesterona (MPA)en ratones hembras vírgenes de

Ia cepa BALB/c. Los tumores utilizados fueron todos carcinomas ductaies metastáticos con alto

contenido de FlE y FtP, que se comportan como hormono-dependientes en los primeros pasajes

subcutáneos singeneicos, creciendo sólo en presencia de progestágenos. En pasajes sucesivos

pueden adquirir un fenotipo progestágeno-independiente, independizándose del requerimiento de

hormonas, pero aún así mantienen la expresión de RE y RP. Un estudio de comportamiento de una

serie de tumores PI, nos condujo a subclasificarlos en respondedores (Pl-R) o no respondedores (Pl­

NR) (Helguere y col. Breast Cancer Res and Treat 79: 379-390, 2003) de acuerdo a Ia sensibilidad in

vivopara regresionar con el tratamiento a antiprogestágenos.

Para evaluar si existen factores de crecimientocapaces de reemplazar a los progestágenos en

Ia estimulación de la proliferación celular en cultivos primarios de un tumor PD, el CC4-HD, usamos al

bFGF y bloqueamos el RP mediante el uso de antiprogestágenos (RU 486 y ZK 299) y mediante el uso

de oligonucleótidos antisentido. En todos los casos el bloqueo del RP inhibió Ia proliferación celular

inducida por MPA,factores séricos o bFGF, de manera específica. Resultados similares se obtuvieron

utilizando cultivos primarios de 3 tumores PI diferentes: 59-2-HI, C7-2-Hl y CC4-HI.

Estudios de MobilityGel Shift confirmaron que tanto el MPA como el bFGF pueden inducir Ia

activación del RP en células en cultivoy que los mismos se encuentran constitutivamente activados en

cultivos primarios de tumores PI.

Por otra parte se demostró que in vivo Ia terapia con oligonucleótidos antísentido de RP fue

capaz de inducir una inhibicióndel crecimiento tumoral. Los tumores de animales tratados mostraron

una significativa reducción de células en fase proliferativa y en la expresión de FlP. Se observó

incremento de apoptosis sólo en un tumor en el cual el tratamiento indujo reducción de tamaño.

Para evaluar Ia expresión del bFGF y los receptores (RFGF 1 al 4) en los tumores PD y PI

procedimos a evaluar primero su expresión en distintos estadios del desarrollo de glándulas mamarias

III

normales por inmunohistoquímica. Si bien Ia expresión de bFGF en Ia mama normal de ratón ya estaba

reportada, nuestros estudios revelaron una regulación de Ia expresión en el desarrollo. Los 4

receptores también se expresan en las mamas normales y su expresión también está regulada en los

distintos estadios del desarrollo.

Por inmunohistoquímica o inmunofluorescencia no se detectaron diferencias evaluables de

expresión de bFGF o de sus receptores entre tumores PD y Pl-R; si bien se pudo determinar Ia

marcación de bFGF predominantemente estromal y la de los receptores en el parénquima tumoral. Los

RFGF 2 y 3 están ampliamente expresados con localizaciónnuclear además de la convencional.

Debido a que con la técnica inmunohistoquímica no se puede discriminar entre las distintas

isofonnas de bFGF, se hicieron estudios de Western blots para identificar la isofonna clásica de 16kDa.

Se detectó una mayor expresión de esta isofonna cuando los tumores PD crecían en ausencia de

progestágenos. Para poder evaluar mejor Ia contribución de las células epiteliales o los fibroblastos en

la expresión de bFGF, separamos ambas poblaciones y se hicieron cultivos primarios. Observamos

mayor expresión de bFGF en los fibroblastos estromales de tumores Pl que en los de tumores PD. En

su conjunto estos datos indicarían que el bFGF estromal podría contribuir a inducir Ia proliferación

celular en tumores PI a través de la activación de FlP. En co-cultivos de células epiteliales obtenidas de

un tumor PD con fibroblastos estromales obtenidos de un tumor PD o de uno Pl se demostró que

ambos fibroblastos ejercían un efecto sinérgico de la proliferación celular y que este efecto era mayor

con los fibroblastos Pl. A la inversa, células epiteliales PI cultivadas con fibroblastos PD crecieron más

lentamente que al cultivarlas con fibroblastos PI.

En el primer capitqu concluimos que los tumores con fenotipo PD y los PI-R necesitan de un

RP funcional para proliferar y que el estroma cumple una participación activa en el crecimiento tumoral.

En el crecimiento Pl-Fi, el bFGF junto con otros factores provenientes del estroma podría estar

activando los RP presentes en el parénquima, contribuyendo al fenotipo Pl. EI estroma Pl Iiberaría una

mayor cantidad de factores en respuesta a señales del parénquima.

En el segundo capítulo estudiamos la participación del RE en el crecimiento tumoral PD y para

ello bloqueamos el REa con un antiestrógeno puro, el ICl 182.780 y oligonucleótidos antisentido de

REo. Como resultado, en ambos casos obtuvimos una inhibición de la proliferación celular

acompañada por una disminución de expresión de RP, sugiriendo que el REa participa en el

crecimiento PD y que la alta expresión de RP pueda deberse a la presencia de RE activados.

En el tercer y último capítulo estudiamos el efecto de dos SERMs, y del antiestrógeno puro ICI

182.780, utilizados en la clínica sobre el crecimiento de un tumor PD y sobre Ia síntesis de RP. El ICI

IV

182.780, el tamoxifeno y el raloxifeno mostraron efectos inhibitorios per se en el crecimiento in vitro al

igual que el 17-,3l—estradiol(E2) pero en mayores concentraciones. EI raloxifeno indujo una estimulación

de la proliferación en presencia de progestágenos. EI ICI 182.780 y el raloxifeno revirtieron el efecto

inhibitorio del E2 mientras que el tamoxifeno fue inhibitorio. El ICl 182.780 disminuyó la síntesis de RP

mientras que el tamoxifeno y el E2 los aumentaron y el raloxifeno no tuvo efectos significativos.

Concluimos que el tamoxifeno tiene un efecto similar al observado en Ia clínica en nuestro modelo

experimental inhibiendo el crecimiento tumoral y aumentando la expresión de FlP. Estos resultados nos

llevan a hipotetizar que el tamoxifeno pueda ejercer efectos ínhibitoriospor su efecto estrogénico leve

más que por su acción antiestrogénica.

En conjunto estos resultados: a) jerarquizan el roI del receptor de progesterona en el

crecimiento de carcinomas mamarios, b) brindan al estroma un posible rol protagónico en Ia adquisición

de la honnono-independencia y c) la similitudentre los efectos del tamoxifeno obtenidos en Ia clínica y

en estos tumores son interesantes para validar aún más los dos ítems anteriores en cuanto a su

relevancia clínica.

SUMMARY

In this Thesis work we have tested the followinghypothesis:

1. Progesferone receptors (PR) are involved ¡nprogestin-independent (Pl) tumor growth.

2. Proliferativepathways activated by growth factors activate PR.

3. Tumor stromal factors activate PR and participate in the transition to horrnone-independency.

4. Estrogen receptors alpha (ERa;l are involvedin progestin-dependent (PD) tumor growth.

All experiments were carried out in an experimental model in which the continuous

administration of medroxyprogesterone acetate (MPA)to virgin BALB/cfemale mice induces mammary

carcinomas. The tumors are metastatic ductal carcinomas expressing high levels of PR and ER showing

a hormone-dependent growth pattem in syngeneic passages, since they only grow in the presence of

MPA.In successive passages the tumors may acquire a progestin-independent phenotype and they can

grow in the absence of MPA, even though they retain ER and PR levels. In a recent work of our

laboratory (Helguera et al Breast Cancer Research and Treatment 79: 379-390, 2003) we classified Pl

tumors in responsive (Pl-R) and unresponsive (PI-UR) based on their capacity to regress with

antiprogestin treatment.

In order to evaluate the ability of growth factors to mimic the stimulatory effect of progestins on

cell proliferation, primary cultures of the PD tumor line (CC4-HD), were used. Cells were incubated with

either MPAor bFGF and PR expression was blocked using antiprogestins or antisense oligonucleotides.

Both treatments were able to reduce significantly3H-thymidineuptake and cell number suggesting that

PR are mediating bFGF induced cell proliferation. Using primary cultures from three different Pl tumors:

59-2-HI, C7-2-HI and CC4-HI we were also able to demonstrate that antiprogestins and antisense

oligonucleotides were able to inhibitcell growth. Specificityof antisense treatment was assessed using

unrelated oells and using scrambled oligonucleotides.The elfectiveness was assessed by Western blots

and by binding techniques. MobilityGel Shift studies confirmed that both MPA and bFGF can induce PR

activation in PD oells and that PR are constitutiver activated in primary cultures of Pl tumors.

On the other hand, these ¡n vitro studies were supported by ¡n vivo assays in which we

demonstrated that antisense therapy using phosphorothioated oligonucleotides inhibited tumor growth.

Tumors from antisense-treated animals showed a significant reduction ot proliferating cells and PFl

expression, while no differences were found when comparing tumors from scrambled- treated or control

mice.

We next wanted to explore the expression of bFGF and its receptors (FGFR 1 to 4) in PD and

PI tumors and in different developmental stages of normal mammary glands. The presence and

distribution of bFGF in normal murine mammary gland has already been described, but no studies

regarding its expression in differentdevelopmental stages have been acknowledged. The four receptorsv1

were present in normal mammary glands and their expression, as bFGF, were also regulated in the

different developmental stages.

Immunofluorescence and immunohistochemical studies did not reveal any significant

differences in bFGF and FGFR expression between PD and PI tumors; although we could determine a

basically stromal and parenchymal staining for bFGF and FGFFl respectively. FGFFl-2 and FGFR-3

were expressed in the nuclei of parenchymal cells in addition to the reported conventional Iocalization.

Immunohistochemical studies could not distinguish between the different bFGF isofonns so

Westem blot assays were used to determine the expression of the classical bFGF isoform of 16 kDa.

This isofonn was highly expressed in tumors from untreated as compared to MPA-treated mice. As

bFGF was more expressed in stroma than in the parenchyma of both PD and Pl tumors and to further

evaluate the contribution of epithelial or fibroblastic cells to bFGF expression, we separated both

populations obtaining tumor epithelial or fibroblastic enriched primary cultures. An impressive increase

in bFGF expression was observed in stromal fibroblasts from PI tumors as compared to those of PD

tumors. On the other hand, epithelial PD cells co-cultivated with fibroblastic PD cells or with Pl

fibroblasts showed that both fibroblastic populations had a synergic effect on cell proliferation but this

effect was greater when epithelial PD cells were co cultured together with Pl fibroblasts. These data

altogether indicate that stromal bFGF could contribute to activate cell proliferation in Pl tumors through

PR activation.

In the first chapter we concluded that PD and Pl-R tumors need a functional PR in order to

proliferate and that the stroma has an active role in tumor growth. ln Pl-Fltumor growth, bFGF and other

factors coming from the stroma could be activating PFls present in tumor parenchyma, contributing to

the PI phenotype.

ln the second chapter we studied the role of ER in PD tumor growth. We blocked ERoLwith a

pure antiestrogen (ICI 182.780) and antisense oligonucleotides to ERor. As a result, in both cases cell

proliferation was inhibited and this was associated to a decrease in PR expression, suggesting that

EFlot participates in PD tumor growth and that the high levels of PFl expression may be due to

constitutive EFlactivation.

ln the last chapter, we studied the effects ot two SEFlMs and a pure antiestrogen (ICI 182.780)

commonly used in clinical studies, on PD tumor growth and on PR synthesis. ICI 182.780, tamoxifen

and raloxifene disclosed inhibitory effects per se in ¡n vitro cell proliferation as 17-[3-estradiol (E2)

although at higher concentrations. Raloxifene stimulated cell proliferation in the presence of MPA. ICl

182.780 and raloxifene reversed E2 inhibitory effect whereas tamoxifen was inhibitory. lCI 182.780

VII

reduced PR expression while tamoxifen and E2increased them and raloxifene had no significant effect.

We conclude that tamoxifen has a similar effect to that observed in the clinic in our experimental model

inhibiting tumor growth and increasing PR expression. These results led us to hypothesize that

tamoxifen can exert its inhibitoryeffects as a result of small estrogenic effects and not because of its

antiestrogenic action.

Altogether our results: a) underline the role of PRs in the growth of mammary carcinomas, b)

highlight the role of stromal factors in the acquisition of hormone-independence and c) the similarity

between the effects of tamoxifen obtained in the clinic and in our tumors validate even further our

experimental model of breast cancer highlighting the clinical relevanoe of the two items described

above.

Abreviaturas

(ERE:

asRP:

bFGF:

Cpm:

CRE:

DAB:

DBD:

EGF:

ERE:

Ez:

EPI:

FB:

HRG:

ICI 182.780:

Kd:

LBD:

MAPK:

MPA:

MEC:

NMuMG:

PD:

Pg:

PI:

PI-R:

PRE:

RAL:

RE:

RFGF:

RP:

RU 486:

R5020

oligonucleótidoantisentido del receptor de estrógenos.

oligonucleótidoantisentido del receptor de progesterona.

factor de crecimiento fibroblástico básico.

cuentas por minuto.

elemento respondedor a AMPc.

diaminobencidina.

dominio de unión al ADN.

factor de crecimiento epidérmico.

elemmto respondedor a estrógenos.

l7-B-estradiol.

células epiteliales.

fibroblostos estromales.

heregulina.

antiestrógeno faslodex.

constante de disociación.

dominio de unión al ligando.

proteínas quinasas activadas por Mitógenos.

acetato de medroxiprogesterona.

matriz extracelular.

línea celular de mama normal murina.

4.1.! _I J‘ .LI'" a a r

progesterona.A! ' J J‘ .L

P" a a r

p. , 4‘, ' 4 r 4' * respondedores.

elemento respondedor a progestágenos.

antiestrógeno raloxifeno.

receptor de estrógenos.

receptor del factor de crecimiento fibroblóstico.

receptor de progesterona.

RU38.486: antiprogestágeno mifepristona.

promegestona; progestágeno sintético.

subcutáneo.

SCRP:

SERM:

TAM:

T-47D:

ZK 299:

secuencia nucleotídica del (ERPordenada al azar.

Moduladorselectivo del receptor de estrógeno.

antiestrógeno tamoxifeno.

línea celular de mama humana.

ZK 98.299: anfiprogesfágeno onaprisfona.

INDICE

Agracecimientos I

Resumen III

Summary Iv

Abreviaturas Ix

INTRODUCCION 1

1. Cáncer de mama

1. Hormonas y cáncer de mama 2

2. Biologia del cáncer de mama 3

2. Receptores hormonales

1. Receptor de progesterona (RP) 4

2. Receptor de estrógeno (RE) 6

3. Receptores esteroides de membrana 8

3. Tratamiento endócrino del cáncer de mama 9

4. Antiprogestágenos 9

1.leeprtstona o RU38486 11

5. Antiestrógenos

1. Tipo 1: Tamoxifeno o Nolvadex 12

2. Tipo 1: Raloxlfeno o Keoxlfeno (LY 156,758) 12

3. Tipo 2: Faslodex o FuIvestant (ICI182,780) 15

6. Mecanismos involucrados en la transición de L- - " ,. " ' ah- ..... .... ' " ,. 4 ' y en la resistencia al tratamiento hormonal

1. Selección de clones L ' J ,_ 4‘ ‘ 16

2.Mutaciones a nivel de receptores hormonales 16

3. Mutaclones en otros genes 16

4.Activación constitutiva de otras vias proliferatlvas 17

7. Factor de crecimiento fibroblástico (FGF)en cáncer de mama

1.Factor de crecimiento fibroblástico (FGF) 19

2. Receptores de FGF 20

3. Factor de crecimiento flbroblástico básico (bFGF) 21XI

4. FGFs en cáncer

5. RFGFs en cáncer

6.FGFsy hormonas esteroideas en cáncer

7. Desan'ollo de la glándula mamaria normal murlna

9° Relación estroma-parénquima tumoral

1. Regulación hormonal por el compartimento estmmal

5° Estrategia antísentido

1. Estrategia antigénica

2. Estrategia "anti-ARNm"3. Mecanismo de acción

4. Estrategias dirigidas a mejorar la técnica antisentido

5. Ingreso a Ia célula6. Estructura de los ODNs

7. Elección del ODN

8. Especificldad de los ODNs9. ODNs IN VIVO

10.Propiedades toxicológicas

11. Terapia antisentido

10.Modelos experimentales

1. Modelo experimental de inducción de adenocarcinomas

mamariospor progestágenos

II. OBJETIVOS

III.MATERIALES Y MÉTODOS

1.EXPERIMENTOSIN wvo

2. EXPERIMENTOS IN VlTRO

1.Cultivos primarios

2.Repique de células

3.Ensayos de proliferación celular

a) Incorporación de 3H-timidina

b) Recuento celular

4.Ensayos de bindlng

5. Extractos tumorales y celulares

6. Western blot

7.Inmunohistoquimica 626.Inmunofluorescencla 64

9.Identificación de celulas apoptóticas (TUNEL)en secciones tlsulares 64

10.Moblllty Gel Shift 6411.Anáiisis Estadístico 66

IV. RESULTADOS es

1.CAPÍTULO1: Receptor de progesterona

1.Efecto del bloqueo del RP sobre Ia proliferación celular inducida por MPA. 69

2.Rol de la isofonna B del RP sobre la proliferación celular inducida por MPA. 72

3.Efecto del bloqueo de ambas isoformas del RP sobre la estimulación celular

inducida por factores de crecimiento. 76

4.Efecto del bloqueo de ambas lsofonnas del RP sobre la proliferación celularPi in vitro. 62

5.Investigar el efecto del bloqueo de ambas Isoformas del RP sobre elcrecimiento tumoral PI in vivo. 84

6.Efecto del bFGF sobre la activación genómlca del RP en un tumor PD:

Mobility Gel Shift. 93

7.Activación genómlca del RP en un tumor Pl: Mobility Gel Shift. 95

6.Caracterización dela expresión de bFGFy RFGFsen eI desanollo

de Ia glándula mamaria normal. 97

9.Caracterización de Ia expresión de bFGF y RFGFs en un tumor PD

y sus variantes Pi. 101

10.Estudiar la expresión de bFGF en extractos de tejido tumoral. 107

11.Estudiar Ia expresión de bFGF en extractos celulares de células

epiteiiaies y flbroblastos estromales. 109

12.Efecto del estroma Pl sobre la proliferación celular de celulas epiteliales PD. 111

13.Crecimiento tumoral in vivo de células epitellales provenientes de un

tumor PDjunto con fibroblastos estromaies provenientes de un tumor Pl. 113

2. CAPÍTULO2.-Relación entre RE y RP

1.Investigar el efecto del bloqueo del REsobre la proliferación celular

inducida por MPAy factores séricos en cultivos primarios de un tumor PD. 115

3.CAPÍTULO 3: SERMs

1.Efecto del Ezy los antiestrógenos tamoxifeno, raioxifeno e ICl162.780

sobre la proliferación celular inducida por MPAy factores séricos. 121

2.Efecto de los antiestrógenos sobre la inhibición de Iaproliferación celular

inducida por el E2. 124

3.Efecto del E2y los antiestrógenos tamoxifeno, raioxifeno e ICi 182.760

XIII

sobre la síntesis de RP.

¿Efecto del tamoxifeno y el raloxlfeno sobre el crecimiento tumoral.

v. DISCUSIÓN

VI. RESUMEN DE RESULTADOS Y CONCLUSIONESVII. REFERENCIAS

INTRODUCCIÓN

Cáncer de mama

EI cáncer de mama es causa de muerte del 20% de las mujeres que tienen cáncer y su

incidencia ha aumentado en los últimos años de modo que se considera que una de cada nueve

mujeres de los Estados Unidos desarrollará cáncer de mama (1). Es por esto que no llama la atención

que esta enfermedad haya sido el foco de atención en cuanto a los estudios que involucran diagnóstico

temprano, agentes etiológicos y tratamiento.

Hormonas y cáncer de mama

Varias hormonas, y en especial los estrógenos, parecen cumplir un papel fundamental en el

cáncer de mama humano. A continuación se enumeran factores de riesgo relacionados oon hormonas,

que se asocian a mayor incidencia tumoral en cáncer de mama humano:

9’ Menarca temprana.

. Menopausia tardía.

. Primer embarazo tardío.

. Dar a luz sin amamantamiento posterior o períodos de amamantamiento cortos.

. Nuliparidad y/o fallas en la ovulación.

T‘QQOU Obesidad en mujeres post-menopáusicas.

g. Dietas ricas en grasas y proteínas.

3' . Tratamientos prolongados con dosis farmacológicas de estrógenos.

El efecto protector de una menopausia temprana así como también una menarca tardía

demuestran que la exposición durante los ciclos menstruales normales a 17-B-estradiol (E2) y/o

progesterona aumentan el riesgo de contraer cáncer de mama, probablemente debido a que las

hormonas ováricas estimularían directa o indirectamente la proliferación celular de las células

mamarias. La nuliparidad, un primer embarazo tardío y tratamientos prolongados con dosis

farmacológicas de estrógenos implicanuna exposición prolongada a picos de estrógeno durante el ciclo

menstrual el cual aumentaría el riesgo de contraer Ia enfermedad. EI amamantamiento tiene un efecto

protector sobre Ia mama ya que induce la diferenciación del tejido mamario. La obesidad y el consumo

de dietas ricas en grasas y proteínas aumentan el riesgo de contraer la enfermedad ya que estaría

asociado a los altos niveles de estrógenos circulantes formados a partir de Ia aromatización de la

androstenediona en el tejido adiposo (2;3).

A pesar de que Ia mayoría de las evidencias apuntan a los estrógenos como principales

responsables, se ha sugerido últimamente que la progesterona puede tener importancia en el proceso

de transformación de la glándula mamaria. Las siguientes observaciones estarían relacionadas con

dicho riesgo:

a. Un comienzo temprano de los ciclos ovulatorios regulares.

b. Los anticonceptivos orales combinados de estrógenos y progesterona en mujeres jóvenes

asociados a un pequeño incremento en la incidencia de tumores (4).

c. Es controvertido el efecto de la inoculación de anticonceptivos de acción prolongada, por

ejemplo el acetato de medroxiprogesterona (MPA)depof como factor de riesgo (5).

d. Existe un aumento de riesgo de contraer cáncer de mama con la terapia conjunta de

progestágenos y estrógenos en la post-menopausia (6).

Durante años se postuló que los efectos proliferativosde los estrógenos y diferenciadores de la

progesterona en el útero eran extrapolables a la glándula mamaria. En los últimos años han surgido sin

embargo, numerosas evidencias epidemiológicas que se han sumado a las experimentales que

apuntan a un papel protagónico de los progestágenos en cáncer de mama.

Recientemente, una comunicación del Woman Health Initiative(WHI)Group suspendió un ensayo

clínico en el cual se trataban a un grupo de mujeres postmenopáusicas con útero intacto con MPA y

estrógenos oonjugados durante aproximadamente 5 años. La razón de la suspensión fue por el

aumento en la incidencia de cáncer de mama en este grupo y no en el grupo tratado con estrógenos

solamente. Este es el primer ensayo controlado y randomizado que confirma que la terapia de

reemplazo con estrógenos y MPAaumenta el riesgo de incidencia de cáncer de mama invasor (7).

3. Biologia del cáncer de mama

Se postulan en el cáncer de mama distintos momentos evolutivos o etapas biológicas. Estas

etapas cuya expresión fundamental es un incremento progresivo de la agresividad clínica, se asocian a

patrones histológicos y biológicos específicos: lesiones preneoplásicas y lesiones invasoras hormono­

dependientes y honnono-independientes, estas últimas en general expresión de progresión y

diseminación. Los mecanismos que disparan la progresión a través de las distintas etapas y que

culminan con la adquisición de un crecimiento autónomo (hormono-independiente) se desconocen pero

su estudio es de fundamental importancia. Según el estadío en que se encuentra el tumor en el

momento del diagnóstico será el tratamiento elegido. En la clínica se predice el grado de dependencia

hormonal evaluando la presencia de receptores hormonales.

Receptores hormonales

En la clínica, se utiliza la cuantificación de receptores de estrógenos (RE) y de progesterona (RP)

para predecir la respuesta tumoral al tratamiento hormonal. Entre los receptores de esteroides se

incluyen además de los FlEy RP, los de andrógenos (RA), glucooorticoides (RG) y mineralocorticoides

(RM). En ausencia del Iigando, los receptores se encuentran asociados a complejos proteicos que

incluyen proteinas de shock térmico como hsp 90 (proteina de 90 kDa) y hsp 70 (proteina de 70 kDa), y

pueden ser citoplasmáticos o nucleares. Una vez en el núcleo, los receptores hormonales esteroides

ditundirían hacia el citoplasma y serian transportados en forma activa de vuelta al núcleo. La unión oon

el Iigando lleva a Ia disociación del complejo proteico, a Ia dimerización del receptor y a la unión con

una secuencia consenso en el ADN,el elemento respondedor de hormonas (HFlE)que se trata de una

secuencia invertida separada por tres nucleótidos. Los RP, RG, RA y RM se unen todos a la misma

secuencia (AGAACAnnnTG'lTCT), mientras que los RE se unen a AGGTCAnnnTGACCT. El dímero

luego interactúa con factores de transcripción basales, otras proteínas de unión al ADNy ooactivadores

de manera que aumenta o disminuye la transcripción del gen en cuestión (8).

Los receptores nucleares se caracterizan por tener un dominio de unión al ADN oentral (DBD), un

dominio de unión a la hormona carboino-terminal (LBD), una región variable amino-tenninal y una

región bisagra. EI DBD se une a secuencias específicas en el ADN, los HFlE (“hormone response

element") (9). Este elemento está compuesto por dos dedos de zinc altamente conservados necesarios

para Ia unión al ADN in vitro (10). El LBDes el sitio de reconocimiento de la hormona y asegura tanto la

especificidad como la selectividad de la respuesta fisiológica llevando al reoeptor a un estado

transcripcionalmente activo (9). La secuencia bisagra incluye una señal de localización nuclear y, junto

con la región carboino-tenninal, es importante para Ia unión con proteinas de shock térmico. Tanto Ia

región amlno- oomo la carboino-tenninal poseen secuencias (Iigando-dependientes) involucradas en Ia

transactivación que se denominan AF-1 y AF-2. Estos dominios son porciones de Ia proteína que al

combinarse con el ADNproducen un aumento en Ia iniciación de Ia transcripción.

Receptor de progesterona (RP)

El gen del RP codifica para, por lo menos, nueve especies de ARNm con un tamaño que oscila

entre 2.5 y 11.4 kilobases. Los mensajeros dirigen la sintesis de al menos dos ¡sotonnas relacionadas

(isotorma A y B) que difieren en tamaño de acuerdo a la especie (11). Cuando las isoformas A y B se

encuentran en cantidades equimolares en células que contienen RP éstas se dimerizan y pueden

unirse al ADN de tres maneras: homodímeros A/A y B/B o heterodímeros A/B (12). La isolorma B del

RP posee un tamaño que varía entre 101 a 120 kDa mientras que la isolonna A oscila entre 79 a 94

kDa encontrándose truncada en su extremo amino-terminal. En roedores, el PM de FlPay RPAes 115 y

83 kDa, respectivamente (11). Ambas isotonnas se expresan en cantidades aproximadamente4

equimolares en aves y humanos mientras que la isoforma A es la predominante en el ratón (11). En

aves, ambas proteínas son sintetizadas por traducción alternativa de un único ARNm(13); en humanos

y ratón a partir de dos ARNm distintos que se sintetizan por transcripción alternativa a partir de dos

promotores (14;15) (Figura 1-1). AI examinar el cADN del RP humano se encontró otro sitio de

iniciación de la traducción rio abajo del sitio de iniciación de la traducción de la isoforma A. Esta

isoforma solo abarca el segundo dedo de zinc del DBD, secuencias de localización nuclear,

dimerización y el LBDcarboxilo-terminal. Esta tercer isoforma de 56 kDa se denominó RPC y no se le

ha dado una importancia significativa en los últimos años (16).

RP-B RP-A

C

1 165 567 633 680 933

AF-3 AN ms Am

Figura 1-1: Modelo del receptor de progesterona humano mostrando el sitio de iniciación de la traducción de la

isoforma B del RP (RP—B)y de la isoforma A (RP—A).BUS: segmento exclusivo de la isoforma B; DBD: dominio de unión al

ADN; H: región bisagra; LBD: dominio de unión al Iigando; NLS: secuencia de localización nuclear; AF: secuencias de

transactivación.

La mayoría de los receptores esteroides (RP, RG, RE) son fosfoproteínas, con lo cual se fosforilan

post-traduccionalmente. El RP humano se fosforila en, por Io menos, siete residuos de serina que se

encuentran en el extremo amino-tenninal (17). Tres de los sitios (Ser81,Serloz, Ser152)se encuentran en

el extremo amino-terminal exclusivo de la isoforma B, mientras que los otros se localizan en la región

compartida por la isoforma B y la isoforma A del RP (Ser190, Ser294,Ser345, and Ser4°°). Los sitios de

fosforilación se identificaron en células T47D de cancer de mama (citado en (17). El tratamiento de las

células con un agonista de progesterona estimula la fosoforilación del RP por lo menos, por dos

mecanismos. Cuatro de los sitios se encuentran basalmente fosforilados (Ser81, Ser162,Ser190,and

Ser‘OO)y con el tratamiento esta aumenta aproximadamente 2 veces. Los otros sitios se fosforilan en

respuesta a la hormona (Ser102,Ser294,Ser345)y luego de 1 a 2 horas de tratamiento la fosforilación es

máxima. Se postula que los dos grupos de sitios de fosforilación son blanco de distintas vías de

señalización por la diferente cinética de respuesta hormonal y podrían servir para distintos roles

funcionales y/o estructurales. El rol funcional de la fosofrilación del RP aún no se conoce. Estos

resultados en el RP humano junto con los otros receptores esteroides sugieren que la fosforilación

funciona para amplificar o atenuar la actividad transcripcional (citado en (17)).

Receptor de estrógeno (RE)

EI RE existe como dos isoformas distintas cada una localizada en genes separados y en

distintos cromosomas (18). EIprimero en describirse fue el REa con un peso molecular de 67 kDa (19),

pero los efectos de los estrógenos sobre tejidos y células de ratones knock out del REa (alfaERKO)

indicaban que debía existir otro receptor capaz de unírseles. Recientemente, se clonó el RED de

próstata de rata con un peso molecular de 54 kDa (20). Los RE comparten un 96 % de homología en el

DBDy un 59 % en el LBD(Figura 1-2). Se han descrito numerosas variantes de cada tipo de receptor

que son productos del corte y procesamiento alternativo de cada uno de los ARNm (citado en (21)).

Ambos receptores comparten una relación entre ellos similar a la que existe entre el receptor de

glucocorticoides y el de mineralooorticoides o entre el de glucocorticoides y progesterona, que

muestran homología entre sus dominios de unión al ADNy al ligando similares a las compartidas entre

los FiEocy REB. Los dos tipos de RE se expresan ampliamente en varios tejidos. En el humano, el

REB se expresa en tejido nervioso, sistema cardiovascular, sistema inmune, tracto uro-genital, tracto

digestivo, riñones y pulmones (22). Los REorse expresan mayonnente en glándula mamaria y útero si

bien el REB también se expresa en menor proporción (REodREB: 9/1) (23).

La distribución diferencial de ambos receptores oorrelaciona con respuestas biológicas diferentes. En la

glándula mamaria de roedores, durante la fase más proliferativa(iniciode la preñez) hay baja expresión

de REa y alta de REB (24). De hecho, esta última se mantiene constante y es la forma predominante

en la mama normal y tumores benignos. La situación opuesta (REor>>REB)parece característica del

cáncer de mama aunque este concepto todavía no está bien establecido debido a la escasa

información que existe concerniente a REB (23). Todos estos resultados llevan a inferir que el REB

podria tener un papel protector de Ia carcinogénesis (22), pero también existen evidencias que

contradicen esta afirmación. En un muestreo pilotosobre 240 tumores de mama Fuqua et al (citado en

(25)) evaluaron el porcentaje relativo de REor y REB. Si bien una alta propoción coexpresa ambos

receptores, REoc está más asociado con la expresión de RP y correlacionó positivamente con

parámetros biológicos indicativos de buen pronóstico como bajo grado y diploidía. En contraste, el

FiEBse correlacionó con un pronóstico menos favorable y aneuploidia, especialmente en ausencia de

REG. Apoyando estos resultados, Murphy et al informaron que los tumores con mejor pronóstico

tienden a expresar una mayor proporción de REa (citado en (25)).

DBÜ Hinge

Figura 1-2: Receptores de estrógenos humanos. Se transcribena partirde dos genes diferentes. El

REB es más corto en su extremo N-terminal que el REoc. DBD: domino de unión al ADN; Hinge: región

bisagra y de la secuencia de localización nuclear; LBD:dominio de unión al Iigando. Los números dentro del

REB indican su homología con el REa.

El RE ha sido el foco de interés en el estudio del cáncer de mama, debido a la asociación

favorable entre su expresión y la respuesta favorable a la terapia endocrina (26). La terapia más

ampliamente usada es el tratamiento con el antiestrógeno tamoxifeno, Io que indica Ia importancia del

RE en el cáncer de mama. Desde hace más de 25 años se evalúa Ia expresión de RE, siendo éste un

buen marcador de sensibilidad a hormonas en la mama (21). La resistencia a la terapia hormonal

puede desarrollarse debido a cambios a nivel del RE mismo o vías de señalización pre y/o post

receptor. Se han propuesto al menos cuatro posibles mecanismos para Ia adquisición de resistencia a

la terapia hormonal (27):

1

2

Pérdida o mutación del RE.

Alteraciones de los niveles de otros mensajeros (AMPc) o activación de cascadas de

fosforilación (MAPK),o cambios en los niveles de co-activadores (Ej. CBP/p300, SRC-1) y

co-represores (Ej. N-cor/SMRT)que influencian la actividad transcripcional del RE.

3V Cambios en la sensibilidad/producción de factores de crecimiento, o interacciones

parácrinas célula-célula.

3 Cambios en el metabolismo del tamoxifeno que Iotransforman en un metabolito agonista.

La idea de mutaciones en el RE resulta, por su simpleza, la hipótesis más atractiva para

explicar Ia resistencia a Ia terapia hormonal. Durante años se ha invertido mucha energía en buscar

variantes del RE a nivel de ARNm y proteína. De hecho se han descrito numerosos productos

7

generados por corte y procesamiento alternativo del ARNm del REO.y últimamente de REB (28-30),

pero en la mayoría de los casos estos productos se encuentran en el tejido normal o no correlacionan

con mayor grado tumoral o resistencia al tamoxiteno. Estos datos llevan a un debate sobre Ia

malignidad de estas variantes y su papel en la adquisición de hormono-independencia y resistencia

hormonal (21;31). Paralelamente, se ha tratado de correlacionar la expresión de formas anormales

(truncadas, mutadas) del RE con el cáncer de mama y Ia resistencia a la terapia endocrina (21;31;32),

pero hasta el momento nada se ha podido concluirde estos estudios. También se ha demostrado que

mutaciones puntuales en el RE pueden provocar que un antiestrógeno con actividad antagonista

presente actividad agonista (33).

Receptores esteroides de membrana

Las hormonas esteroides pueden ejercer, además de los efectos genómicos, otros efectos que

son rápidos e insensibles a inhibidores de Ia transcripción. Estos efectos denominados no genómicos

se han descripto tanto para RE como para el RP (34) y se asocian a receptores de membrana.

Recientemente, se han descrito sitios receptores para estrógenos en membranas celulares de útero de

conejo (35) así como también de la línea celular MCF-7 de cáncer de mama humano (36). Estos

receptores tendrían una estructura similar a la del REa clásico puesto que son reconocidos por los

mismos anticuerpos. Un pequeño porcentaje de Ia unión del Iigando total (5-10 %, (37)) correspondería

a estos receptores de membrana. En particular, para el RP se estudió con mayor profundidad en

oocitos de Xenopus (38) y en espermatozoides humanos (39) y para el FtE en células tumorales de

hipófisis (40) y neuronas del hipocampo (41). A pesar de Ia acumulación de evidencias con respecto a

los efectos de membrana de estos receptores aún permanecen dudas con respecto a la identidad de

los receptores y a sus acciones celulares. Se postula que algunos efectos de membrana podrían

llevarse a cabo por receptores clásicos que activarían otras vías de señalización no convencionales. En

células T-47D de cáncer de mama, en 1998 Migliaccioet al (42) demostraron que los estrógenos

activan Ia vía de src/erk por una interacción entre el FiE y c-src. Además reportaron la activación por

progestágenos de la misma vía por interacción del RPBcon el FiEa e identificaron los dominios de

unión entre ambos receptores (43) postulando que serían receptores de membrana. En un trabajo

reciente publicado por nuestro laboratorio (44) se observan sitios receptores para progesterona con un

kd de 43 i 9 pM que correlacionan con efectos proliferativos in vitro a concentraciones de 10-14M y se

postuló que estos sitios podrían corresponder a receptores de membrana. Recientemente se han

clonado RP de membrana que pertenecen al grupo de receptores acoplados a protéina G (45). En

agosto del año 2003 se publicó un trabajo en el que los autores demuestran la existencia de receptores

de membrana de RP que son reconocidos por los mismos anticuerpos que reconocen los RP nucleares

en células endoteliales humanas de aorta (46).

Tratamiento endócrino del cáncer de mama.

La terapia endócrina en el cáncer de mama humano se basa en inducir Ia alteración del entorno

hormonal, en particular Ia disminución en los niveles de estrógenos, antagonizando así la acción

estimuladora del crecimiento de los mismos. Esto permite reducir el crecimiento del tumor mamario en

muchas especies (47). En un 70-80% de los pacientes con cáncer de mama, los tumores expresan RE

(RE+) y RP (RP+) y la respuesta al tratamiento hormonal antiestrogénico es favorable. La expresión de

ambos receptores es altamente indicativa de un FlEfuncional y, en consecuencia, de una respuesta

favorable al tratamiento. De todas maneras, en la gran mayoría de los cánceres de mama, el

tratamiento hormonal cesa de ser efectivo luego de un cierto tiempo; la enfermedad recurre y se

disemina (48). El tipo de tratamiento puede ser ablativo o aditivo:

—l v Terapias ablatlvas

a) Ootorectomía.

b) Adrenalectomía e hipotisectomía.

2V Terapias adltlvas

Andrógenos.

Progestágenos.

a

b

c Antlprogestágenos.

d Análogos del factor LHRH.

e Glucocorticoides.

f) Antleatrógenos.

9

h

V Interferencia con esteroidogénesis adrenal.

Inhibidoresde aromatasa.V

El más utilizado es el tratamiento con el antiestrógeno tamoxiteno aunque recientemente hay

ensayos clínicoscon antiprogestágenos.

Antipr'ogestágenos

Los antagonistas hormonales sintéticos son extremadamente útiles como herramientas clínicas y

experimentales. En los últimos años el estudio de los antiprogestágenos ha sido de gran interés por dos

razones principales:

- Potencial terapéutico: en Ia interrupción de un embarazo temprano, como desencadenante

del trabajo de parto y para el tratamiento de tumores honnono-dependientes.

- Para utilizarloscomo herramienta para estudiar el mecanismo molecular de acción hormonal.

Los antiprogestágenos pueden actuar en todos los niveles de acción hormonal. Estos son:

activación, dimerización del receptor y unión de los dímeros a las secuencias específicas en el ADN

(49). Algunos autores optaron por dividirlosen dos categorías de acuerdo a su mecanismo de acción:

Tipo I: ZK 98299 u onapristona

Tipo II: RU 486 o mifepristona y ZK 112993

Los de tipo I actúan impidiendo Ia unión del RP al ADN mientras que los de tipo H permiten la

unión del RP al ADN aunque impiden la activación de la transcripción (50). Cada antiprogestágeno

posee distinta potencia inhibitoriaque estaría controlada por numerosos factores como: la afinidad por

el RP, la afinidad del complejo antagonista-receptor por el HRE. el número y cantidad disponible de

HRE en un promotor y otros factores (12).

Se describieron diversos mecanismos para explicar la acción inhibitoria de los

antiprogestágenos:

1. Clásico. inhibicióndirecta dela acción agonisla.

El antagonista se une al RP que a su vez se une al HRE y, como consecuencia impide la

regulación de la transcripción. Este mecanismo involucra, en primer lugar, la competencia entre

ambos Iigandos (agonista y antagonista) por ocupar el RP, y en segundo lugar, la competencia

entre los complejos Iigando-RP para su unión a los HRE.

En general, ambas isofonnas poseen diferente potencial inhibitorio y, en concentraciones

equimolares de ambas se observó que la isoforma A del RP (RP-A) unida a su antagonista es un

inhibidor transcripcional y proliferativomás fuerte que la isoforma B (RP-B) unida a su antagonista.

2. No convencional. Inhibicióninducida por el complejo antagonista-RP sin la unión directa al ADN

en los HRE.

Existen evidencias de diversos mecanismos que podrían estar involucrados:

- En células que tienen HRE. el complejo antagonista-RP podría estar secuestrando un

coactivador requerido por el complejo agonista-FiP unido al HRE. La RP-A sería un

inhibidor más potente que Ia RP- B por este mecanismo.

- Además se encontró que la RP-A ocupado por antagonistas (no necesita estar unido a

HFiE) pueden inhibir Ia transactivación por RE en una construcción conteniendo una

secuencia consenso para estrógenos. El mecanismo se desconoce pero podría tratarse de

una proteína regulatoria común a la función de varios receptores de hormonas esteroides.

- Finalmente, otro mecanismo de inhibiciónde la transcripción restringido a RP-A es a través

de sitios de unión al ADN no canónicos. La RP-A unida al antiprogestágeno inhibiría Ia

transactivación constitutiva utilizando este promotor.

Por otra parte, se sabe actualmente que bajo ciertas condiciones, los antiprogestágenos pueden

tener efectos agonistas, por ahora restringidos a la RP-B, independientemente del modelo utilizado.

Existen diversos mecanismos propuestos todos independientes de la unión al HRE canónico:

- Los receptores no se unen directamente al ADN sino que interactúan con otras proteínas

que sí Io hacen, y activan la transcripción.

- Los receptores se unen a otros sitios de unión al ADN distintos de los HRE activando la

transcripción (12).

Posteriormente, Sarton'us ef al (51) demostraron en la línea celular de cáncer de mama humano

T47D, en presencia de concentraciones elevadas de AMPc, determinados antiprogestágenos

(mifepristona, ZK 112993) pueden cambiar su efecto de antagonista (en ausencia de concentraciones

altas de AMPc) a agonista, cuando predomina la isoforma B del RP. Este efecto no se ve con la

isoforma A ni con el antiprogestágeno onapristona. Éste no funciona como agonista, ya sea porque no

se une al HFiEo Io hace en forma anómala. Para que el antagonista unido al RP active Ia transcripción

bajo el control del AMPc el receptor debe estar unido al ADNaparentemente en HRE. Estos resultados

son consistentes con el hecho de que la dirección de la transcripción esté indirectamente regulada por

proteínas coactivadoras cuya actividad estaría controlada por fosforilacióndependiente de AMPc.

Mifepristona o RU 38486

La mifepristona es, hasta el momento, el único antiprogestágeno utilizado terapéuticamente. Se

trata de un potente antagonista de la progesterona y los glucocorticoides, uniéndose con alta afinidad a

ambos receptores (50). La constante de disociación para el RP humano y de roedores es de

aproximadamente 2 x 10-9M, la cual es similar a Ia del progestágeno sintético R5020 y mayor que la de

la progesterona (52). No existen diferencias en cuanto a Ia especificidad, afinidad y estabilidad de la

unión del RP al ADN al comparar la mifepristona con el R5020 (53). La mifepristona activa el RP,

induce su oligomerización y su unión a HRE (49). Luego de su unión al ADN, inhibe la activación del

receptor quizás comunicándose con la maquinaria transcripcional a través de interacciones proteína­

proteína (50). La unión al RP humano genera su hipertosforilación aún mayor que la observada al

ll

utilizar el agonista H5020. Se puede estudiar el efecto de los antiprogestágenos en cada uno de los

pasos desde que entra a la célula, interacciona con el receptor y su papel en la inhibición de la

transcripción. Se observó que promueve la unión al ADN ya que fueron necesarias altas

concentraciones de sal (similares a las utilizadas cuando se utiliza progesterona) para separar el

complejo mitepristona-RP del ADN. El antiprogestágeno permite la formación de homodímeros y

heterodímeros entre las isolormas A y B del RP. En cuanto a Ia transcripción se observaron

propiedades agonistas asociadas a la ¡soforma B del RP y antagonistas (52). La inactivación del RP

ocurre luego de aproximadamente una hora de la unión del complejo agonista-RP al ADNy los niveles

de receptores descienden en un 80-90% tardando mas de 24 horas en restaurarse. Por el contrario,

cuando se utilizamitepristona los niveles de receptores permanecen elevados por horas o días (52).

Antiestrógenos

Los antiestrógenos se clasificaron inicialmenteen dos grandes grupos:

o Tipo 1: Análogos de tamoxiteno o sus metabolitos. Poseen actividades mixtas agonistas o

antagonistas en ensayos de laboratorio de acuerdo al tejido donde ejerzan su efecto (SERM:

Selective Estrogen Beceptor Modulator).

o Tipo 2: Antiestrógenos puros. No poseen propiedades estrogénicas en ensayos de laboratorio.

1. Tipo 1: Tamoxlfeno o Nolvadex

Es el antiestrógeno más utilizado en la clínica y se lo clasifica como SERM debido a su acción

como agonista estrogénico en útero, hueso y sistema cardiovascular y antagonista en mama. En la

clínica se lo utiliza como terapia endocrina de primera línea en cáncer de mama avanzado y como

terapia adyuvante luego de la escisión del tumor primario. EI tamoxiteno es un Iigando del RE, se

metaboliza en el hígado y en menor medida en las células blanco. Como resultado de su metabolismo

se genera un metabolito activo denominado 4-hidroxitamoxilenque tiene mayor afinidad por el RE que

el tamoxiteno (54).

2. Tipo 1: Raloxlfono o Keoxifeno (LY156,758)

El raloxileno se lo clasifica como SERM ya que actuaría como antagonista estrogénico en

mama (55) y útero (56) y como agonista en hueso (57) y sistema cardiovascular (58). Estas

características hicieron que el raloxileno presente el perlil de un SERM que puede ser aplicado como

un agente preventivo de la osteoporosis con el beneficio adicional de prevenir el cáncer de mama y

enfermedades cardíacas. Tiene una alta afinidad por el RE aunque una menor actividad estrogénica

que el tamoxiieno en ensayos con útero de roedores (59). Es un compuesto con baja biodisponibilidad

por su rápido metabolismo. El hecho de que presente una vida media corta hace que no sea superior al12

tamoxifeno en dosis equivalentes. En Ia actualidad existen tres estudios clínicos con raloxiteno. EI

MORE (Multiple Outoomes of Raloxifene Evaluation), RUTH (Raloxifene Use for the Heart) y STAR

(Study on Tamoxifen and Raloxifene). El ensayo MORE fue diseñado para estudiar los efectos del

raloxiteno en Ia osteoporosis de mujeres posmenopáusicas. Al investigar las tasas de cáncer de mama

observaron una reducción en el riesgo de cáncer de mama entre las mujeres que tomaron raloxiteno

(60). EI ensayo RUTH involucra 10000 mujeres y pretende evaluar los beneficios del raloxiteno como

terapia cardiovascular finalizando en el año 2005. EI estudio STAR compara el antiestrógeno

tamoxifeno con el raloxiteno para determinar sus respectivos efectos en la prevención de cáncer de

mama. Este estudio está diseñado para mujeres mayores de 35 años que ya han entrado en el periodo

de Ia menopausia. El estudio incluye a 22,000 mujeres en Canadá, Estados Unidos y Puerto Rico y

concluiría alredeor del año 2006.

Mecanismo de acción

Los antiestrógenos tipo 1 se denominan SERMs ya que pueden ejercer un efecto agonista o

antagonista de acuerdo al tejido donde actúen. Los antiestrógenos tipo 1 parecen formar un complejo

con el receptor que no logra conformar la forma activa. Como resultado, el complejo es sólo

parcialmente activo en iniciar Ia activación génica (61).

Se han planteado distintas hipótesis para explicar la especificidad de tejido en el mecanismo de

acción de los antiestrógenos. Paech ef al (62) sugirió que la acción agonista podía ocurrir por medio del

REB que forme un complejo con el antiestrógeno y actúe activando genes respondedores a estrógenos

vía sitios AP-1. Otros autores plantean que células diferentes pueden tener distintos ambientes

intracelulares que determinan si un antiestrógeno es un agonista o antagonista. Estas diferencias

podrían resultar de distintos factores de transcripción y proteínas coactivadoras (citado en (63).

También se plantea Ia existencia de EREs específicos en Ia región promotora de determinados genes

que interactúen con el complejo RE-tamoxifeno. Es posible que la secuencia y el número de EREs en

un determinado promotor tenga algún efecto sobre como se considere al antiestrógeno

(agonista/antagonista) (64). Para complementar esta teoría se identificó un elemento respondedor a

antiestrógenos como un sitio alternativo para Ia activación de un gen específico (65).

En la figura 1-3 se representa esquemáticamente una de las teorías que pretenden explicar el

comportamiento dual de algunos antiestrógenos según el tejido o "ambiente" en el que se encuentren.

Se ejemplifica con el tamoxifeno y el panel A podría representar una célula de la glándula mamaria

mientras que el panel B podría ser una célula uterina. Existen dos sitios de activación de la

transcripción en el RE denominados AF-1 y AF-2, y se encontró que la región AF-2 depende de la

unión del E2 y es insignificante en presencia de tamoxifeno. En el ejemplo del panel A el RE sólo se

activa si se activan ambos dominios de transactivación (AF-1 y AF-2). Por Io tanto, el E2funciona como

13

agonista ya que activa ambos dominios y el tamoxifeno que sólo activa vía AF-1 forma un complejo

inactivo. En el panel B, por el contrario, basta la activación de AF-1 para formar un complejo activo.

Como el tamoxifeno activa AF-1, en este caso actuaría como agonista.

Figura 1 -3: Representación esquemática de la actividadantagonista (A)o agonista (B)del antiestrógeno tamoxifeno en

dos tejidos hipotéticos diferentes (adaptado dei Trends of Endocrinologyand Metabolism).

A

AF-t

AF-2

E2

RE

uságf)Tam

B

AF-1

AF-2Ez

Tam GFJ

Complejo activo

Complejo inactivo

——>6’Complejo activo

+6“!Complejo activo

3. Tipo 2: Faslodex o Fulvestant (lCl 182,780)

Teniendo en cuenta la acción agonista del tamoxífeno que trae aparejado un aumento en el

riesgo de contraer cáncer de endometrio, se desarrollaron nuevos antiestrógenos carentes de su acción

agonista.

Se lo clasifica como antiestrógeno puro por su falta de actividad como agonista estrogénico.

Fue descubierto por Wake/¡nget al (66) y éste y otros antiestrógenos denominados "puros" (como el ICI

164,384) se han desarrollado para sobrellevar los efectos negativos de los efectos agonistas dell

tamoxifeno y otros SERMs en el endometrio y para evitar o posponer el desarrollo de resistencia a Ia

terapia en el cáncer de mama (67).

El lCI 182,780 es un compuesto esteroideo con un mecanismo de acción distinto al tamoxifeno

y otros antiestrógenos no esteroideos. Se caracteriza por tener una cadena lateral alquilamina en la

posición 7a del anillo B en el esteroide con una longitud de 16 a 18 átomos de carbono. Además, se

agregaron átomos de fluoruro en Ia cadena lateral de manera de mejorar su solubilidad y su afinidad

por el RE (68). Estudios clinicos demostraron que inyecciones diarias de lCI 182.780 pueden reducir el

índice de proliferación medido por Ki67, los FtP y los RE en tumores de mama (69).

Mecanismo de acción

Inicialmente, se creía que los antiestrógenos puros impedían la dimerización del receptor y, por

lo tanto, no se unían a su sitio en el ADN (ERE: estrogen responsive element). En consecuencia, no

había activación génica y el compuesto sería un antiestrógeno puro (70). Sin embargo numerosos

trabajos han demostrado que los complejos antiestrógeno puro-RE pueden unirse al ADN aunque la

unidad es inactiva. Lo que los hace únicos es que provocan la degradación del RE en distintos

sistemas (69;71). Normalmente, el RE se sintetiza en el citoplasma y se transporta al núcleo donde

funciona como un factor de transcripción. Un antiestrógeno puro se une al RE y luego se destruye

rápidamente (63).

Mecanismos involucrados en la transición de hormona-dependencia a hormono­

independencia y en la resistencia al tratamiento hormonal

Como ya dijimos anteriormente, los tumores mamarios que en un principio son honnono­

dependientes indefectiblemente evolucionan hacia estadios de crecimiento autónomo y hormono­

independiente. Esto no sólo se ve en la clínica sino en distintos modelos experimentales. Los

mecanismos responsables de esta transición no se conocen y diversas hipótesis se han propuesto para

explicar estos fenómenos:

I J .Il A1. Selección de clones L Durante muchos años se sugirió que en los

tumores podrian coexistir poblaciones que expresen receptores hormonales y otras de crecimiento

autónomo. Con el tiempo se seleccionarian las poblaciones hormono-independientes. Bel/are et al

(72) sugirieron que las células más diferenciadas son las que expresan receptores y son eliminadas

en Ia terapia endocrina. Las células madres (sfem cel/s) serían las más inditerenciadas con alta

tasa de proliferación y no expresan receptores. El hecho de que exista un alto porcentaje de

tumores que no responde al tratamiento que sigue expresando receptores hormonales sugiere que

este mecanismo no sería el que prevalece.

2. Mutaclones e nivel de receptores hormonales: Mutaciones, rearreglos o deleciones en los

genes o ARNm para los receptores esteroides podrían alterar su función: como consecuencia

puede haber terminación prematura de la transcripción y producción de receptores que estimulan la

expresión de genes respondedores a esteroides aún en ausencia de hormona (73). Fuqua et al

(74) investigando deleciones en el RE observaron que al delecionar el exón 5 del RE, éste era

transcripcionalmente activo en presencia o ausencia de Iigando. Para el caso del RP, Vegefo ef al

(citado en (75)) demostraron que una construcción del RP con el extremo carboino-tenninal

truncado indujo falta de respuesta a progestágenos aunque oontirió plena actividad agonista a Ia

mifepristona.A pesar de que hay muchas evidencias experimentales que apoyan estas hipótesis, Ia

falta de correlación en la clínica entre presencia de mutaciones y resistencia al tratamiento sugiere

que estos no serian los mecanismos predominantes.

3. Mutaclones en otros genes:

a. Mutación en protooncogenes. La mutación de ras puede hacer que se active

constitutivamente y que los tumores no necesiten de la administración de hormonas para

crecer.

b. Mutación en genes supresores de tumores. Ej. p53. En células de cáncer de mama T-47D

Ia expresión de p53 desciende en presencia de progestágenos sugiriendo que los

progestágenos podrían estar estimulando la proliferación celular disminuyendo Ia proteína16

inhibidora. La pérdida de la hormono-dependencia lleva a una regulación negativa constitutiva

de p53 y este podría ser un mecanismo que lleve a un aumento en el crecimiento en ausencia

de hormona (76).

Mutación en ciclinas de G1.Poseen roles fundamentales en el control del ciclo celular y se

encuentran transcripcionalmente reguladas por esteroides. Recientemente, se demostró que

hormonas esteroides (incluyendo estrógenos) ejercen su efecto sobre la proliferación celular

afectando el control del ciclo celular en G1 (77).

Mutaciones en HRE: Se sugiere que podrían llevar a una activación constitutiva de la

transcripción de los genes a los que se une el complejo honnona-receptor (27).

4. Activación constitutiva de otras vias proliferativas

Factores de crecimiento. Estos se encuentran involucradosen la regulación del crecimiento

del cáncer de mama por mecanismos tanto autocrinos como paracrinos. Por Io tanto, Ia

honnono-independencia podría deberse a un desacople en la regulación por factores de

crecimiento (78).

Receptores para factores de crecimiento. Transcripción constitutiva o aumentada de

receptores de factores de crecimiento con efecto estimulatorio. Ej. cerbB-2 que es un receptor

huérfano ya que no se le conoce ligando. En células T-47D los progestágenos aumentan los

niveles de ARNm de EGF y REGF. Este efecto es dosis dependiente y puede ser revertido

por la administración de mifepristona (antiprogestágeno). Una secreción constitutiva de EGF

o REGF podría estar mediando el pasaje de hormono-dependencia a honnono-independencia

(76).

Activación constitutiva de oncogenes. En general se trataría de proteínas relacionadas

con la transducción de señales. Por ejemplo en ratones atímicos ovariectomizados

transplantados con células MCF-7 transfectadas oon un vector que sobreexpresa el

protooncogen Ras se vio que eran capaces de formar tumores aún en ausencia de

estrógenos (75).

Disminución en la secreción de un factor de crecimiento con efecto lnhlbitorio o

disminución del número de receptores. Ej. TGF-B que inhibe Ia proliferación celular en

células T-47D (76).

4. Activación de vías proliferativas que utilizan la via de receptores para esteroides. En los

últimos años se han descripto interacciones entre vías convencionales de estimulación de la

proliferación y la activación de vias de receptores hormonales. Por ejemplo, Vignon ef al (79)

observaron que los antiestrógenos podían inhibir la proliferación celular de células de cáncer de

l7

mama MCF-7 estimuladas con EGF o insulina en ausencia de estrógenos. Kato et al (80)

encontraron que el FlE podía ser activado (fosforilado) por EGF e lGF’s sugiriendo una

conversación cruzada entre ambas vías. Además en células tumorales humanas de T47D se

observó que el EGF y el TGF-a aumentan la respuesta a progestágenos. Este efecto estaría

mediado por la activación del receptor de EGF y no altera la unión del RP al ADN (81). Por otra

parte, se vio que el RP de pollo puede ser activado por neurotransmisores oomo Ia dopamina. Si se

muta Ia Ser623,pierde la capacidad de activarse por dopamina, aunque sí puede ser activado por

progesterona, lo que sugiriere que podría haber numerosas vías de activación hormono­

independientes (82). También se demostró una conversación cruzada entre la vía de RP y la del

AMPc (50). Estos segundos mensajeros y otros pueden afectar cascadas de fosforilacióncomo las

MAPK (proteínas quinasas activadas por mitógenos). La activación independiente de Ia

administración de esteroides se descubrió inicialmente para el RP de pollo (83) y recientemente

otros trabajos (84;85) continúan aportando nuevas evidencias de activación independiente de

Iigando. Últimamente también se está estudiando la posibilidad de que la expresión aberrante de

coactivadores de receptores esteroideos esté involucrada en Ia adquisición de la resistencia a

tratamientos hormonales (86).

Factor de crecimiento fibroblástico (FGF)en cáncer de mama

Algunas hormonas esteroides, sus antagonistas y también un gran número de factores de

crecimiento modulan la proliferación celular del cáncer de mama, y se ha demostrado que el medio

condicionado de células tratadas con estrógenos contiene distintas proteinas como proteasas y

factores de crecimiento. Algunos de estos factores de crecimiento podrían actuar en forma autocrina

sobre células epiteliales que posean los receptores adecuados, o podrían ser liberados al medio y

actuar sobre el estroma, el cual a su vez podría producir otros factores que actúen en forma paracrina

sobre las células epiteliales. Los factores de crecimiento que más se han asociado a la proliferación de

células tumorales mamarias son los de la familia del factor de crecimiento epidémiico (EGF), factor de

transformación alfa (TGF-a), la familia de los factores semejantes a Ia insulina I y H (IGF-I y II), y

algunos miembros de la familia del factor de crecimiento fibroblástico (FGF) (87).

Factor de crecimiento fibroblástico (FGF)

La familia del factor de crecimiento fibroblástico está compuesta por alrededor de 20 miembros

distintos. Los distintos Iigandos se agrupan de acuerdo a una estructura común. Entre sus

caracteristicas estructurales se encuentran una elevada afinidad por heparina y por

glicosaminoglicanos similares a la heparina (HLGAGs)además de un centro de 140 aminoácidos con

alta homología entre los distintos miembros de Ia familia. El oentro se pliega en doce cadenas

antiparalelas B que forman un cilindrocerrado por las zonas más variables amino- y carboino-terminal.

Con la excepción del FGF-1 o aFGF, FGF-2 o bFGF y FGF-9 los demás miembros presentan una señal

de secreción que los conduoe fuera de la célula y suelen tener una señal de localización nuclear.

Además, pueden presentar modificaciones postraduccionales como la glicosilación y Ia acetilación.

Históricamente, Ia nomenclatura de estas proteínas estuvo dada por su actividad biológica y, es por

ello, que se los denomina “FGF”seguido de una designación numérica. El uso de estas iniciales no

significa que todos estos factores estimulan el crecimiento fibroblástico pero sí que pertenecen a una

familia de proteinas estructuralmente relacionadas (Ejemplo: el FGF-7 no estimula eI crecimiento de los

fibroblastos)(88).

Las funciones generales de los FGFs incluyen desarrollo embrionario normal, reparación de

heridas y desarrollo y progreso tumoral mientras que entre las funciones celulares generales

encontramos actividades mitogénicas, quemotácticas y angiogénicas (88).

Almacenamiento y liberación

Los FGFs se almacenan en la membrana basal unidos a heparán sulfato que cumple la función

de protegerlos de Ia degradación por enzimas proteolíticas y sirve como reservorio de FGFs. El

heparán sulfato se encuentra generalmente unido covalentemente con cadenas laterales a

proteoglicanos de la superficie celular. La liberación del factor se produciría por cIivaje enzimático de

los componentes de la matriz extracelular por medio de proteasas o heparanasas, y durante el

desarrollo embrionario se ha descripto la unión a una proteína transportadora que los lleva a su

receptor.

Receptores de FGF

Los receptores de FGFs pertenecen a la superfamilia de los receptores de inmunoglobulinas

con un dominio transmembrana, un extremo amino-terminal extracelular y un dominio carboino-terminal

intracelular. Este último posee actividad tirosina-quinasa. Se han descripto cuatro receptores para

FGFs (RFGF-1, RFGF-2, RFGF-3 y RFGF-4) con una homología a nivel de proteína que varía del 55 al

72% y cada uno de ellos posee varias variantes por splicing altemativo(88). Un trabajo de Moscatel/i et

al (89) con células de riñón de hamster recién nacidos demostró la existencia de dos sitios de unión

para los FGFs: uno de alta afinidad (20 pM) y otro de baja afinidad (kd: 2 nM). Se concluyó que el sitio

de baja afinidad no sería fisiológicamente relevante y que correspondía a la unión del FGFs a

moléculas de la superlicie celular con homología a la heparina mientras que el sitio de alta afinidad

correspondía a la unión del FGFs a su receptor. Más tarde, Yayon et al. (90) concluyó, que por eI

contrario. los HLGAGsson fisiológicamente relevantes ya que son necesarios para la unión del bFGF a

su sitio de alta afinidad en el receptor presente en Ia superlicie celular. Encontraron que células CHO

que expresan RFGF-t y HLGAGs unían 125l-FGF-2mientras que células CHO mutantes que no

expresan los HLGAGs no eran capaces de unir el 125I-FGF-2aunque esta unión podía ser restaurada

por el agregado exógeno de heparina o heparán-sulfato. En consecuencia, propusieron que tanto los

HLGAGs libres como los adheridos a la superficie celular son capaces de impartir un cambio

coniormacional en el FGF-2 de manera de permitirla unión a su receptor. Además se demostró que los

HLGAGs no sólo facilitan la unión al FlFGF-1 sino también al FlFGF-2 (91) y que esta unión facilita la

señalización por FGFs, disparando la mitcgénesis y la angiogénesis (92:93). Basados en los

conocimientos que se tienen hasta el momento, se postulan dos posibles mecanismos para la

activación del RFGF:

o Los HLGAGs oligomerizan las moléculas de FGFs ya que la heparina puede unir varias

moléculas de FGF. Esta oligomerización facilitaría la dimerización del RFGF necesaria para Ia

activación del receptor (94). Este modelo no explica la interacción necesaria entre el HLGAGy

el RFGF.

20

o Dos moléculas de FGFs se unen a dos moléculas de RFGF formando un dímero que se

estabiliza sólo con el agregado de un HLGAG.Este modelo contempla la interacción de los tres

componentes del complejo (95-97).

Mecanismo de acción

EI Iigando se une a su receptor permitiendo su dimerización y estabilizándose la unión por el

HLGAG.EI receptor puede dimerizarse formando homo- u heterodímeros y existen mecanismos para

impedir Ia dimerización del receptor en ausencia de FGFs. Una vez ocurrida la dimerización se produce

la auto- y transfosforilación de cada uno de los monómeros en sus colas citoplasmáticas que llevan a Ia

activación del receptor. EI receptor activado recluta proteínas específicas a su cola citoplasmática y las

modifica por fosforilación. Estas proteínas pueden Iocalizarse interaccionando con sus dominios SH2 y

residuos fosfotirosina específicos en el RFGF. La propagación de Ia señal se da fundamentalmente por

activación de vias proliferativas como las de MAPKy ka (88).

Factor de crecimiento fibroblástlco básico (bFGF)

EI bFGF es un polipéptido catiónico aislado inicialmente a partir de un extracto de hipófisis

bovina (98) ya que era capaz de estimular el crecimiento de células 3T3 en cultivo. Una vez aislado el

factor se observó que se trataba de una proteína de 146 aminoácidos con un peso molecular de 16.4

kDa, mientras que el bFGF aislado de placenta humana tenía 157 aminoácidos y con un peso

molecular de 17.5 kDa. En Ia actualidad se han descripto 4 isofonnas por traducción alternativa de un

mismo AFiNmensajero que se traducen en cuatro proteínas distintas cuyos pesos moleculares en el

humano son: 17.8 kDa, 22.5 kDa, 23.1 kDa y 24.2 kDa (estos pesos moleculares varían levemente de

acuerdo a Ia especie) (99). La ísofonna de 18 kDa (16.4 kDa en el bovino) fue descripta en primer lugar

y presenta 157 aminoácidos (146 aminoácidos en el bovino; (98)) que comienza su traducción en el

primer codón AUG del ARN mensajero. El resto de las isofonnas comienzan su traducción en distintos

codones CUG ubicados río arriba del primer AUG. Ninguna de las isofonnas arriba mencionadas posee

una señal de secreción por lo que se desconoce su mecanismo de secreción fuera de Ia célula. La

ísofonna de 18 kDa no posee señal de localización nuclear por lo que se Ia considera

fundamentalmente citoplasmática (100) mientras que las demás isofonnas poseen esta señal que las

destinaría al núcleo (101). Aún cuando se las encuentra en el núcleo está poco claro el rol de esta

secuencia. La presencia de receptores de membrana (102), el efecto inhibitorioal utilizar anticuerpos

neutralizantes, su localización en la membrana basal in vivo (103) y su presencia en el medio

condicionado de cultivos celulares in vitro, indicarían un mecanismo de acción extracelular del bFGF

(104). El bFGF posee 4 cisteínas de las cuales dos son conservadas aunque no serían importantes

para su rol mitogénico ya que aún cuando se mutan no cambia Ia estructura ni la actividad mitogénica

21

de la proteína en células 3T3. El bFGF puede fosforilarse tanto por pkc (en serina 64) como por pka (en

treonina 112). Se vio que la fosforilación en serina no cambia su actividad biológica, ni su unión a

heparina o a su receptor. La fosforilación en treonina, que se encuentra en el dominio de unión al

receptor, aumenta de 3 a 8 veces dicha unión. Igualmente, aún no se conoce la regulación de las

fosforilaciones, y por lo tanto, que rol fisiológico tendria.

Se expresa en prácticamente todos los tejidos estudiados, tanto normales como malignos

(105). Originalmente fue descripto como un mitógeno para fibroblastos aunque luego se observó que es

un potente mitógeno de otros tipos celulares también (106). Entre sus funciones más importantes

encontrarnos su rol como factor angiogénico ayudando a la proliferación e invasión de células

endoteliales necesarias para la formación de capilares. Es un potente mitógeno de diversos tipos

celulares incluyendo, entre otras, células endoteliales capilares, células de múscqu liso vasculares y

células de Ia granulosa (98). Los ratones knockout para bFGF fueron viables y fenotipicamente

indistinguibles de los ratones salvajes. En una examinación más minuciosa no se observaron falencias

a nivel angiogénico aunque si una disminución del tono muscular. Con la hipótesis de que el aFGF

podía estar reemplazando el efecto angiogénico del bFGF en los ratones knockout, se realizaron

ensayos con ratones knockout para ambos factores. Como resultado se obtuvieron ratones con

defectos fenotipicos similares a los ya observados sugiriendo que el aFGF no es el factor que

compensa Ia falta del bFGF (107).

FGFs en cáncer

En eI proceso neoplásioo todos los componentes de la cascada de señalización son

potenciales oncoproteínas que pueden llevar a la pérdida de regulación y luego desencadenar en un

crecimiento tumoral. Las etapas que pueden verse alteradas en este proceso son desde la liberación

del factor en eI espacio extracelular, la unión a su receptor, la transducción de señales y la proliferación

celular (88). Esta última puede verse afectada por la progresión del ciclo celular o por la inhibición de

vías de muerte celular. Si analizamos Ia expresión alterada de FGFs existen tres posibilidades:

o Secreción y sobreexpresión por las células tumorales. En células de glioma humano se observó Ia

expresión de bFGF en el tejido tumoral y no en eI tejido normal mientras que los RFGF se

encontraron en ambos tipos de tejido indicando que el factor podria actuar de manera autocrina y

paracrina (108).

o Secreción por células estromales en respuesta a una señal tumoral. Se observó expresión de

FGF-5 por parte de fibroblastos pancreáticos en respuesta a una señal mitogénim liberada por las

células tumorales que sobreexpresan EGF, PDGF y TGF-or. La señalización se completa con Ia

presencia de RFGFs en las células epiteliales tumorales (109).

o Secreción por células tumorales en respuesta a una señal no tumoral. Las células del Sarcoma de

Kaposi producen bFGF en respuesta a una señal (TNF-a, IL-1, INF-y) proveniente de los

fibroblastos (110).

Por otra parte, puede verse afectada la liberación del factor de Ia matriz extracelular. El bFGF se

libera de la matriz extracelular por la acción de heparanasas o enzimas proteolíticas (111). Como

resultado, el bFGF se acerca a sus receptores de membrana. Se cbsen/ó que el aumento en Ia

expresión de heparanasas correlaciona con un carcinoma más invasivo y metastásioo. La liberación de

bFGF es consistente con su actividad angiogénica necesaria para los procesos de invasión y

metástasis (112). Del mismo modo el aumento de Ia actividad proteolítica también aumenta la

liberación de bFGF (88).

Además, puede alterarse el crecimiento celular actuando como mitógenos de las células

tumorales, promoviendo Ia angiogénesis en el tumor en crecimiento e inhibiendo Ia apoptosis. Este

último rol es conflictivoya que existen evidencias que lo asocian con un rol apoptótico (bajada de bcl-2)

(citado en (88) y otras con un rol antiapoptótico (aumento de bol-2) (113).

Existe una larga historia que liga Ia expresión inadecuada de FGFs con el desarrollo de cáncer

de mama. Las evidencias que Io asocian al cáncer de mama murino son fuertes aunque éstas se

debilitan en el cáncer de mama humano. De todas maneras los FGFs poseen una cantidad de

propiedades in vitro que sugieren que tienen el potencial para contribuir a la inducción, progresión y

metástasis del cáncer de mama. El bFGF, con su gran poder angiogénico, es el Iigando que ha sido

más ampliamente estudiado de Ia familiade FGFs. La mayoría de los estudios se han realizado con un

número limitado de muestras Io que llevó a resultados muchas veces conflictivos. Por ejemplo, en

estudios realizados sobre biopsias mamarias humanas se encontraron menores niveles al medir

proteínas y ARNm de bFGF en muestras tumorales comparado con el tejido normal o benigno (114),

mientras que otros estudios no encontraron diferencias (115) o mayores niveles (116-118). Por

inmunohistoquímica se reveló que el bFGF en tumores de mama humanos se encuentra asociado al

componente estromal y poco o nada en las células tumorales (119). En estudios realizados sobre

líneas celulares como MCF-7 y T47D existen resultados contradictorios que Io señalan como

proliferativo (120;121) o no proliferativo (122).

La expresión de bFGF en la glándula mamaria murina virgen, preñada y lactante ya ha sido

estudiada por otros autores (123) por radioinmunoensayo. Los estudios ¡n vitro usando lineas celulares

de mama son aún más conflictivos en cuanto al efecto del bFGF sobre su crecimiento. Existen

evidencias que Io señalan como proliferativo (120;121) y otras como inhibitorio del crecimiento de

acuerdo a las condiciones (122). Esto se debe probablemente a que el bFGF es multifuncionalya que

tiene distintas funciones que varían de un tipo celular a otro y de determinada condición de crecimiento

a otra. El trabajo de Fenig ef al (124) describe la inhibición del crecimiento en células MCF-7 aún

23

cuando observan paralelamente una activación de las MAPK(ERK 1 y ERK 2) que generalmente se

considera que señalizan efectos estimulatorios del crecimiento. Souttou et al (125) observaron una

acción autocrina del bFGF en el crecimiento de líneas celulares de cáncer de mama humanas

sugiriendo que el bFGF es importante en los eventos tempranos que llevan a la transformación

neoplásica de células epiteliales mamarias humanas.

Por otra parte, la mayor expresión en el estroma que en el epitelio tumoral también ha sido

descripta en otros sistemas tales como adenocarcinomas de próstata y (126;127) y carcinomas de

mama humanos En cáncer de mama humano hay trabajos que describen la expresión de algunas

isolon'nas (128;129) o todas (130) aunque no en tejido sino en líneas celulares. En Ia literatura se

describió una variante de splicing del RFGF-3 que se localiza en el núcleo tanto en líneas malignas

como normales (130).

RFGFs en cáncer

Los RFGF pueden ver alterada su expresión, pueden presentar mutaciones puntuales,

tomarse distintas variantes por splicingalternativo o alteraciones genómicas que lleven a su activación

independientemente de la presencia de Iigando (88). En distintos trabajos se encontró una

sobreexpresión de FiFGFs en distintos tipos de cáncer comparando con el tejido normal. Esto se

observó por inmunohistoquímica en cerebro (131), mama (128), próstata (132), glándula tiroides (133),

melanoma (134) y glándula salivar (135) de muestras tumorales.

Existen numerosos datos que mencionan la existencia de mutaciones puntuales en RFGFs

aunque ninguno de ellos se ve asociado a un comportamiento neoplásico sino a defectos en el

desarrollo (136). En estos casos se produce una activación Iigando-independiente del receptor y las

mutaciones pueden darse en cualquiera de los dominios del RFGF (137).

En el caso del RFGF-3 se detectó una alteración en el procesamiento post-transcripcional aunque

esta alteración tiene un rol desconocido en el cáncer de mama humano. Se reportó una variante de

splicing a la que le faltan los exones 7 y 8 que codifican para el dominio transmembrana pero que

mantienen intacto su dominio tirosin-quinasa y se localiza en el núcleo (130). Estos resultados arrojan

la posibilidad de un nuevo mecanismo de señalización autocrina en el núcleo aunque el rol que

ejercería esta variante nuclear permanece desconocido.

Finalmente, los rearreglos génicos también llevan a una activación Iigando-independiente de los

RFGFs. En una línea celular de osteosarcoma de rata se encontró una forma constitutivamente activa

del RFGF-2. Esto se debe a un rearreglo cromosómico que lleva a la formación de una proteína de

lusión con el RFGF-2 y a Ia formación de dímeros que se autofosforilan y activan constitutivamente Ia

vía de los FGFs (138). Otro caso es el observado en células mieloides humanas oomo consecuencia de

24

una translocación que lleva a la sobreexpresión del FlFGF-3y resulta en la activación autocrina de la

vía de los FGFs (139).

FGFs y hormonas esteroideas en cáncer

Los estrógenos, Ia progesterona y la prolactina son los reguladores priman'os in vivo del

desarrollo de la glándula mamaria mientras que los factores de crecimiento pueden considerarse como

mediadores o modificadores de la acción hormonal (140). El E2 es capaz de unirse a sus receptores

presentes tanto en el epitelio como en el estroma de la glándula mamaria, mientras que los receptores

de progesterona se encuentran sólo en el epitelio mamario. Sin embargo la mayor parte de las células

que proliferan en presencia de E2¡n vivo no poseen RE. Esto sugiere que el E2estimula la proliferación

celular por mecanismos indirectos que incluyen la inducción de factores de crecimiento o sus

receptores. El E2también puede afectar indirectamente el desarrollo de la glándula mamaria induciendo

la síntesis de RP en el epitelio mamario. La regulación de la síntesis de factores de crecimiento y de

sus RE o RP es todavía motivo de estudio. Entre las evidencias encontramos que el E2 estimula el

crecimiento ductal por un aumento en el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y sus receptores (141).

Otras evidencias surgen de que Ia expresión de factores de crecimiento puede cambiar durante el

desarrollo de la glándula mamaria sugiriendo una regulación hormonal (142). Imagawa W ef al (143)

observaron que el E2inhibió la expresión de una de las isoformas del RFGF-2 (RKGF) solo en ausencia

de progesterona mientras que en trabajos previos habían demostrado que el E2estimulaba Ia síntesis

en el estroma mamario de FGF-7 (KGF) in vivo.

Desarrollo do la glándula mamaria normal murina

La mama neonata consiste en cordones epiteliales conectados al pezón por un conducto

primario. Gradualmente se forman los conductos que terminan en brotes terminales. En Ia pubertad los

brotes terminales de los conductos mamarios se elongan produciendo células ductales y mioepiteliales

diferenciadas. Las células epiteliales rodean el conducto que, a su vez se rodea por una ó dos capas

de células mioepiteliales. A partir de los conductos primarios surgen las ramificaciones laterales que

permiten que se llene el tejido adiposo en todas sus áreas. Los conductos detienen su crecimiento

cuando llegan al límite del tejido adiposo (144). La preñez trae consigo los mayores cambios

morfológicos en Ia glándula mamaria del ratón adulto. El número de ramificaciones laterales

incrementa, seguido de la diferenciación lóbulo-alveolar en preparación para la lactancia. Finalizada la

lactancia, la involuciónse caracteriza por una apoptosis masiva de las células epiteliales y una extensa

remodelación tisular que tiene como resultado una glándula mamaria que morfológicamente es similar

a la encontrada en los animales nulíparos (145).

Relación estroma-parénquima en la glándula mamar-ia.

EI desarrollo y crecimiento de la glándula mamaria se encuentra mediada por complejas

interacciones entre hormonas y factores de crecimiento. El correcto funcionamiento y desarrollo de Ia

glándula mamaria también depende de interacciones entre células del estroma y el parénquima. Las

células estromales pueden regular el epitelio oon la producción de factores inhibitorios o estimulatorios

solubles. Además, los componentes de la matriz extracelular como colágenos, fibronectina y Iaminina

pueden actuar como moléculas de señalización a través de integrinas específicas en las células

epiteliales. Cada vez hay más evidencias de que efectos paracrinos podrían estar mediando

indirectamente numerosas respuestas a estrógenos y progesterona en la glándula mamaria (146).

El estroma abarca más del 80% del volumen mamario humano en reposo (147). El estroma se

encuentra compuesto por fibroblastos, células endoteliales, células de músculo liso, adipocitos, células

inflamatorias, células nerviosas y una red macromolecular de proteoglicanos y glicoproteínas que

conforman la matriz extracelular (citado en (148)).

El tibroblasto es la célula que se considera de mayor importancia en el compartimento estromal

y se encuentra íntimamente involucrada en dirigir el diálogo con el epitelio para mantener la

homeostasis tisular. Se han documentado numerosas alteraciones en los fibroblastos del estroma

adyacente a células epiteliales transformadas (citado en (148)).

Regulación hormonal por el compartimento eetromal

Los estrógenos y la progesterona son necesarios para la proliferación y morfogénesis de la

glándula mamaria normal. Los estrógenos permiten el desarrollo ductal durante la pubertad mientras

que ambos en conjunto median los cambios morfológicos y proliferativosde las ramificaciones laterales

de los conductos y la alveologénesis que ocurren durante la maduración sexual y la preñez. La

progesterona también es proliferativaen la mama humana pre-menopáusica y post-menopáusica.

Estudios realizados en tejido mamario de roedores y humano mostraron que marcadores de

proliferación celular como Ki67 rara vez colocalizan con los RE en la misma célula epitelial, sugiriendo

que la célula epitelial proliferativano expresa RE (149). Por otra parte, ensayos realizados en ratones

knockout y salvajes para el REa indicaron que la presencia de un estroma que expresa RE es

necesario para una respuesta proliferativa del epitelio inducida por E2 (150). A pesar de que estos

datos implican una acción directa del estroma en eI control de Ia proliferación celular epitelial mediada

por hormonas, estos resultados no son completamente extrapolables al humano ya que es cuestionado

si las células estromales humanas expresan RE (149). Esto indicaría la existencia de diferencias

fundamentales entre distintas especies en la regulación del crecimiento y morfogénesis epitelial por

parte del estroma. Estudios realizados por el grupo de Haslam (151) demostraron que fibroblastos

26

mamarios murinos que expresan RE pueden mediar la proliferación inducida por E2 en las células

epiteliaies a través del HGF. Observaron que el E2 era capaz de aumentar la producción de HGF por

los fibroblastos aunque el E2sólo no tenía un efecto proliferativosobre los cultivos epiteliaies.

Aunque los RP se expresan en las células epiteliaies durante la pubertad, ésta es menos

respondedora que la glándula mamaria adulta a los efectos proliferativos y alveologénicos de Ia

progesterona. La respuesta a progestágenos puede ser inducida en células epiteliaies púberes

quirúrgicamente recombinadas con estroma mamario adulto (152). En consecuencia, el estroma

mamario influye sobre la respuesta del epitelio al progestágeno. En experimentos realizados con

células adultas de glándula mamaria de ratón (153) encontraron que el R5020 sólo o con E2 era

incapaz de aumentar Ia proliferaciónde células epiteliaies. Cuando el progestágeno se agregaba junto

con medio condicionado de fibroblastos Ia proliferacióncelular de estas células sí aumentaba en mayor

proporción que con el medio condicionado sólo. Luego, demostraron que el factor presente en el medio

condicionado con el que interactuaba el R5020 era el HGF (Hepatocyte growth factor).

La matriz extracelular (MEC)actúa de diversas maneras para modular Ia morfología y proliferación

celular, actuando como un sustrato a donde las células se pueden adherir y como un reservorio de

factores de crecimiento. Se encuentra conectada al núcleo por una red de proteínas que incluyen

proteínas de adhesión transmembrana, el citoesqueleto y la matriz nuclear.

El estroma mamario también puede influir sobre el comportamiento de las células epiteliaies,

alterando la composición de Ia MEC que afecta vías de señalización mediadas por integrinas. Las

interacciones entre hormonas esteroides y factores de crecimiento y entre dos factores de crecimiento

se encuentran influenciadas por la composición de Ia MEC. Por ejemplo, el colágeno 1, Ia fibronectina

y, en menor medida Ia Iaminina, promueven un efecto sinérgico de EGF+IGF-1 sobre Ia proliferación.

Los progestágenos reducen la respuesta proliferativa a factores de crecimiento en presencia de

Iaminina. Esto sugiere que vías de señalización específicas de integrinas de la MEC pueden alterar

interacciones entre hormonas esteroides y factores de crecimiento. En estudios realizados in vivoen el

desarrollo de Ia glándula mamaria normal, se observó que sólo los niveles de fibronectina cambiaron

apreciablemente. La expresión de fibronectina se encuentra regulada honnonalmente por E2 y

progesterona. La integrina 05131 específica de fibronectina también se encuentra regulada

hormonalmente (154).

Aparentemente, las hormonas pueden actuar sobre el epitelio y el estroma y existiría una compleja

interrelación entre hormonas y factores de crecimiento actuando en estos compartimentos. Cambios en

Ia regulación de los mecanismos de señalización que llevan a alteraciones en Ia regulación de la

proliferación y diferenciación por factores de crecimiento pueden deberse a: pérdidas de receptores

hormonales, alteraciones en Ia síntesis de E2, en Ia matriz extracelular y en las interacciones epitelio­

estroma (155). Las irregularidades en los componentes del estroma-epitelio o aberraciones en sus

27

interacciones pueden inducir por ejemplo: inestabilidad genómica y estimular la proliferación oelular

tumoral. EI estroma podría ser algo más que una fuente de factores de crecimiento y MEC para las

células epiteliales tumorales mamarias. EIestroma podría promover la progresión tumoral proveyendo

la plataforma para generar heterogeneidad en las células tumorales.

Estrategia antisentido

La tecnología antisentido se ha convertido en una alternativa real en el tratamiento de

enfermedades producto de anormalidades genéticas como amplificacióno sobreexpresión génica. En

los últimosaños, se han desarrollado numerosas estrategias dirigidas al bloqueo de la expresión génica

y a medida que avanza el tiempo, aumenta la demanda por efectivos tratamientos contra el cáncer.

La estrategia antisentido consiste en la eliminación de la expresión de una proteína cuya función

se desea evaluar. Actualmente, esto puede llevarse a cabo actuando a dos niveles diferentes:

transcripción y traducción. Zamecnik y Stephenson (156) propusieron por primera vez esta estrategia

en 1978. Utilizaron un oligonucleótido de 13 bases para inhibir la replicación del virus del Sarcoma de

Rous in vitro. Luego, utilizaron otro oligodesoxiribonucleótido (ODN) complementario a un fragmento

del ribosoma para inhibir Ia traducción de proteínas virales.

Desde el punto de vista funcional, pueden definirse dos tipos de estrategias para interrumpir la

expresión génica: una “antigénica' y otra “anti-ARNm".

Estrategia antigénica

La estrategia antigénica apunta a inhibir la transcripción de un gen en particular con el agregado

de ODNs. Esto puede llevarse a cabo de dos maneras:

aV Recombinaclón homóloga. Se considera la mejor estrategia ya que elimina el gen por completo.

Las desventajas consisten en que es un tratamiento costoso ya que deben transfectarse grandes

cantidades de ADN(son construcciones grandes y pooo eficientes) y su uso se encuentra limitado

a determinados tipos celulares.

bV Formación de una triple hélice. La función génica puede interrumpirse con el agregado de

oligonucleótidos (polinucleótidos) que forman una triple hélice en general hibridizando en el surco

mayor del ADN. En este caso, el oligonucleótido actuaría inhibiendo la unión de factores de

transcripción e impidiendo el desenrrollamiento de Ia doble hélice (157). Esta técnica podría

utilizarse en cualquier tipo de célula sin la necesidad de un vector (158).

Estrategia “antl-ARNm"

La estrategia “anti-ARNm"apunta a inhibir la traducción de un transcripto en particular con el

agregado de oligonucleótidos de menos de 30 nucleótidos de ADNo ARN (159). Esto puede llevarse a

cabo de varias maneras:

a) Rlbozimas. Son moléculas de ARN enzimáticamente activas diseñadas para clivar un transcripto

en particular y, en consecuencia, inhibirla traducción.

b) ODNs antisentido. Son ODNs dirigidos a unirse a secuencias complementarias de ARNme inhibir

Ia traducción.

29

c) Oligonucleótldos antisentido de ARN. Son oligonucleótidos dirigidos a un ARNm

complementario que resultan en híbridos doble cadena ARN-ARNque impiden la traducción.

d) Oligonucleótldos de ARNdoble cadena o ARNde interferencia (iARN). En lo últimos años se

ha desarrollado una nueva técnica para silenciar la expresión de genes blanco que consiste en el

agregado de pequeños oligonucleótidos de ARN que forman un complejo activo con otros

componentes proteicos que se posicionan sobre el AFlN blanco y Io destruyen. Como

consecuencia se silencia la expresión génica (160).

En este trabajo de Tesis nos centramos en la utilización de ODNsantisentldo.

Mecanismo de acción

EI ODN está diseñado para que ejerza su efecto sobre un ARNm determinado dentro de Ia

célula. Para que esto ocurra se deben sortear ciertas dificultades y el proceso puede dividirse en

numerosos pasos:

1. Endocltosis del ADN desnudo. Los ODNs son poIianiones y, como tales casi no pueden

atravesar Ia membrana plasmática por difusión. Estos serían transportados dentro de Ia célula

por un mecanismo de endocitosis mediada por proteínas tipo receptor que se encuentran en

una gran variedad de células (161) o por una combinación de endocitosis de fluido de fase o

pinocitosis (intemalización de sustancias disueltas en el fluido extracelular que son atrapadas

en los hoyos recubiertos de clatrina e invaginados para formar vesículas recubiertas).

Sobrevivir al ataque de nucleasas. Luego de la intemalización, los oligonucleótidos entran al

endosoma/Iisosma donde podrían acidificarse y adquirir enzimas que degraden los ODNs lo

que impediría su actividad biológica. Evidentemente, aunque no se conoce el mecanismo

involucrado, algunos de los oligonucleótidos salen de las vesículas intactos, entran al

citoplasma y luego difunden al núcleo donde se unirían a su ARNm o ADN blanco (157). En

fibroblastos embrionarios de rata REF-52 se observó una acumulación rápida y preferencial de

pequeños oligos en el núcleo de células intactas. EI hecho de que el ingreso al núcleo fuera

independiente de la temperatura, de la administración de ATP y de la competencia con

moléculas no marcadas, lleva a pensar que se trata de un mecanismo pasivo (162).

Encontrar y unirse al sitio activo donde ejercerán su efecto. Una vez en el núcleo, el ODN

sintético se uniría a secuencias complementarias que podrian ser tanto de ADN(formando una

triple hélice) impidiendo que se transcriba a ARNm, como ARN bloqueando la expresión del

gen en cuestión. Si se forma el híbrido ADN-ARNentonces pueden suceder dos fenómenos: el

hibrido se transforma en sustrato de la ARNsa H (corta híbridos ADN-ARN)y es degradado

quedando el oligonucleótido libre para hibridizar con otra copia de ARNm. En segundo lugar, si

3o

el oligonucleótido es complementario a alguna región alrededor del codón de iniciación de la

traducción entonces podría provocar una unión menos eficiente del ribosoma al ARNm y Ia

traducción podría arrestarse. En consecuencia. no sólo se reduce la cantidad de ARNm (por

digestión con AFlea) sino que además se inhibe Ia traducción efectiva de los mensajeros

restantes. Si la vida media de la proteina y del ARNm son cortas, se producirá una rápida

pérdida de proteína total (163).

ESTRATEGIAS DIRIGIDASA MEJORAR LA TÉCNICA ANTISENTIDO

Para lograr una hibridización óptima del ODN con su secuencia blanco deben mejorarse

determinadas condiciones como: un incremento en el ingreso a la célula, mejora en la salida de los

compartimentos subcelulares y una correcta localización espacial y temporal del ODN en el sitio donde

ejercerá su efecto. El efecto antisentido se logrará también en la medida que la concentración del ODN

llegue al sitio blanco y que se mantenga durante un período de tiempo adecuado. El tiempo necesario

durante el que debe mantenerse el ODN dependerá de la vida media de la proteína y del nivel de

inhibiciónque se desee obtener. Por ejemplo: el tratamiento contínuo durante un tiempo equivalente a

la vida media de Ia proteina, teóricamente sólo resultará en una inhibicióndel 50% del efecto máximo.

Un tiempo de tratamiento de aproximadamente 4 vidas medias sería necesario para obtener un 90% de

inhibición (164).

Ingreso a la célula

Los oligonucleótidos antisentido y las ribozimas son macromoléculas generalmente polianiónicas.

y en consecuencia, la correcta incorporación de estas moléculas tanto in vivo como ¡n vitro es de

especial interés farmacológico. Numerosas estrategias se han diseñado de manera de mejorar el

ingreso de estos ODNs y ribozimas con distinto grado de éxito.

La incorporación del ODN a la célula implica Ia combinación de la unión a la membrana y su

intemalización. En células en cultivo la intemalización del ODN desnudo es generalmente ineficiente y

solo algunas moléculas entran efectivamente a la célula. Una vez dentro de Ia célula, no todos los

ODNs llegarán a su secuencia blanco ya que Ia mayoría de los ODNs quedan secuestrados por

lisosomas o endosomas. Para evitar Ia vía de endocitosis se pueden microinyectar los ODNs,

provocando la acumulación de los ODNs dentro del núcleo lo que sugiere que una vez fuera de los

endosomas los ODNs son capaces de migrar al núcleo. Esta libre movilidad de los ODNs entre el

citosol y el núcleo es una ventaja de la técnica antisentido con respecto a la terapia génica donde la

migración de grandes construcciones de ADN entre el citosol y el núcleo disminuye la eficiencia.

Existen numerosas estrategias tendientes a mejorar el ingreso del ODNa la célula:

o Asociarlo a particulas Iipotrópicas como colesterol ayudan a la penetración celular.

31

o Asociarlo a partículas con carga eléctrica positiva que mejoren el contacto entre el ODN y Ia

membrana celular con carga negativa. Entre las partículas analizadas como transportadores

potenciales de los ODNs encontramos:

1. Liposomas.

2. Lipofectamina (lípido policatiónico).

3. DOTAP y DOSSIER (lípido catiónico) (165).

Los Iiposomas se encuentran compuestos por fosfolípídos organizados en una bicapa que

puede encapsular ácidos nucleicos en un centro acuoso o formar complejos de lípidos con ácidos

nucleicos como consecuencia de sus cargas electrostáticas opuestas. Es el sistema más ampliamente

utilizado para incorporar ácidos nucleicos in vitro ya que protegen al ácido nucleico mientras que

aumentan su ingreso a Ia célula. Su carga positiva le confiere alta afinidad por las membranas celulares

que están negativamente cargadas en condiciones fisiológicas y facilitan su ingreso a la célula por

endocitosis adsortiva. Para facilitar luego, la liberación del ODN dentro de Ia célula se utilizan

Iiposomas que contienen un lípido helper como el DOPE que se fusionaría y/o rompería la membrana

endosómica. Aunque el mecanismo exacto no se conoce, la relación de cargas entre el lípido catiónico

y el ácido nucleico es fundamental para un eficaz ingreso y acción dentro de Ia célula. La eficacia de

estos complejos también depende del tipo y naturaleza del lípidocatiónico, del tipo celular y del tamaño

del ODN (164).

Estructura de los ODNs

Los ODNs no modificados son muy sensibles a la degradación por endonucleasas y

exonucleasas y, por lo tanto, pueden ser químicamente modificados para protegerlos. Un

mononucleótido consta de una base, un azúcar y un grupo fosfato. En general se prefiere no modificar

los dos primeros ya que podrían afectar el correcto apareamiento de las bases y, en consecuencia se

elige cualquiera de los cuatro oxígenos unidos al fósforo central. La falta de estabilidad biológica es un

problema importante en el uso de ODNs como agentes terapéuticos. Para solucionar este problema se

han desarrollado ODNs químicamente modificados que son significativamente más estables. Los ODNs

modificados más ampliamente utilizados son los fosforotioatos (PODNs) que contienen un átomo de

azufre en cada sitio de unión al intemucleótido en lugar de un átomo de oxígeno (Figura 1-4). La

ventaja de esta modificaciónes que le ofrece mayor resistencia a la degradación por nucleasas aunque

disminuye la eficacia de Ia activación de la ARNsa H y aumenta su afinidad por proteínas comparado

con los ODNs no modificados. El PODN podría unirse a proteínas relacionadas con el metabolismo de

ácidos nucleicos como la ARNsa H o Ia ADN polimerasa o formar complejos estables con factores de

crecimiento compitiendo por sus receptores específicos (166). Para disminuir Ia afinidad por proteínas,

sin perder la resistencia a exonucleasas, se reducen el número de átomos de azufre que se introducen

32

en los grupos fosfatídicos. Además, se han estudiado otras modificaciones que incluyen los

metilfosfonatos (modificación en el fosfato intemucleótjdo) y las modificaciones en ribosa. Estas dos

últimas poseen Ia desventaja que no activan la ARNsa H.

A. ODN.

omo fi ®NUCLEÓTIDOh- 0 — P—- 0

B. FOSFOROTIOATO.O

OTRO ®

NUCLEÓTIDO—0 — lI’— 0S­

Figura 1 -4: Estructura quimica nucleotldica con Ia unión fosfodiester de un ODN no modificado (A)y de un fosforotioato

(B).

Elección del ODN

Los ODNs más comúnmente utilizados y efectivos son de 12-15 nucleótidos de largo. La

secuencia del ODN se encuentra determinada por la estructura del gen que se desea bloquear. El

blanco más apropiado es el sitio de iniciación de Ia traducción (el fragmento conteniendo el codón

AUG)aunque también se utilizan la región de Ia señal de poliadenilación o sitios regulatorios de unión a

proteinas en el ARNm. Generalmente, la manera de elegir una secuencia antisentido óptima es

ensayando una variedad de secuencias que involucren distintos fragmentos del ARNm(165).

33

Especificldad de los ODNs

En teoria los ODNs deberían ser sumamente específicos. Igualmente, además de su efecto

antisentido que dependerá de su secuencia nucleotídica, los ODNs poseen numerosas acciones no

específicas. Agrawal ef al (167) propuso clasificar los mecanismos de Ia actividad de ODNs en:

o Actividad antisentido y secuencia específica. Comprende: (a) el impedimento estérico en Ia

partícula de ARNm; (b) la degradación de los complejos ARNm-ODN por AFthas; (c) y Ia

desestabilización de la estructura secundaria del ARNm.Todos estos mecanismos inhiben Ia unión

del AFle al ribosoma y su migración a lo largo de Ia hebra de AFlN. Además se impide el

transporte del ARNm del núcleo al citoplasma y se estorba Ia escisión de los intrones a partir del

pre-ARNm. Como resultado de esta actividad se inhibe o disminuye la cantidad de ARNm y Ia

proteína para la cual codifica.

o Actividad no antisentido y secuencia especifica. lnvolucran aquellos ODNs conteniendo

secuencias dGGGG o motivos palindrómicos CpG. Los ODNs con motivos CpG parecen tener

grandes actividades inmunoestimuladoras que incluirían la inducción de numerosas citoquinas

como lL-6, IL-12, IFN-yy TNF-a (168).

o Actividad no antisentido y secuencia inespeclflca. Es el resultado de Ia interacción del ODN y

proteínas. Los efectos serian independientes de la secuencia y los efectos ventajosos o adversos.

En un trabajo de Jansen et al.(169) encontraron que ODNs de una secuencia aleatoria retardaba el

progreso de un melanoma maligno in vivo. Presumiblemente este efecto fue debido a la unión no

específica del ODN a factores de crecimiento.

ODNs IN VIVO

Los ODNs más utilizados son los PODN. Se trata de ODNs estables, polianiónicos con un peso

molecular que oscila entre los 6.8 a 8.5 kDa. Todos los PODN poseen propiedades químicas parecidas

independientemente de su secuencia nucleotídica. La vida media de los PODN es generalmente de 12­

24 hs (170) y su decaimiento se debe fundamentalmente a Ia hidrólisis por la acción de las nucleasas.

Sin embargo, los ODNs no modificados son mucho más susceptibles a Ia degradación por enzimas

nuclelíticas (165).

Se realizaron ensayos utilizandoPODN marcados para evaluar el clearence cuando los PODNs se

inoculaban intravenosos. Este ensayo mostró una curva bifásica:

o Fase inicial: es dosis-dependiente y determinada por el método de administración. EI t1/2es oorto

(entre 25 a 55 minutos). En esta fase los PODNs penetran rápidamente los tejidos, particularmente

los riñones y el hígado y, en menor proporción. pulmones bazo, corazón, médula ósea y sistema

digestivo con una mínima penetración en el sistema nervioso central. Análisis posteriores

revelaron que Ia desaparición del PODN del sistema sanguíneo se debe a un rápido ingreso a los

34

tejidos y no a la degradación por nucleasas. Este efecto impide la acumulación en suero y los

efectos tóxicos que esto podría ocasionar.

o Fase de eliminación terminal: con una vida media de más de 30 hs. y se caracteriza por una

baja concentración del PODN en suero. Esto se debe probablemente a la lenta liberación de los

productos de degradación del ODN desde las células. El tiempo de eliminación del PODN del

tejido varia entre distintas especies. Por ejemplo, en roedores es de aproximadamente 24-48 hs

mientras que en primates es de 3 días. Esto permite concluir que administraciones múltiples

pueden llevar a la acumulación tisular de la droga.

La fannacocinética es diferente luego de la administración subcutánea de los ODNs. Se observan

las mayores concentraciones en los nódulos linfáticos regionales. Cuando los ODNs llegan a la

circulación sistémica poseen una menor concentración plasmática que cuando se administran de

forma endovenosa.

Propiedades toxicológicas

En teoría los electos adversos de los ODNs podrían surgir de al menos dos razones:

o La expresión génica se altera no sólo en las células canoerosas sino en todo el cuerpo.

o Los ODNs podrían hibridizarcon otros fragmentos del genoma con una secuencia igual o parecida

a la que se pretendía bloquear.

A los efectos arriba mencionados se suman otros más significativosen el caso de los PODNs:

o Interferencia oon otras moléculas como proteínas además del ARNm (165).

Terapia antleentldo

Los ODNs pueden utilizarse como herramientas específicas para inhibir la expresión de

determinados genes relacionados oon el crecimiento tumoral. Se han utilizado para inhibir la expresión

de oncogenes de distintas familias como: RAS, MYC,MIB,MDM-2y BCR-ABL,genes relacionados con

apoptosis como BOL-2y para genes de resistencia a multidroga (Pawlak W.; 2000). A nivel clínico en

1998 se aprobó el primer ensayo por Ia FDA para el tratamiento de retinitis inducida por CMV en

pacientes con SIDA,y actualmente los demás se encuentran en fases l-llly se usan en combinaciones

con otros citostáticos (171). Los resultados todavía son difícilesde evaluar.

35

Modelos experimentales

Los modelos animales pueden ser muy útiles para el estudio de la biología del cáncer de mama.

Estos contribuyen a un mayor entendimiento de la enfermedad y los factores endocrinológicos que

influyen tanto sobre el desarrollo de la glándula mamaria normal como Ia susceptibilidad al cáncer de

mama. Existen numerosos efectores fisiológicos (endocrinológicos, inmunológioos y de

comportamiento) que podrían influirsobre el crecimiento y progresión de la enfermedad. Por otra parte,

estos modelos también son críticos para el ensayo de nuevos agentes terapéuticos en el tratamiento

del cáncer de mama humano y para tratar de conocer los mecanismos asociados a Ia iniciación,

promoción y progresión de la enfermedad. Un factor de gran importancia en la elección del modelo es

tener claro hasta qué punto refleja la enfermedad humana y sirve para el propósito de la investigación

(172). Algunos de los modelos animales utilizados para el estudio del cáncer de mama son:

- Inducldos por carcinógenos quimicos. Útilespara el estudio de los eventos tempranos y Ia

progresión maligna en el proceso de carcinogénesis química especialmente usados en la

rata y el ratón (Ej. 7,12- dimetilbenzantraoeno o DMBAy N- nitrosometilurea o NMU)(173).

lnducldos por virus. Desde haoe años se utiliza el modelo de MMTVen ratón donde se

están identificando mutaciones que tendrian una potencial importancia en el desarrollo de la

enfermedad humana (174). Por otra parte, posteriormente se desarrollaron modelos

inducidos por adenovirus tipo 9 (175) y por polyoma virus (176).

Xenotransplantes humanos. Son los modelos animales de cáncer de mama más utilizados.

Poseen la ventaja de que son de origen humano pero como ya están transformados no se

pueden estudiar eventos tempranos como la iniciación(177).

- Modelos en ratones transgénicos y knock cuts. Surgieronen este últimotiempo y pueden

ser muy útiles aunque su aplicación podría ser limitada (178). Han aportado datos muy útiles

en cuanto a la participación de distintos genes en la progresión tumoral. En cáncer de mama

su mayor limitación es que en general los tumores son histológicamente diferentes a los

humanos y no expresan receptores hormonales.

lnducldos por hormonas. Por administración prolongada de acetato de

medroxiprogesterona (MPA)(179;180).

Modeloexperimental de inducción de adenocarcinomas mamarlos por progestágenos

En nuestro laboratorio se ha desarrollado el modelo experimental de inducción de

adenocarcinomas mamarios murinos por administración prolongada de acetato de

medroxiprogesterona (MPA) en ratones hembra BALB/c,con una incidencia actuarial de 76% y una

latencia media de 52 semanas (179;180). Estos tumores son en su mayoría de origen ductal con36

capacidad de dar metástasis en pulmón y nódulos linfáticos (181) y poseen un comportamiento

progestágeno-dependiente (PD) con altos niveles de receptores de estrógeno (RE) y progesterona (RP)

y bajos o no detectables de EGF (REGF) (182). Los tumores se mantienen por pasajes singeneicos en

ratones hembra virgenes BALB/cy se lograron seleccionar por presión selectiva en ratones sin tratar

variantes progestágeno-independientes (Pi) que conservan altos sus niveles de RE y RP (Figura 1-5).

lineastumorales Pl

BALBIc con CAde mama

Figura 1 -5: Obtención de lineas tumorales PD y Pl. Se transplanta el tumor primarioa dos ratones tratados con MPA

(20 mg depot, subcutáneo, oontralateral al transplante tumoral) y a dos ratones sin tratar. Los tumores ductales crecen sólo

en los tratados con MPA durante los dos a tres primeros meses de seguimiento. Cuando el tumor alcanza un tamaño

aproximado de 10-15 mm de diámetro, se transplante a otros dos ratones tratados, o no, con MPA y asi sucesivamente

controlando la hormono-dependencia, es decir que el tumor no crezca durante dos meses en los ratones sin tratar. Para

seleccionar una variante Pl, se espera hasta que empiece a crecer un tumor en los animales sin tratar y se lo transplanta a

animales sin tratar y asi sucesivamente.

En menor proporción, el MPA induce también carcinomas del tipo lobulillarque no expresan RE ni

RP mientras que si poseen REGF. Histológicamente,se asemejan a los tumores mamarios que surgen

espontáneamente en hembras multíparas BALB/c.Tanto los tumores del tipo ductal como lobulillarson

precedidos por lesiones preneoplásicas similares a las del cáncer de mama humano (182).

En los primeros experimentos, los tumores inducidos por MPAse transplantaron en hembras

BALB/cy luego de un período de latencia de 4 a 12 meses se establecieron diversas lineas tumorales.1’ J .l' L

(PD) y se caracterizaron por tener una37

Algunas de ellas se definieron como p" v V I'

mayor tasa de crecimiento, un menor período de latencia en animales tratados con MPA o

progesterona (Pg) y por no crecer en animales ovariectomizados sin tratar. Por otro lado, también se

obtuvieron líneas tumorales progestágeno-independientes (PI) que crecían tanto en presencia como en

ausencia de la hormona (181;183) y que surgen a través de los sucesivos pasajes. Recientemente,

(184) se han subdividido los tumores PI en respondedores (PI-Fl)o no respondedores. Esta subdivisión

se basó en la capacidad de inhibirsu crecimiento tumoral en respuesta a antiprogestágenos (RU 486 y

ZK 299) y 17-B-estradiol (E2).

OBJETIVOS

Hipótesis general de trabajo: Elreceptorde progesteronase encuentrainvolucradoen

el crecimiento tumoral progestágeno-independiente (Pl). Postulamos que otras vías proliferativas

activadas por factores de crecimiento provenientes del estroma tumoral podrían activar aI receptor de

progesterona y favorecer el crecimiento tumoral.

CAPITULO 1

Objetivo 1: Investigar si existen factores de crecimiento capaces de reemplazar el aumento del

crecimiento tumoral progestágeno-dependiente (PD) inducido por el MPA.

o Investigar el efecto del bloqueo del RP sobre la proliferacióncelular inducida por progestágenos.

o Investigar el efecto del bloqueo de la isoforma B del FIP sobre la proliferación celular inducida por

MPA.

o Evaluar el efecto del bloqueo de ambas isofonnas del RP sobre la estimulación celular inducida

por factores de crecimiento.

Objetivo 2: Evaluar el efecto del bloqueo del RP sobre el crecimientotumoral PI.

o Investigar el efecto del bloqueo de ambas isofonnas del RP sobre la proliferación celular in vitro.

o Investigar el efecto del bloqueo de ambas isofonnas del FIPsobre el crecimiento tumoral in vivo.

Objetivo 3: Evaluar Ia activación genómica del RP en un tumor con crecimiento PD y su variante PI.

o Estudiar el efecto del bFGF sobre Ia activación genómica del RP en un tumor PD: Mobility Gel

Shift.

o Estudiar la activación genómica del RP en un tumor PI: MobilityGel Shift.

Objetivo 4: Evaluar la hipótesis de que el FGF estuviera involucrado en el crecimiento

pr”: y . 4 r A.

o Estudiar Ia expresión de bFGF y RFGFs (RFGF-1, RFGF-2, RFGF-a y FIFGF-4) por

inmunohistoquímica.

1. En glándula mamaria normal.

2. En un tumor PD y sus variantes PI.

o Estudiar la expresión de bFGF por Western blot.

1. En extractos de tejido tumoral.

2. En extractos celulares de células epiteliales o fibroblastos estromales.

40

Objetivo 5: Investigar el rol de los fibroblastos PI en el crecimiento tumoral PD.

o Estudiar el efecto del estroma Pl sobre Ia proliferacióncelular de células epiteliales PD.

o Investigar si las células de crecimiento PD cuando son inoculadas con fibroblastos provenientes de

tumores PI, crecen en ausencia de MPA.

CAPITULO 2

Objetivo 1: Estudiar Ia participacióndel RE en el crecimiento de un tumor PD.

o Investigar el efecto del bloqueo del RE sobre la proliferación celular inducida por MPA y factores

séricos en cultivos primarios de un tumor PD.

CAPITULO 3

Objetivo 1: Estudiar el efecto de distintos antiestrógenos utilizadosen la clínica en un tumor PD.

o Investigar el efecto del 17-B-estradiol y los antiestrógenos tamoxifeno, raloxifeno e ICI 182.780

sobre Ia proliferación celular inducida por MPAy factores séricos.

o Investigar el efecto de los antiestrógenos sobre Ia inhibiciónde la proliferación celular inducida por

el 17-I3-estradiol.

o Investigar el efecto del 17-B-estradiol y los antiestrógenos tamoxifeno, raloxifeno e ICI 182.780

sobre Ia síntesis de RP.

o Estudiar el efecto del tamoxifeno y el raloxifeno sobre el crecimiento tumoral.

MATERIALES y MÉTODOS

EXPERIMENTOS IN VIVO

Animales

Se utilizaron ratones hembra de la cepa BALB/cde dos meses de edad, provenientes del

bioterio de Ia Academia Nacional de Medicina y del Instituto de Biología y Medicina Experimental con

agua y comida ad Iibitum,con un cronograma de doce horas de luz y doce de oscuridad. EI transplante

tumoral se realizó utilizando un trócar en el que se coloca un pedacito de tumor de 2-3 mm3en forma

subcutánea en el flanco inguinal derecho del animal. En el caso de los tumores progestágeno­

dependientes se agrega también en forma subcutánea (sc) 0.1 ml de MPA depot (40 mg:

Medrosterona) en el flanco inguinal izquierdo. Como control de hormono-dependencia dejarnos siempre

un animal por pasaje sin tratar con Ia hormona.

Tumores utilizados:

Se utilizaron tumores de histología ductal inducidos por MPA (179;180).

De acuerdo a su aparición cada tumor presenta una nomenclatura distinta aunque siempre Ia

terminación HDcorresponde a un tumor PD mientras que Ia terminación HI corresponde a una variante

PI.

Los tumores utilizados en este trabajo se denominan:

Tumor PD

o CC4-HD: pertenece a la familia de tumores C4 y es el tumor más utilizado en el trabajo.

Presenta un comportamiento PD y se mantiene por pasajes singeneicos en hembras vírgenes

BALB/cinoculados con MPA depot. Se originó a partir del inócqu de células epiteliales de un

cultivo primario del tumor C4-HD.

Tumores Pl

o C4-Hl: pertenece a la familiade tumores C4. Presenta un patrón de crecimiento PI y responde

al tratamiento con antiprogestágenos. Se mantiene por pasajes singeneicos en hembras

vírgenes BALB/cen ausencia de MPA.Se originó a partir del tumor C4-HD.

o CC4-Hl: pertenece a la familia de tumores C4. Presenta un patrón de crecimiento Pl y

responde al tratamiento con antiprogestágenos. Se mantiene por pasajes singeneicos en

hembras vírgenes BALB/cen ausencia de MPA.Se originó a partir del tumor CC4-HD.

o 59-2-Hl: pertenece a Ia familia de tumores 59. Presenta un patrón de crecimiento PI y

responde al tratamiento con antiprogestágenos. Se mantiene por pasajes singeneicos en

hembras vírgenes BALB/cen ausencia de MPA.

43

o C7-2-HI: pertenece a Ia familia de tumores C7. Presenta un patrón de crecimiento Pl y

responde al tratamiento con antiprogestágenos. Se mantiene por pasajes singeneicos en

hembras vírgenes BALB/cen ausencia de MPA.

o 32-2-le pertenece a la familia de tumores 32. Presenta un patrón de crecimiento PI y

responde al tratamiento con antiprogestágenos. Se mantiene por pasajes singeneicos en

hembras vírgenes BALB/cen ausencia de MPA.

Ocasionalmente, se congelan pedacitos de aproximadamente 2 mrn2 en N2 líquido para poder

volver a un pasaje más temprano del tumor y no perder las variantes PD, que con los sucesivos

pasajes tienden a Ia hormono-independencia.

De trabajos previos sabemos que el MPA estimula en forma significativa tanto la proliferación

celular como el crecimiento tumoral de un tumor PD CC4-HD. En la figura 2-1 (A) se ejemplifica con

una típica curva de crecimiento tumoral PD. El MPA favorece notablemente el crecimiento tumoral en

ratones ovariectomízados, o no, lo que indica que no se necesita E2para activar eI FtP necesario para

que el MPA ejerza su efecto. En ausencia de MPA, los tumores recién comienzan a crecer y más

lentamente a panir de los 100 días del transplante y, aproximadamente 100 días más tarde en el caso

que además se encuentren ovariectomízados. Por otra parte, Ia figura 2-1 (B) muestra un típico

comportamiento de una variante PI que crece a la misma velocidad independientemente de Ia

administración del progestágeno. Abajo, (figura 2-1 (0)) se observa Ia proliferación celular medida por

incorporación de 3H-timidina en un cultivo primario de células epiteliales del tumor CC4-HD. Se

observa una respuesta bifásica al MPAcon un aumento en la proliferación celular significativo y dosis­

dependiente ya a partir de 10-14M.Se observan dos pendientes, una a concentraciones muy bajas

(E050: 1.5 :l:0.7 fM)y la otra a concentraciones más altas (E050: 0.33 :t:0.3 nM), que está dentro del

orden del Kd del FiP reportado previamente (185).

Hormonas y antlhormonas utilizadas:

o RU 38.486 o mifepristona (Roussel Uclaf, Francia): Administrada sc en dosis diarias de 6.75

mg/kg por día. Se preparó una solución madre de concentración 22.5 mg/ml y diariamente se

preparó Ia solución de trabajo 12100en solución fisiológica (SF), inyectándose 0.6 mVratón.

o ZK 98.299 u onapristona (Schering, Alemania): Administrada sc en dosis diarias de 10 mg/kg por

día. Se preparó una solución madre de concentración 90 mg/ml, Ia solución de trabajo se preparó

en forma diaria (1:100) en SF, inyectando 1 mI/ratón.

o 17-B-estradlol (E2)(Sigma): 5 mg en pel/ets de silastic implantados sc en la parte dorsal del ratón.

Los pellets se prepararon pesando Ia cantidad de hormona necesaria, por ejemplo, para preparar

10 pel/ets (50 mg) y luego con el peso de un pellet que es de aprox. 0.05 g se calculó cuánto

debían pesar los 10 pel/ets (0.5 g). A este peso se le resta el peso de la hormona (0.05 g) y se

obtiene la cantidad de silastíc que se debe pesar (0.45 g.)

A.

A 500- +MPA(+)"E MPA --«-- 0vx-MPA(+)E 400- -1A-MPA(-)Z --0- va-MPA (-)g ovx clMPA300­E38 200­

g slMPA,_ 100- ovx s/MPAI

O'l dr0 so 100 150 200 250 300

Días

B.

750' —I-MPA(+)

"E —a—MPA(-)ÉE 500­OE3O'g 250­

E

c T I l l I l 1010 20 30 40 50 60 70

Días

C.

o 4''DC:9

a 3­o E3 E

'3 "I'O

3 1­.6E

c I I l l I l-17 -15 -13 -11 -9 -7 -5

Log MPA (M)

Figura 2 - 1: (A)Tamaño tumoral en función del tiempo del tumor CC4-HDcreciendo en presencia o ausencia de MPA

y en animales ovariectomizados, o no. (B) Curva de crecimiento lumoral de una variante PI. (C) Curva de proliferación

celular en presencia de MPA expresado como indice de incorporación de 3H-timidinaen células epiteliales de un cultivo

primario del tumor CC4-HD. MPA: acetato de medroxiprogeslerona; OVX:ovariectomizados.

o Raloxifeno (Lab. Gador; Argentina): Administrada sc en dosis diarias de 12.5 mg/kg por día

disueltas en solución fisiológica. Se preparó una solución madre de 50 mg/ml en alcohol 100° y se

diluyó 1:100 en solución fisiológica, inoculando 0.5 ml por ratón.

o Tamoxifeno (Lab. Gador; Argentina): Administrado sc en dosis diarias de 5 mg/kg por día

disueltas en solución fisiológica. Se preparó una solución madre de 20 mg/ml en alcohol 100° y se

diluyó 1: 100 en solución fisiológica, inoculando 0.5 mI por ratón.

o MPA (Lab. Gador; Argentina): Administrado como depot subcutáneo de 0.1 ml. En los ensayos

con el tumor CC4-HD en ausencia de MPA se quitó el depósito 7-10 días antes de extirpar el

tumor.

Crecimiento tumoral con antihormonas:

Los tratamientos se comenzaron cuando los tumores alcanzaron un tamaño aproximado de

25-50 mm2. Se usaron 3-4 ratones por grupo. Los tumores se midieron con un calibre cada 2-3 días

(largo x ancho) y se graticó el tamaño tumoral (mm?) en función del tiempo. En el caso en el que se

evaluaba el efecto de antihomtonas en un tumor PD, se extirpó el MPA7 días antes del comienzo de

los tratamientos.

Oligonucleótidos utilizados:

Ambos oligonucleótidos utilizados ¡n vivo se obtuvieron de DNAgency (Malvem PA, USA). Los

oligonucleótidos se resuspendieron en solución fisiológicapara obtener una concentración madre de 50

mg/ml. Esa solución madre se distribuyó en distintos eppendorit con el volumen necesario para cada

inócqu y se guardó a -20°C.

o AsRPa: Oligonucleótido antisentido dirigidoal sitio de iniciación de Ia traducción de las isotonnas A

y B del RP cuya secuencia es: 5' AC TCA TGA GCG GGG ACA ACA 3' (186;187). Administrado

intraperitonealmente en dosis de 1, 2 ó 2.4 mg/ratón distribuidas en 1, 2 ó 3 dosis diarias.

respectivamente de acuerdo al experimento. Antes de cada inyección se diluyó el contenido del

eppendorlt de 50 mg/ml en solución fisiológica inoculándose 0.2 mI por vez.

o ScRP: Oligonucleótido que contiene los mismos nucleótidos que el asRPa aunque ordenados al

azar, y cuya secuencia es: 5' ACG CTA GAC TGA CGA CGA GA 3’. Administrado

intraperitonealmente en dosis de 2.4 mg/ratón distribuidas en 3 dosis diarias. Antes de cada

inyección se diluyó el contenido del eppendorlt de 50 mg/ml en solución fisiológica inoculándose

0.2 mI por vez.

47

Crecimiento tumoral con oligonucleótidos antisentido:

Los tratamientos se comenzaron cuando los tumores alcanzaron un tamaño aproximado de 25

mm2. Se usaron 3-4 ratones por grupo. Los tumores se midieron con un calibre cada 2-3 días (largo x

ancho) y se graficó el tamaño tumoral (mm?)en función del tiempo. Se analizaron los ciclos estrales por

hisopado vaginal y se observaron al microscopio. Alfinalizar el experimento se realizaron:

o Autopsia completa de todos los animales.

o Tumor:

1. Se pesó cada tumor.

2. Se guardó un pedazo a -70°C para Westem blot o para medir receptores por binding.

3. Se fijóen tormalina fría al 10% y se cambió el contenido a alcohol 70° a las 24 horas.

o Se lijaron con lormalina fría al 10% cambiando a alcohol 70° a las 24 horas los siguientes órganos:

mama, hígado, riñón, pulmón, bazo, intestino y se prepararon tacos embebidos en parafina de los

que se realizó una tinción de hematoxilina y eosina.

Los controles de todos los experimentos realizados in vivo se inocularon con solución fisiológica

subcutánea o intraperitoneal según correspondiera.

Crecimiento tumoral aislando previamente las células epiteliales y fibroblastos estromales de un

tumor PD y su variante Pl:

En primer lugar se realizaron los cultivos primarios del tumor CC4-HD y del tumor C4-HI como

se detalla más adelante en esta sección. Se obtienen así dos de las poblaciones celulares que

conforman el tumor. De estos cultivos se utilizaron las fracciones correspondientes a los fibroblastos

estromales, que se dejan crecer en 10% SFB durante aproximadamente una semana para obtener

suficiente cantidad como para realizar el ensayo in vivo. Concluido ese lapso se realizó un nuevo

cultivo primario para ambos tumores de manera de obtener las células epiteliales. Las células así

obtenidas no se cultivan sino que se cuentan en una cámara de Neubauer y, de ser suficientes, se

utilizan directamente en el experimento. Por otra parte, se levantan los fibroblastos ya crecidos y

también se cuentan en una cámara de Neubauer. Se realizaron tres experimentos y. en los dos

primeros, se inocularon 1x105 células por ratón en el caso de los ratones que llevaban un solo tipo

celular, y 2x105 células (1x105 de cada tipo celular) en los que llevaban ambos tipos celulares. Se

utilizó como vehícqu solución fisiológica. En el tercer experimento, para minimizar la contaminación

epitelial que teníamos en los fibroblastos estromales PI, redujimos el número de células a 1x104 en el

caso de los fibroblastos estromales y 2x104para las células epiteliales.

48

EXPERIMENTOS IN VITRO

Medios y soluciones

PBS 10X

o NazHPO4.12H20 (fosfato dibásico de sodio, dodecahidrato Baker) 30.069

o NaH2P04.H20 (fosfato monobásico de sodio monohidratado, Anedra) 2.569

o NaCI 87.69

Se lleva a un litrocon agua deionizada o bidestilada.

Para trabajar se hace una dilución1:10 con agua bidestilada.

Medio de cultivo

o DMEM/F12 (Dulbecco’s modified Eagle's medium: Ham’s F12, 1:1)

(Sigma) sin rojo fenol. 15.6 g/I

o Bicarbonato de sodio (Sigma Co.) 2 g/I

o Sulfato de gentamicina comercial 50 mg/I

Se preparó según las instrucciones del fabricante con agua bidestilada o deionizada.

Medio de cultivo para fibroblastos (10% SFB)

o DMEM/F12

o 10% suero fetal bovino (SFB) (Gen S.A., Buenos Aires) decomplementado.

Medio de cultivo para células epiteliales (5% SFBch)

o DMEM/F12

o 5% SFB deoomplementado y adsorbido con carbón (SFBch).

Medio de lavado (2,57. SFB)

o DMEM/F12

o 2,5% SFB decomplementado.

SFB decomplementado

SFB calentado en baño térmico a 56°C durante treinta minutos.

SFB adsorbido con carbón (SFBch)

Se incubó el SFB deoomplementado con carbón activado (5%) (Mallinckrodt)durante 1 hora a 4°C

con agitación permanente. Luego de Ia adsorción, eI suero se centritugó dos veces a 12000 rpm

durante 20 minutos. EI sobrenadante se volvió a incubar con 5% de carbón activado pero esta vez

durante toda Ia noche y, finalmente, eI suero se centritugó 6 ó 7 veces hasta eliminar completamente eI

carbón. Luego se esterilizó por filtración (0,22 u).

49

Solución enzimática utilizada para la digestión tumoral

o Tripsina (Gibco BRL) 0,25%

o Colagenasa Tipo II (Gibco BRL) 0,25%

o Albúmina sérica bovina (Sigma Co) 0,5%

Todo disuelto en buffer fosfato (PBS).

Tripsina

o Tripsina (Gibco BRL) 0,25%

Disuelta en PBS 1X.

Tripsina-EDTA: en PBS (sin Ca++o Mg“).

o Tripsina (Gibco BRL) 0.25 %

o EDTA (Gibco BRL) 0.2 %

Líquidode centelleo

o Optiphase Hl-sate3 (Wallac).

Hormonas y antihormonas utilizadas:

o MPA de Sigma Co.

o RU 38.486 o mifepristona de Sigma Co.

o ZK 98.299 u onapristona de Schering.

o 17-B-estradiol de Sigma Co.

o Citrato de tamoxifeno de Laboratorios Gador.

o OH-tamoxileno de Sigma Co.

o Tamoxiteno de Sigma Co.

o Raloxiteno de Laboratorios Gador.

o ICI182.780 o Faslodex de Zeneca Phannaceuticals.

La adición a los cultivos se realizó a partir de soluciones madres concentradas 1000 a 10000

veces en etanol redestilado. La concentración final de etanol no exoedió el 0,10% v/v, y no afectó

significativamente el crecimiento ni la morlología celular (188).

Factores de crecimiento utilizados:

Se utilizófactor de crecimiento tibroblástico básico (bFGF) y ácido (aFGF) y factor de crecimiento

epidénnico (EGF) de Sigma Co. reconstituídos según las indicaciones del fabricante.

50

Oligonucleó‘tidos sentido y an‘tisen‘tidoutilizados:

Receptor de progesterona

Se sintetizaron dos secuencias complementarias al ARNmdel RP. Una diseñada para bloquear

la expresión de RPa (asRPb) (Fagos. Buenos Aires, Argentina y DNAgency, Malvem PA, USA) y la otra

para bloquear ambas ¡soformas (asRPa) (186) (DNAgency). Se diseñó un oligonucleótido para

controlar Ia especificidad del asFlPa (scRPa), que contiene Ia misma cantidad y tipo de bases pero

ordenadas en otra secuencia al azar, que no resultó tener homologia oon ninguna proteina conocida de

ratón. Se prepararon en una concentración madre de 4 mg/ml (en medio DMEM/F12 estéril) y se

diluyeron en medio 2.5% SFBch en un rango de 5 a 0.3 pg/ml antes de usar. Los oligonucleótidos se

diseñaron de manera que incluyeran Ia secuencia de iniciaciónde la traducción de las isotonnas A o B

del RP, respectivamente (Tabla 2-1).

Receptor de estrógeno

Se sintetizó una secuencia complementaria al ARNm del RE, diseñada para bloquear la

expresión de FlEtipo alta (asRE) (Fagos, Buenos Aires, Argentina y DNAgency, Malvem PA, USA). Se

preparó en una concentración madre de 4 mg/ml (en medio DMEM/F12estéril) y se diluyó en medio

2.5% SFBch en un rango de 5 a 0.3 ¡ig/ml antes de usar. EI oligonucleótido se diseñó de manera que

incluyera la secuencia de iniciación de la traducción del RE tipo alta.

Tabla 2- 1 . Secuencia nucleotídicade los oligodeoxinucleótidosutilizados.

Secuencia génica mRNA Secuencia antleentido

“RP 5' TGTTGTCCCCGCTCATGAGT3'

a a- ACA ACA GGG GCG AGT ACT CA a"5' UGU UGU CCC CGC UCA UGA GU 3' 5' AC TCA TGA GCG GGG ACA ACA 3'

asRP 5'-AGTC GTC ATGACTGAGCTG G 3'

b 3'-T CAG CAG TAC TGA CTC GAC c 5'5'-A GUC GUC AUG ACU GAG CUG C 3' 5'-G CAG CTC AGT CAT GAC GAC T 3'

5' TC TCG TCG TCA GTC TAG CGT 3'SCRP 5' UC UCG UCG UCA GUC UAG CGU 3‘ 5' ACG CTA GAC TGA CGA CGA GA 3'

3' AG AGC AGC AGT CAG ATC GCA 5'

5' TG CCA C'IT ACC ATG ACC ATG 3'¡SRE 5' UG CCA CUU ACC AUG ACC AUG 3' 5' CAT GGT CAT GGT AAGTGG CA 3'

3' AC GGT GAA TGG TAC TGG TAC 5'

Cultivos primarios

Los cultivos primarios se realizan utilizando tumores de entre 50 y 100 mm2, aproximadamente a

los 15 días del transplante. Los tumores se extirpan en esterilidad disgregando primero en forma

mecánica oon tijera y luego en presencia de la solución enzimática, agitando a 37°C durante 40

minutos. La suspensión celular obtenida está compuesta por dos poblaciones, una de estirpe epitelial y

Sl

otra de estirpe tibroblástica. Para separarlas se utiliza la técnica de Pandis y et al..(189) con algunas

modificaciones. Esta técnica se basa en que la velocidad de sedimentación de las células epiteliales

que lonnan agregados celulares es mayor que la de los fibroblastos, permitiendo así su separación

luego de varias decantaciones diferenciales. Se colocan las células en un tubo de centrífuga junto con

15 mI de medio de lavado y se centrifugan a 1000 rpm durante 10 minutos. Se descarta el

sobrenadante y las células se resuspenden en 10% SFB. La suspensión se deja sedimentar durante 20

minutos; el sedimento constituye la tracción enriquecida en células epiteliales que se encuentran

habitualmente en agregados y del sobrenadante se obtiene Ia fracción fibroblástica, que se siembra

directamente en los frascos de cultivo. Por otro lado, al tubo de 50 mI donde quedó la tracción

enriquecida en células epiteliales se le agregan 15 ml de 2.5% SFB en el que se resuspenden las

células. Así se repiten las decantaciones cada 20 minutos descartándose el sobrenadante cada vez

hasta que en él no se detecten más células. Este es el momento en que se considera que se han

separado exitosamente ambas poblaciones. Luego de Ia últimadecantación las células se resuspenden

en 10% SFB y se siembran en frascos de cultivo (Figura 2-2).

En el caso de los tibroblastos, para evitar la posible contaminación con células epiteliales

remanentes, se dejan adherir durante dos horas, descartándose luego todas las células que no se

adhirieron. Los cambios de medio se realizan cada 48 horas. Los cultivos en estadío de

semiconlluencia (obtenidos a los 5-10 días a partir de la siembra), se tripsinizan y los subcultivos se

utilizanpara los diferentes ensayos.

Para la obtención de cultivos enriquecidos en células epiteliales, los agregados celulares se dejan

adherir durante 24-48 horas, y luego se elimina cuidadosamente el sobrenadante. Para los cultivos de

tumores CC4-HD (PD), se reemplaza el medio por 5% SFBch + MPA 1019M. Este medio de crecimiento

se cambia cada 48 horas y al cabo de 7 a 10 días se repican las células en placas de 96 hoyos donde

se realizan los ensayos de proliferación.

52

Figura 2-2: Representación esquemática del cultivode tumores primariosy proliferacióncelular.

Disección PasajoenRatónhembra

disgregaciónt BN-.,

Mecánica Enzimática

.9... sv.ú. no DMEMIF12H mp5,“,0,25%Albúmina: 0,5%

DMEMIF12 Colagenasa II: 0,25%o o o o o (250U/mg): :

SedimentaciónvIncorporación de 3H­

timidina

4­Flbmblastos36% FSBCh—' cmww» “n Veces"

Repique de células

Se enjuagan las células con Ia solución de tripsina estéril y se incuban durante 2-15 minutos a

37°C con Ia cantidad de tripsina necesaria como para cubrir el fondo mínimamente. Una vez que éstas

se despegan del fondo de la placa se las pasa a un tubo conteniendo 10 ml de medio de cultivo con

10% SFB. Las células se centrifugan a 1000 rpm durante 10 minutos. Luego, el sobrenadante se

descarta y el precipitado se resuspende con 10% SFB, en el caso de los fibroblastos, y 5% SFBch en el

caso de las células epiteliales. Finalmente, se siembran las células en las placas correspondientes. Los

fibroblastos estromales pueden repicarse con tripsina-EDTAen lugar de tripsina sola para Ievantarlas

más rápidamente. Para las células epiteliales no conviene utilizar tripsina-EDTA ya que pueden

dañarse en el proceso y luego perder adhesión al sustrato.

Ensayos de proliferación celular

1) Incorporación de 3H-1irnidina

i) Cultivos primarios tumorales

Los cultivos enriquecidos en células epiteliales o libroblásticas se subcultivan en microplacas de

96 hoyos y se incuban durante 24-48 horas para permitirla adhesión. Luego el medio se reemplaza por

medio fresco conteniendo las soluciones cuyo efecto se desea evaluar. Los ensayos se realizan por

octuplicado. Las células se incuban durante 48 horas con las soluciones correspondientes,

reemplazándose, a las 24 horas, el 50% del volumen de cada hoyo por medio de prueba fresco.

Durante las últimas 18 horas de incubación se aplica un pulso de 0.4 pCi de 3H-timidina (NEN,

actividad específica 20 Ci/mmol) en cada hoyo. Luego los cultivos se tripsinizan y oosechan en un

cosechador de células y la radioactividad incorporada se mide en un contador de centelleo líquido beta

durante 1 minuto.

ii) Ensayos de co-cultivo

Se realizaron a partir de cultivos primarios de células epiteliales o libroblastos estromales de los

tumores CC4-HD o C4-Hl. Se repicaron las células con tripsina y se oentrifugaron para inactivar la

tripsina. Se descartó el medio y se resuspendió en 10% SFB. Se contaron las células en cámara de

Neubauer y se sembraron en una placa de 96 hoyos, 2500 ó 5000 células por hoyo tanto para los

libroblastos como para las células epiteliales según correspondiera. Los ensayos se realizaron, por Io

menos, por octuplicado. Las células se incubaron durante 48 horas con las soluciones

correspondientes, reemplazándose, a las 24 horas, el 50% del volumen de cada hoyo por medio de

prueba fresco. Durante las últimas 18 horas de incubación se aplicó un pulso de 0.4 pCi de aH-timidina

(NEN, actividad especifica 20 Ci/mmol) en cada hoyo. Luego los cultivos se tripsinizaron y oosecharon

54

en un cosechador de células y la radioactividad incorporada se midió en un contador de oentelleo

líquido beta durante 1 minuto.

iii) Cultivos de líneas celulares

NMuMG. Los subcultivos de Ia línea celular de mama murina epitelial (NMuMG) se realizaron en

placas de 96 hoyos donde se ensayaron los distintos tratamientos. Los ensayos se realizaron por

octuplicado. A las 24 hs. se reemplazó el 50% del volumen de cada hoyo por medio de prueba fresco.

Durante las últimas 18 hs. se aplicó un pulso de 0.4 uCi de 3H-timidinaen cada hoyo. Finalmente, las

células se oosecharon y la radioactividad incorporada se midióen un contador de oentelleo líquido.

T470. Son líneas celulares de mama tumorales. Se crecieron en placas para obtener material

suficiente para utilizaren la preparación de extractos según lo indicado para el MobilityGel Shift.

Z) Recuento celular

Las células se sembraron en placas de 24 hoyos con 5% SFBch y se dejaron adherir durante 48

hs. Se incubó con Ia solución a ser evaluada durante una semana cambiando las soluciones

regularmente cada dos días. AIfinalizarel experimento se eliminóel medio y las células se despegaron

con tripsina. Se contaron 10 ul de esta suspensión en una cámara de Neubauer. Cada tratamiento se

realizó por Iomenos, en cuadriplicados y se gralicó número de células / ml i DS.

ENSAYOS DE BINDING

Hormonas radioactivas utilizadas:

o 3H-R5020 (NEN)

o aH-17-[3-estradiol (NEN)

Hormonas frías utilizadas:

o R5020 (NEN)

o DES (dietilestilbestrol) (NEN)

Cuantificación de receptores esteroides por la técnica bioquímicade b/ha’ingpara

célulaentera

Se sembraron células epiteliales de CC4-HD en placas de 24 hoyos en condiciones de

crecimiento. Cuando las células alcanzaron cierto grado de confluencia se reemplazó el medio de

cultivo por medio con 2.5% de SFBch en presencia o ausencia de las drogas a evaluar. A las 24 horas

se incubaron las células con medio sin suero durante una hora. Luego, se reemplazó el medio por 1 mI

55

de medio fresco en presencia de 300.000 cpm de 3H-R5020(análogo sintético a la progesterona) o 3H­

17-[3-estradiolcon una actividad especifica de 85 Ci/mmol,en presencia o ausencia de 100X de R5020

trío o DES trío durante 2 horas. Después de varios lavados con PBS se despegaron las células con

tripsina (0.25%) y se contaron en un contador beta. Se contó el número de células para referir la

cuantificación de los receptores por número de célula.

Ensayos de competencia: unión del radioligando al receptor

Se utilizaron extractos celulares totales para ensayar la unión del (3H)-E2a su receptor. Se

cuantiticaron los FlE incubando por duplicado 100 ul del extracto con 3 nM de (3H)-E2desplazado con

DES, tamoxiieno o raloxileno de 20000 a 0.23 nM.Se agregó dihidrotestosterona 100 veces en exceso

para bloquear la unión inespecilica. La reacción se llevó a cabo durante 18 hs a 4°C. La hormona

unida se separó de la libre por la adición de 100 ul de una solución de carbón-dextrano (BufferA + 1%

de carbón activado + 0.1% dextrano) que se dejó durante 10 minutos y luego se centrifugaron las

muestras a 3500 rpm durante 10 minutos y a 4°C. Se tomó una alícuota de 100 ul que se contó en un

contador B de centelleo líquido.

EXTRACTOS TUMORALES Y CELULARES

Medios y soluciones:

Buffer A: Tris-HCI(Gibco) pH 7.4 20 mM

EDTA (Sigma) 1.5 mM

Dithiothreitol (Sigma) 0.25 mM

N82M004 (Merck) 20 mM

Glicerol (Raudo) 10 %

Inhibidores (Sigma): 0.5 mM PMSF, 0.025 mM ZPCK, 0.025 mM TLCK, 0.025 mM TPCK, 0.025 mM

TAME(se agregan inmediatamente antes de usar el buffer).

Preparación de extractos tumorales o celulares totales:

Los tejidos y tumores se homogeneizaron en buffer de lisis (Buffer A) en una proporción 1:4

p/v. El homogenato se realizó con un politron (Teckman) a velocidad media con tres veces por 5

segundos cada una. Posteriormente, se sonicó a frecuencia media durante 10 segundos (dos veces).

El homogenato se centrilugó a 40.000 rpm, 45 min, 4°C. Posteriormente los homogenatos se

comenzaron a centrífugar a 12.000 rpm, 30 min, 4°C ya que se verificó que los resultados no diferian

de los obtenidos a 40.000 rpm. El sobrenadante se guardó rápidamente a -70°C ó en N2liquido para

56

ser usado posteriormente en Western blot. Paralelamente se determinó Ia concentración de proteínas

por el método de Lowry(190).

Para realizar los extractos citosólicos a partir de células en cultivo, se Iavaron las mismas con

PBS, y se levantaron con un rastrillo en un volumen no mayor de 100-200 pJ/frasco de cultivo (aprox.

1x107células) con buffer de lisis (en trio). EIhomogenato fue sonicado dos veces durante 10 segundos

a intensidad media. Se centrifugó a 12.000 rpm, 30 min, 4°C. El sobrenadante se guardó

inmediatamente a -70°C o en N2líquido.

Extractos nucleares

Medios y soluciones:

TEDGS 10%: Tris 50 mM (pH 7.4)

EDTA 7.5 mM

D'l'l' 0.5 mM

Glicerol 10%

Sacarosa 0.25 M

Buffer lavado núcleos: TEDGS 10% + NP-40 0.01%.

Buffer rotura núcleos: TEDGS 10% + KCI0.4 M.

TEDGS 30%: Idem TEDGS 10% pero con 30% de glicerol.

Preparación de extractos celulares nucleares

Se realizaron a partir de cultivos celulares de células epiteliales de CC4-HD, C4-Hl o a partir de la

línea celular de mama humana tumoral T47D (gentilmente cedida por el laboratorio de la Dra. Elizalde).

Las células se levantan en PBS e inhibidores de proteasas con un rastrilloy se oentrifugan a 3300 rpm,

10 min, 4°C. El sobrenadante se descarta y el pellet se resuspende en bufler TEDGS 10% siempre en

presencia de inhibidores de proteasas. Se vuelve a centrifugar a 3300 rpm, 10 min., 4°C. Como

resultado se obtiene un sobrenadante que se vuelve a centrifugar a 12000 rpm, 20 min, 4°C para luego

guardar a -70°C el sobrenadante que contiene la tracción citosólica. Por otra parte, el pellet obtenido

luego de centrifugar a 3300 rpm se resuspende en buffer de lavado de núcleos (TEDG 10% + NP-40

0.01%). Se centrífuga a 3300 rpm, 10 min., 4°C, descartándose el sobrenadante y resuspendiendo el

pellet en buffer TEDG 10% pero con KCI 0.4 M, que permite la rotura de los núcleos. Se ayuda al

disgregado del extracto utilizando una jeringa y se deja extraer en hielo durante 30 minutos. Luego, se

centrífuga a 12000 rpm, 20 min., 4°C y se obtiene el sobrenadante que se lleva al doble de volumen

con bufler TEDG 30%. Se guardan los extractos a -70°C y se separa una alícuota para medir

proteínas.

57

Extractos de membrana

Medios y soluciones:

Bufier sucrosa: Sucrosa 0.32M(pH7.4)

MgClz 1 mM

K2HP04 1 mM

Buffer Krebs-Tris: Tris-HCI 20 mM(pH7.4)

NaCI 118 mM

KH2PO4 1.2 mM

MgSO4 1.2 mM

KCI 4.7 mM

CaClz 1.8 mM

Glucosa: Glucosa 5.6 mM

Preparación de extractos tumorales y celulares de membrana

Los tumores se homogeneizaron con un politrón a velocidad media en buffer sucrosa en una

proporción 1:4 p/v. Posteriormente, el homogenato se centritugó a 3300 rpm, 10 min, 4°C. EI

sobrenadante obtenido se centrifugó a 12000 rpm por 20 minutos a 4°C. EI pellet obtenido se

resuspendió en eI buffer Krebs-Trisjunto con Ia glucosa y se alicuotó para guardar a -70°C hasta ser

utilizado. Paralelamente se determinó la concentración de proteínas por el método de Lowry(190).

Para realizar los extractos de membrana a partir de oélulas en cultivo, se Iavaron las mismas

con PBS y se levantaron con un rastríllo con PBS. EIvolumen recuperado se centrífugó por 10 minutos

a 3300 rpm; 4°C. Se descartó el sobrenadante y se resuspendió el pellet en buffer sucrosa siguiendo

los mismos pasos que con el extracto tumoral.

Western b/ar

Medios y soluciones:

Acrilamida 30 %: Acrilamida(GibcoBRL) 29 gr

Bisacrilamida (Gibco BRL) 1 gr

H20 bidestilada 100 ml

Agitar durante 30 minutos. Si la bisacrilamida no se disuelve calentar un poco. Cuando todo se haya

disuelto filtrar Ia solución con un filtrode 0.22u. Guardar protegida de la luz.

58

Tris-HCI 1.5 M pH 8.8: Tris 90.85gr

H20 bidestilada 400 mI

Llevar a pH con HCI 1:2. Completar el volúmen a 500 ml con H20 bidestilada.

Tris-HCI 1.0 M pH 6.8: Tris 60.57gr

H20 bidestilada 400 mI

Llevar a pH con HCl 1:2. Completar el volumen a 500 ml con H20 bidestilada.

SDS 10 7°: SDS (Gibco BRL) 10 gr

H20 bidestilada 100 ml

Persulfafo de amonio 10 % (APS): APS (GibooBRL) 1 gr

H20 bidestilada 10 ml

PBST (PES-Tween 0.1 °/o):PBS pH 7.4: NaCI(Sigma) 0.8 %

KCI(Sigma) 0.02 %

NazHPO4 (Baker) 0.144 %

KH2PO4 (Baker) 0.024 %

Tween 20 (Sigma) 0.1 %

Cracking Buffer 3X: SDS(Anedra) 6 %

B- mercaptoetanol (Sigma) 15 % v/v

Glicerol (Flaudo) 60 %

Tris 0.18 M pH 6.8 0.18 M

Azul de Bromo Fenol (BPB) (Sigma) 0.006 % p/v

Se diluye a 1X con la muestra, o con un volumen de muestra y otro de H20 destilada si Ia muestra está

muy concentrada.

Ponceau S: Red Ponceau (Sigma) 0.5 %

Ác. acético glacial (Merck para análisis) 1 %

Buffer de corrida 10X: Tris 30gr

Glicina (BioFlad) 144 gr59

SDS (Anedra) 10 gr

Se lleva a un litrocon agua bidestilada y se diluye 1/10 en H20 bidestilada antes de usar.

Buffer de transferencia: Bufferde corrida1X 800mI

Metanol (Merk, para análisis) 200 ml

Marcadores de peso molecular:

Prestained molecular weight markers (Gibco BRL).

Kaleidosoope prestained standards (BioHad).

Raibow prestained molecular weight markers (Amersham).

High Range (Sigma).

Membrana de nitrocelulosa:

Trans-Blot transfer Medium (0.2 pm) (BioFlad).

Hybond c (0.2 pm) (Amersham).

Solución de bloqueo:

Leche descremada (Molico)5 % en PBST

Anticuerpos:

Monoclonales:

RP: hPRa 7 (NeoMarkers).mmRFGF: Flg (Santa Cruz Biotechnology) o RFGF-1.

Bek (Santa Cruz Biotechnology) o RFGF-2.

RFGF-S (Santa Cruz Biotechnology).

RFGF-4 (Santa Cruz Biotechnology).

FGF: FGF-2 (Santa Cruz Biotechnology).

RP: Ab-1 PRAB (gentilmente cedido por Ia Dra. Shyamala)

Anticuemos secundarios:

Anti-mouse lg, horseradish linked whole antibody (Amersham Lite Science).

Anti-rabbit Ig, horseradish linked whole antibody (Amersham Lite Science).

Sustra‘lo quimioluminiscente:

ECL western bloting detection reagent (Amersham Lite Science).

Supersignal (Pierce)

Películafotográfica:

CURIX FlP1 (Medical X-Flay tilm, Agfa).

Método de Lowr'y

Curva standard de albúmina (Sigma) con valores en un rango desde 0-80 pg (por duplicado).

Sc1 : CuSO41 %, tartrato de NazK 1 % en buffer N32C03 2 % / NaOH 1N.

Se diluye la muestra 3:100 y 5:100 en agua bidestilada. De esta dilución se toman 100pJ y se agregan

0.9 ml de Sc1. Luego de 10 minutos se agregan 100 ul de reactivo de Folin (Folin-Ciocalteu, Merck)

diluído a la mitad en agua bidestilada. Esperar 30 minutos y medir absorbancia a una longitud de onda

de 750 nm (lector de ELISA).

Waste/vr b/a r.­

Las muestras (50-100 ug de proteínas totales/calle) se separaron en un gel de poliacrilamida

discontinuo (7.5 %, 12 % y 15 % para separar el FlP, el RE y el bFGF, respectivamente) usando el

sistema de bufiers discontinuos de Laemmli(191). Se corrió un conjunto de marcadores de PM en cada

gel. Las proteínas se disolvieron en solución desnaturalizante (cracking buffer) y se hirvieron durante 2­

3 min. Se realizó la electroforesis durante 20-30 minutos a 15 mAmp/ gel hasta que la muestra pasó el

stacking y por 60-75 min a 20 mAmp/ gel en el separador. Luego, las proteinas se transfirieron a una

membrana de nitrocelulosa (Hybond-c, Amersham, UK) durante 2 hs a 80 V. Las membranas se

bloquearon durante toda la noche en solución de bloqueo. AIterminar el bloqueo, las membranas se

Iavaron varias veces en PBST y luego fueron incubadas oon los anticuerpos correspondientes. Para RP

con el anticuerpo monoclonal PgR Ab-7/hPRa 7 (Ab7) (Neomarkers, Union City, CA) a temperatura

ambiente, por 2 hs, en una oonoentración de 2pg/ ml (1:100), en PBST. Este anticuerpo oomercial se

obtuvo utilizando RP purificado de carcinoma de endometrio humano como antígeno (192) y se ha

demostrado que reacciona con el RP de ratón (193). EIAb7 detecta tanto RPAoomo RPa. Se utilizóen

una oonoentración final de 2 ug/ml (diluido 1/100 del vial madre en PBST). El segundo anticuerpo

utilizado fue un policlonal anti lgG de ratón realizado en oveja oonjugado con la enzima peroxidasa de

rábano (Amersham Lite Science, Bukinghamshire, UK), diluido 1/1500 en PBST. Se utilizó también el

anticuerpo policlonal anti RP de ratón PFl AB (Ab1) desarrollado en el laboratorio de la Dra. Shyamala

(194), este suero se diluyó 1/1000 en solución de bloqueo y como segundo anticuerpo se utilizó anti

lgG de conejo realizado en oveja conjugado con la enzima peroxidasa de rábano (Amersham Lite

Science), diluido 1/1500 en PBST. En el caso de RE se utilizó el anticuerpo policlonal MC-20 (Santa

61

Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA), diluido 1/100 en PBST. Luego de incubar con el segundo

anticuerpo se realizaron dos lavados de 10 minutos oon PBST y un lavado de 10 minutos con PBS.

Para revelar las bandas inmunoreactivas se utilizóel sustrato “ECLwestern blotting detection reagent"

(Amersham LifeScience) que al ser modificado por la peroxidasa del segundo anticuerpo da una señal

quimioluminiscente. Para visualizar la señal, las membranas se expusieron a una placa radiogrática

(Curix FlP1, Agfa Argentina) durante 10 seg a 5 min, dependiendo de la intensidad de la señal

observada. Sólo se cuantitioó la intensidad de las bandas en los geles donde la proporción de

intensidad se mantuvo lineal,es decir que la mancha no estaba saturada.

Inmunohistoquímica:

o Detección de bFGF y RFGF's

Los tumores se fijaron en tonnalina 10 % en PBS y se incluyeron en parafina según técnicas de

rutina. Se desparatinaron cortes de 5p en xileno y se deshidrataron en una serie de alcoholes de

graduación decreciente (alcohol 100°, alcohol 96°, alcohol 70° y agua destilada). La actividad de la

peroxidasa endógena se inhibiócon H202al 3 % en metanol durante 30 min. Los oortes se trataron de

5 a 30 minutos oon una solución de HCI3.6 % (VN) y se Iavaron con abundante agua destilada. Luego

se bloquearon con suero de caballo 5 % en PBS por 30 min y se incubaron con RFGF-t, RFGF-2,

RFGF-a, RFGF-4 o bFGF (Santa Cruz Biotechnology)en una dilución 1/100 en 5% suero de caballo en

PBS durante 24 hs (RFGF-2, RFGF-3 y bFGF) o 48 hs (RFGF-1 y FlFGF4) a 4°C. Se Iavó con PBS y

sucesivamente se incubó durante 30 min a temperatura ambiente con el segundo anticuerpo (anti lgG

de conejo conjugados oon biotina, Vector Labs, San Francisco, CA), diluidos 1/400 en 5% de suero de

caballo en PBS, y con el complejo ABC, preparado según las indicaciones del fabricante (Vector Labs).

Los vidrios se Iavaron varias veces oon PBS y se revelaron bajo el microscopio con 3-3’

diaminobenzidina 0.06 % en PBS y H2020.1 %. La reacción se detuvo con H20 destilada, entonces los

cortes se deshidrataron en una serie de alcoholes de graduación creciente, xileno y se montaron en

medio sintético (DPX, Fluka). Como control de especificidad de la señal se omitió el anticuerpo primario

en algunos cortes.

o Detección de proteina RP

Los tumores se fijaron en tormalina 10 % en PBS y se incluyeron en parafina según técnicas de

rutina. Se desparatinaron cortes de su en xileno y se deshidrataron en una serie de alcoholes de

graduación decreciente (alcohol 100°, alcohol 96°, alcohol 70° y agua destilada). Se realizaron 3

lavados con PBS de 5 minutos cada uno. Se inhibió la actividad peroxidasa endógena oon H202 al 3%

62

(vol/vol)en PBS durante 15 min. a temperatura ambiente. Se Iavó 3 veces oon PBS y se bloqueó la

adherencia inespecítica íncubando con suero normal de conejo (kitABC) diluido 1:200 en PBS durante

20 min. a temperatura ambiente. Luego, se incubó oon el anticuerpo primario (C-20; Santa Cruz

Biotech.) en una dilución 1:100 durante 24 hs. a temperatura ambiente. Se lavó 3 veces con PBS y se

incubó con el anticuerpo secundario, se usaron anti-Ig G de conejo biotiniladas (Vector), diluidas 1:200

durante 30min. a temperatura ambiente. Se repitieron los lavados con PBS y se incubó oon eI Sistema

de Detección: se utilizó el Complejo Avidina Biotina conjugado a peroxidasa (kit ABC-Vectastain Elite,

Vector)preparado según instrucciones del fabricante, 1/2 hora antes de usar a los electos deformación

del complejo en una dilución 1:50 y se incubó durante 30min. a temperatura ambiente. Se lavó 3 veces

con PBS y se incubó con Ia solución de revelado: 1 ml. de 3-3’ diaminobencidina (DAB 1mg/ml en Tris

Butter ph 7.6) con 7 pl de H202como substrato. Se incubaron los cortes y Ia reacción se desarrolló bajo

control microscópico, siendo interrumpidasumergiendo las secciones en agua destilada.

o Técnica de incorporación de bromo-deoxiuridina (Brd-Ur)

En seis ratones portadores de la línea 32-2-HI,dos controles, dos tratados con asRPa y dos con

scRP durante 5 días, se evaluó proliferación celular mediante incorporación de Brd-Ur usando Cell

proliferation kit, Amersham, UK.

La identificación de células proliterantes se basa en que la Brd-Ur es un análogo a la timidina

siendo incorporada corno una base análoga durante la fase de replicación del ADN,subsecuentemente

se localiza usando un anticuerpo monoclonal específico anti-BrdUr que es detectado mediante un

anticuerpo anti-Ig G de ratón conjugado a peroxidasa.

Los animales fueron inyectados via ¡ntraperitoneal con 5-Bromo-2’-deoxiuridina en dosis de

1mV100 gr de peso corporal y sacrificados 2 hs. después. Los tejidos removidos se fijaron en tormol

buffer 10% no más de 12 hs y se incluyeron en parafina cuidando que la temperatura de inclusión no

supere los 589G.

Se desparafinaron cortes de 5p en xileno y se deshidrataron en una serie de alcoholes de

graduación decreciente (alcohol 100°, alcohol 96°, alcohol 70° y agua destilada). Se realizaron 3

lavados con PBS de 5 minutos cada uno. Se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con una

solución de nucleasa/anti 5-Bromo-2'-deoxiuridina para facilitar el acceso del anticuerpo. Se Iavó 3

veces con PBS y se incubó con el anticuerpo anti-IgGZde ratón conjugado con peroxidasa durante 30

min. a temperatura ambiente. Se repitieron los lavados en PBS y se incubó durante 5 a 10 min con Ia

solución de revelado, usando DABcomo sustrato y Cobalto y níquel como intensificadores. Luego se

realizaron 3 lavados en agua destilada y las secciones se deshidrataron y se montaron en medio

permanente.

63

Inmunofluorescencia:

Se realizaron sobre cortes de criostato de los tumores estudiados. Los cortes se oonservaron a -70

QChasta el momento en que se comenzaron las marcaciones. En primer lugar se fijaron los preparados

en formalina 10% durante 1 hora a temperatura ambiente. Se Iavó con PBS y se bloqueó con suero de

caballo en PBS al 5% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, se incubó con el primer

anticuerpo: bFGF, RFGF-1, RFGF-2, FlFGF-3 y RFGF-4 (1 ug/ml) diluido en suero al 5% durante 24 hs

a 490. Se Iavó con PBS y se incubó durante 1 hora con el segundo anticuerpo (anti IgG de conejo

conjugado a lluoresceína) en una dilución 1:100 de Ia solución madre. Se tiñeron los núcleos con DAPI

(1 ug/rnl) o ioduro de propidio (1 pg/rnl) durante 2 minutos, se lavó y se montaron los preparados con

solución de montaje para iluorescencia (Vectashield). Se observaron los preparados al microscopio de

tluorescencia.

Identificación de células apoptóticas (TUNEL)en secciones tisulares

El método TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeiing) de detección in situ de apoptosis (195)

se fundamenta en la identificaciónde fragmentos de ADN,especialmente de tamaño oligonucleosomal,

incorporando mediante una reacción enzimática nucleótidos marcados a los extremos libres. La enzima

deoxinucleotidil translerasa terminal (Td'D se une específicamente a los extremos 3’-OH libres e

incorpora nucleótidos (dUTP) unidos a un trazador (digoxigeninao fluoresceína) lonnando una cadena.

Los nucleótidos incorporados se detectan con un anticuerpo dirigido contra el trazador y conjugado a

peroxidasa.

En muestras seleccionadas se identificó Ia apoptosis mediante la incorporación ín situ de

nucleótidos marcados (Apoptag Plus; Onoor Inc, MD). Los cortes se desparafinaron e hidrataron

mediante dos pasajes por xileno de 5 min. cada uno, dos cambios de etanol absoluto de 5 min. y

cambios de 3 min. en etanol 95% y 70%. Luego se realizó un lavado en PBS de 5 min. El tejido se

penneabilizó para exponer el ADN usando enzimas proteolíticas (proteinasa K, 20ug/ml) durante 15

min. a temperatura ambiente, seguido por cuatro cambios en agua destilada de 2 min. cada uno. Luego

se continuó la incubación según las instrucciones del fabricante (In situ Cell Death Detection Kit,

Fluorescein).

Mobi/I'fyGel Shíff

Marcación de la sonda (PRE)

Se desnaturaliza el elemento respondedor a progestágenos (PRE) llevando a 75°C por 5 minutos

en baño térmico y se renaturaliza dejando que la temperatura descienda lentamente a 37°C.

Se coloca en hielo: PRE renaturalizado

(Santa Cruz Biotech.; DNAgency)

T4PNK (New England Biolabs)

Butter (New England Biolabs)

H20

32P-ATP (New England Nuclear)

Se incuba durante 1 hora a 37°C.

Frenado de la reacclón

Se precipita la sonda marcada agregando en el eppendorlf de reacción:

EDTA (0.5m; pH 8) 2 pl

tRNA (10 ug/ul) 2 pl

H20 1 pl

NH4AcO (7M) 15 ul

EtOH absoluto 90 pl

75ng

1rd

2.5 pl

hasta 25 pl

1 NJ

Se incuba durante 30 minutos a -20°C o -70°C y se centrífuga 20 minutos a 12000 rpm y a

4°C. En un contador de pozo se cuenta Ia emisión del pellet. EI sobrenadante también se cuenta corno

control de marcación. Luego, se resuspende en H20 bidestilada estéril de manera de obtener 50000

cpm/pl.

Hibrldlzación PRE‘ con extracto:

t. Se agrega en un eppendorll:

o Extracto nuclear 10 ug

o Buffer de hibridización' 6 ul

o Polidi-dc" (Sigma) 40 ng/ug de proteína del extracto

o PRE' 1 pl (50000 cpm/ ensayo)

o Inhibidoresde proteasas'“ (Sigma) 1X

‘EI buffer de hibridización contiene: Tris pH 7.4 10 mM

NaCI 50 mM

DTT 1 mM

MgClz 5 mM

Gelatina 0.5 ug/ul

Glicerol 10%

Todo disuelto en H20 bidestilada estéril.

": Sigma Co. y se resuspende en H20 bidestilada estéril.

*** : Leupeptina: 5 ug/ml

65

Aprotinina: 5 ug/ml

Pepstatina; 5 ¿Lg/mi Disueltos en agua bidestilada estéril.

Espennina: 0.15 mM

Espermidina: 0.5 mM

pMSF: 10 W Disueltoen etanol

2. Se deja 20 minutos a temperatura ambiente.

o Corrida electroforética:

Gel: 5% no desnaturalizante.

o H20 33.3 ml

o Acrilamida-bis. (29:1) 6.18 ml

o TBE 5X' 10 ml

o APS 0.5 ml

o TEMED (Gibco BRL) 0.02 mI

'Para 0.5 litros de TBE 5X:

o Tris 27 g

o Bórico (HaBoa) 12.75 g

o EDTA (0.5M; pH 8) 10 ml

—L . Se precorre el gel sin sembrar 1 hora a 10mA por gel (con circulación de H20) en buffer de corrida

(TBE 0.25X).

. Se siembran las muestras y se corren a 20 mApor gel por aproximadamente 3 horas.

. Se pasa el gel a un papel Whatman y se cubre con un filmtransparente.

. Se seca el gel en un secador de geles durante 2 horas a 80 °C.

01-th . Se expone el gel en un chasis con placas radiográficas a -70°C durante aproximadamente 24 a 72

horas.

6. Se revelan los films a distintos tiempos buscando la mejor exposición (puede ser hasta diez días

más tarde).

Análisis Estadístico:

Las diferencias entre los tratamientos in vivo se evaluaron realizando una regresión lineal para

cada tratamiento y comparando diferencias entre las pendientes. En los experimentos de proliferación

celular y recuento de células, las diferencias entre concentraciones de un único tratamiento y el control

se compararon usando ANOVAy “f' de Tukey para comparar grupos entre sí. Las diferencias entre

medias de dos tratamientos se evaluaron con una prueba 't" de Student. La intensidad de las bandas66

se cuantiticó usando el software Image Quant®(Molecular Dynamics, Versión 3.3); sólo se cuantiticaron

exposiciones no saturadas.

El análisis de los PMs se realizó trazando una recta de regresión con los valores

correspondientes a cada marcador y su movilidaden el gel. En función de estos datos se calculó el PM

de cada banda en el gel.

En las figuras se muestra con asteriscos el grado de significación estadística con respecto al

grupo control, y mediante letras los grupos que se quieren comparar entre sí.

Todos los experimentos se repitieron por lo menos tres veces salvo que se especifique Io

contrarlo.

RESULTADOS

CAPÍTULO 1

Receptor de progesterona

Objetivo l: Investigar si existen factores de crecimiento capaces de reemplazar el aumento del

crecimiento tumoral progestágeno-dependiente (PD) inducido por el MPA.

Efecto del bloqueo del RPsobre la proliferación celular inducida por MPA.

o Incorporación de 3H-timidina

En experimentos previos realizados en el Seminario de Licenciatura demostramos Ia participación del

RP en el crecimiento PD mediante el bloqueo funcional o de la síntesis del FlP. Los experimentos fueron

realizados en cultivos primarios de un tumor mamario murino PD: CC4-HD (196) y se observó que el

bloqueo funcional del RP por medio de antiprogestágenos que tienen mecanismos de acción diferentes

inhibieron la incorporación de aH-timidina en forma significativa y dosis-dependiente. EI RU 486

(antiprogestágeno tipo Il: permite la unión del RP al ADN e impide la activación de la transcripción)

inhibió a partir de 10'1‘M(p<0.001) y el ZK 299 (antiprogestágeno tipo I: impide Ia unión del RP al ADN

y, en consecuencia, no se activa la transcripción) inhibió a partir de 10-9M(p<0.001) la proliferación

celular inducida por factores séricos (Figura 3-1 A y B). Los mismos antiprogestágenos en

concentraciones de 103M inhibieron la proliferación celular inducida por MPA 10“3M (Figura 3-1 C y D).

Cabe destacar Ia magnitud del efecto obtenido ya que concentraciones de los antiprogestágenos del

mismo orden que la aplicada con el MPA fueron capaces de revertir el efecto estimulante del MPA

cuando usualmente se utilizanconcentraciones 100 veces mayores a las del Kd del receptor para lograr

estos efectos. Habiendo obtenido estos resultados decidimos utilizarotra estrategia de bloqueo del FlP.

Para ello, bloqueamos la sintesis del RP utilizando un oligodeoxinucleótido (ODN) antisentido dirigido al

sitio de iniciación de Ia traducción de la isoforma A del RP. Este ODN inhibiría la iniciación de la

traducción de la isoforma A y B del RP ya que ambas isofonnas se traducen a partir del mismo

transcripto, siendo la isoforma B más larga que la isoforma A en su extremo amino-tenninal. La doble

cadena de ADN y ARN formada a partir del agregado del ODN sería sustrato de Ia ARNsa H la que

clivaría el híbrido ARN-ADN, impidiendo su traducción. Por otra parte, el ODN puede actuar además

como impedimento estérico para el pegado del ribosoma y bloqueando el inicio de la traducción. EI

agregado de este ODN al que denominamos (asRPa) inhibióen forma significativay dosis-dependiente

Ia proliferación celular inducida por factores séricos en concentraciones de 2.5 y 5 ug/ml (A) que

corresponde a una inhibición del 66:7%. El MPA 103M aumentó más de tres veces la proliferación

celular y el asFlPa produjo una inhibiciónsignificativa del 37.9i8% con 5 pg/ml (p<0.01) (B) (Figura 3-2).

69

RU 486 B_ ZK 299

.8 1.5 8 1.5C C:9 :9

5 2 8 2g 1.0 g 1:: 1.0É "5 É 5“3 ..= '3 "I1: 0.5 'U 0.50 0.2 .9'U 'UE E

¡_ocnE

0.0Log (M) Control -11 Control -1O -9

a vs. b: p<0.001

M N

3H-timidina

d A

Indicedeincorporaciónde Indicedeincorporaciónde

3H-tlmldlna

-8 o -8Control -- RU 10 M Control -- m 10 M

MPA 103M MPA 103M

Figura 3- 1: Efecto del RU 486 (A y C) y ZK 299 (B y D) sobre Ia incorporación de 3H-timidinaen células epiteliales de

cultivos primarios del tumor CC4-HD en presencia de factores séricos (Ay B) o MPA (C y D). Se muestra un experimento

representativo de, por Io menos, tres. Cada tratamiento se rea|izó por octuplicado y con 2.5% SFBch. RU 486 y ZK 299:

antiprogestágenos; MPA: acetato de medroxiprogesterona; ***:p<0.001.

Indicedeincorporaciónde

’H-timidina

Indicedeincorporaciónde

3H-timidina

0.6

asRPa pglml

0.0Control 0.3

Figura 3-2: Efecto del asRPa sobre la incorporación de 3H-timidinaen células epiteiiales de cultivos primarios del

tumor CC4-HD en presencia de factores séricos (A)o MPA (B). Cada tratamiento se realizó por octuplicado y con 2.5%

SFBch. Se muestra un experimento representativo de, por Io menos, tres. asRPa: secuencia antisentido para las

isoformas A y B del RP; MPA: acetato de medroxiprogesterona; "*: p<0.001; **:p<0.01.

Rol de la isoforma B del RPsobre la proliferación celular inducida por MPA.

o Incorporación de 3H-timidina

Están descriptas dos isofonnas de RP (A y B) y, hasta el momento, habíamos estudiado el

efecto producido por concentraciones crecientes de asFlPa sobre la proliferación celular. Con el

objetivo de investigar la participación de Ia isofonna B diseñamos un ODN dirigido al sitio de iniciación

de la traducción de la isofonna B del RP (asFin). Este ODN se uniría al sitio de iniciación de la

traducción de la isofonna B del BP impidiendo Ia unión del ribosoma para comenzar Ia traducción y

formando híbridos ADN-ARNque son sustrato de Ia ARNsa H. En la figura 3-3 A observamos el efecto

del asRPb sobre Ia incorporación de 3H-timidinaen un cultivo primario del tumor CC4-HD. EI asRPb en

concentraciones de 2.5 a 0.6 pg/ml no tuvo un efecto significativosobre la proliferación celular inducida

por factores séricos, e inhibió en un 47:8% y significativamente Ia proliferación celular a partir de 5

ug/ml. AIestimular la proliferación celular a más del doble que el control (236:19%) con MPA 106M, el

asFin inhibió la incorporación de 3H-timidinaen forma significativa y dosis dependiente a partir de 0.6

pg/ml (p<0.01) y alcanzó una inhibiciónmáxima de 42.8i4.66% con 5 pg/ml (p<0.001) (Figura 3-3 B).

o Recuento celular

Como control de Ia técnica utilizada para medir Ia proliferación celular se realizó el recuento

celular correspondiente y se observó una disminución significativa (p<0.001) en el número de células

en presencia de MPA con una concentración de asFiPa y asRPb de 5 pg/rnl (p<0.001) (Figura 3-4).

Esto indica la eficacia de Ia técnica de incorporación de 3H-timidina como reflejo de Ia proliferación

celular.

o Especlflcidad

Para corroborar Ia especificidad del oligonucleótido utilizado se realizaron ensayos en cultivos

primarios de CC4-HD utilizando un oligonucleótidocon las mismas bases que el asRPa pero ordenadas

en forma aleatoria (scFlP). Se evaluó el efecto del scFlP en un cultivo primario y en una línea celular de

mama normal (NMuMG)que no posee receptores hormonales. En la figura 3-5 A se observa que el

scRP no tuvo ningún efecto significativosobre la proliferación celular en las mismas condiciones en las

que el asRP había ejercido un efecto inhibitorio. Las figuras 3-5 B, C y D muestran el resultado del

tratamiento con eI asFiPa, asFle y scFiP, respectivamente, en Ia línea celular NMuMG.Ninguno de los

oligonucleótidos utilizados produjo un efecto significativo sobre la incorporación de 3H-timidina en el

mismo rango de concentraciones utilizadas en el cultivoprimario.

72

o 1.5 o2 2 a a vs. b: p<0.001g oo 3 'E Ñ E m

85 1.0 g á 2o _2 5 S‘3 I 3 n:v 0.5 “U 1É ÉE E 7/ , . ,

0.o A 1 o [/17 ira/C ///' í "”Control 0.6 1.25 2.5 5 asRPbmglml) Control - 0.6 1.25 2.5 5

asRPb (pg/ml) MPAm-aM

Figura 3-3: Efecto del asRPb sobre ia incorporación de 3H-tímidinaen células epiteliales de cultivos primarios del

tumor CC4-HD en presencia de factores séricos (A)o MPA (B). Cada tratamiento se realizó por octuplicado y con 2.5%

SFBch. asRPb: secuencia antisentido para la isoforma B del RP; MPA:actetato de medroxiprogesterona; ***:p<0.001.

a vs. b: p<0.001a vs. b: p<0.001É _

v‘ «É 3*3 8 zox x¿i 2'‘3 "3

g g 10at ¡t

Control MPA aSRPa o Control MPA asRPb(1o nM) (5 ug/ml) (1o nM) (5 ¡ug/mi)

Figura 3 -4: Efecto del asRPa (A)o asRPb (B)sobre la proliferacióncelular en células epiteliales de cultivos primarios

del tumor CC4-HD en presencia de MPA. Cada tratamiento se realizó por cuadruplicado y con 2.5% SFBch. asRPa:

secuencia antisentido para las isoformas A y B del RP; asRPb: secuencia antisentido para Ia isoforma B dei RP; MPA:

acetato de medroxiprogesterona; ***:p<0.001.

Sa.-..mmmm.wc.wm.áx/unmaa55eaY.I7)7mmwAawm aam.a5luv//M5Wv4.W¡Wuw2a”//Z(m...“M0.mGrWG7/PeIN.\.50MaMmdMmmu¿au/AsmmmmM1.Mfl//ummpmN7N7m.Iaomm.m n

IlO

4.ako.mn Mnna¿maohma.mCCeaanwm.mwB5nm50.D5050w.mWW«525??«5285.5Mxm“a.mr“ou539.0985ou3:2:ou539.09.35ou3:2:mrnM%ma,mnen.P,IaR

Oaun.

\lmCaBnmdmWsaoa>mWw.m.).mnD2cnlvMw.m,u.“mwnH4C.I0. l\V.CV;h.¡(JWAC0aAR(emrPGsDId.nlvWa.

MMaR.0um.

cnuousadMMa.mommwpummmmmmCa¡la..nmm5Uee..mswA321o)C3s4Mü

«525..-?mm.mm.wb.40..au:o_um._on._0u=_uu00:2...wm«EEEzinW.MmWcucgofloEooEovouïEHeMüMr

o Eficiencia

Ensayamos la expresión de FlP por Wesfem blof a partir de cultivos primarios de células

epiteliales tratadas oon el asFlPa o el asRPb. La banda inmunoreactiva de aproximadamente 120 kDa

correspondiente a Ia isofonna B del RP disminuyó en un 63.5% por esta técnica en el extracto tratado

con el asFle mientras que Ia isofonna A de 83 kDa disminuyó en un 55%. En el caso del extracto

tratado con el asFiPa se observó una disminución del 32.8% y 49.5% en las intensidades de las

isofonnas A y B, respectivamente. En las calles de la izquierda se observan las bandas

inmunoreactivas correspondientes a ambas isoformas del FlPpresentes en útero de ratón y la ausencia

de ellas en el caso del extracto de células NMuMG(Figura 3-6 A). A nivel funcional, observamos que el

tratamiento con el asRPa inhibió en un 92 :i:28% (p< 0.01) la unión específica del radioligando al RP.

El tratamiento con el asRPb disminuyó en un 63 1 15.4% (p<0.05) la unión del radioligando a su

receptor, mientras que el tratamiento con scRP no impidióesta unión (Figura 3-6 B).

Estos resultados indican la participación de ambas isofonnas del RP en la proliferación celular

inducida por factores séricos y MPAen un tumor PD (CC4-HD).

Efecto del bloqueo de ambas isoformas del RP sobre la estimulación celular

inducida por factores de crecimiento.

Con el objetivo de investigar si ambas ¡soformas del RP están involucradas en el aumento de la

proliferación oelular inducida por factores de crecimiento, caracterizamos el tumor CC4-HD en cuanto a

su respuesta proliferativaa distintos factores de crecimiento. Los resultados obtenidos en ese trabajo

demostraron que los cultivos primarios de las células epiteliales tumorales aumentaron su proliferación

celular solo en presencia de FGFs, mientras que el TGFB tuvo un efecto inhibitorioy los IGF-I y H y el

EGF no tuvieron un efecto por sí mismos (Tabla 3-1).

TIPO DE EGF IGFs FGFs TGFBsCELULA 0,05-100ng/mI1-200ng/ml 1-100ng/ml 7pg-70ng/ml

Epiteliales IE lE MW “r

Fibroblastos 11% 1‘ +1"? 'Ít'f'f

Tabla 3-1. Esquema cualitativo de la incorporación de aH-timidinaen cultivos primarios de células epiteliales y

fibroblastos estromales del tumor CC4-HD en presencia de factores de crecimiento: EGF, lGFs. FGFs y TGFBs (197).

76

asRPb asRPa

Uteror - + - +

NMuMG

RPB -> y "¿li

RPA ->

B.

A 750- Control:115fmolesl105céls.

g- scRP: 1o7fmores/105céls.3cu.2 500­1':oo%oC 250­:9cD

Control asRPa asRPb scRP

Figura 3-6: (A) Expresión de RP en cultivos primarios de células epiteliales del tumor CC4-HDen presencia de asRPa o

asRPb por Western blot. Se sembraron 100 ug de proteínas totales por calle en un SDS-PAGE 7.5%. (B) Ensayo del número

de RP en cultivos primarios de células epiteliales del tumor CC4-HD en presencia de asRPa o asRPb por la técnica de unión

del Iigando a punto único de saturación. Se grafico la unión específica :l: DS que proviene de la resta de Ia unión específica a

las cuentas totales. Control negativo: NMuMG: línea celular de mama normal murina; Control positivo: útero; asRPa:

oligonucleótido antisentido dirigido al sitio de iniciación de la traducción de la isoforma A del RP; asRPb: oligonucleótido

antisentido dirigido al sitio de iniciación de la traducción de la isoforma B del RP. scRP: oligonucleótido con las mismas bases

que el asRPa aunque ordenadas al azar.

Dentro de los FGFs, se ensayaron el bFGF o FGF-2 y el aFGF o FGF-1, siendo ambos estimulatorios

de la proliferación celular. El aFGF presentó un efecto estimulatorio significativo de la proliferación

celular a concentraciones 10 veces menores que el obsen/ado con el bFGF (Figura 3-7).

Se pusieron a prueba dos hipótesis: que el bFGF estuviera induciendo Ia proliferación celular a

través de una vía independiente del RP o que el bFGF activara una vía proliferativaque se cruzara en

algún punto oon la vía del RP. Se evaluó, entonces, el efecto del bloqueo del RP sobre la proliferación

celular inducida por bFGF. Para eIIo se realizaron ensayos de incorporación de aH-timidinaen cultivos

primarios de células epiteliales de CC4-HD en presencia de bFGF e inhibiendo el RP. Cuando

estimulamos Ia proliferación celular con bFGF (100 ng/ml) y bloqueamos funcionalmente al RP

mediante el uso de RU 486 103M encontramos una inhibición significativa (p<0.01) en la incorporación

de 3H-timidina(Figura 3-8). Luego, bloqueamos la síntesis del RP con ODNs antisentido para ambas

isofonnas del RP. Tanto el tratamiento con el asFiPa como con el asFin inhibieron en forma

significativa la estimulación de la proliferación celular inducida por bFGF a partir de 0.6 ug/ml (p<0.001)

y 1.25 pg/ml (p<0.01), respectivamente (Figura 3-9).

Estos resultados Indican que la via de señalización del RP y del bFGFconvergen en algún punto

previo a inducir la proliferación celular. Por lo tanto, el RP estaria involucrado en la proliferación

celular inducida por bFGF o el RP es imprescindible ya que su inhibición no es compatible con

la proliferación celular.

2.5­

lndicedeincorporaciónde

3H-tlmldma

0.0- ‘Control 1 10 100 1 10 100

bFGF (ng/ml) aFGF (ng/ml)

Figura 3-7: Efecto del bFGF y el aFGF sobre la incorporación de 3H-timidinaen células epiteiiales de cultivos

primarios del tumor CC4-HD. Cada tratamiento se realizó por octuplicado y con 2.5% SFBch. bFGF: factor de

crecimiento fibroblástico básico; aFGF: factor de crecimiento fibroblástico ácido; ***:p<0.001.

a vs. b: p<0.01

Nl

T¡nlI

Indicedeincorporaciónde

3H-tlmldlna

Control - RU486

bFGF (100 nglml)

Figura 3-8: Efecto del RU 486 10«9Msobre la incorporación de 3H-timidinaen células epiteliales de cultivos primarios

del tumor CC4-HD en presencia de bFGF. Cada tratamiento se realizó por octupiicado y con 2.5% SFBch. bFGF: factor

de crecimiento flbroblástico básico; RU 486: antiprogestágeno; **:p<0.01.

a vs. b: p<0.001

Indicedeincorporaciónde

“Htimrdina

o A 4asRPa Control -- 0.3 0 6 1 25 2 5 5uglml bFGF (100 ng/ml)

Indicedeincorporaciónde

3H-timidina

0asRPbpglml

Control

a vs. b: p<0.01a vs. c: p<0.001

- 0.6 1.25 2.5 5

bFGF (100 nglml)

Figura 3-9: Efecto del asRPa (A)o asRPb (B)sobre la proliferacióncelular en células epiteliales de cultivos primarios

del tumor CC4-HD en presencia de bFGF. Cada tratamiento se realizó por octuplicado y con 2.5% SFBch. asRPa:

secuencia antisentido para las isoformas A y B del RP; asRPb: secuencia antisentido para la isoforma B del RP; bFGF:

factor de crecimiento fibroblástico básico; ***:p<0.001.

Objetivo 2: Evaluar el efecto del bloqueo del FlPen un tumor con crecimiento Pl.

Efecto del bloqueo de ambas isoformas del RPsobre la proliferación celular PI ¡n

vitro.

En este modelo los tumores progestágeno-independientes surgen a partir de las variantes

progestágeno-dependientes a través de los sucesivos pasajes en ratones hembras vírgenes de la cepa

BALB/c.Estos tumores se caracterizan por mantener la expresión de sus receptores hormonales (RE y

RP). Recientemente (184), se han subdividido los tumores Pl en respondedores (PI-R) o no

respondedores. Esta subdivisión se basó en la capacidad de inhibir su crecimiento tumoral en

respuesta a antiprogestágenos (RU 486 y ZK 299) y E2 que correlaciona con un patrón distintivo de

expresión de isofonnas del RP analizadas por Western blot.

Una vez demostrado que la vía del bFGF se cruza con la vía del RP, estudiamos Ia

participación del RP en el crecimiento Pl. El hecho de que los tumores regresionan completamente con

los dos antiprogestágenos de distinto mecanismo de acción sugería fuertemente que los RP están

involucrados en el crecimiento Pl. Para demostrarlo decidimos bloquear la síntesis del RP y evaluar el

crecimiento tumoral tanto in vivo como in vitro.

o Experimentos ¡n vitro

Sabíamos que los tumores Pl-Fl se inhibían con el tratamiento con antiprogestágenos ¡n vivo

pero faltaba demostrar que Ia inhibición de la síntesis del RP inhibía la proliferación celular in vitro. En

primer lugar se eligió el tumor C7-2-HI para realizar los experimentos in vitro ya que esta línea tumoral

era fácilmente cultivable. No todos los tumores se adhieren de la misma forma al plástico o resisten el

proceso de repique. A veces se adhieren bien inicialmente al plástico pero al subcultivarlos ya no se

adhieren o se adhieren pero dejan de proliferar. En la figura 3-10 A y B observamos el comportamiento

in vivo e in vitro al tratamiento con antiprogestágenos. Observamos Ia regresión tumoral con el

tratamiento con los antiprogestágenos (Figura 3-10 A). Las pendientes de las curvas resultaron

significativamente distintas con respecto al control (p<0.001) tanto con el RU 486 como con el ZK 299.

Los ensayos ¡n vitro se realizaron sobre células epiteliales de cultivos primarios de estos tumores.

Observamos que tanto el RU 486 (p<0.01) como el ZK 299 (p<0.01) inhibieron significativamente la

proliferación celular en cultivos primarios a partir de 10-9M(Figura 3-10 B). Cuando se bloqueó la

síntesis del RP con asRPa y asRPb se obtuvo una inhibición significativa con concentraciones que

oscilaban entre 1.25 a 5 ug/ml con ambos ODNs (Figura 3-10 C y D).

A.

A 50° o 1-5 +Ru4uN ‘UE c +ZK299

‘OÉ ‘°° '5É S E 1.oo 300 e :gE 8 É3 20° .5 gx8 8" 0.5W o

5 1oo 2'- É

o 0.3 . ¡ ¡ l l I.15 13 -11 9 .7 5

Log M

C. D.

o 1.5 o 1.5'U 'UC C2 .9g 0a g 1.o E g 1.oE- E E .12O O25 25._ I ._ I8" 0.5 8” 0.5O l).2 .91: '° ,E / E / /

o , , M w , , ,, /Control 0.3 0.6 1.25 2.5 5 Control 0.3 0.6 1.25 2.5

asRPa (ug/ni) asRPb (pg/ml)

Figura 3-10: (A) Crecimiento tumoral de Ia línea C7-2-HIen ratones tratados con solución fisiológica, RU 486 o ZK

299. (B) Efecto de los antiprogestágenos RU 486 y ZK 299 o (C y D) asRPa y asRPb sobre Ia incorporación de 3H­

timidina en cultivos primarios de células epiteliales del tumor C7-2-HI. Cada tratamiento se realizó por octuplicado y con

2.5% SFBch. Se grafica un experimento representativo de tres. La flecha indica el día de comienzo de los tratamientos.

asRPa: secuencia antisentido para las isoformas A y B del RP; asRPb: secuencia antisentido para Ia isofonna B del RP;

***:p<0.001; **:p<0.01; p<0.05. indice de incorporación de 3H-timidina: cpm del tratamiento/ cpm controt.

En el caso del tratamiento con el asFiPa observamos, en este experimento en particular, un aumento

significativo en la proliferación celular para las dosis de 0.3 y 0.6 ug/ml; esto no sucedió en los otros

dos experimentos realizados en las mismas condiciones.

Investigar el efecto del bloqueo de ambas isoformas del RPsobre el crecimiento

tumoral PI in viva.

o Experimentos ¡n vivo

A partir de los resultados obtenidos in vitro quisimos evaluar si se obtenía el mismo efecto al

inhibir la síntesis del RP ¡n vivo. De los tres tumores respondedores que tenemos en el laboratorio

elegimos, en primer lugar, el que nos parecía más apropiado para ver un efecto inhibitoriopor su mayor

tasa de crecimiento tumoral y su efectiva respuesta a los antiprogestágenos. EI tumor 59-2-HI fue

utilizado para realizar un experimento pilotoque nos permitiera encontrar una dosis efectiva y no tóxica.

Se eligió una dosis de 1 mg/ratón/día de asFlPa inoculada intraperitonealmente a tres ratones hembra

BALB/c (198) y se utilizó solución fisiológica como vehículo. La curva de regresión ¡n vivo con

antiprogestágenos que nos llevóa la elección de este tumor respondedor puede observarse en Ia figura

3-11 A. Observamos el tamaño tumoral en función de los dias y su regresión significativa (p<0.001) al

tratarlos con los 2 antiprogestágenos. Abajo (Figura 3-11 B) se observa el gráfico correspondiente al

experimento piloto con el asFlPa en el cual se observa una tendencia inhibitoriaaunque no significativa.

Si comparamos las curvas de crecimiento en el control en las figuras 3-11 A y 3-11 B se ve claramente

que el tumor no estaba creciendo a Ia misma velocidad en uno y otro caso, siendo éste mayor en Ia

figura 3-11 A. Esta disminución en Ia tasa de crecimiento pudo haber enmascarado el efecto esperado.

La figura 3-11 C muestra el peso de los tumores al finalizar el experimento y se observa la misma

tendencia. Estos resultados nos alentaron a continuar con el experimento pero buscando mejores

condiciones. En consecuencia, elegimos otro tumor PI-R (32-2-HI)y aumentamos el número de ratones

utilizados como control para favorecer el análisis estadístico. Además, se duplicó Ia dosis utilizada por

dia de 1mg/día/ratón a 2 mg/día/ratón pero inoculada en dos veces. Este último cambio se realizó

teniendo en cuenta que la dosis utilizadaanteriormente no habia presentado signos de toxicidad ya que

el estado general de los ratones era bueno, el tratamiento no alteró su peso corporal y la autopsia no

reveló ningún rasgo de anormalidad. El patrón de crecimiento tumoral y su regresión con el tratamiento

con antiprogestágenos pueden apreciarse en la figura 3-12 A.

34

59-2-HI

A.

NA400- +ControlE -0-RU486

É 300_ —-—ZK299Tv5g 200- *quO'5EN¡_

c I I I0 10 20 30 40

Días

B.

100- +Contro|"A -0-asRPa

EÉ, 75­ÉÉa 50­O'5

É 25- i

0" ¡— l l l l0 10 15 20 25 30 35

Días

C.

0.3­

É73 0.2­OEzHO8 0.1­D.

0.3Control asRPa

Figura 3-11: (A) Crecimiento tumoral de Ia linea 59-2-HI en ratones tratados con solución fisiológica, RU 486 o ZK

299. (B) Crecimiento tumoral de Ia linea 59-2-Hi en ratones tratados con solución fisiológica o una dosis de 2 mg/ratón

de asRPa. (C) Peso tumoral al finalizar el ensayo de los tumores de Ia línea 59-2-HI tratados con solución fisiológica o

asRPa. La flecha indica ei dia de comienzo de los tratamientos. asRPa: secuencia antisentido para ias isoformas A y B

dei RP.

Al realizar el tratamiento con el asRPa observamos una inhibición significativa (p<0.05) del tamaño

tumoral ya a partir del séptimo día de comenzado el tratamiento (Figura 3-12 B). Las pendientes de las

curvas del control comparado con la tratada fueron significativamente diferentes (p<0.05). Este efecto

se vio reflejado también en el peso tumoral (p<0.05; tde Student de 1 cola) al finalizar el experimento

(Figura 3-12 C).

o Eficiencia

La corrida eiectroforética de los extractos tumorales correspondientes a los controles y al

asFlPa por Western blot revelaron una disminuciónen la intensidad de las bandas correspondientes a

las isoformas A y B del RP (Figura 3-12 D). En promedio, la intensidad de las bandas disminuyó en un

63.3:15.1% para Ia isoforma A y en un 55.8:32.9% para la isoforma B. Otro dato muy interesante

surgió de Ia observación microscópica de los extendidos vaginales de los animales tratados con el

asRPa. Las hembras tratadas detuvieron su ciclo estral en estro. AIevaluar el efecto del RU 486 y el

ZK 299 sobre el ciclo estral también se observó una detención del ciclo estral principalmente en

metaestro para los tratados con RU 486 y en estro para los tratados con ZK 299 (Tabla 3-2). Todos

estos resultados corroboran Ia eficacia y especificidad del tratamiento utilizado.

Tabla 3-2: Cuadro comparativode los ciclos estrales correspondientes a animales tratados con solución fisiológica,RU

486, ZK 299, asRPa o scRP durante los 5 primeros días de tratamiento. M: metaestro; E: estro; P: proestro; D: diestro. *: se

encontraron células correspondientes al estadio de metaestro con algunas células de proestro en el extendido vaginal.

86

32-2-HI

A. B.

A 500- +Control 100- -I-Control-°- RU486 NA —o—asRPa

5400- —-—ZK299 É 75­

g 300 gg D 50­“ ‘03

O 200- Ig *x:

E100 g 25' *" *a t P(H 04 Í l l I

0 10 20 30 40 50 60 ( 10 15 20 25 30

Días Días

c. D0.4­

3Ï 03­tvhÉ: 0.2­aO8n. 0.1­

0.3Control asRPa

CONTROL asRPa

Figura 3-12: (A)Crecimiento tumoral de la línea 32-2-HIen ratones tratados con solución fisiológica, RU486 o ZK299.

(B) Curva de crecimiento del tumor 32-2-Hl en función del tiempo (dias) en ratones tratados con solución fisiológica o con

asRPa en dos dosis diarias de 1 mg/ratón. (C) Peso tumoral a! finalizar el ensayo de los tumores dela línea 32-2-HI tratados

con solución fisiológica o asRPa. (D) Expresión de RP en extractos celulares totales del tumor 32-2-HI controles o

inoculados con asRPa por Western b/ot. Se sembraron 100 pg de proteinas totales por calle en un SDS-PAGE 7.5%. La

flecha indica el día de comienzo de los tratamientos. asRPa: secuencia antisentido para las isoformas A y B del RP. *:

p<0.05.

o Especlflcldad

Habiendo demostrado que el asFlPa funcionaba y era eficiente in vivo encaramos un último

experimento utilizando además un oligonucleótido al azar (scRP) que demostrara la especificidad del

tratamiento. Este experimento se realizó con el tumor 32-2-HI inoculando 3 dosis intraperitoneales de

0.8 mg/kg cada 8 horas. El experimento se llevó a cabo durante solo 5 días para evaluar cambios

morfológicos y medir parámetros como apoptosis y proliferación celular en los cortes de tejido. En la

figura 3-13 A se muestran los resultados del crecimiento tumoral expresado como porcentaje de

aumento en el último dia de tratamiento con respecto al primer día de tratamiento. Los resultados

muestran un estancamiento del crecimiento tumoral (p<0.05) en los tumores tratados con el asRPa

comparados con los ratones control. EI tratamiento con el scFlP no tuvo efectos significativos sobre el

crecimiento tumoral. La tasa de crecimiento tumoral tue similar a la de los ratones controles. A la

derecha (Figura 3-13 B) observamos los mismos resultados representados como gráfico de barras

comparando el tamaño tumoral final de los tres grupos al finalizar el tratamiento. AI analizar el gráfico

se observa (figura 3-14) Ia fotografía de un corte histológico de un tumor sin tratar, uno tratado con el

scRP y dos tratados con el asRPa; de los cuáles uno estaba disminuyendo su masa tumoral en el

momento de finalización del experimento y otro había disminuido su tasa de crecimiento con respecto

al control. De los cuatro tumores que se trataron con el asFlPa, solo uno redujo claramente su tamaño

tumoral mientras que otro Io redujo parcialmente y el resto disminuyeron su tasa de crecimiento con

respecto al control. El tumor que redujo su tamaño tumoral presentó claros signos histológicos de

regresión (Figura 3-14 A-D)al momento de finalizar el ensayo. En los cortes histológicos de los dem{as

tumores tratados con asRPa no se observaron diferencias significativas en cuanto a los signos de

regresión con respecto a los controles. Se realizaron ensayos de incorporación de bromodeoxiuridina

como reflejo de la proliferación tumoral y de apoptosis por la técnica de TUNEL. Mediante la técnica de

bromodeoxiuridina se observó una marcación nuclear y se demostró que no hubo diferencias entre los

animales controles y los tratados con el scRP mientras que hubo menor número de células marcadas

en el tumor en regresión tratado con el asRP (Figura 3-14 E-H). Por otra parte, los resultados utilizando

Ia técnica de TUNEL revelaron que el único caso donde hubo un aumento de las apoptosis fue en el

tumor en regresión (Figura 3-14 l-L).

o Eficiencla

En este último experimento se corroboró la eficiencia del tratamiento por inmunohistoquímica. Se

evaluó la expresión de RP en cortes histológicos de tumores sin tratar o

32-2-HI

B.

30° -I- Control-0- asPR

'g -°— scPR og.9 —o—RU 486 m.2 E 20° E Eése EEu a o a3 1oo 8.\° .\°

0Control asPR scPR RU486

n=7 n=4 n 4 ­n­

Figura 3-13: (A) Curva de crecimiento dei tumor 32-2-HI en función del tiempo (dias) en ratones tratados con

solución fisiológica, con asRPa o con scRP en tres dosis diarias de 0.8 mg/ratón. (B) Tamaño tumoral ai día 5 de

tratamiento. asRPa: oligonucleótido antisentido dirigido al sitio de iniciación de ia traducción de Ia ¡soforma A del RP;

scRP: secuencia nucieotidica al azar utilizada como control de especificidad del oligonucleótido asRPa. *: p<0.05.

BromodeoxiuridinaHematoxílina y eosína.¿.'

..

' y, » .,

¡\ y)4* 1 x ‘ ; ' ..

¡‘v‘ ‘ A. «t

v" '1 l , .. Vu v.¡ «g |

\ , ,. v ¡ .

Mm.‘ . ‘ v‘d ._ ‘ ‘.S‘Ï" '. ’ . ‘¡_.

. ¡ ’' Á l '.

. a ‘ ,. ' ' 1 l. N «‘

.. L W 4 _

TUNEL

Figura 3-14: Efecto ¡n vivo de ratones creciendo con el tumor 32-2-HI y tratados con solución fisiológica (control)

(A-C), SCRP (D-F) y asRP (G-L), (A,D,G,J) Hematoxilina y eosina. (B,E,H,K) Tinción con bromodeoxiuridina para

medir células en mitosis. (C,F,I,L) Técnica de TUNEL para medir apoptosis. Aumento: 100X.

tratados con scRP o asRP. En la figura 3-15 observamos una disminución en la marca del tumor que

regresiónó tratado con asRP con respecto a los no tratados (solución fisiológica) o tratados con scFiP.

Este resultado refleja la eficiencia del tratamiento utilizado para disminuir Ia expresión de RP.

Observamos que la marcación disminuye aunque no desaparece por completo, que es simiiar a lo

observado por Western blot en Ia figura 3-12.

Estos resultados lndicarian que estos tumores PI-Rno necesitan dela administración exógena

de la hormona para crecer pero si necesitan de un RP activo y funcional sugiriendo que el RP

estaria activado por vías alternativas.

Figura 3-15: Inmnohistoquínúca de cortes arbebldos en parafina del wmor 32-2-HIproveniente de ratones

hatadosmtarneSdasconsoluciónfisiológica (A),scRP(B)oasRPa (C).Seravelócon mmficuerpocmb'a RP

seguido dal sistema avidna-biotina y daminobencidna. Aumento: 400K asRP. oligonucleótido antisenfido para la

isoformaAdel RP; scRP. digonucleótido con las mismas bases del RP aunque ordmadas al azar.

Objetivo 3: Evaluar Ia activación genómica del FiPen un tumor con crecimiento PD y su variante PI.

Efecto del bFGF sobre la activación genómica del RP en un tumor PD: Mabí/¡Iy

6e/Shift

Para demostrar que se trata de un efecto genómico y comprobar que efectivamente existe una

activación del RP en presencia de bFGF, realizamos un ensayo de MobilityGel Shift. Este ensayo

permite ver si el FlP se encuentra activado en la medida que sea capaz de unirse a un fragmento de

ADN que se encuentra marcado. El fragmento de ADN que se utiliza es el Elemento Respondedor a

Progesterona (PRE) al cual se une iisiológicamente el RP para regular Ia síntesis de determinados

genes. Si el FlP se encuentra activado está en condiciones de asociarse a su elemento respondedor y

se verá reflejado en el gel como un corrimiento hacia arriba de la banda marcada. De Io contrario, el FlP

no podrá unirse a su elemento respondedor y el ADNmarcado correrá libre y se verá como una banda

de menor peso molecular. La figura 3-16 muestra un aumento en la intensidad de la banda

correspondiente al dímero AA del RP unido al PRE' (elemento respondedor a progestágenos),

acompañado de una disminución del dímero AB al utilizar las células epiteliales del tumor CC4-HD

incubado durante 2 horas con MPA 1019M, comparado con el que no estuvo en contacto con Ia

hormona (CC4-HD (-)). AI incubar el cultivo celular durante el mismo tiempo con bFGF (100 ng/ml)

observamos un aumento significativo, y de mayores proporciones que el observado con el MPA, en Ia

intensidad de las tres bandas Io que indicaría que este factor activa al FiP y le permite unirse a su

elemento respondedor. En las calles de la izquierda se observa el desplazamiento de la banda al

agregar el oligonucleótidoen exceso trío (50 ó 100X). Este desplazamiento fue dosis-dependiente. Por

otra parte, en las calles de Ia derecha se observa un control oon una línea celular de tumor mamario

humano (T47D)que expresa RP. Se observa un aumento en la intensidad de Ia banda en presencia de

MPAcon respecto al que no fue tratado con la hormona.

Estos resultados demuestran que el RP se activa en presencia de bFGF y se encuentra en

condiciones de unir a su elemento respondedor. El bFGF permite entonces la activación del RP

através de mecanismos genómicos.

93

CC4-HD T47D

x58?­a,ÉÉ Trrémï**“IEEZImmonan: ILO-¡zum¿AÉEELEE

4 5 *

Figura 3- 16: Ensayo de MobilityGel Shifl en el tumor CC4-HD sin tratar, tratado con MPA (10'8 M)o con bFGF

(100 ng/ml). Se sembraron 4 fmoles de receptores por calle y se realizó Ia corrida electroforética según lo indicado

en materiales y métodos. El gel se secó y se expuso con una placa radiográfica a —70°C. MPA: acetato de

medroxiprogesterona; bFGF: factor de crecimiento fibroblástico básico; PRE: elemento respondedor a

progestágenos; T47D: línea celular de mama humana.

Activación genómica del RPen un tumor PI: Mab/lífy 6e/ Shift

Una vez demostrada la activación del RP en presencia de bFGF en un tumor PD, nos

preguntarnos si el RP estaria activado en el crecimiento PI. La figura 3-17 muestra un fuerte aumento

en Ia intensidad de la banda correspondiente al dímero AAen Ia calle correspondiente al tumor PI C4­

HI. Esto indica que existen una gran cantidad de RP activos capaces de unirse al PRE. La especificidad

del ensayo quedó demostrada con el desplazamiento de la banda observado en las calles de la

izquierda al agregar el oligonucleótido en exceso sin marcar (25, 50 ó 100X). Este desplazamiento fue

dosis-dependiente. Además, utilizamos un oligonucleótido no relacionado oon el RP (CRE: elemento

respondedor a AMPc) como control adicional de Ia especificidad de la unión al PRE'. Este

oligonucleótido agregado 50 veces más concentrado que el PHE' no disminuyó la intensidad de la

banda, lo cual indica que no fue capaz de desplazar Ia unión específica del RP a su elemento

respondedor. En este ensayo. a diferencia del anterior (en el que se sembró la misma cantidad de RP),

se sembró la misma cantidad de proteina por calle. Aún en estas condiciones se volvió a observar un

aumento en la intensidad del dímero AAen presencia de MPAcon respecto al que no fue tratado con Ia

hormona. La figura 3-17 muestra el aumento en la intensidad de Ia banda correspondiente al dímero AA

del RP unido al PRE' al utilizar el tumor CC4-HD incubado durante 2 horas con MPA 1019 M

(comparado con el que no estuvo en contacto con la hormona (CC4-HD (-))). AI incubar las células

epiteliales del cultivo durante el mismo tiempo con bFGF (100 ng/ml) observamos un aumento de

magnitud similar en la intensidad de esta banda, Io que indicaría que este factor activa al RP y le

permite unirse a su elemento respondedor. Los otros dímeros de RP (RPABy RPBB)aparecen como una

banda tenue en todos los casos estudiados excepto en el caso del tumor C4-HI. En este último se

distingue claramente cada uno de los dímeros aunque la intensidad de la banda es mayor para el

dímero RPM. Estos resultados indican que los dímeros RPAAserían los que se activan y se unen en

mayor proporción al PRE.

Estos resultados demuestran que el RP se encuentra activado en un tumor Pl aún en ausencia

de un progestágsno.

95

CC4-HD CC4-HD

.9 ‘É o oh h ¡z i:‘0- x '4- ll- o>< o >< >< A ho O O ID T + .QIn ‘- In N Ï LL z É =I.IJ m I.IJ I.I.I . o l.l.In! n: a: m v n. n.o n. n. n. o 'É E E E

Figura 3-17: Ensayo de MobilityGel Shifl en el tumor CC4-HDsin tratar, tratado con MPAo bFGF y en el tumor

C4-Hl. Se sembraron 10 pg de proteína por calle y se realizó la corrida electroforética según Io indicado en

materiales y métodos. EI gel se secó y se expuso con una placa radiográfica a —70°C. MPA: acetato de

medroxiprogesterona; bFGF: factor de crecimiento fibroblástioo básico; PRE: elemento respondedor a

progestágenos; CRE: elemento respondedor a AMPc;T47D: línea celular de mama humana.

Objetivo 4: Evaluar la hipótesis de que el bFGF estuviera involucrado en el crecimiento

progestágeno-independiente.

Con la confirmación de un RP activo y funcional en el crecimiento Pl y teniendo en cuenta que

el bFGF activaba el RP, nos preguntamos si este factor podía ser el responsable de la activación de la

vía del FiP en el crecimiento Pl. Nuestra hipótesis de trabajo entonces era que el RP, en ausencia del

ligando natural, podia ser activado por la vía proliferativadel bFGF que converge en algún punto con la

vía de señalización del RP. Para ello fue necesario encarar el estudio del sistema FGF-RFGF en

nuestro modelo y en Ia glándula mamaria normal.

o lnmunohlstoqulmlca

Caracterización de la expresión de bFGF y RFGFsen el desarrollo de la glándula

mamaria normal.

En la bibliografía disponible hasta el momento no existía un estudio completo de Ia expresión

del bFGF y sus 4 receptores en el desarrollo de Ia glándula mamaria normal de ratón por

inmunohistoquímica. En virtud de estudiar su expresión en un tumor PD y su variante PI, primero

estudiamos su patrón de expresión en el tejido normal. Caracterizamos por inmunohistoquímica la

expresión de estas proteínas en cortes embebidos en parafina de las mamas provenientes de ratones

hembras: vírgenes, preñadas y lactantes.

bFGF

En la glándula mamaria virgen aproximadamente un 30% de las células epiteliales Iuminales

de los conductos mamarios presentaron una marcación nuclear intensa (Figura 3-18 A). Además, en

algunas zonas se observó una marcación citoplasmática (Figura 3-18 A: recuadro). Por otra parte, se

observó una intensa marcación en las células estromales que rodean el conducto mamario que podría

involucrar a las células mioepiteliales. En la glándula mamaria preñada la marcación fue

exclusivamente citoplasmática en las células epiteliales con una concentración de la marca en la

membrana Iuminalde los conductos y IobuliIIos.En algunas células del estroma periductal se observó

una marcación nuclear. Los adipocitos también se marcan en el citoplasma y ocasionalmente con

intensidad en el núcleo. En la glándula mamaria lactante la marcación fue totalmente citoplasmática en

los acinos y en el estroma periductal. A diferencia de los otros dos estadios mamarios éste último no

presentó marcación nuclear.

Mamacontrol

Mamapreñada

Mamalactante

Figura 3-18: Inmunohistoquímicade un corte embebido en parafina de gláidula mamaria normal, pneñacho

lactante revelado con un anticuerpo policlonalque reconoce el bFGF (Santa Cruz Biotech). Los tejidos se fijaron

en fon'nalinaal 10%, se montaron en tacos de parafina y se realizaon los cortes. Luego, se desparafinó e hidrató

con alcoholes decrecientes, se inhibió la peroxidasa endógena y se bloqueo con suero normal para incubar

durante 18 hs con el anticuerpo primario. Se Iavó e incibó con el anticuerpo secundario (antioonejo) y se reveló

con el sistema avldna-biotlna seguido de diaminobencidina. Aumento mama normal y lactante: 400K Aumento

mama preñada: 200X

RFGF-l

En la glándula mamaria virgen se observó una marcación citoplasmática en un alto porcentaje

de las células epiteliales del conducto mamario y una marcación más tenue en el citoplasma del

estroma periductal. En las mamas preñadas y lactantes no se observó marcación específica (Figura 3­

19 A).

RFGF-Z

Tanto en la glándula mamaria virgen como en Ia preñada y en la lactante se observó una

marcación predominantemente citoplasmática tenue en las células epiteliales de los conductos

mamarios y en el estroma periductal (Figura 3-19 B).

RFGF-3

En la glándula mamaria virgen se observó una marcación nuclear intensa en un alto porcentaje

de las células epiteliales que componen el conducto mamario. Los adipocitos presentaron marcación

citoplasmática tenue con algún núcleo marcado. En Ia glándula mamaria preñada se observó una

marcación nuclear fuerte en casi todas las células que componen los Iobulillosmamarios. El estroma

periductal también presentó una marcación nuclear aunque en menor proporción que la observada en

las células epiteliales. También se observó marcación nuclear en algunos adipocitos. En cambio en la

glándula mamaria lactante prácticamente no se observó marcación específica. Aisladamente, se

observó algún núcleo marcado en un conducto mamario (Figura 3-19 C).

RFGF-4

En la glándula mamaria virgen no se observó ninguna marcación en las células epiteliales d_e. l

los conductos mamarios. Existe una marcación citoplasmática tenue en el estroma periductal y en los: :

adipocitos mientras que no se observó marcación específica en la glándula mamaria preñada.y-;- 5

lactante (Figura 3-19 D). - .

99

Mama control Mama pr'eñado Momo lactante

Figura 3-19: Inmunohistoquímicade un corte errbebido en parafina de glándula mamaria virgen (A,D,G,J),

preñada (B,E,H,K)o lactante (C,F,I,L) revelado con anticuerpos policlonales que reconocen el RFGF-1 (A-C), RFGF-2

(D-F), RFGF-3 (G-I) y RFGF-4 (J-L) (Santa Cruz Biotech). Los tejidos se fijaron en formalina al 10%, se montaron en

tacos de parafina y se reatízaron los cortes. Luego, se desparafinó e hidrató con alcoholes decrecientes, se inhibióla

peroxidasa endógena y se bloqueo con suero normal para incubar durante 18 hs con et anticuerpo priman'o.Se Iavó e

incubó con et anticuerpo secundario (anticonejo) y se revetó con el sistema avidina-biotina seguido de

díaminobencidina. Aumento: 200X.

Caracterización de la expresión de bFGFy RFGFsen un tumor PDy sus variantes

PI.

Con el objetivo de estudiar si existía alguna regulación hormonal o expresión diferencial del

bFGF, comparamos la expresión del factor en tumores miembros de la misma familia aunque con

distinto patrón de respuesta hormonal. Estudiamos cinco tumores por inmunohistoquímica: CC4-HD

tratado con MPA (CC4-HD (+)), CC4-HD sin MPA (CC4-HD (-)), C4-HI, C4-2-HI y CC4-HI. De los 5

tumores, uno tiene un comportamiento PD y se estudió en presencia y ausencia de Ia hormona y 3 son

variantes PI.

No se observaron grandes diferencias entre los distintos tumores estudiados. En

consecuencia, presentarnos las marcaciones obtenidas con un ejemplo representativo para todos los

antígenos evaluados (bFGF y sus 4 receptores) (Figura 3-20 y 3-21). Los resultados obtenidos por Ia

técnica inmunohistoquímica utilizando diaminobencidina como sustrato colorimétrico también se

corroboraron por inmunofluorescencia en uno de los tumores estudiados. Las figuras 3-22 y 3-23

muestran los resultados obtenidos utilizandoesta técnica.

bFGF

En eI tejido tumoral el bFGF se expresó tanto en el parénquima como en el estroma tumoral.

La figura 3-20 A expone una marcación típicamente citoplasmática epitelial en el tumor CC4-HI

mientras que la figura 3-20 B muestra Ia misma marcación en el estroma tumoral de un corte de tejido

del tumor C4-2-Hl. Ambas marcaciones presentaron una distribución puntitonne. Por zonas Ia marca

era equivalente en el epitelio y en el estroma tumoral mientras que en otras zonas se notó una

marcación más intensa en el estroma extratumoral comparada con la observada en el parénquima

tumoral. En un ejemplo representativo del tumor C4-Hl se observó una marcación epitelial más intensa

en Ia capa de células en contacto con el estroma tumoral (Figura 3-20 C). Las imágenes tomadas por

microscopía confocal se realizaron sobre un corte de criostato del tumor CC4-HD (+) y revelaron una

intensa marcación citoplasmática en el estroma peritumoral (Figura 3-22 A-C). Sin embargo, aunque

con mucha menor intensidad, el parénquima tumoral también presentó marca citoplasmática. Esta

puede apreciarse más claramente en Ia figura 3-22 D donde una sobreexposición en Ia marca del

estroma permite observar la marcación epitelial.

RFGF-l

Se observó una marcación fundamentalmente citoplasmática en el epitelio tumoral CC4-HD (+)

(Figura 3-21 A) y en algunas zonas Ia marca pareció estar asociada a vesículas secretoras en Ia base

de la membrana apical en cortes del tumor CC4-HI (Figura 3-21 A: recuadro). EI estroma intratumoral

lOl

C4-2-HI

Figura a-zc Inmunohistoquímicade cortes embebidos en parafina del tumor de mama murino CC4-Hl revelados

con un anticuerpo policlonalque reconoce el bFGF (Santa Cnrz Biotech). Los tejidos se fijaron en formalina al 10%, se

montaron en tacos de parafina y se realizaron los cortes. Luego, se desparafinó e hidrató con alcoholes decrecientes, se

inhibló la peroxidasa endógena y luego se bloqueo con suero normal para incubar durante 18 hs con el anticuerpo

primario. Se Iavó e incubó con el anticuerpo secundario (anticonejo) y se reveló con el sistema avidna-biotina seguido

de daminobencidina. Aumento:200X

Figura 3-21: Inmunohistoquimicade cortes embebidos en parafina del tumor CC4»HDcon MPA(salvo a y c qJe

son de un tumor CC4-Hl)revelados con anticuerpos policlonales me reconocen el RFGF-1, RFGF-2, RFGF-3 y RFGF­

4 (Santa Cruz Biotech). Los tejidos se fijaron en formaflinaal 10%, se montaron en tacos de parafina y se realizaron los

cortes. Luego, se desparafinó e hidrató con alcoholes decrecientes, se inhibió la peroxidasa endógena y se bloqueo

con suero normal para inclbar durante 18 hs con el anticuerpo primario. Se Iavó e incubó con el anticuerpo secundario

(anticonejo) y se reveló con el sistema avidna-biotina seguido de diaminobencidina. Aumento: 200K

Figura 3-22: Inmunofluorescencia de un corte de criostato de un tumor C4-HD revelado con un anticuerpopoliclonal que reconoce el bFGF (Santa Cruz Biotech). Los cortes se fijaron en formalina fria al 10% y se bloqueo consuero normal ai 2% para luego incubar durante 18-24 hs con el anticuerpo primario. Se Iavó e incubó con el anticuerposecundario (anticonejo) acoplado a FiTC, y ios núcleos se tiñeron con ioduro de propidio (5 pg/mi) y se observó conmicroscopía confocal. Aumentos: A: ZOOX;B: 400X; C: 600X; D: 600X.

presentó escasa o nula marcación de distribucióncitoplasmática. Por inmunofluorescencia también se

observó en el tumor C4-HD (+) una marcación fundamentalmente citoplasmática con claro predominio

en el epitelio tumoral y no así en el estroma tumoral (Figura 3-23 A).

RFGF-Z

La expresión en el tumor CC4-HD (+) del RFGF-2 fue predominantemente epitelial y

citoplasmática (Figura 3-21 B). Algunos núcleos del parénquima tumoral presentaron marcación

específica. La marcación fue puntifonne y granular en el citoplasma del parénquima tumoral y se

distribuyó fundamentalmente en las células del borde de invasión (en contacto con el estroma).

Prácticamente no se detectó marcación en el estroma intratumoral y los pocos campos que sí la

presentaron la misma fue citoplasmática y de menor intensidad que la del epitelio tumoral. Por

inmunotluorescencia del tumor C4-HD (+) observamos una fuerte marcación citoplasmática y nuclear

en el epitelio tumoral (Figura 3-23 B). La intensa marcación nuclear contrasta con los datos obtenidos

por diaminobencidina, que evidentemente no lograba exponer los antígenos presentes en el núcleo de

las células epiteliales.

RFGF-S

Se observó altamente expresado en el núcleo de las células epiteliales del tumor CC4-HD (+).

El parénquima tumoral presentó una marcación nuclear en un alto porcentaje de las células. Escasa y

esporádica marcación en los núcleos de las células del estroma tumoral (Figura 3-21 C). Por

inmunofluorescencia del tumor C4-HD (+) se observó una marcación no solo nuclear sino también

citoplasmática en las células epiteliales tumorales (Figura 3-23 C). La distribución de Ia marca en los

tumores se asemejó a la obtenida para la mama virgen y preñada.

RFGF-4

Se observó una tenue marcación citoplasmática en el epitelio tumoral del tumor CC4-HD (+).

Esta marcación se encontró preferentemente en el parénquima tumoral en contacto con el estroma. No

se observó marcación específica en el estroma tumoral (Figura 3-21 D). Por inmunotluorescencia del

tumor C4-HD (+) se observó una marcación citoplasmática tenue y nuclear con predominio en el

epitelio tumoral (Figura 3-23 D).

105

Figura 3-23: lnmunofluorescencia de un corte de criostato de un tumor C4-HD revelado con anticuerpospoliclonales para el RFGF-1 (A), RFGF-2 (B), RFGF-3 (C), RFGF-4 (D) (Santa Cruz Biotech) y control del segundo

anticuerpo (E). Los cortes se fijaron en formalina fria al 10% y se bloqueó con suero normal al 2% para luego incubardurante 18-24 hs con los anticuerpos primarios. Se lavó e incubó con el anticuerpo secundario (anticonejo) acoplado aFITC, los núcleos se tiñeron con ioduro de propidio (5 pg/ml) y se observó con microscopía confocal. Aumentos: A-E:400X4 Recuadros (b) Detalle de marcación a 600X; (c) Detalle de marcación a 1000X; (d) Detalle de marcación a600X.

Control del segundo anticuerpo

La figura 3-23 E muestra los núcleos teñidos con ioduro de propidio y la falta de marca al

incubar con el segundo anticuerpo solo. Esto demuestra que los resultados obtenidos no se deben a

inespeciticidad del segundo anticuerpo. La intensidad del rojo de los núcleos permite comparar más

claramente con el color de los núcleos donde la marcación es nuclear. AIIícuánto más intensa es la

marca, el color se vuelve más amarillento.

Estos experimentos revelaron una mayor marcación en el estroma que en el parénqulma

tumoral para el bFGF. Por el contrario, la marcación de los RFGF fue mayor en el parénquima

tumoral que en el estroma tumoral donde muchas veces fue imperceptible. La expresión de

RFGF-2 y RFGF-3fue más que el RFGF-1que se encuentró en menor cantidad y el RFGF-4 fue

prácticamente inexistente.

o Western bIot

Estudiar la expresión de bFGFen extractos de tejido tumoral.

Teniendo en cuenta que el anticuerpo reconoce las 4 isoformas del bFGF y para explorar Ia

posibilidad de que pudiera existir una expresión diferencial de las distintas isoformas en los distintos

tumores estudiados, ensayamos la expresión el bFGF por Westem blot.

Se realizaron corridas electroforéticas con geles desnaturalizantes de poliacrilamidaal 15% de

manera de detectar Ia expresión del bFGF con sus distintas isoformas. AI comparar extractos

tumorales de membrana del grupo C4 observamos una banda inmunoreactiva con un peso molecular

aproximado de 16 kDa correspondiente al bFGF tanto en los tumores PD como en los PI. Se observó

además un aumento en Ia intensidad de la misma en los tumores a los que se les retiró el MPA (PD (-))

una semana antes de extirpar el tumor con respecto a los que tenían MPA(PD (+)) en el momento de

preparar el extracto. Se utilizó el factor puro (Sigma Co.) como control adicional de la posición de la

banda inmunoreactiva. Estos resultados indican que el MPA es capaz de regular negativamente la

expresión de la isotorma de 16 kDa de bFGF. La isotorma de 25 kDa, descripta en la bibliografía,

también se revela con el anticuerpo utilizado. El tumor PI (C4-HI) mostró un aumento en la expresión

de la isotorma de 25 kDa y una disminución de la expresión de la isotorma de 16 kDa (Figura 3-24 A).

Esta expresión aumentada en el tumor Pl se observó en algunos de los casos estudiados aunque no

en todos (26). En los casos en los que no se obtuvo ese patrón de expresión se observó una banda

en ese peso molecular de intensidad similar a la observada para el tumor PD. En la figura 3-24 B se

observa la intensidad relativa de las bandas correspondientes al tumor PD (+) y al tumor PD (-) de

cinco experimentos diferentes. La media de las intensidades de estos experimentos reveló una

intensidad significativamente mayor (p<0.01) en los tumores PD (-) que en los PD (+).107

25->

16"

Intensidadrelativa

PD (+) PD (-)

Figura 3-24: (A) Expresión del bFGF en extractos de tumores PI o PD en presencia (+) o ausencia (—)de MPA

por Westem blot. Se sembraron 50 pg de proteinas totales por calle en un SDS-PAGE 15%. (B) Gráfico de barras

de ia Intensidad relativa de Ia ísoforma de 16 kDa en extractos del tumor PD en presencia o ausencia de MPA

(N=5). Se tomo como 1 la intensidad de Ia banda correspondiente al tumor PD en presencia de MPA. Control

positivo: factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) (Sigma); PD: progestágeno-dependiente; Pl;

progestágeno-independiente; MPA:acetato de medroxiprogesterona.

Estudiar la expresión de bFGF en extractos celulares de células epiteliales y

fibroblostos estromales.

Según nuestra hipótesis de trabajo esperábamos encontrar una mayor expresión del bFGF en

el tumor PI comparado con su variante PD. Esto no parecía atribuible a la isotonna de 25 kDa, ya que

no ocurrió en el 100% de los tumores C4-HI estudiados ni en otros tumores oon un comportamiento PI

(datos no publicados). La expresión de esa isotonna pareciera no estar directamente relacionada con el

fenotipo PI. Por otra parte, los tumores están compuestos principalmente por células epiteliales y

tibroblastos estromales. La proporción de cada una de ellas en la composición del tejido neoplásico

depende del tumor. En consecuencia, decidimos separar estas poblaciones celulares de manera de

¡ndependizamos de la proporción de cada tipo celular en el tumor y analizar la expresión del factor.

Teniendo en cuenta que el bFGF es mitogénico también en tibroblastos estromales y poniendo a

prueba la hipótesis de que el estroma tumoral PI podía estar involucrado en la adquisición de un

lenotipo Pl, se evaluó su expresión separando ambas poblaciones celulares. Se realizaron cultivos

primarios separando los tibroblastos estromales de las células epiteliales y se analizó Ia expresión de la

proteína en presencia o ausencia de MPA. EI análisis del Western blot (figura 3-25) reveló una banda

inmunoreactiva de aproximadamente 16 kDa presente tanto en los tumores PD como en los PI de

células epiteliales y tibroblastos. La intensidad de la banda lue significativamente mayor en las oélulas

epiteliales de cultivos primarios de tumores PD crecidas en ausencia de MPA. Esta banda

inmunoreactiva se vió disminuida (Figura 3-25 B) en las células epiteliales de tumores creciendo en

presencia de MPA. Por otro parte, otro dato interesante surgió del análisis de los tibroblastos

estromales de tumores PD o PI. Los tibroblastos provenientes de tumores PI presentaron una proteina

de 16 kDa oon una intensidad relativa significativamente mayor (p<0.05) que Ia de tibroblastos PD

comparados en tres experimentos diferentes (Figura 3-25 C). Como control se utilizaron extractos de

una línea celular epitelial de mama normal (NMuMG). Además se detectaron otras bandas

correspondientes aproximadamente a: 20, 22 y 25 kDa, que se encuentran descriptas corno isoionnas

del bFGF en Ia bibliografía (99). No se encontró ningún patrón de expresión distintivo de esas

isotormas entre los distintos grupos estudiados.

109

I Epitelíales I IFibroblastos—I

NMuMGPD PI PD PI

MPA- + - - - ­25—>W

tu «a» l fi,22-» w l20+ ‘3 ü z16+w '

16kDa—>

O

3°.Pq::

Nl

..

Intensrdadrelativa

_).

l

00.00.0000 OOOOOOOOOOO 32‘3'3'2°2°2;Z;2;2'E;32:20:

ooooooooooooqo.o

°Í?o

o.vvoooovvvv 00000000003 o0:.o,

¡o{oo%o

fioyooooooooo

‘o o o o0oo.

ooo

o.ña.oo

r.aro

FB PD FB PI

Figura 3-25: (A) Expresión del bFGF en extractos de células epiteliales o fibroblastos estromales provenientesde

cultivos primarios de tumores PD o PI por Western blot. Las células epiteliales de tumores PD se trataron, o no, con

MPA 10'3 M durante 96 hs. Se sembraron 50 pg de proteínas totales por calle en un SDS-PAGE 15%. (B) Gráfico de

barras de la Intensidad relativa de la isoforma de 16 kDa en extractos de fibroblastos estromales PD versus Pl (N=3).

Se tomo como 1 la intensidad de la banda correspondiente a los fibroblastos provenientes de un tumor PD. NMuMG:

células normales de glándula mamaria murina; PD: progestágeno-dependiente; PI; progestágeno-¡ndependiente; MPA:

acetato de medroxiprogesterona.

Objetivo 5: Investigar el rol de fibroblastos de un tumor PI sobre el crecimiento tumoral PD.

Efecto del estroma PI sobre la proliferación celular de células epiteliales PD.

Numerosos trabajos describen una mayor expresión del bFGF en el estroma que en el

parénquima tumoral (126;199) y, lo que nos llamó Ia atención en este caso, fue el aumento significativo‘ .I .I' A

de la expresión en los fibroblastos provenientes de tumores pm, con

respecto a su contrapartida progestágeno-dependiente. Los resultados obtenidos por Western blot

permitieron hipotetizar que el estroma cumpliría un rol fundamental en el fenotipo progestágeno­

independiente y, por qué no, en Ia adquisición de Ia hon'nono-independencia. Para evaluar este

fenómeno se realizaron los cultivos primarios de ambos tumores: CC4-HD y C4-HI, separándose los

fibroblastos estromales de las células epiteliales. Se realizaron ensayos de oo-cultivopor incorporación

de 3H-timidinade ambas estirpes celulares provenientes de la variante PD y una Pl. En la figura 3-26

se obsen/an los resultados de dos experimentos individuales (de un total de 3 experimentos). Se

observó un efecto aditivo (figura 3-26) al oo-cultivar fibroblastos PD junto con células epiteliales PD.

Por otro lado, al oo-cultivar las estirpes celulares PI se obtuvo una respuesta sinérgica comparando

con cada grupo celular por separado (figura 3-26 B). Interesantemente, al agregar los libroblastos PI a

las células epiteliales PD también se obtuvo un efecto sinérgico de magnitud similar al obtenido con las

células epiteliales Pl. Este efecto fue significativamente mayor que el obtenido con los libroblastos y

células epiteliales provenientes de un tumor PD. Los libroblastos PD junto con las células epiteliales PI

aumentaron significativamente Ia proliferación celular aunque en menor proporción que su

contrapartida Pl (Figura 3-26 B). Este efecto sinérgico en presencia de los fibroblastos estromales se

inhibió en presencia del antiprogestágeno RU 486 a niveles similares a los de las células epiteliales

cultivadas solas (p<0.001). Por otra parte. las células epiteliales provenientes de un tumor Pl

aumentaron alrededor de 10 veces su proliferación celular (p<0.001) con el agregado exógeno de

bFGF (100 ng/ml) al medio de cultivo, resultando en una respuesta aún mayor que la obtenida con las

células epiteliales PD (observada en las figuras 3-8 y 3-9).

lll

- 2500células4000- - 5000células

a vs. b: p<0.01a vs. c: p<0.001

3000- b vs. c: p<0.001a vs. d: p<0.001

Incorporaciónde

3H-timidina

NOO‘P

0..EPI PD + + - - - - + + + +FBPD - - + + - - + - + ­FBPI - - - - + + - + - +

B.

3000- a vs. b: p<0.055: p<0.001

o í p<o.oo11: a p<0.001:5 5 zooo-Éo :u _E Éo a:a l-- :1:8” 1000­E

0­EPI PD + - - - + - + ­EPIPI-+---+-+FBPD--+-+--+FB Pl - - - + - + + ­

Figura 3-26: Efecto del co-cuitivode células epiteliales ¡unto con fibroblastos estromales provenientes de cultivos

primarios de un tumor PD (CC4-HD) o uno PI (C4-HI) sobre Ia incorporación de 3H-timidina.Se muestra el resultado de

dos experimentos independientes (A y B) de un total de tres. Cada tratamiento se realizó por octuplicado y con 1%

SFBch. EPI: células epiteiiaies; FB: fibroblastos estromales; PD: progestágeno dependiente; Pi: progestágeno­

independiente; RU 486 o mifepristona: antiprogestágeno; bFGF: factor de crecimiento fibrobiásfico básico.

Crecimiento tumoral ¡n vivo de células epiteliales provenientes de un tumor PD

junto con fibroblastos estromales provenientes de un tumor PI.

Los resultados obtenidos in vitro nos indujeron a diseñar un experimento in vivo que

contemplara los mismos grupos experimentales realizados in vitro. Este experimento permitiría

discernir si la presencia de fibroblastos estromales provenientes de un tumor Pl son suficientes para

permitir el crecimiento de células epiteliales PD que normalmente no crecen en ausencia de MPA.

Para evaluar este fenómeno se realizaron los cultivos primarios de ambos tumores: CC4-HD y C4-HI,

separándose los fibroblastos estromales de las células epiteliales. Los fibroblastos se dejaron crecer

durante, aproximadamente, 7 días. Transcurrido este tiempo se realizó otro cultivo primario de ambos

tumores y se obtuvo la fracción enriquecida en células epiteliales. Luego, se analizó el crecimiento

tumoral en ratones hembras tras el inóculosubcutáneo de células epiteliales o fibroblastos estromales

provenientes del tumor PD o del Pl. Se analizaron los siguientes parámetros: Ia toma, la latencia y el

tamaño tumoral. Las células epiteliales PD aisladas no crecieron ya que necesitan MPA para crecer y

las células epiteliales Pl si fueron capaces de crecer aunque más lentamente que aquellas que se

inocularon junto con sus propios fibroblastos estromales. En el grupo de ratones inoculados con las

células epiteliales de un tumor PD con los fibroblastos estromales de un tumor Pl se observó un

crecimiento significativo (p<0.05) similar al obtenido por células epiteliales provenientes de un tumor PI

con sus propios fibroblastos. Los fibroblastos estromales PD no crecieron mientras que los PI si lo

hicieron. El hecho de que hayan crecido indica que la purificación y aislamiento de los fibroblastos no

fue suficiente como para erradicar totalmente las células epiteliales PI. La pequeña contaminación

epitelial permitió el crecimiento tumoral aunque no todos los animales inoculados crecieron (2/4) y su

latencia fue mayor que los demás grupos.

Latencia Tamaño tumoral (mm?)

(dias) Día 11 Día 16 Dia 25

at «xx

113

seria fundamental para el fenotipo Pl.

CAPÍTULO 2

Relación entre RE y RP

Objetivo 1: Estudiar Ia participacióndel RE en el crecimiento de un tumor PD.

Investigar el efecto del bloqueo del RE sobre la proliferación celular inducida

por MPAy factores séricos en cultivos primarios de un tumor PD.

Hasta el momento, habíamos estudiado el rol de los receptores de progesterona en el

crecimiento tumoral. Sin embargo, en cáncer de mama el rol protagónico Io han tenido siempre los

receptores estrogénicos y los RP se encuentran regulados por los RE. Luego de haber determinado

que el RP es un mediador clave del crecimiento tumoral nos preguntarnos si el alto número de RP de

estos tumores se debe a que los RE están permanentemente activados o si Ia expresión de RP es

constitutiva.

Con el objetivo de evaluar Ia participación del RE sobre la proliferación celular inducida por

MPA o factores séricos, se midió Ia proliferación celular por incorporación de 3H-timidina. Para ello se

inhibió Ia síntesis del RE con un oligonucleótido antisentido (asRE) o se bloqueó su función con un

antiestrógeno puro (ICI 182.780). Los resultados revelaron que el asFtE inhibió en forma significativa Ia

proliferación celular del tumor CC4-HD en concentraciones de 2.5 y 5 ug/ml (figura 3-27 A) al igual

que el ICI 182.780 que inhibió a partir de 10'9 M (p<0.001) (Figura 3-27 B). Por otra parte. cuando las

células epiteliales aumentaron su proliferacióncelular en respuesta a MPA 103 M observamos que el

asFlE inhibió Ia proliferación celular en forma significativa y dosis dependiente a partir de 0.6 ¿ig/ml

(p<0.01) (Figura 3-28 A). Además, el ICl 182.780 también inhibió en forma significativa y dosis

dependiente a partir de 1043M (p<0.01) Ia proliferación celular inducida por MPA (figura 3-28 B). Cabe

destacar Ia magnitud del efecto observado ya que concentraciones del antiestrógeno del mismo orden

que el progestágeno son capaces de revertir significativamente la estimulación de Ia proliferación

celular.

o Recuento celular

La figuras 3-28 C y D muestran que Ia disminución en la incorporación de 3H-timidina se vio

traducida en un menor número de células cuando se estimuló Ia proliferación celular con MPA 10“3M y

se trató con asRE (5 pg/ml) o ICI 182.780 10-7M.

llS

o o'u 1:c c:9 :9o oiv ma .2 a EE- E E- 'Eo E O E‘c’ =? 8 a._ I .- Id) n o n1:: 1:

.3 .3u 1:E E

0.0Control 1.25 2.5 5 Control -9 -8 -7 -6

asRE (ug/ml) ICI log (M)

Figura 3-27: Efecto del asRE (A)o ICI 182.780 (B) sobre la por incorporación de 3H-timidinaen células epiteliales de

cultivos primarios del tumor CC4-HD en presencia de factores séricos. Cada tratamiento se realizó por octuplicado y con

2.5% SFBch. asRE: secuencia antisentido para el RE tipo a; ICI 182.780: antiestrógeno puro; ***:p<0.001; **:p<0.01.

asRE ICI 182.780

A. B.

g 3 a a vs. b: p<0.01 g 5 a a vs. b: p<0.01:5 ,M a vs. c: p<0.001 ¡É 4 a vs. c: p<0,001

É E 2 É .3

.s 5; Emi?2 / 7%"’1 8 / % / c3 1 / / / 7

asREa Control -- 0.6 1.2 2.5 5 ¡Cl '09 (M) Contr0| -- -9 -8 -7 -6

(ug/ml) W MPA(10nM)

D.

30 ,Ï, 150a vs. b: p<0.05 a vs, b: p<0.001

NO

#decélulasx104Iml

a#decélulasx1o‘ImI

0Control -- asRE Control -- ICI182.180

MPA 1o nM MPA10nM

Figura 3-28: Efecto del asRE (A y C) o ICI 182.780 (B y D) sobre la proliferación celular en células epiteliales de

cultivos primarios del tumor CC4-HD en presencia de MPA. La proliferación celular se evaluó por incorporación de 3H­

timidina (Ay B) o por recuento celular en cámara de Neubauer (C y D). Cada tratamiento se realizó por octuplicado y con

2.5% SFBch. asRE: secuencia antisentido para el RE tipo a; ICI 182.780: antiestrógeno puro; MPA: acetato de

medroxiprogesterona; ***:p<0.001.

o Especificidad

Los controles de especificidad (figura 3-29) realizados en iibroblastos estromales que no

expresan receptores hormonales, no revelaron ningún efecto significativotanto con el asRE como con

el ICI 182.780. El bFGF se utilizócomo control positivo para los fibroblastos ya que estos aumentan su

proliferación celular en su presencia. EI asFlE en experimentos similares utilizando Ia línea celular de

mama NMuMG no presentó ningún efecto significativo sobre Ia proliferación celular en las

concentraciones ensayadas (no se muestra).

o Eficiencia

A nivel funcional, observamos que el tratamiento con el asRE inhibió en un 59.6 i 9.4% y de

manera significativa (p<0.01) la unión específica al FiE (Figura 3-30), demostrando Ia eficiencia del

oligonucleótido utilizado.

Estos resultados indican la participación del REen la proliferación celular inducida por factores

séricos y MPA.Estudios en curso del laboratorio que no son parte de este trabajo de Tesis

están dirigidos a investigar si los RE son necesarios para Inducir el RP o si hace falta una

interacción entre ambos receptores.

FIBROBLASTOS

A B.' 1.51

q, 1.5 3"a c5 .9._ O0É S 1o g g 1'0'

8 É 0 a= '-‘ .s._ I a":8 0.5 u 0.5­3 .32 z

.°<> Control

Figura 3-29: Efecto del asRE (A)o ICI 182.780 (B) sobre Ia incorporación de 3H-timidinaen fibroblastos estromales

de cultivos primarios del tumor CC4-HD en presencia de factores séricos. Cada tratamiento se realizó por octuplicado y

con 2.5% SFBch. asRE: secuencia antisentido para el RE tipo a; ICI 182.780: antiestrógeno puro; ***:p<0.001.

Receptor de estrógenos

150- Control: 12.6 fmolesl105 célulasg

5.: 100- ‘ ‘

É8 **C _50cD

Control asRE(5 ¡»lg/ml)

Figura 3-30: Ensayo de unión al Iigandopara el RE por célula entera en presencia de asRE en cultivos primariosde

CC4-HD. Las células se íncubaron durante 24 hs en 2.5% SFBch con los tratamientos. Este es un experimento

representativo de tres. Cada tratamiento se realizó.por quintuplicado. asRE: secuencia antisentido para el receptor de

estrógeno tipo a; **:p<0. 01.

CAPÍTULO 3

SERMs

Los ensayos realizados hasta el momento revelaron un efecto inhibitorio de la proliferación

celular inducida por MPA al utilizar un antiestrógeno puro: ICl 182.780. Sin embargo existen

numerosos antiestrógenos en circulación con distintos mecanismos de acción y con gran importancia

clinica. Entre ellos encontramos el tamoxifeno y el raloxifeno. Estos últimos antiestrógenos se

clasifican como SERMs (Selective Estrogen Beceptor Modulator) para incluiraquellos compuestos que

se unen al FlEpero que pueden tener un efecto agonista o antagonista de acuerdo al tejido en el que

ejerzan su acción. Elegimos el tamoxifeno y el raloxifeno (ver introducción) para profundizar el estudio

del RE en nuestro modelo experimental y agregar datos que permitan aclarar los resultados

controvertidos obtenidos en la clínica.

El objetivo de esta parte de Ia Tesis es evaluar el efecto de dos tipos distintos de

antiestrógenos del tipo SERM y compararlos con el antiestrógeno puro ya utilizado en nuestro modelo

experimental.

Objetivo 1: Estudiar el efecto de distintos antiestrógenos utilizadosen Ia clínica en un tumor PD.

Efecto del E2y los antiestrógenos tamoxifeno, raloxifeno e ICI 182.780 sobre

la proliferación celular inducida por MPAy factores séricos.

En primer lugar ensayamos el efecto de los antiestrógenos sobre Ia incorporación de 3H­

timidina en cultivos epiteliales de CC4-HD en ausencia de MPA o progesterona (Pg). Como

observamos anteriormente, el E2 tuvo un efecto inhibitorio a partir de 10-14M, y el ICI 182.780 inhibió

significativamente a partir de 10'9 M (p<0.001). Tanto el tamoxifeno como el raloxifeno inhibieron Ia

proliferación celular en forma significativa y dosis dependiente a partir de 1019M (figura 3-31). En

segundo lugar se ensayaron los mismos compuestos aunque en presencia de MPAo Pg. El E2 inhibió

Ia incorporación de 3H-timidina aún a bajas concentraciones (10'13 M) y el ICI 182.780 produjo un

electo similar aunque a 103M (Figura 3-32 A y B). EI tamoxifeno inhibió Ia proliferación celular (Figura

3-32 C) a partir de 10-9 M (10-7 M: 22.61:5.4% de inhibición) aunque en menor proporción (p<0.05)

que aquella inducida por el estradiol (10-7M: 64.77131 .3% de inhibición). Por el contrario, el raloxifeno

estimuló aún más la proliferación celular inducida por MPA a partir de 10-9 M (figura 3-32 D).

Experimentos realizados en las mismas condiciones en presencia de progesterona en lugar de MPA

presentaron resultados similares (no se muestran).

121

E2 lCl 182.780

0.5 0.5

A. B

lg 1.5 .3

5% 1.o E; 1.o55 255.: gn:3 .3É E

0.o 0.o / ' 7" '

Log (M) cm Log (M) cm —9 .3 .7 -6

Tamoxifeno RaloxifenoC. D.

.3 1.5 g 1.5

gg 1.o 1.0É 5 É 5¡”I 3.?'u o_5 u 0.5

e e

_ 0.o / x7, '/ / / _Log (M) Ctrl .9 43 .7 c Log (M)

Figura 3-31: Efecto del E2 (A), ICI 182.780 (B), tamoxifeno (C) y raloxifeno (D) sobre la incorporación de 3H-timidina

en células epiteliales de cultivos primarios del tumor CC4-HD en presencia de factores séricos. Cada tratamiento se

realizó por octuplícado y con 2.5% SFBch. Este es un experimento representativo de, por Io menos, tres experimentos.

E2: 17-B-estradiol; ICI 182.780: antiestrógeno puro; ctrt: control. ***:p<0.001; **:p<0.01.

E2 ICI 182,780

A. B.

g 10.0 g 5 aye

é 7 5 b=v<°-°°1 4 '" 232222823331E 2 - 9 2g: 3538 S 5.o É 5.E 3'; -- I 28M gnE5 2.5 .3 1E E

0.0 í} ,1,/ ví; L Mo .8 7 uLog(M)Ctrl- -13-11-10-9 .7 °9()MPA(10nM)

MPA(10nM)

Tamoxifeno Raloxifeno

C. D.

o . o 30É a vs' b' “MM É a vs. b: p<o.oo1

% :5E I...

g g g 20E O E

É z ¿é g8" 8" 1oÉ .3E E

0 _ / w,Log (M) Ctrl - -9 a .7 45 Log (M) Ctrl - .9 -8 -7

MPA(10nM) MPA(10nM)

Figura 3-32: Efecto del E2(A), ICI 182.780 (B), tamoxifeno (C) y raloxifeno (D) sobre Ia incorporación de 3H-timidina

en células epiteliales de cultivos priman’os del tumor CC4-HD en presencia de MPA. Cada tratamiento se realizó por

octuplicado y con 2.5% SFBch. Este es un experimento representativo de, por Io menos, tres. MPA: acetato de

medroxiprogesterona; ctr|.: control; E2: 17-Bestradiol; ***:p<0.001.

Se correlacionaron los resultados obtenidos por incorporación de aH-timidina mediante el recuento

celular en experimentos con células epiteliales tratadas con MPA a las que se les agregó E2 (103M),

ICI 182.780 (10-7 M), tamoxifeno (10-7 M) y raloxifeno (10*9 M) durante 7 días. Los resultados

confirmaron los obtenidos por incorporación de 3H-timidina. El E2 y el lCI 182.780 disminuyeron el

número de células mientras que el raloxifeno las aumentó (figura 3-33). EI efecto inhibitorio del

tamoxifeno se confirmó en otros experimentos: MPA 10“3M: 15.111.56 x 104 células; MPA (1019M) +

tamoxifeno (10-7 M): 7:t:1.45 x 104 células (p<0.05).

Efecto de los antiestrógenos sobre la inhibición de la proliferación celular

inducida por el E2.

Las células epiteliales de CC4-HD se trataron con E2 10'9 M y con concentraciones crecientes

de ICI 182.780, tamoxifeno y raloxifeno para evaluar la habilidad de estos compuestos de revertir el

efecto inhibitorio estrogénico. Los resultados indicaron que el tamoxifeno no tuvo ningún efecto

significativo a ninguna de las dosis ensayadas. Por otra parte, el ICI 182.780 (p<0.001) y el raloxifeno

revirtieron parcialmente la inhibición inducida por el E2 (p<0.01) a concentraciones de 10* M. A

mayores concentraciones inhibieron aún más la proliferación celular (Figura 3-34).

Efecto del E2y los antiestrógenos tamoxifeno, raloxifeno e ICI 182.780 sobre la

sintesis de RP.

El estradiol no solo regula Ia proliferación celular sino que también induce la síntesis de RP. En

consecuencia, evaluamos los efectos de estos tres compuestos sobre Ia inducción de RP. Tanto el E2

(10-9 M) como el tamoxifeno (10-7 M) aumentaron el número de FiP capaces de unirse a su ligando

(p<0.001); aunque el E2 Io hizo en mayor cantidad. El ICI 182.780 (10-7 M) inhibió significativamente el

número de RP (p<0.001) mientras que el raloxifeno (10'7 M) no tuvo un efecto significativo (Figura 3-35

A). Estos experimentos se repitieron utilizando E2 (10'12 M) y tamoxifeno (10-10M). EI E2 aumentó el

número de RP aún a esas concentraciones mientras que el tamoxifeno no tuvo ningún efecto (Figura

3-35 B).

124

150­:é c

1‘ a a vs b: p<0.001 r8 avs c:p<0.01x 100­wtu

É“8 50­a:'U41:

0_­\ x Q o o

o.60 QA Í(¡a «oo «¿o0° '39, o‘P o'P

6‘ e}\° «o Q­

MPA(10nM)

Figura 3-33: Efecto del E2, ICI 182.780, tamoxifeno y raloxifenosobre la proliferacióncelular evaluada por recuento

celular tras 7 dias de tratamiento. Los cultivos primarios se repicaron en placas de 24 hoyos y se incubaron durante 7

días con los distintos tratamientos en presencia de 2.5% SFBch y cambiando la mitad del medio de cultivo dia por medio.

AIfinalizar se realizó el recuento celular en una cámara de Neubauer; E2: 17-B-estradiol.

Tamoxifeno

Indicedeincorporaciónde

3Htlmldlna

¡_O«a É0Ctrl - -9 -8 -7 -6

.x O

Pa:

Indicedeincorporaciónde

3Htlmldma

0.0 ‘ ‘Log (M) Ctrl - -9 -8 -7 -6

1

.1 O

.°a1

Indicedeincorporaciónde

3HtImIdIna

¡_O(QÉ0

Ctrl - -9 -8 -7 -61

Figura 3-34: Efecto del tamoxifeno (A), raloxifeno (B) e ICI 182.780 (C) sobre Ia incorporación de 3H-timidinaen

células epiteliales de cultivos primarios del tumor CC4-HD en presencia de E2 10-9M. Cada tratamiento se realizó por

octuplicado y con 2.5% SFBch. E2: 17-Bestradiol; ***:p<0.001.

3001

Uniónespecífica

(%delcontrol)

NoC.’

_\ o‘ï"

Uniónespecífica(cpm)

Control -9 -12 -7 -10

E2 Tamoxifeno

Figura 3-35: (A)Cuantificación del número de RP por Ia técnica de unión del Iigando a punto único de saturación en

cultivos primarios de células epiteliales de CC4-HD tratadas con E2 o distintos antiestrógenos. Este es un experimento

representativo de tres. (B) Cuantificación del número de RP por la técnica de unión del Iigando a punto único de

saturación en cultivos primarios de células epiteliates de CC4-HD tratadas con E2 o tamoxifeno a dos concentraciones

diferentes (N=1). Los cultivos se incubaron durante 3 días con los distintos tratamientos y se utilizó 2.5% SFBch. E2: 17­

B-estradiol. *: p<0.05; **:p<0.01; ***:p<0.001.

Efecto del Tamoxifenoy el raloxifeno sobre el crecimiento tumoral.

Los experimentos realizados hasta el momento fueron todos sobre cultivos primarios de células

epiteliales. Para evaluar su comportamiento in vivo se inocularon ratones hembra de la cepa BALB/c

con el tumor y se evalúo el crecimiento tumoral en respuesta a diferentes tratamientos. Los ratones se

dividieron primero en dos grandes grupos: ambos fueron administrados oon MPA y a Ia mitad de ellos

se les extrajo el MPA una semana antes de empezar el tratamiento. A su vez a cada grupo se Io

¡noculó diariamente (sc) tamoxileno (5 mg/kg), raloxifeno (12.5 mg/kg) o solución fisiológica durante

aproximadamente 20 dias. En la figura 3-36 se observa que los tumores de ratones tratados con

tamoxileno fueron significativamente más chicos en tamaño y peso que los controles y que los tratados

con raloxifeno. Este resultado se observó en los animales tratados con MPA y en los animales a los

que el MPA se les había sido sustraído. EI análisis de las curvas de crecimiento por regresión lineal

también reveló una diferencia significativa en la tasa de crecimiento entre estos grupos (p<0.001). En

los animales tratados oon raloxifeno el aumento en el tamaño tumoral o del peso tumoral en los

animales sin MPA no fue estadísticamente significativo.Sin embargo, el análisis de las pendientes de

las curvas de crecimiento entre los animales control y los inoculados con raloxifeno reveló un aumento

significativo en Ia tasa de crecimiento de este último tratamiento (p<0.01). Un grupo de animales fue

tratado con E2 para confirmar Ia sensibilidad del tumor en el pasaje utilizado. La tabla 2 resume los

datos del análisis de las pendientes para los distintos tratamientos ¡n vivo.

Tabla 3-4. Análisis de las pendientes correspondientes al crecimiento in vivo del tumor CC4-HD tratados oon

tamoxileno. raloxifenoo E2por regresión lineal. p<0.001; ": p<0.01 con respecto al control.

Control Tamoxlfeno Raloxifeno E2

Con MPA 13.78 i 1.42 6.63 i 0.51m 13.43 i 1.08 ND

Sin MPA 9.58i- 0.4 2.78i 0.61 12.26i 0.86" -3.44i 0.92‘"

Para evaluar si Ia dosis efectiva de tamoxileno podía ser menor como está descripto en

determinadas citas bibliográficas, realizamos un experimento comparando la dosis utilizada hasta el

momento oon una 10 veces menor (0.4 mg/kg). La figura 3-37 muestra el crecimiento tumoral en

función de los días oon una disminución significativaen Ia tasa de crecimiento independientemente de

la dosis utilizada. La figura 3-38 muestra la foto de los animales tratados, o no, con MPA al finalizar el

tratamiento con los antiestrógenos.

128

A MPA (+) B Día 29: MPA (+)A A 5 a

“E 50° -I- Control +MPA 8 a vs. b. p<0.01g 400 + Tamoxufeno+MPA E 4E + Raloxifeno+MPA mL- V° 30° i 3É '6 E4523: .y ¿ZZ° 20° g 2 :szs

¡5 ‘5 s22: 2:22;

É 100 g 1 'ozo:'- n.

3 r . . . o 32:25:220 10 20 30 COHÍFOI Tamoxrfeno Ralox|feno

Tiempo (días) MPA

Día 42: MPA (-)c. MPA (-) D.a vs. b: p<0.01 c

A 7501 a vs. b: p<0.01 7,7 5 a b vs. c: p<o.oo1N

E c vs. d: p<0.001 gE + Control 2 4 vE 500_ + Tamoxufen c g _.o + Raloxifeno a E 3g + E2 O+1 _ E 2o i :3i: 250- H

g 8 1 4.;

3 o 4l 1'0 5'0 Control Tamoxifeno RaIOXIfeno

Tiempo (días)

Figura 3-36: Efecto del tamoxifeno y del raloxifeno sobre el crecimiento del tumor CC4-HD. Los tumores se

transplantaron en ratones hembras vírgenes de Ia cepa BALB/c con MPA. Cuando estaban de un tamaño de

aproximadamente 50 mm2se extirpó ei MPAde Ia mitad de los animales. Luego de una semana, se administró en forma

subcutanea y diaria tamoxifeno (5 mg/kg), raloxifeno (12.5 mg/kg) o solución fisiológica por aproximadamente 20 dias. AI

finalizar el ensayo los tumores se extirparon y pesaron. MPA: acetato de medroxiprogesterona; E2: 17-B-estradioi; **:

p<0.01; *: p<0t05.

500‘+ ControlNE -ú- Tam (0.1mg)É 400“+ Tam(0.04mg)E5 300­E5‘5 200­l:Em 100- l ,, *I- * *

c l I l I fio 1o 20 30 4o 50

Figura 3-37: Efecto del tamoxifeno sobre el crecimiento del tumor CC4-HD.Los tumores se transplantaron en ratones

hembras virgenes de la cepa BALB/csin MPA. Cuando alcanzaron un tamaño de aproximadamente 50 mm2 se extirpó el

MPA y, a Ia semana, se realizaron las inoculaciones subcutáneas y diarias de tamoxifeno (0.1 mg ó 0.04 mg/ratón) o

solución fisiológica durante aproximadamente 25 días. La flecha indica el día de comienzo de los tratamientos. 'z p<0.05.

1‘ JH." v­:' “"¡‘E‘i'l'í'l'l‘l'

|., ‘u'HuuÍunleu‘lvnlllll1¡uqlglllllllúIX\I¡lH"

Con ol a oxífeno Raloxif o

Figura 3-39: Fotografía de la masa tumoral al finalizar el experimento en ratones tratados con MPA (A) o sin

tratar (B). De izquierda a derecha: control con/sin MPA, tamoxifeno con/sin MPA y raloxifeno con/sin MPA.

Finalmente, se realizaron ensayos de unión al Iigando por competencia para definir las

afinidades de los distintos compuestos al RE. Como resultado, el tamoxifeno demostró tener menor

afinidad por el RE que el raloxifeno. La afinidad de unión relativa definida como el KiSERM/ Ki DES fue

de 05110.32 (n=3) para el raloxifenoy de 41.92i10.87 (n=3) para el tamoxiteno (Figura 3-39).

Resumiendo, el antiestrogeno lCI 182.780 y los SERMs tamoxifeno y raloxifeno mostraron

efectos inhibitorios per se en el crecimiento in vitro al igual que el E2 pero en mayores

concentraciones, el raloxifeno indujo una estimulación de la proliferación en presencia de

progestágenos. El ICI182.780 y el raloxifeno revirtieron el efecto inhibitorio del E2en un rango

de concentraciones mientras que el tamoxifeno fue siempre inhibitorio. Estas observaciones

sugieren que el tamoxifeno tiene un efecto estrogénico moderado en carcinomas mamarios

murinos.

—I— DES100 —E— Tamoxifeno

‘g 80; ---G—-Raloxifeno'ED 60­o\° 4o­

20­

C I I Í I I

-2 -1 0 1 2 3 4 5

log nM

Figura 3 - 39: Ensayo de competencia de unión al Iigando. Se incubaron alícuotas de extractos celulares de CC4-HD

con 4 nM de (3H)-E2durante 3 horas solo o en presencia de 0.01 a 20000 nM de DES, tamoxifeno o raloxifeno. Se utilizó

100 X de dihidrotestosterona para inhibir Ia unión no especifica. DES: dietilestilestrol.

DISCUSIÓN

Receptores de progesterona: proteinas centrales en el crecimiento tumoral dependiente e

independiente de progestágenos:

En el primer capítulo de este trabajo de Tesis se demostró que los RP cumplen un rol

fundamental en el crecimiento de carcinomas mamarios experimentales. Confinnamos Ia participación

de ambas isofonnas del RP en Ia proliferación celular inducida por MPA, por factores séricos y por el

factor de crecimiento fibroblástico básico en el crecimiento PD. Más aún, demostramos que estos RP

siguen cumpliendo el mismo papel en tumores que ya no necesitan de la administración exógena del

progestágeno para crecer.

Con el objetivo de investigar el efecto del bloqueo del RP sobre la proliferación celular se

usaron dos abordajes, el uso de antagonistas farmacológicos y de oligonucléotidos antisentido. En

trabajos previos del laboratorio ya se había establecido que el FiU486 inhibía la incorporación de 3H­

timidina de cultivos primarios PD (188) y luego en mi trabajo de Licenciatura se demostró que otro

antagonista con distinto mecanismo de acción, el ZK 299, ejercía un efecto similar pero a

concentraciones más altas: el RU 486 ejerció efectos inhibitorios ya a partir de 10'11 M mientras que

con el ZK 299 se obtuvieron efectos similares en concentraciones de 10-9 M. Estos resultados son

coincidentes con la mayor afinidad del RU 486 con respecto al ZK 299 en su unión al RP (200). Es de

notar que los efectos inhibitoriosen ambos casos se obtuvieron en concentraciones muy bajas de

antagonistas. En general se usan concentraciones de antagonistas 100 veces superiores al Kd de los

receptores hormonales. Estos antiprogestágenos, sobre todo el RU 486, tienen también actividades anti

glucocorticoide (201) y anti androgénicas (202), sin embargo estas actividades se han demostrado en

concentraciones mayores a 10-100 nM (202203). Los efectos obtenidos en este trabajo a tan bajas

concentraciones de antiprogestágenos sugeririan fuertemente que su acción estaría mediada a través

del RP.

Para confirmar estos resultados, utilizamos una estrategia antisentido que permite bloquear Ia

síntesis del RP. La técnica antisentido se ha utilizado en los últimos 10 años para inhibireficientemente

Ia expresión de determinadas proteínas. Debido a que hay por lo menos dos isofonnas de FiP, la A y Ia

B, usamos en principio un oligonucleótido de 20 bases diseñado por el grupo de O'Malley (186)

dirigido a bloquear el codón de iniciación de Ia isoforma A pero que teóricamente debería inhibir

también la istoforma B ya que el sitio AUG de la isoforma A está a menos de 500 nucleótidos río abajo

del sitio de inicio de la isoforma B (11). Este asRPa ha sido eficientemente usado en trabajos

relacionados con comportamiento sexual en ratas (186204) aunque no había sido utilizado en cáncer

de mama. Por otra parte diseñamos un asRP dirigidoa bloquear específicamente la isoforma B. ya que

no hay reportes al respecto. El oligonucleótido (ODN) diseñado no posee impedimentos para su

correcto apareamiento. El ODN, diseñado por el grupo de O'Malley tiene una secuencia de 4G

seguidas, Io cual no es conveniente debido a la formación de estructuras secundarias que impiden el

l35

correcto apareamiento de las bases, pero aún así demostró ser efectivo. Se verificó que ambos

oligómeros no presentaran secuencias con homología mayor al 70% con respecto a otros genes

conocidos.

En los experimentos de este trabajo se obtuvieron inhibiciones significativas utilizando bajas

concentraciones de oligonucleótidos antisentido para el RP (menores de 5 pg/ml aprox. 1 pM) mientras

que otros trabajos informan sobre efectos similares utilizandootros oligómeros a concentraciones de 20

pg/ml o más (205-208). Concentraciones mayores a las mostradas en este trabajo resultaban en

efectos inhibitorios no específicos. La especificidad de los efectos obtenidos se corroboró

exhaustivamente usando oligonucleótidos scRP y utilizando células que no expresan RP, como por

ejemplo la línea celular de mama normal de ratón NMuMG (209) o fibroblastos estromales en las

mismas condiciones experimentales. Es importante resaltar que es imprescindible realizar la mayor

cantidad de controles posibles ya que es necesario discernir entre los efectos inhibitoriosespecíficos y

los no especificos (169). En un principiohemos usado como control las secuencias sentido, pero luego

éstas se dejaron de usar ya que se reportó que podían intercalarse en el ADN y de alguna manera

también afectar la transcripción del gen (165). La secuencia sthP fue elegida de modo que no tuviera

una homología mayor al 70% con ningún gen luego de una búsqueda en el Blast.

La capacidad de los oligonucleótidos de inhibir las respectivas isoformas se evaluó en los

ensayos in vitro por Western blot y por técnicas de unión al Iigando para evaluar la disminución en la

expresión de los RP y su capacidad de unirse al Iigando. respectivamente. Los resultados de unión al

Iigando revelaron una disminución más pronunciada en las células tratadas con el asRPa con respecto

a las tratadas con el asFle. Esto es lógico ya que el ODN dirigidoal sitio de iniciación de la traducción

de la isofonna A del RP inhibe la síntesis de ambas isoformas mientras que el asRPb sólo inhibiría la

isofonna B, y mediante esta técnica se cuantifican ambas isoformas sin discernir sobre la cantidad de

cada una de ellas. La técnica de Western blot también reveló una disminución en ambas isoformas con

el tratamiento con el asFtPa aunque la disminución en la isofonna A fue menor que la esperada. El

tratamiento con el asRPb también reveló una disminución en la expresión de ambas isoformas. En

coincidencia con otros autores (210), la inhibiciónen la expresión de la proteína no es total, y quizás

ese sea el motivo por el que no se observa un efecto de mayores proporciones en la incorporación de

3H-timidina.Los efectos en la proliferación celular obtenidos con el tratamiento con el asRPa y asFle

revelaron en ambos casos una mayor inhibicióncuando el tratamiento se realizó en ausencia de MPA.

Si bien el MPA tiene efectos glucooorticoides (211) y androgénicos (212) además del clásico

progestacional, que podrían contribuiral aumento en la proliferacióncelular y serían independientes de

Ia disminución en los niveles de RP, pensamos que el MPA ejerce su efecto proliferativo a través de

RP, ya que la dexametasona sólo induce proliferacióncelular a altas concentraciones y, por otra parte,

la tlutamida, un antiandrógeno, no moduló la proliferación celular inducida por MPA (188). Postulamos

136

que el efecto del asRP es menos notorio en las células tratadas con MPAporque, como el bloqueo de

Ia proteína no es total, el MPAtodavía puede ejercer efectos proliferativos, aunque menores, a través

de este número reducido de RP. En ausencia de progestágenos, la eficiencia de los mecanismos no

convencionales a los cuales nos referiremos más adelante sería menor.

En todos estos estudios se evaluó incorporación de aH-timidinaa las 48 hs de tratamiento

como parámetro de proliferación celular, y ocasionalmente se hicieron recuentos celulares a tiempos

posteriores para confirmar los resultados obtenidos por timidina. En todos los casos hubo una

correlación entre ambas técnicas. Al tratarse de cultivos primarios existe una heterogeneidad de cpm

en los grupos controles de los distintos experimentos. Para unificarcriterios en los gráficos se señala la

incorporación de 3H-timidina corno índice de proliferación independizándonos del número de cpm

obtenido en cada experimento. Cabe destacar que en los experimentos de proliferación en los cuales

no hubo estimulación por hormonas o factores de crecimiento, el número de cpm basales fueron muy

bajos ya que los experimentos se realizaron en presencia de bajas concentraciones de suero fetal

adsorbidos con carbón para evitar la presencia de esteroides.

Curiosamente, en los experimentos que se hicieron cultivando tumores de crecimiento PI, las

cpm basales también fueron bajas. Se podría pensar que se trata de tumores que no necesitan de la

hormona para crecer y que sus cpm basales serían equivalentes a las de un tumor PD en presencia de

MPA,sin embargo no fue así.

Se demostró así que los RP jugaban un rol clave en la proliferación de cultivos primarios de

células de un tumor progestágeno-dependiente y de tres tumores distintos progestágeno­

indepedientes. En estudios previos se habia estudiado en el laboratorio los efectos de varios factores

de crecimiento sobre el crecimiento de células epiteliales PD y de fibroblastos estromales. Entre ellos el

EGF, IGF I y Il, TGF 61-3, HRG, FGF ácido y básico. De todos ellos el único que había estimulado la

proliferación en forma comparable a los progestágenos eran los FGFs (196). Curiosamente, estos

factores estimulan la proliferacióntanto de las células estromales como las de la contraparte epitelial, el

EGF en cambio sólo estimuló a los fibroblastos (197;213), mientras que los TGFBs eran estimulaton‘os

para fibroblastos e inhibitoriospara epiteliales (197). Los lGFs estimularon en pequeño grado sólo a los

fibroblastos (197;214). La HRG utilizada hasta ese momento no aumentaba la proliferación celular o era

inhibitoria.Estas propiedades fueron utilizadas como controles para determinar la pureza de los cultivos

tanto de fibroblastos como de células epiteliales. Es decir, cuando se evaluó el efecto proliferativo de

FGFs en células epiteliales se usó EGF para demostrar que los efectos observados no se debían a

contaminantes de fibroblastos.

Se usó entonces al bFGF como factor paradigmático para demostrar que el bloqueo de RP

impide el crecimiento celular inducido por factores de crecimiento que activan Ia vía de las MAPK,

sugiriendo así un “cross talk" entre ambas vías de señalización que hasta el momento no había sido

l37

demostrado para el RP (196). Posteriormente, otros trabajos (84) confirmaron nuestra hipótesis

usando heregulina (HRG) en lugar de bFGF en las mismas células tumorales, y demostrando que la

HRG es capaz de fosforilar y activar al RP murino in vitro.

En los últimos años se han descripto interacciones entre vías convencionales de estimulación

de la proliferacióny la activación de vías de receptores hormonales. En cuanto al FlP, en 1993 Edwards

et al (50) demostraron por primera vez un "cross talk" entre la vía del RP y la del AMPc.

Posteriormente, otros trabajos demostraron diversas interacciones entre distintas vías de proliferacióny

RP. En 1994 Turgeon et al (215) describieron que en células humanas de hipófisis tanto el GnFlH por

activación de pKa como el 8-bromo-AMPc activaban la vía del FiP aún en ausencia de progesterona y

los efectos se inhibían por antagonistas de progesterona. A los dos años, el grupo de O'Malley

describió una modulación de la activación del FlP por el neurotransmisor dopamina en cerebro de ratas

(216). En 1998 Clemens et al (217) describió una conversación cruzada de la vía del AMPc con la vía

del RP en células de granulosa de ovario. En general, para el RP se ha propuesto que los

progestágenos aumentan la sensibilidad a otros factores de crecimiento (218).

Todos estos experimentos indicaban que el FiP se podria activar en ausencia del Iigando

natural. Con el objetivo de demostrar la activación del FlP en presencia de bFGF se realizaron los

ensayos de MobilityGel Shift. Como control positivo utilizamos extractos celulares de Ia línea T47D, ya

que había sido ampliamente estudiada por el grupo de Edwards (201) en ensayos similares y se

conocía su activación en respuesta a progestágenos y a AMPc.Es de notar que estas células expresan

ambas ¡soformas en forma equimolar (51), sin embargo en los ensayos de MobilityGel Shr'flla banda

correspondiente al dímero AA es mucho más prominente que la correspondiente a los dímeros AB y

BB. En estas células en los ensayos de fosforilación la isofonna que se fosforila en Ser 294 luego de la

activación con MPA es la B que curiosamente participa menos en la unión al ADN. En nuestros

experimentos con los extractos celulares de CC4-HD, los dímeros AA son los que más se activan en

respuesta a bFGF. En nuestro modelo, esto coincidiría con la fosforilación preferencial de Ser 294 de Ia

isofonna A por FGF y por MPA (resultados no incluídos). Los resultados presentados por Labn'ola et al

(84) no coinciden exactamente por Io obtenido por nosotros. En su trabajo se observa una activación

aproximadamente equimolar de todos los dímeros y luego una mayor fosoforilación de la isoforma B del

RP. No encontrarnos explicación para estas diferencias aunque, en nuestro caso Ia mayor activación

del dímero AAcoincide con una mayor expresión de la isolorma A con respecto a la B en los ensayos

de Western blot, y con la fosforilaciónde esta isolonna en serina 294. Quizás la diferencia se encuentre

en la incubación de las células previa a la preparación del extracto, que nosotros realizamos en medio

libre de suero a diferencia de ellos, o que el tumor utilizado ha ido cambiando en el tiempo transcurrido

y ya no estamos frente al mismo tumor en los parámetros estudiados. Otra diferencia se observa en

cuánto a la activación del RP en el extracto control sin tratar con MPA. Nosotros observamos una

138

activación basal aún en los extractos sin tratar que coincide con una fosforilación basal en Ser 294 en

la isolorma A. Por el contrario, en el trabajo de Labn'o/a et al no se observa activación basal del RP

aunque sí tienen fosoforilación basal de Ser 294. Si bien el tiempo de incubación con el progestágeno

es de 10 minutos en ese trabajo y de dos horas en el nuestro, esta no sería Ia causa de las diferencias

ya que la fosforilación en el extracto control ya es diferente. El ensayo de MobilityGel Shift se realizó

en primer lugar comparando calles en las que se sembró igual número de receptores hormonales. Esto

no nos convencía ya que la variabilidad de la técnica de unión al Iigando usando volúmenes tan

pequeños (10 ul) resultaba muy grande y la intensidad de Ia banda correspondiente al dímero AAen el

extracto tratado con bFGF era varias veces mayor que el obtenido en el extracto tratado con MPA. Esta

técnica permite cuantificar receptores usando volúmenes correspondientes a 100 ul de muestra. En

consecuencia, realizamos el ensayo sembrando igual cantidad de proteína como se realiza

habitualmente para otras proteínas que no son receptores como p53 (219) y también se ha utilizado

para el RP (220), comparándose siempre células provenientes de un mismo cultivo. La crítica que

puede tener esta metodología es que los RP se "downregulan"en respuesta al MPAcon el correr del

tiempo y ya a las dos horas (tiempo de tratamiento) comienza a verse este efecto en las T47D (85) y en

las C4-HD (84). Igualmente, de ocurrir esto últimoestaríamos subevaluando el resultado obtenido. Por

Io tanto, si se observara un efecto indicaría que es así o de mayores proporciones. Los resultados

indicaron un aumento principalmente en la activación del dímero AA y, para el bFGF, el aumento de

una magnitud similar a la obtenida para el MPA. Por otra parte, se observó una expresión elevada de

los tres dímeros activados para el extracto tumoral de C4-HI. No es posible comparar en este caso la

magnitud de la activación con los resultados obtenidos en el tumor C4-HD ya que se trata de un cultivo

diferente y puede haber mayor expresión de RP en este tumor que en el C4-HD (184). Lo importante en

este caso fue demostrar que en un tumor progestágeno independiente los RP no solo median la

proliferación celular sino que además en condiciones basales están activados, y que el patrón de

activación de los dímeros es similar al tumor PD.

Todos estos resultados ¡n vitro adquirieron una dimensión mayor al ser respaldados por

experimentos in vivo.Ya se había demostrado anteriormente que los antiprogestágenos y estrógenos

eran capaces de inducir la regresión completa de tumores progestágeno-independientes (221-223).

Cabe destacar que los efectos ¡n vivoson muchos más pronunciados que los efectos obtenidos in vitro,

sugiriendo la participación de mecanismos sistémicos o una interacción con el estroma tumoral que

permitiría una regresión drástica del crecimiento tumoral. Los mecanismos asociados a la regresión

tumoral son parte de la Tesis doctoral de Silvia Vanzulli.Se demostró que tanto la citostasis como un

aumento de apoptosis acompañado por una reacción estromal más tardía serían fenómenos

relacionados a la regresión tumoral. En otros modelos experimentales de cáncer de mama también se

139

han documentado efectos inhibitoriosde antiprogestágenos (224) y de estrógenos sobre la proliferación

tanto in vivo (225) como in vitro (226).

Se decidió entonces evaluar el efecto del tratamiento antisentido ¡n vivo. Los fosforotioatos

desnudos se han utilizado con frecuencia en estudios in vivo para demostrar el rol de distintas

proteínas como bcI-2 (227) mdm2 (228) y ch (210). Aunque se obtuvieron efectos significativos, las

diferencias entre el grupo control y los tratados son pequeñas, y es por ello que se están desarrollando

nuevas tecnologías para mejorar el tratamiento con terapia antisentido.

En nuestros experimentos hemos ensayado distintas dosis para administrarlos, una única

dosis, dos o tres dosis diarias, siempre por vía intraperitoneal (228), ya que no se puede inocular

repetidas veces en forma endovenosa. El grupo control usando scFlP fue incluido en el último

experimento luego de evaluar que las condiciones experimentales eran favorables para estudiar el

efecto del asFlP. El efecto transiente del asFtP inhibiendo el crecimiento tumoral fue acompañado por

cambios endocrinológicos que se hicieron evidentes por eI análisis de los extendidos vaginales. EI

estado contínuo de estro-metaestro en los animales tratados comenzó a cambiar con el incremento en

el crecimiento tumoral, sugiriendo una respuesta del huésped que contrarresta el efecto del asRPa.

Distintos autores han reportado un estado de estro contínuo en animales tratados con

antiprogestágenos (229). En nuestro caso, el tratamiento con FlU 486 se asoció a un estado de

metaestro, mientras que el tratamiento con ZK299 Iohizo a un estro altemándose ocasionalmente con

un metaestro. El bloqueo del RP a nivel hipotalámico puede inducir un efecto inhibitorio que lleva al

arresto del ciclo en estro. Los bajos niveles de estrógenos no oontrarrestados por progesterona podrían

inducir este estado de estro contínuo. En el último experimento decidimos evaluar los resultados a

tiempos cortos para obtener material para estudios histológicos antes que los tumores comenzaran a

crecer nuevamente. Con el material obtenido al finalizar el ensayo se realizaron estudios

inmunohistoquímicos evaluando proliferación celular y apotosis en todos los grupos. La apoptosis se

observó como un puntillado fluorescente (Túnel) sólo en uno de los tumores del grupo tratados oon el

asFlPa, que es el tumor que mostró signos histológicos de regresión tumoral, además de una

disminución del tamaño tumoral. En los tumores que no cambiaron de tamaño luego de iniciado el

tratamiento, es decir que quedaron estancos, no hubo un aumento de apoptosis pero sí una

disminución de Ia incorporación de bromodeoxiuridina. Estos resultados son coincidentes oon una

disminución en la expresión de RP y con un bloqueo incompleto de Ia expresión de Ia proteína, tal

como se observa por técnicas de inmunohistoquímica y Western Blot. EI hecho de que no

observáramos marcación de Tunel en los demás grupos no significaque en los tumores no exista nada

de apoptosis, sino que el ensayo se hizo en condiciones límite de manera de poder detectar las

diferencias entre los grupos. En otras condiciones observaríamos marca en los otros grupos aunque

serían más difícilesde evaluar las diferencias oon el grupo tratado con asFlPa.

140

FGFy sus receptores en tejido mamario normal y neoplásica

Numerosos trabajos han estudiado Ia expresión de bFGF en tejido mamario humano benigno y

neoplásico. En general, estos señalan una disminución en la expresión de este factor con la

transformación maligna (230). Sin embargo, algunos autores encontraron un aumento de la expresión

del bFGF en mujeres con cáncer de mama (116-118). En particular, un trabajo reciente de Yiet al (231)

en el que comparan la expresión de bFGF y VEGF en mujeres jóvenes y postmenopáusicas con

tumores mamarios observaron una correlación directa entre el aumento de expresión de este factor con

la agresividad tumoral en las mujeres jóvenes. Nuestros resultados muestran que tanto los tumores PD

como los PI expresan bFGF principalmente en el estroma tumoral y, en menor proporción en el epitelio

tumoral. La expresión de bFGF en Ia glándula mamaria murina virgen, preñada y lactante ya ha sido

estudiada por otros autores (123) aunque es Ia primera vez que se muestra la expresión comparativa

por inmunohistoquímica. Los resultados obtenidos coinciden aproximadamente con los presentados por

radioinmunoensayo (123). Además, la localización en las células aparentemente mioepiteliales y en el

estroma subyacente coincide con los resultados obtenidos en glándula mamaria humana (230) y con la

expresión de ARNm en ratón (232). Los estudios in vitro usando líneas celulares de mama son aún

más conflictivos en cuanto al efecto del bFGF sobre su crecimiento. Existen evidencias que Io señalan

como proliferativo (120;121) y otras como inhibitorio del crecimiento de acuerdo a las condiciones

(122). Esto se debe probablemente a que el bFGF es multifuncional,ya que tiene distintas funciones

que varían de un tipo celular a otro y de determinada condición de crecimiento a otra. EI trabajo de

Fenig et al (124) describe Ia inhibición del crecimiento en células MCF-7 aún cuando observan

paralelamente una activación de las MAPK (EFlK 1 y EFlK 2) que generalmente se considera que

señalizan efectos estimulatorios del crecimiento. Souttou et al (125) observaron una acción autocrina

del bFGF en el crecimiento de líneas celulares de cáncer de mama humanas, sugiriendo que el bFGF

es importante en los eventos tempranos que llevan a la transformación neoplásica de células epiteliales

mamarias humanas.

Si bien el sistema FGF- FiFGF dio resultados muy interesantes ya que es un sistema muy

regulado con las variaciones hormonales en glándula mamaria normal, no observamos diferencias

importantes comparando la expresión en los tumores hormono-dependientes o independientes. En

consecuencia, decidimos evaluar por Western blot la expresión de bFGF en los distintos tumores y en

los hormono-dependientes tratados o no con MPA. Se observó menor expresión de bFGF en los

tumores honnono-dependientes tratados con MPA (banda de 16kDa). Si bien no era un resultado

esperado, ya que el bFGF es mitogénico en nuestro sistema, podría ser que el tumor que crece con

MPAno necesita bFGF para crecer. En un principiopensamos que podría ser debido a un aumento de

proporción de estroma en tumores en ausencia de MPA,sin embargo en cultivos de células epiteliales

l4l

también se vio el mismo efecto. El hecho de que por inmnunohistoquímica no se haya visto regulación

puede deberse a que por esta técnica no podemos diferenciar las distintas isoformas, de manera que la

expresión del conjunto es similar en los distintos tumores estudiados. Por otra parte, estudiamos

extractos de membrana y citosólicos y la regulación sólo se pone de manifiesto cuando se usan las

fracciones de membrana. El MPA estaria regulando la expresión de Ia isofonna de 16 kDa que es Ia

que no posee señal de señalización nuclear y que se la asocia principalmente con la estimulación de la

migración celular, síntesis de integrinas y downregulación de la síntesis del receptor (88). Este aumento

en ausencia de MPApodria estar más relacionado con un remodelamiento del tejido tumoral que con la

proliferación. Este resultado también nos llevó a pensar que era posible que el aporte exógeno de

bFGF tuviera un efecto distinto que Ia síntesis endógena del factor, y a postular que el bFGF

proveniente del estroma podria jugar un rol en el crecimiento de estos tumores. Un resultado curioso

fue que el tumor C4-Hl reveló en determinadas ocasiones una banda de 25 kDa de gran intensidad

pero que no se observó en todos los extractos del mismo tumor utilizados ni en otros tumores PI. Esta

banda está descripta en la bibliografíay coincidiria con una isolonna de bFGF de localización nuclear.

Decidimos no encarar un estudio más exhaustivo de esta banda ya que no se trataría de una banda

prototípica de los tumores PI y sería una particularidad más de este tumor. Las bandas obtenidas por

Western blot coinciden aproximadamente con los pesos moleculares de las isoformas reportadas para

bFGF en cerebro humano (99). Por otra parte, Ia mayor expresión en el estroma que en el epitelio

tumoral también ha sido descripta en otros sistemas tales como adenocarcinomas de próstata

(126;127) y carcinomas de mama humanos (199). Si bien los factores de crecimiento tendrían una

localización citoplasmática y de membrana, se han descripto isoformas de localización nuclear (233) de

aFGF y bFGF y nosotros Io detectamos en el núcleo de células Iuminales de Ia glándula mamaria

virgen. Bug/er et al (101) informó que cuando el bFGF se sintetiza en la célula sólo las isoformas de

alto peso molecular permanecen en el núcleo. De todas maneras, la isoforrna de 16 kDa podría

ingresar al núcleo en Ia fase G1 del ciclo celular Iocalizándose en el nucleolo (234). Todos estos

resultados nos llevaron a estudiar la expresión de bFGF en fibroblastos estromales de tumores PD y PI

y encontramos un claro aumento en la expresión del bFGF en los fibroblastos PI. Este aumento no

pudo deberse a contaminación con células epiteliales del mismo tumor ya que Ia expresión en las

células epiteliales es mucho menor. Esta intensidad de Ia banda en el tumor PI no se observó en el

extracto tumoral posiblemente porque los fibroblastos estromales se encuentran en menor proporción

en el tumor. Otra alternativa que no se puede descartar es que células contaminantes PI, pero no PD,

sean capaces de inducir el aumento de expresión de bFGF en los fibroblastos. Esto implica que no

habría diferencias intrínsecas entre los fibroblastos PD y Pl aunque sí en la capacidad de activación.

Las bandas observadas en los Western blofs correspondientes a las isoformas de bFGF han sido

descriptas por distintos autores (235).

142

En cuánto a los RFGFs es la primera vez que se describe la expresión en conjunto de los

RFGFs en el desarrollo de la glándula mamaria normal murina. En cáncer de mama humano hay

trabajos que describen la expresión de algunas isoforrnas (128;129) o todas (130) aunque no en tejido

sino en líneas celulares. Al igual que nosotros encuentran una marcación positiva para todos los

receptores y parecen tener una mayor expresión de RFGF-4 y RFGF-2 en las células malignas que en

las normales. Nuestros resultados revelaron una localización nuclear para el RFGF-3 observada por

diaminobencidina y por inmunofluorescencia. En la literatura se describió una variante de splicing del

RFGF-3 que se localiza en el núcleo tanto en líneas malignas como normales (130). En general, los

resultados obtenidos por ambas técnicas de marcación coincidieronaunque en el caso del RFGF-3 se

reveló por inmunofluoresoencia una marcación citoplasmática ausente al revelar con diaminobencidina.

Ambas técnicas difieren levemente en el procedimiento. En una partimos de cortes de criostato y en

otra los cortes provenían de tacos embebidos en parafina. Estas diferencias pueden haber afectado la

exposición del antígeno que fue revelado en un caso y no en el otro. Por otra parte, la técnica de

inmunofluorescencia es más sensible que la inmunohistoquímica. Los anticuerpos utilizados en este

estudio han sido ampliamente utilizados por otros grupos de investigación y también en

inmunohistoquímica (236).

El RFGF-t se localizó principalmente en células epiteliales de la mama normal y en los tumores

y esto ha sido reportado en Ia bibliografía (237). Los demás receptores, el FlFGF-2 y 4 se localizaron

fundamentalmente en el epitelio y no en el estroma tumoral. La marcación fue citoplasmática en los tres

casos y además nuclear para el RFGF-2 y RFGF-4. EI trabajo de Johnston et al (130) que describe la

expresión en líneas celulares humanas encuentran una marcación citoplasmática para el RFGF-2 y

RFGF-4.

Resulta quizás extraño encontrar receptores de membrana con localización nuclear. Muchas

veces se asocia Ia acumulación nuclear de los receptores a una activación dependiente de Iigando

(238). Esto ocurre por intemalización de vesículas que contienen los receptores activados y su traslado

a la membrana nuclear. Como el bFGF se encuentra en grandes cantidades en el estroma que rodea

las células epiteliales canoerosas y también rodeando los conductos mamarios normales, es posible

que el bFGF liberado interactúe con los FiFGF-3 en el epitelio y que se produzca la activación e

intemalización

Los RFGFs poseen varias variantes de splicingcada uno y cada isofonna posee características

de unión específicas. Estudios adicionales que permitan discernir qué variantes están presentes en

nuestro sistema permitirán estudiar si existe alguna diferencia entre los distintos tumores estudiados y

quizás establecer patrones de expresión.

En cuanto a regulación hormonal de miembros de la familia FGF, estudios realizados por

Pedchenko (239) con FGF-7 revelaron que éste en combinación con progesterona y prolactina tenían

143

un efecto sinérgioo sobre la proliferación de células del epitelio mamario normal de ratón. Además

observaron que la progesterona era capaz de aumentar los niveles del ARNm de los receptores para

FGF-7 (se trata de una isoforma del RFGF-2 también denominado KGF y perteneciente a Ia familia de

los FGFs). Además, Yi ef al (240) demostraron en ratones ovariectomizados que la administración

suprafisiológica de KGF lleva a una hiperplasia ductal sólo cuando se Ia administra junto con

estrógenos y progesterona. Lo que lleva a pensar en un papel de este factor en el inicio de un

crecimiento anormal y como promotor de la tumorigenesis en sinergismo con hormonas mamogénicas.

En un estudio preliminar no observamos marcación en tumores con un anticuerpo anti FGF-7 de Santa

Cruz Biotechnology.

Roldel estroma en la adquisición dela honnono-lndependencia

Actualmente, se sabe que el estroma cumple un papel muy importante en el crecimiento

tumoral; células tumorales pueden crecer o no de acuerdo al ambiente en el cual se encuentren. El

grupo de Sonnenscheín (Sonnenscheín, comunicación personal) está investigando la participación del

estroma en determinados modelos experimentales de carcinogénesis química y demuestran que el

estroma que sufrió la exposición al agente carcinogénico es quien determinaría Ia modificación en los

compartimentos epiteliales. En estos últimos años se han reportado trabajos tendientes a demostrar

que el estroma no ejerce un rol pasivo sino activo. Por ejemplo, se informó que Ia herceptina

(anticuerpo monoclonal que se utiliza para el tratamiento de células que sobreexpresan Her-2) tiene

como blanco el estroma tumoral (241) y que la proteína p53 se encuentra mutada con elevada

frecuencia en el epitelio y en el estroma mamario neoplásico (242). La bibliografía con respecto al rol

del estroma en la adquisición del fenotipo hormono-independiente es prácticamente inexistente excepto

por unos trabajos que apuntan a que el estroma de un tumor PI podría producir más aromatasa que el

de tumores PD (citado en (243)). Teniendo en cuenta los resultados obtenidos nos pareció importante

explorar el aporte del estroma en Ia transición de un fenotipo PD a uno Pl. Realizamos ensayos de co­

cuItivo en los que se observó un aumento mayor en la proliferación celular de las células PD al

incubarlas con fibroblastos provenientes de un tumor Pl que con los del tumor PD. Estos resultados

indicarían claramente una diferencia entre ambos tipos de fibroblastos que podría, o no, ser coincidente

con la mayor producción de bFGF de los fibroblastos Pl. Esto deberá demostrarse mediante el uso de

anticuerpos neutralizantes para bFGF. Los resultados se reprodujeron sistemáticamente en los distintos

ensayos y la magnitud de Ia respuesta fue variable en los distintos experimentos. En un experimento

preliminar presentado en este trabajo de tesis exploramos la posibilidad de reproducir el fenómeno in

vivo. Si bien los resultados obtenidos apuntan a que las células tumorales PD inoculadas con

fibroblastos PI adoptan el fenotipo PI, el hecho que en el grupo de animales inoculados con fibroblastos

Pl, 2 de los 4 animales desarrollaron tumores invalida los resultados obtenidos. Sin embargo, una

144

información adicional de este experimento sería que las células estromales potencian la acción

tumorigénica de las pocas contaminantes epiteliales, ya que en otros experimentos en los que

inoculamos una menor cantidad de células epiteliales (20.000 en lugar de 100000), no hubo

crecimiento tumoral. Actualmente, estamos ensayando distintos abordajes de purificación como Ficol­

Hypaque, gradientes de Percol y centrifugaciones diferenciales de los tibrobiastos para mejorar la

eficiencia del aislamiento, ya que si el resultado que se vislumbra se verifica entonces serían datos muy

originales.

Estos tumores a los que llamamos progestágeno independientes respondedores (PI-R)

comparten diversas características: responden a la terapia endócrina, expresan altos niveles de RE y

RP y al cultivarlos el estroma es conspicuo y es necesario eliminar los fibroblastos por sucesivas

decantaciones para obtener células epiteliales purificadas. Los tumores no respondedores por el

contrario, además de no responder a Ia terapia endócrina, tienen FiP detectables por

inmunohistoquímica y en menor grado por Western blot (184) y crecen fácilmente en cultivo sin

necesidad de eliminar el componente estromal. AI sembrar las células epiteliales éstas rápidamente

forman una monocapa libre de fibroblastos mientras que las células epiteliales provenientes de un

tumor PI-R permanecen como cúmulos aislados con baja tasa de crecimiento, salvo en el caso de

contaminación fibroblástica donde retoman un crecimiento acelerado. Si comparamos de Ia misma

manera el crecimiento in vitro de los cúmulos epiteliales PD estos crecen con mayor facilidad que su

contrapartida PI-R.

Todas estas observaciones apuntan a una “conversación”entre el estroma y el parénquima

tumoral. Los resultados obtenidos en este trabajo han demostrado que los RP estarían activados en el

crecimiento PI. Esta activación podria estar dada en forma constitutiva, en forma autocrina o en foma

paracrina. Todas las observaciones anteriormente mencionadas junto con Ia demostración que un

factor de crecimiento fundamentalmente estromal estaría involucrado en la activación del RP, sugieren

que un tumor puede evolucionar hacia la hormono-independencia adquiriendo mayor sensibilidad a

factores estromales o reclutando fibroblastos más eficientes en Ia secreción de dichos factores. Un

candidato es el bFGF pero es probable que haya otros. Por ejemplo, recientemente se ha demostrado

que el HGF sería un mediador entre el parénquima y el estroma en la glándula mamaria normal (146).

Más aún, células estromales en respuesta a estrógenos inducirían la síntesis de HGF que finalmente

estimularían eI crecimiento en el epitelio (151). En este modelo aún no hemos abordado el estudio del

rol del HGF.

Por otra parte, Labn'ola et al, que utilizan los tumores del mismo modelo experimental, han

demostrado minuciosamente que la HRG y los c-erst serían vías involucradas en el crecimiento

tumoral en respuesta al MPA, y por lo tanto, también serían moléculas candidatas a Ia activacion de

tumores PI (84). Sin embargo, los resultados en un conjunto indicarían que si la transición a Ia

145

hormone-independencia se diera por una activación de la vía de señalización de HRG, c-erb2, estas

células tendrian una alta tasa de crecimiento sugiriendo que estos cambios son consecuencia de un

estado proliferativomás que la causa del mismo.

Receptores estrogénicos también participan en el crecimiento tumoral

En estos años en el laboratorio, nos hemos abocado a determinar el rol de los receptores de

progesterona en el crecimiento tumoral. Sin embargo, en cáncer de mama el rol protagónico Io han

tenido siempre los receptores estrogénicos. Luego de haber determinado que el RP es un mediador

clave del crecimiento tumoral nos preguntamos si el alto número de RP de estos tumores se debe a

que los HE están permanentemente activados o si la expresión de RP es constitutiva.

Utilizamos en primer lugar un antiestrógeno al que se clasificó como "puro", aunque luego

surgieron trabajos que describieron su efecto antiprogestacional (244), y la estrategia antisentido para

bloquear la síntesis del REor. Se evaluó el efecto del bloqueo de RE en la proliferación celular y se

diseñó un oligonucleótido con el mismo criterio que en los casos anteriores. Este tipo de estrategia ha

sido utilizada por otros investigadores en experimentos in vitro (245). La eficiencia del tratamiento se

evaluó midiendo la expresión de asFiE por Western blot y por binding. En este caso cabe recordar que

tanto el REa como el REB son capaces de unirse a su receptor, y por lo tanto, nunca se va a obtener

un bloqueo completo del binding usando un único antisentido.

Si bien los resultados mostraron claramente una inhibición de la proliferación celular al

bloquear el RE, los resultados de Western blot no dieron los valores inhibitorios esperados. Ese

fenómeno ya ha sido reportado por otros autores quienes sugirieron que el bloqueo del RE con

determinados oligonucleótidos induce un aumento en la síntesis del receptor (246). De todos modos al

bloquear los RE se observó una disminución también de los RP, sugiriendo que los RE son

responsables, por lo menos en parte, de la alta expresión de RP. Por lo tanto, en trabajo futuros sería

interesante investigar la hipótesis de una activación constitutiva del REa o de una interacción entre

ambos receptores.

Las hormonas esteroides pueden ejercer, además de los efectos genómicos, otros efectos que

son rápidos e insensibles a inhibidores de la transcripción. Estos efectos denominados no genómicos

se han descripto tanto para RE como para el RP (34) y se asocian a receptores de membrana. En

particular para el RP se estudió con mayor profundidad en oocitos de Xenopus (38) y en

espermatozoides humanos (39), y para el RE en células tumorales de hipófisis (40) y neuronas del

hipocampo (41). A pesar de la acumulación de evidencias con respecto a los efectos de membrana de

estos receptores aún permanecen dudas con respecto a Ia identidad de los receptores y a sus acciones

celulares. Se postula que algunos efectos de membrana podrían llevarse a cabo por receptores

clásicos que activarían otras vias de señalización no convencionales. En células de cáncer de mama,

146

en 1998 Migliaccio et al (42) demostraron que los estrógenos activan la vía de src/erk por una

interacción entre el RE y c-src. Además reportaron la activación por progestágenos de la misma vía por

interacción del RPa con el REa e identificaron los dominios de unión entre ambos receptores (43). Por

otra parte, en el año 2002 Watson et al (247) observan que al inhibir la síntesis del REor con

oligonucleótidos antisentido se eliminó el FiEorde membrana (mREoc)mientras que apenas se redujo el

de localización nuclear. Estos datos extrapolados a nuestro sistema indicarr’an que el mREor

participaría en Ia proliferación celular y que al activarlos se obtendría un efecto inhibitorio. Ensayos

tendientes a discernir si en nuestro sistema existen receptores esteroides de membrana y si estos son

capaces de interaccionar se están llevandoacabo en la actualidad.

Papel de antagonistas estrogénicos usados en la clinica en nuestro modelo experimental

En el tercer y últimocapitulo de este trabajo de Tesis informamos sobre el efecto diferencial de

dos SERMs de uso generalizado como el tamoxifeno y el raloxifeno en comparación con el

antiestrógeno puro ICI 182.780 o faslodex, ya utilizado en nuestro modelo experimental de cáncer

mamario. El raloxifeno sería potencialmente superior al tamoxifeno en la clínica ya que no ejerce

efectos estrogénicos en el útero. Si se demostraran efectos beneficiosos en cáncer de mama

desplazaría al tamoxifeno. Es interesante recordar que en nuestro modelo experimental, los estrógenos

ejercen efectos inhibitorios,por lo tanto a priori se podría inferirque los antiestrógenos deberian tener

efectos estimulatorios. Sin embargo como ya se vio previamente el ICl 182.780 también ejerce efectos

inhibitorios. En los experimentos mostrados demostramos que (a) el raloxifeno puede aumentar la

proliferación celular en determinadas condiciones experimentales, (b) el tamoxifeno ejerce un efecto

inhibitorio tanto ¡n vivo como in vitro, (c) los efectos del tamoxifeno, el raloxifeno y el E2 parecen no

estar asociados a su efecto sobre la síntesis de RP.

En estudios realizados in vitro, el E2 tuvo un efecto inhibitorio de la proliferación celular aún a

concentraciones mucho menores que el Kd del RE para estos tumores (5 x 10-9 M (248), sugiriendo

que existen otros mecanismos distintos de Ia interacción clásica con el RE. La hipersensibilidad con el

RE a concentraciones de 10-15M ha sido descripta en otros modelos experimentales (249-251). El

efecto de los estrógenos involucra la unión al RE y acciones genómicas a través de ERE (elemento

respondedor a estrógenos) o sitios AP1 (252). Como se mencionó anteriormente en esta discusión, se

describió la activación del FlE por vías no relacionadas con Ia interacción clásica Iigando/receptor,

sugiriendo la existencia de RE de membrana. Encontramos que tanto los efectos inhibitorios de la

proliferacióncomo la inducción de la síntesis de RP se produjeron a las mismas bajas concentraciones.

Estos hallazgos, que con los conocimientos actuales son difíciles de interpretar sugieren una

interrelación entre mecanismos genómicos y no genómicos.

147

El tamoxifeno tuvo un efecto agonista estrogénico tanto para Ia proliferación celular como para

la sintesis de RP que fue descripto previamente por otros autores (253), aunque es menos eficiente

que el E2 en inhibir la proliferación celular. En este caso las inhibiciones se obtuvieron en

concentraciones esperables para mecanismos genómicos. El raloxiteno se comportó como un

antagonista estrogénico, revirtiendo la inhibición del E2 aunque a concentraciones mayores tuvo un

efecto inhibitorioper se. Además, aumentó levemente la proliferación celular inducida por MPA aunque

no modificó Ia síntesis de RP. El lCl 182.780 revirtió parcialmente ei efecto inhibitorio del E2 e inhibió

drásticamente la expresión de RP. La afinidad del RE en este y otros modelos se encuentra en el orden

de 1-5 nM (248254). Los efectos inhibitoriosdel E2son difíciles de interpretar ya que una ocupación de

los receptores de 1 cada 1000 es suficiente para ejercer su máximo efecto, mientras que las acciones

del raloxiteno, tamoxifeno e ICI 182.780 fueron evidentes a concentraciones cercanas al Kd del RE y

similares a las descrpitas por otros (56;66;68). Los resultados obtenidos con raloxiteno o lCl 182.780 en

presencia de E2están de acuerdo con lo que se espera para una interacción clásica ligando/receptor.

En el fenómeno de “mutual annihilation" Kaye et al (255) describen que el E2 y el SERM pueden

interactuar formando homodímeros o heterodímeros activos dependiendo de la concentración molar y

la afinidad relativa. EI heterodímero resultante puede estar impedido de desarrollar interacciones

especificas con los diferentes oo-activadores y co-represores. En nuestro diseño experimental, en

presencia de E2, los heterodímeros Ez-SERM inhibirían los efectos mediados por E2. Al aumentar la

concentración de los SERMs se favorece la formación de los homodímeros (SERM-SERM) que

inducirian el mismo efecto que en los experimentos en los que el compuesto se agrega en ausencia de

E2.

En los experimentos in vivo,el tamoxifeno tuvo un claro efecto inhibitorioaunque no indujo una

regresión tumoral completa como la observada para el E2o los antiprogestágenos (223). Por otra parte,

el raloxiteno indujo un aumento significativoen la tasa de crecimiento en los experimentos en los que

se había sustraído el MPA. Curiosamente, in vitro, Ia estimulación de la proliferación celular se obtuvo

en presencia de MPA 10 nM o Pg. Las concentraciones de MPAen suero presentes en los animales

tratados con MPA pueden ser mayores que las utilizadas in vitro y, por lo tanto, podrían estar

interfiriendocon el efecto del raloxiteno a Ia concentración utilizada. Es de destacar que los tumores PD

regresionan cuando se sustrae el progestágeno, pero en pasajes más avanzados siguen creciendo

pero a una menor velocidad. Para este experimento se eligió un pasaje avanzado con el fin de poder

evaluar inhibiciones de crecimiento tumoral. Si hubiéramos usado el tumor que regresiona al extirparse

el pellet de MPAno hubiéramos podido evaluar los efectos inhibitoriosdel tamoxifeno.

El análisis de los resultados revela que, evidentemente, Ia habilidad del E2 y el tamoxifeno de

modular la expresión del RP no está relacionada con su efecto inhibitoriodel crecimiento. Esta línea

tumoral tiene niveles de RP mayores que 100 fmong de proteína (256). Ambos compuestos inhiben la

148

proliferación celular y aumentan Ia síntesis de FiP al mismo tiempo. Como los progestágenos son las

hormonas estimuladoras en este modelo, entonces un aumento en los niveles de RP debería no tener

efecto o llevar a un aumento en la proliferación. EI raloxifeno, por el contrario, no modificó los niveles de

RP aunque aumentó aún más la proliferación celular inducida por MPA. Estos resultados mostraron

una falta de coneiación entre los efectos de los SERMs sobre la proliferación celular y Ia expresión de

RP, sugiriendo que si la activación de los RP es una vía esencial para Ia proliferación, entonces los RE

podrían estar modulando Ia activación por eventos ocurriendo antes o después del RP en la cascada

de señalización. Esto sería independiente, dentro de ciertos límites, de la cantidad de FlP.

Los resultados obtenidos en este últimocapítulo indican que, si bien hay mucha expectativa en

cuánto al uso del raloxifeno en pacientes con cáncer de mama, deben realizarse más experimentos

para ensayar los posibles beneficios de este tratamiento.

Por otra parte, el hecho de que el tamoxifeno sea inhibitorio en nuestros tumores, es

interesante desde otro punto de vista también. Una de las evidencias que implican a los estrógenos

como agentes involucrados en el cáncer de mama es el hecho que los antiestrógenos como el

tamoxifeno tienen un efecto beneficioso. Curiosamente, en pacientes también los estrógenos han

tenido efectos favorables en la clínica y se han dejado de usar debido a los efectos colaterales. Estas

observaciones sugerirían que el tamoxifeno podría ser beneficioso por su efecto estrogénico y no por

su efecto antiestrogénico. Estos datos en conjunto con los datos que indican que mujeres que han

estado sujetas a terapia de reemplazo con estrógenos no tienen mayor incidencia de cáncer de mama

y en cambio las mujeres expuestas a estrógenos y progesterona sí, sugieren que el rol de los

estrógenos en cáncer de mama debe ser revisado (257).

La importancia de los RP como mediadores fundamentales en la biología del cáncer de mama

ha sido opacada por todos los estudios que apuntan a los estrógenos como las principales hormonas

carcinogénicas en esta enfermedad. Por otra parte, existen numerosas evidencias que señalan a la

progesterona con un rol proliferativono solo en modelos animales sino también en humanos. Going et

al (258) demostró que en el epitelio mamario normal el mayor índice mitóticose observa durante la fase

Iuteal, y más recientemente las evidencias directas de que los progestágenos podían ser dañinos en

cuanto a cáncer de mama provinieronde un estudio en mujeres suecas que recibían una terapia de

reemplazo hormonal por más de 6 años que llevó a un aumento de 4.4 veces en el cáncer de mama

(259). Más recientemente, en un estudio se mostró que los progestágenos agregados en una terapia de

reemplazo hormonal disminuyeron la incidencia de cáncer de endometrio aunque aumentaron la

incidencia de cáncer de mama (260). Las evidencias epidemiológicas que señalan la exposición

aumentada a estrógenos como un factor de riesgo, no han considerado que casi todas las veces el

aumento en los niveles de estrógeno es acompañado por un aumento en los niveles de progesterona.

Recientemente, con el aumento en la incidencia del cáncer de mama en mujeres a las que se les

149

administraba estrógeno junto con MPA.y no en las que se administraba estrógeno sólo, han surgido

nuevas hipótesis que le adjudican efectos indirectos al MPA oomo el aumento de la actividad

aromatasa (citado en (243)). Por que no adjudicar efectos directos?

Resumen de resultados y conclusiones

RPs y FGFs

Las células de fenotipo PD pueden utilizarprogestágenos para proliferar o factores de crecimiento

como los FGFs. En ambos casos se necesita un RP funcional lo que indicaría que las células son

más FtPdependientes que progestágeno dependientes.

De Ia misma manera algunas de las variantes tumorales que han adquirido la capacidad de crecer

en forma autónoma serían progestágeno independedientes pero seguirían siendo RP

dependientes, ya que el bloqueo de RP induce Ia regresión tumoral (tumores R-PI).

Estos mecanismos involucrarían efectos genómicos sin descartar Ia participación de mecanismos

no genómicos.

Los tumores PI al cultivarlos ¡n vitro siguen teniendo al igual que los PD, una gran dependencia

estromal. Esto no sería esperable de tumores que tienen una activación autocrina de RP. Sin

embargo, el estroma de los tumores independientes produce mayor cantidad de bFGF.

Debido a que el bFGF puede activar al RP, y que el FtP está activado en ausencia de

administración exógena del progestágeno se hipotetizó que factores estromales entre los cuales

estaría el bFGF participarían en el fenotipo progestágeno independiente.

Resultados de co-cultivos entre estroma PD o PI cultivado con células epiteliaies PD o PI sugieren

que el estroma PI ejerce un efecto más proliferativoque el PD, avalando la hipótesis planteada.

Resultados muy prelimares realizados in vivoapuntan en el mismo sentido.

La mayor expresión de bFGF en el estroma con respecto al parénquima tumoral y Ia mayor

expresión de receptores de bFGF principalmente el RFGF-2 y el 3 en parénquima tumoral están en

concordancia con la hipótesis planteada. Sin embargo no hemos visto diferencias consistentes

cuantificables entre los distintos tumores.

La familia de FGFs también cumple un rol importante en la glándula mamaria normal ya que Ia

expresión de los factores y de sus receptores está regulada en los distintos estadios del desarrollo.

El patrón encontrado en los tumores es semejante al encontrado en Ia mama virgen y preñada.

En general, podemos concluir que los tumores con fenotipo PD y los Pl-R necesitan de un RP

funcional para proliferar. EI estroma ejerce una participación activa en el crecimiento tumoral PD y PI-Ft

favoreciendo su crecimiento. En el crecimiento PI-Ft el bFGF u otros factores provenientes

fundamentalmente del estroma podrían estar activando los RP presentes en el parénquima tumoral,

otorgándole el fenotipo progestágeno-independiente. EI estroma PI Iiberaría una mayor cantidad de

factores en respuesta a una señal proveniente del parénquima tumoral.

ERs y antlostrógenos151

o EFia estaría involucrado en el crecimiento de los tumores PD. Los resultados sugieren que la alta

expresión de RP en los tumores podría estar dada por la presencia de RE activados. Nuestros

resultados no descartan que una interacción entre RE y RP sea necesaria para ejercer efectos

estimulatorios.

o El antiestrogeno ICl 182.780 y los SERMs tamoxifeno y raloxifeno mostraron efectos inhibitorios

per se en el crecimiento in vitro al igual que el E2 pero en mayores concentraciones, el raloxifeno

¡ndujo una estimulación de la proliferación en presencia de progestágenos. El lCl 182.780 y el

raloxifeno revirtieron el efecto inhibitoriodel E2 en un rango de concentraciones mientras que el

tamoxifeno fue siempre inhibitorio.Estas observaciones sugieren que el tamoxifeno tiene un efecto

estrogénioo moderado en carcinomas mamarios murinos.

Perspectivas

En conjunto los resultados mostrados en este trabajo entatizan el papel de los RP como proteínas

claves en la regulación del crecimento del cáncer de mama. Esta no es una particularidad del modelo

murino ya que recientemente se ha involucrado al MPAen Ia inducción de cáncer de mama en mujeres

post-menopáusicas. Un análisis exhaustivo de los resultados obtenidos en modelos experimentales

junto con las evidencias epidemiológicas constituyen la manera racional de evaluar el rol de las

hormonas en cáncer de mama. Por otra parte, nuestros resultados sugieren que factores estromales

podrían activar a los receptores de progesterona en los tumores de crecimiento autónomo,

jerarquizando el papel del estroma en el crecimiento tumoral. Estudios en curso usando anticuerpos

neutralizantes confirmarán si el bFGF es el responsable de este fenómeno, y brindarán información

sobre la participación de otros factores de crecimiento y proteínas de la matriz extracelular en la

adquisición de la hormono-independencia. En cuanto a los receptores de estrógenos también hemos

encontrado una situación paradojal: mientras que los estrógenos son inhibitorios, los receptores de

estrógenos son necesarios para el crecimiento tumoral. Por otra parte el tamoxifeno, de reportada

actividad antiestrogénica en glándula mamaria, demostró tener efectos estrogénicos moderados en

nuestro sistema experimental. Teniendo en cuenta que en la clínica el efecto en el tratamiento de

cáncer de mama es beneficioso, y que en general se Io considera como antagonista estrogénioo en

mama debido a que el dogma clásico es que los estrógenos estimulan la proliferación en Ia glándula

mamaria. debería re evaluarse el papel de los estrógenos y tamoxifeno en la glándula mamaria. Por

último, el hecho de que el tamoxifeno haya sido terapéuticamente satisfactorio en nuestro modelo

experimental, lo jerarquiza como modelo experimental de cáncer de mama humano.

k..­

/\152

DEA. QLAOZDKAuma.»

._.

Referencias

Greenlee RT, Murray T, Bolden S, Wingo PA 2000 Cancer statistics, 2000. CA Cancer J Clin 50:7­33

Franks LM, Teich NM l997 Introduction to Cellular and Molecular Biology of Cancer.0xfordUniversity Press, 3rd. edn

Cotran RS, Kumar V, Collins T, Robbins SL 1999Robbins Pathologic Basis of Disease .W BSaunders Co, 6th edition edn

Thomas DB 1993 Oral contraceptives and breast cancer. J Natl Cancer Inst 85:359-364

Selman PJ, van Garderen E, Mol JA, van den lngh TS 1995Comparison of the histological changesin the dog after treatment with the progestins medroxyprogesterone acetate and proligestone. Vet Q17: 128-133

Thomas DB 1991 Oral contraceptives and breast cancer: review of the epidemiologic literature.Contraception 43:597-642

Nelson l-lD,Humphrey LL, Nygren P, Teutsch SM, Allan JD 2002 Postmenopausal honnonereplacement therapy: scientific review. JAMA 288:872-88l

Weigel NL 1996 Steroid hormone receptors and their regulation by phosphorylation. Biochem J3 19:657-667

Mangelsdorf DJ, Thummel C, Beato M, Herrlich P, Schutz G, Umesono K, Blumberg B, KastnerP, Mark M, Chambon P 1995 The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell 83:835-839

Carson-Jurica MA, Schrader WT, O'Malley BW 1990Steroid receptor family: structure andfimctions. Endocr Rev l 1:201-220

Schneider W, Ramachandran C, Satyaswaroop PG, Shyamala G 1991Mun'neprogesteronereceptor exists predominantly as the 83-kilodalton 'A‘form. J Steroid Biochem Mol Biol 38:285-291

Horwitz KB, Tung L, Takimoto GS 1996Novel mechanisms of antiprogestin action. Acta Oncol35: 129-140

Conneer 0M, Kettelberger DM, Tsai MJ, Schrader WT, O’Malley BW 1989The chickenprogesterone receptor A and B isoforrns are products of an alternate translation initiation event. J BiolChem 264: 14062-14064

Kastner P, Bocquel MT, Turcotte B, Garnier JM, Horwitz KB, Chambon P, Gronemeyer H 1990Transient expression of human and chicken progesterone receptors does not support alternativetranslational initiation from a single mRNA as the mechanism generating two receptor isoforms. J BiolChem 265:]2163-12167

Shyamala G, Yang X, Cardiff RD, Dale E 2000 Impact of progesterone receptor on cell-fatedecisions during mammary gland development. Proc Natl Acad Sci U S A 97:3044-3049

Wei LL, Norris BM, Baker CJ 1997An N-terminally truncated third progesterone receptor protein,PR(C), forms heterodimers with PR(B) but interferes in PR(B)-DNA binding. J Steroid Biochem MolBiol 62:287-297

Clemm DL, Sherman L, Boonyaratanakornkit V, Sehrader WT, Weigel NL, Edwards DP 2000Differential hormone-dependent phosphorylation of progesterone receptor A and B forms revealed by aphosphosen'ne site-specific monoclonal antibody. Mol Endocrinol 14252-65

Kuiper GG, Carlsson B, Grandien K, Enmark E, Haggblad J, Nilsson S, Gustafsson JA 1997Comparison of the ligand binding specificity and transcript tissue distn'bution of estrogen receptorsalpha and beta. Endocrinology 1382863-870

153

20.

21.

22.

23.

24.

25.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

35.

36.

37.

38.

Koike S, Sakai M, Muramatsu M 1987Molecular cloning and characterization of rat estrogenreceptor cDNA. Nucleíc Acids Res 15:2499-2513

Kuiper GG, Enmark E, Pelto-Huikko M, Nilsson S, Gustal'sson JA 1996Cloning of a novelreceptor expressed in rat prostate and ovary. Proc Natl Acad Sci U S A 93:5925-5930

LeClercq G 2002 Molecular forms of the estrogen receptor in breast cancer. J Steroid Biochem MolBiol 80:259-272

Gustafsson JA 1999 Estrogen receptor beta--a new dimension in estrogen mechanism of action. JEndocrinol 163z379-383

Saji S, Jensen EV, Nilsson S, Rylander T, Warner M, Gustafsson JA 2000 Estrogen receptors alphaand beta in the rodent mammary gland. Proc Natl Acad Sci U S A 97:337-342

Palmieri C, Cheng GJ, Saji S, Zelada-Hedman M, Warri A, Weihua Z, Van Noorden S,Wahlstrom T, Coombes RC, Warner M, Gustafsson JA 2002 Estrogenreceptor beta in breastcancer. Endocr Relat Cancer 9:1-13

Tilley WD, Clarke CL, Birrell SN, Bruchovsky N 2001 l-lormonesand cancer: new insíghts, newchallenges. Trends Endocrinol Metab 12:186-188

Clarke R, Brunner N 1996Acquired estrogen independence and antiestrogen resistance in breastcancer. Estrogen receptor driven phenotypes?. Trends Endocrinol Metabol 7:291-301

Katzenellenbogen BS, Montano MM, Ekena K, Herman ME, Mclnerney EM 1997William L.McGuire Memorial Lecture. Antiestrogens: mechanisms of action and resistance in breast cancer.Breast Cancer Res Treat 44:23-38

Poola l, Speirs V 2001 Expression of altematively spliced estrogen receptor alpha mRNAs ís increasedin breast cancer tissues. J Steroid Biochem Mol Biol 78:459-469

Zhang QX, Hilsenbeck SG, Fuqua SA, Borg A 1996Multiple splicing variants of the estrogenreceptor are present in individual human breast tumors. J Steroid Biochem Mol Biol 59:251-260

Fasco MJ, Keyomarsi K, Arcaro KF, Gierthy JF 2000 Expressionof an estrogen receptor alphavariant protein in cell lines and tumors. Mol Cell Endocrinol 162:167-180

Murphy LC, Dotzlaw H, Wong MS, Miller T, Murphy LJ 1991Mechanisms involved in theevolution of progestin resistance in human breast cancer cells. Cancer Res 51:2051-2057

Diaz-Chico BN, Ogasawara Y, Chamness GC, Salman M, McGuire WL 1988A 46-kDa antigenassociated with estrogen receptor in human breast cancer. J Steroid Biochem 30:315-320

Jordan VC 1999Targeted Antiestrogens to Prevent Breast Cancer. Trends Endocrinol Metab 102312­317

Mlgliaccio A, Castoria G, Di Domenico M, de Falco A, Bilancio A, Auricchio F 2002 Src is aninitial target of sex steroid hormone action. Ann N Y Acad Sci 963: 185-190

Monje P, Boland R 1999 Characten'zation of membrane estrogen binding proteins fi'om rabbit uterus.Mol Cell Endocrinol l47:75-84

Powell CE, Soto AM, Sonnenschein C 2001 Identification and characterization of membrane estrogenreceptor from MCF7 estrogen-target cells. J Steroid Biochem Mol Biol 77:97-108

Razandi M, Pedram A, Greene GL, Levin ER 1999Cell membrane and nuclear esuogen receptors(ERs) originate from a single transcript: studies of ERalpha and ERbeta expressed in Chinese hamsterovary cells. Mol Endocrinol 13:307-319

Sadler SE, Bower MA, Maller JL 1985 Studies of a plasma membrane steroid receptor in Xenopusoocytes using the synthetic progestin RU 486. J Steroid Biochem 22:419-426

154

40.

4 .¡—n

42.

43.

45.

46.

47.

48.

49.

50.

51.

52.

53.

54.

56.

Alexander NJ, Kim HK, Blye RR, Blackmore PF 1996 Steroid specificity of the human spermmembrane progesterone receptor. Steroids 61:116-125

Norfleet AM, Thomas ML, Gametchu B, Watson CS 1999 Estrogen receptor-alpha detected on theplasma membrane of aldehyde-fixed GH3/Bó/F 10 rat pituitary tumor cells by enzyme-linkedimmunocytochemistry. Endocnnoiogy 14023805-3814

Clarke CH, Norfleet AM, Clarke MS, Watson CS, Cunningham KA, Thomas ML 2000Perimembrane localization of the estrogen receptor alpha protein in neuronal processes of culturedhippocampal neurons. Neuroendocn'nology 71234-42

Migliaccio A, Piccolo D, Castoria G, Di Domenico M, Bilancio A, Lombardi M, Gong W, BeatoM, Aurlcchio F 1998Activation of the Src/p21ras/Erk pathway by progesterone receptor via cross-talkwith estrogen receptor. EMBO J 17:2008-2018

Ballare C, Uhrig M, Bechtold T, Sancho E, Di Domenico M, Migliaccio A, Aurlcchio F, Beato M2003 Two domains of the progesterone receptor inter-actwith the estrogen receptor and are required forprogesterone activation of the c-Src/Erk pathway in mammalian cells. Mol Cell Biol 23: 1994-2008

Helguero LA, Lamb C, Molinolo AA, Lanari C 2003 Evidence for two progesterona receptor bindingsites in murine marnmary carcinomas. J Steroid Biochem Mol Biol 8429-14

Zhu Y, Bond J, Thomas P 2003 Identification, classification, and partial character-izationof genes inhumans and other vertebrates homologous to a fish membrane progestin receptor. Proc Nat] Acad Sci US A 10022237-2242

Welter BH, Hansen EL, Saner KJ, Wei Y, Price TM 2003 Membrane-boundProgesterone ReceptorExpression in Human Aortic Endothelial Celis. J Histochem Cytochem 5121049-1055

Vorherr H, Messer RH 1978 Breast cancer: potentially predisposing and protecting factors. Role ofpregnancy, lactation, and endocrine status. Am J Obstet Gynecol 1302335-358

Tonetti DA, Jordan VC 1997The role of estrogen receptor mutations in tamoxifen-stimulated breastcancer. J Steroid Biochem Mol Biol 62:1 19-128

Guiochon-Mantel A, Delabre K, Lescop P, Perrot-Applanat M, Milgrom E 1994Cytoplasmic­nuclear trafiicking of progesterone receptor. In vivo study of the mechanism of action of antiprogestins.Biochem Phannacol 47221-24

Edwards DP, Weigel NL, Nordeen SK, Beck CA 1993Modulators of cellular proteinphosphorylation alter the trans-activation function of human progesterone receptor and the biologicalactivity of progesterone antagonists. Breast Cancer Res Treat 27241-56

Sartorius CA, Groshong SD, Miller LA, Powell RL, Tung L, Taklmoto GS, Horwitz KB 1994NewT47D breast cancer cell lines for the independent study of progesterone B- and A-receptors: onlyantiprogestin-occupied B- receptors are switched to transcriptional agonists by CAMP. Cancer Res5423868-3877

Horwltz KB 1992The molecular biology of RU486. Is there a role for antiprogestins in the treatmentof breast cancer? Endocr Rev 13:146-163

Meyer ME, Pornon A, Ji JW, Bocquel MT, Chambon P, Gronemeyer H 1990Agonisticandantagonistíc activities of RU486 on the fiinctions of the human progesterone receptor. EMBO J 923923­3932

Parker MG 1995 Structure and fimction of estrogen receptors. Vitam Horm 512267-287

Scholl SM, Huff KK, Lippman ME 1983 Antiestrogenic efi'ects of LY 117018 in MCP-7 cells.Endocrinology 113261l-6l7

Black LJ, Jones CD, Falcone JF 1983Antagonism of estrogen action with a new benzothiophenederived antieslrogcn. Life Sci 3221031-1036

155

57.

58.

59.

60.

61.

62.

63.

64.

65.

66.

67.

68.

69.

70.

7l.

73.

74.

Fournier B, Haring S, Kaye AM, Somjen D 1996 Stimulation of creatine kinase specific activity inhuman osteoblast and endometrial cells by estrogens and anti-estrogens and its modulation bycalciotropic hormones. J Endocrinol 1502275-285

Black LJ, Sato M, Rowley ER, Magee DE, Bekele A, Williams DC, Cullinan GJ, Bendele R,Kaufl’man RF, Bensch WR, . 1994 Raloxifene (LY139481 HCI) prevents bone loss and reduces serumcholesterol without causing uterine hypertrophy in ovan'ectomized rats. J Clin Invest 93263-69

Black LJ, Goode RL 1980 Uterine bioassay of tamoxifen, trioxifene and a new esnogen antagonist(LY117018) in rats and mice. Life Sci 26: 1453-1458

Cummings SR, Eckert S, Krueger KA, Grady D, Powles TJ, Cauley JA, Norton L, Nickelsen T,Bjarnason NH, Morrow M, Lippman ME, Black D, Glusman JE, Costa A, Jordan VC 1999Theeffect of raloxifene on risk of breast cancer in postmenopausal women: results from the MORErandomized trial. Multiple Outcomes of Raloxifene Evaluation. JAMA 28 l :2189-2197

Jordan VC 1984 Biochemical phannacology of antieslrogen action. Pharmacol Rev 36:245-276

Paech K, Webb P, Kuiper GG, Nilsson S, Gustafsson J, Kushner PJ, Scanlan TS 1997Differentialligand activation of estrogen receptors ERalpha and ERbeta at API sites. Science 277: 1508-15 10

Jordan VC, Gradishar WJ 1997Molecular mechanisms and future uses of antiestrogens. Mol AspectsMed 18:167-247

Catherino WH, Jordan VC 1995Increasing the number of tandem estrogen response elementsincreases the estrogenic activity of a tamoxifen analogue. Cancer Lett 92239-47

Yang NN, Bryant HU, Hardikar S, Sato M, Galvin RJ, Glasebrook AL, Termine JD 1996Estrogen and raloxifene stimulate transforrning growth factor-beta 3 gene expression in rat bone: apotential mechanism for estrogen- or raloxifene-mediated bone maintenance. Endocrinology l37:2075­2084

Wakeling AE, Bowler J 1987 Steroidal pure antioestrogens. J Endocrinol 112:R7-10

Howell A 2000 Faslodex (ICI 182780). an oestrogen receptor downregulator. Eur J Cancer 36 Suppl42887-888

Wakeling AE, Dukes M, Bowler J 1991 A potent specific pure antiestrogen with clinical potential.Cancer Res 51:3867-3873

DeFriend DJ, Howell A, Nicholson R], Anderson E, Dowsett M, Mansel RE, Blamey RW,Bundred NJ, Robertson JF, Saunders C, . 1994Investigationof a new pure antiestrogen (ICI182780) in women with primary breast cancer. Cancer Res 54:408-414

Fawell SE, White R, Hoare S, Sydenham M, Page M, Parker MG 1990Inhibition of esnogenreceptor-DNA binding by the "pure" antiestrogen ICI 164,384 appears to be mediated by impairedreceptor dimerization. Proc Natl Acad Sci U S A 87:6883-6887

Dauvois S, Danielian PS, White R, Parker MG 1992Antiestrogen ICI 164,384 reduces cellularestrogen receptor content by increasing its tumover. Proc Natl Acad Sci U S A 89:4037-4041

Ballare C, Bravo Al, Laucella S, Sorin l, Cerdeiro R, Loza J, Sousa MF, Guman N, Mordoh J1989 DNA synthesis in estrogen receptor-positive human breast cancer takes place preferentially inestrogen receptor-negative cells. Cancer 64:842-848

Schmitt FC 1995 Multistep progression from an oestrogen-dependent growth towards an autonomousgrowth in breast carcinogenesis. Eur J Cancer 31Az2049-2052

Fuqua SA, Fitzgerald SD, Chamness GC, Tandon AK, McDonnell DP, Nawaz Z, O'Malley BW,McGuire WL 1991 Variant human breast tumor estrogen receptor with constitutive transcriptionalactivity. Cancer Res 5 1:105-109

156

78.

79.

80.

81.

82.

85.

86.

87.

88.

89.

90.

91.

Wolf DM, Jordan VC 1993 William L. McGuire Memorial Symposium. Drug resistance to tamoxifenduring breast cancer therapy. Breast Cancer Res Treat 27227-40

Graham JD, Clarke CL 1997 Physiological action of progesterone in target tissues. Endocr Rev18:502-519

Musgrove EA, Sutherlnnd RL 1994 Cell cycle control by Steroidhormones. Semin Cancer Biol5:381-389

Darbre PD, Dnly RJ 1990Transition of human breast cancer cells from an oestrogen responsive tounresponsive state. J Steroid Bíochem Mol Biol 37:753-763

Vignon F, Bouton MM, Rochefort H 1987Antieslrogens inhibit the mitogenic efi'ect of growthfactors on breast cancer cells in the total absence of estrogens. Bíochem Biophys Res Commun14611502-1508

Kato S, Endoh H, Masuhiro Y, Kltamoto T, Uchiyama S, Sasnki H, Masushlge S, Gotoh Y,Nishlda E, anashlma H 1995Activationof the estrogen receptor through phosphorylationbymitogen-activated protein kinase. Science 270: 1491-1494

Krusekopf S, Chauchereau A, Milgrom E, Henderson D, Cato AC 1991Co-operation ofprogestational steroids with epidermal growth factor in activation of gene expression in mammarytumor cells. J Steroid Bíochem Mol Biol 40:239-245

Bunone G, Brinnd PA, Mlkslcek RJ, Plcard D 1996Activation of the unliganded estrogen receptorby EGF involves the MAP kinase pathway and direct phosphorylation. EMBO J 1522174-2183

Denner LA, Weigel NL, Schrader WT, O'Malley BW 1989Hormone-dependentregulation ofchicken progesterone receptor deoxyribonucleic acid binding and phosphorylation. Endocrinology1252305 1-3058

Labriola L, Salatino M, Proietti CJ, Peeci A, Coso 0A, Kornblihtt AR, Charrenu EH, ElizaldePV 2003 Heregulin induces transcriptional activation of the progesterone receptor by a mechanism thatrequires fimctional ErbB-2 and mitogen-activated protein kinase activation in breast cancer cells. MolCell Biol 23:1095-1111

Shen T, Horwitz KB, Lange CA 2001 Transcriptional hyperactivity of human progesterone receptorsis coupled to their ligand-dependent down-regulation by mitogen-activated protein kinase-dependentphosphorylation of serine 294. Mol Cell Biol 21:6122-613l

Rowan BG, O'Malley BW 2000 Progesterone receptor coactivators. Steroids 65:545-549

Freiss G, Prebois C, Vignon F 1993 William L. McGuire Memorial Symposium. Control of breastcancer cell growth by steroids and growth factors: interactions and mechanisms. Breast Cancer ResTreat 27257-68

Powers CJ, McLeskey SW, Wellstein A 2000 Fibroblast growth factors, their receptors and signaling.Endocr Relat Cancer 7:165-197

Moscatelll D 1987 High and low affinity binding sites for basic fibroblast growth factor on culturedcells: absence of a role for low affinity binding in the stimulation of plasminogen activator productionby bovine capillary endothelial cells. J Cell Physiol 13l z123-130

Yayon A, Klagsbrun M, Esko JD, Leder P, Ornitz DM 1991Cell surface, heparin-like molecules arerequired for binding of basic fibroblast growth factor to its high afi'mity receptor. Cell 64:841-848

Mansukhani A, Dell'Era P, Moscatelli D, Kornbluth S, Hanafusn H, Basilico C 1992Characterization of the murine BEK fibroblast growth factor (FGF) receptor: activation by threemembers of the FGF family and requirement for heparin. Proc Natl Acad Sci U S A 89:3305-3309

157

92.

93.

94.

95.

96.

97.

98.

99.

100.

101.

102.

103.

104.

105.

106.

107.

108.

109.

Aviezer D, Hecht D, Safran M, Eisinger M, David G, Yayon A 1994Perlecan, basal laminaproteoglycan, promotes basic fibroblast growth factor-receptor binding, mitogenesis, and angiogenesis.Cell 79:1005-1013

Rapraeger AC, Krufka A, Olwin BB 1991Requirement of heparan sulfate for bFGF-mediatedfibroblast growth and myoblast differentiation. Science 252: 1705-1708

Spivak-Kroizman T, Lemmon MA, Dikic 1,Ladbury JE, Pinchasi D, Huang J, Jaye M, CrumleyG, Schlessinger J, La! l 1994Heparin-induced oligomerization of FGF molecules is responsible forFGF receptor dimerization, activation, and cell proliferation. Cell 79: 1015-1024

Stauber DJ, DiGabriele AD, Hendrickson WA 2000 Structural interactions of fíbroblast growthfactor receptor with its ligands. Proc Nati Acad Sci U S A 97149-54

Venkataraman G, Raman R, Sasisekharan V, Sasisekharan R 1999Molecularcharacteristicsoffibroblast growth factor-fíbroblast growth factor receptor-heparin-like glycosarninoglycan complex.Proc Natl Acad Sci U S A 96:3658-3663

Plotnikov AN, Schlessinger J, Hubbard SR, Mohammadi M 1999Structural basis for FGF receptordimerization and activation. Cell 98:641-650

Esch F, Baird A, Ling N, Ueno N, Hill F, Denoroy L, Klepper R, Gospodarowicz D, Bohlen P,Guillemin R 1985 Primary structure of bovine pítuitary basic fibroblast growth factor (FGF) andcomparison with the amino-temtinal sequence of bovine brain acidic FGF. Proc Natl Acad Sci U S A82:6507-6511

Florkiewlcz RZ, Sommer A 1989Human basic fibroblast growth factor gene encodes fourpolypeptides: three initiate translation from non-AUG codons. Proc Natl Acad Sci U S A 86:3978-3981

Renko M, Quarto N, Morimoto T, Ril'kin DB 1990Nuclear and cytoplasmic localization of differentbasic fibroblast growth factor species. J Cell Physiol 144:108-114

Bugler B, Amalric F, Prats H 1991Alternative initiation of translation determines cytoplasmic ornuclear localization of basic fibroblast growth factor. Mol Cell Biol 11:573-577

Klagsbrun M, Baird A 1991 A dual receptor system is required for basic fibroblast growth factoractivity. Cell 67 :229-231

Baird A, Ling N 1987 Fibroblast growth factors are present in the extracellular matrix produced byendothelial cells in vitro: implications for a role of heparinase-like enzymes in the neovascularresponse. Biochem Bíophys Res Commun 1422428-435

New BA, Yeoman LC 1992 Identification of basic fíbroblast growth factor sensitivity and receptor andligand expression in human colon tumor cell lines. J Cell Physiol 150:320-326

Basilico C, Moscatelli D 1992The FGF family of growth factors and oncogenes. Adv Cancer Res59:115-165

Logan A, McDermott EE, Logan SD 1990 Production of inositol phosphates in BALB/C 3T3 cellsstimulated with basic fíbroblast growth factor. Cell Signal 2277-84

Miller DL, Ortega S, Bashayan 0, Basch R, Basilico C 2000 Compensationby fibroblast growthfactor l (FGFl) does not account for the míld phenotypic defects observed in FGF2 null mice. Mol CellBiol 20:2260-2268

Takahashi JA, Fukumoto M, Koui Y, Ito N, 0da Y, Kikuchi H, Hatanaka M 1991lnhibitionofcell growth and tumorigenesis of human glioblastoma cells by a neutralizing antibody against humanbasic fibroblast growth factor. FEBS Lett 288265-71

Kornmann M, lshiwata T, Beger HG, Korc M 1997Fibroblast growth factor-5 stimulates mitogenicsignaling and is overexpressed in human pancreatic cancer: evidence for autocrine and paracrineactions. Oncogene 15:1417-1424

158

llO.

lll.

112.

113.

114.

115.

116.

ll7.

118.

119.

120.

121.

122.

123.

124.

125.

Samaniego F, Markham PD, Gendelman R, Watanabe Y, Kao V, Kowalski K, Sonnabend JA,Pintus A, Gallo RC, Ensoli B 1998 Vascular endothelíal growth factor and basic fibroblast growthfactor present in Kaposi’s sarcoma (KS) are induced by inflarnmatory cytokines and synergize topromote vascular permeability and KS lesion development. Am J Pathol 152:1433-1443

Vlodavsky l, Michaeli RI, Bar-Ner M, Fridman R, Horowitz AT, Fuks Z, Biran S 1988Involvement of heparanase in tumor metastasis and angiogenesis. Isr J Med Sci 24:464-470

Vlodavsky l, Friedmann Y, Elkin M, Aingorn H, Atzmon R, lshai-Michaeli R, Bitan M, Pappo 0,Peretz T, Michal l, Spector L, Peeker l 1999Marnmalianheparanase: gene cloning, expression andfunction in tumor progression and metastasis. Nat Med 5:793-802

Konig A, Menzel T, Lynen S, Wrazel L, Rosen A, Al Katib A, Raveche E, Gabrilove JL 1997Basic fibroblast growth factor (bFGF) upregulates the expression of bcl-2 in B cell chronic lymphocyticleukemia cell lines resulting in delaying apoptosis. Leukemia l 1:258-265

Luqmani YA, Graham M, Coombes RC 1992Expression of basic flbroblast growth factor, FGFRland FGFRZ in normal and malignant human breast, and comparison with other normal tissues. Br JCancer 66:273-280

Colomer R, Aparicio J, Montero S, Guzman C, Larrodera L, Cortes-Funes H 1997Low levelsofbasic fibroblast growth factor (bFGF) are associated with a poor prognosis in human breast carcinoma.Br J Cancer 76:1215-1220

Faridi A, Rudlowski C, Biesterfeld S, Sehuh S, Rath W, Sehroder W 2002 Long-term follow-upand prognostic significance of angiogenic basic fibroblast growth factor (bFGF) expression in patientswith breast cancer. Pathol Res Pract 19821-5

Anandappa SY, Winstanley JH, Leinster S, Green B, Rudland PS, Barraclough R 1994Comparativo expression of fibroblast growth factor mRNAs in benign and malignant breast disease. BrJ Cancer 69:772-776

Hsiung R, Zhu W, Klein G, Qin W, Rosenberg A, Park P, Rosato E, Sauter E 2002 High basicfibroblast growth factor levels in nipple aspirate fluid are correlated with breast cancer. Cancer J 8:303­310

Smith K, Fox SB, Whitehouse R, Taylor M, Greenall M, Clarke J, Harris AL 1999Upregulationofbasic fibroblast growth factor in breast carcinoma and its relationship to vascular density, oestrogenreceptor, epidermal growth factor receptor and survival. Ann Oncol 10:707-713

Karey KP, Sirbasku DA 1988 Differential responsiveness of human breast cancer cell lines MCF-7and T47D to growth factors and l7 beta-estradiol. Cancer Res 48:4083-4092

Peyrat JP, Hondermark H, Louehez MM, Boilly B 1991Demonstrationof basic fibroblast growthfactor high and low affinity binding sites in human breast cancer cell lines. Cancer Commun 3:323-329

Wang H, Rubin M, Fenig E, DeBlasio A, Mendelsohn J, Yahalom J, Wieder R 1997Basicfibroblast growth factor causes growth arrest in MCP-7 human breast cancer cells while inducing bothmitogenic and inhibitory Gl events. Cancer Res 57: 1750-1757

Lavandero S, Chappuzeau A, Sapag-Hagar M, Oka T 1998In vivo and in vitro evidence of basicfibroblast growth factor action in mouse mammary gland development. FEBS Lett 439:351-356

Fenig E, Szyper-Kravitz M, Yerushalmi R, Lahav M, Beery E, Wasserman L, Gutman H,Nordenberg J 2002Basicfibroblastgrth factormediatedgrth inhibitionin breast cancercells isindependent of ras signaling pathway. Oncol Rep 9:875-877

Souttou B, Hamelin R, Crepin M 1994 FGF2 as an autocrine growth factor for immortal humanbreast epithelial cells. Cell Growth Differ 5:615-623

159

126.

127.

128.

129.

130.

131.

132.

133.

134.

135.

136.

137.

138.

139.

140.

14..­

142.

Sugamoto T, Tanji N, Sato K, Fujita H, Nishio S, Sakanaka M, Yokoyama M 2001 The expressionof basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor in prostatic adenocarcinoma:correlation with neovascularization. Anticancer Res 21:77-88

Dacic S, Kounelis S, Kouri E, Jones MW 2002 Immunohístochemicalprofile of cystosarcomaphyllodes of the breast: a study of 23 cases. Breast J 8:376-381

Yoshimura N, Sano H, Hashiramoto A, Yamada R, Nakajima H, Kondo M, Oka T 1998Theexpression and localization of fibroblast growth factor-l (FGF-l) and FGF receptor-l (FGFR-l) inhuman breast cancer. Clin Immunol Immunopathol 89228-34

Jacquemier J, AdelaideJ, Parc P, Penault-Llorca F, Planche J, deLapeyriere 0, Birnbaum D1994 Expression of the FGFRl gene in human breast-carcinoma cells. Int J Cancer 59:373-378

Johnston CL, Cox HC, Gomm JJ, Coombes RC 1995Fibroblast growth factor receptors (FGFRs)localize in different cellular compartments. A splice variant of FGFR-3 localizes to the nucleus. J BiolChem 270:30643-30650

Morrison RS, Yamaguchi F, Bruner JM, Tang M, McKeehan W, Berger MS 1994Fibroblastgrowth factor receptor gene expression and immunoreactivity are elevated in human glioblastomamultiforme. Cancer Res 54:2794-2799

Giri D, Ropiquet F, lttmann M 1999Alterations in expression of basic fibroblast growth factor (FGF)2 and its receptor FGFR-l in human prostate cancer. Clin Cancer Res S:1063-1071

Shingu K, Fujimori M, lto K, Hama Y, Kasuga Y, Kobayashi S, ltoh N, Amano J 1998Expressionof fibroblast growth factor-2 and fibroblast growth factor receptor-l in thyroid diseases: differencebetween neoplasms and hyperplastic lesions. Endocr J 45:35-43

Ahmed NU, Ueda M, Ito A, Ohashi A, Funasaka Y, lchihashi M 1997Expression of fibroblastgrowth factor receptors in naevus-cell naevus and maligth melanoma. Melanoma Res 7:299-305

Myoken Y, Myoken Y, Okamoto T, Kan M, McKeehan WL, Sato JD, Takada K 1996 Expressionof fibroblast growth factor-l (FGF-l), FGF-2 and FGF receptor-l in a human salivary-glandadenocarcinoma cell line: evidence of growth. Int J Cancer 65:650-657

Webster MK, Donoghue DJ 1996Constitutive activation of fibroblast growth factor receptor 3 by thelransmembrane domain point mutatíon found in achondroplasia. EMBO J 15:520-527

Neilson KM, Friesel R 1996Ligand-independent activation of fibroblast growth factor receptors bypoint mutatíons in the extracellular, transmembrane, and kinase domains. J Biol Chem 271225049­25057

Lorenzi MV, Horii Y, Yamanaka R, Sakaguchi K, Miki T 1996FRAGl, a gene that potentlyactivates fibroblast grth factor receptor by C-tenninal fusion through chromosomalreanangement.Proc Natl Acad Sci U S A 93:8956-896l

Otsuki T, Yamada 0, Yata K, Sakaguchi H, Kurebayashi J, Nakazawa N, Taniwaki M, YawataY, Ueki A 1999 Expression of fibroblast growth factor and PGE-receptor family genes in humanmyeloma cells, including lines possessing t(4; l4)(q16.3;q32. 3) and FGFR3 translocation. Int J Oncol15:1205-1212

lmagawa W, Cunha GR, Young P, Nandi S 1994Kemtinocyte growth factor and acidic fibroblastgrowth factor are mitogens for primary cultures of mammary epithelium. Biochem Biophys ResCommun 204: l 165-1 169

Haslam SZ, Counterman LJ, Nummy KA 1992EGF receptor regulation in normal mouse mammarygland. J Cell Physiol lS2:553-557

Pedchenko VK, lmagawa W 2000 Pattern of expression of the KGF receptor and its ligands KGF andFGF-lO during postnatal mouse mammary gland development. Mol Reprod Dev 56:441-447

160

143.

145.

l46.

147.

148.

149.

150.

151.

152.

153.

154.

155.

156.

157.

158.

159.

lmagawa W, Pedchenko VK 2001 In vivo inhibition of keratinocyte growth factor receptor expressionby estrogen and antagonism by progesterone in the mouse mammary gland. J Endocrinol 171:3l9-327

Fate JE, Leco KJ, Moorehead RA, Martin DC, Khokhn R 1999Tirnp-l is important for epithelialproliferation and branching morphogenesis during mouse mammary development. Dev Biol 21 1:238­254

Werb Z, Ashkenas J, MaeAuley A, Wiesen JF 1996Extracellular matrix remodeling as a regulator ofStromal-epithelial interactions during mammary gland development, involution and carcinogenesís.Braz J Med Biol Res 29: 1087-1097

Haslam SZ, Woodward TL 2003 Host microenvironment in breast cancer development: Epithelial­cell-stromal-cell interactions and steroid hormone action ín normal and cancerous mammary gland.Breast Cancer Res 5:208-215

Drife JO 1986 Breast development in puberty. Ann N Y Acad Sci 464158-65

Shekhar MP, Pauley R, Heppner G 2003 Host microenvironmentin breast cancer development:extracellular matrix-Stromal cell contribution to neoplastic phenotype of epithelial cells in the breast.Breast Cancer Res 5: 130-135

Russo J, Ao X, Grill C, Russo lH 1999Pattern of distribution of cells positive for estrogen receptoralpha and progesterone receptor in relation to proliferating cells in the mammary gland. Breast CancerRes Treat 53:217-227

Cooke PS, Buchanan DL, Young P, Setiewan T, Brody J, Koraeh KS, Taylor J, Lubahn DB,Cunha GR 1997 Stromal estrogen receptors mediate mitogenic efi‘ectsof estradiol on uterineepithelium. Proc Nat] Acad Sci U S A 94:6535-6540

Zhang HZ, Bennett JM, Smith KT, Sunil N, Haslam SZ 2002 Estrogen mediates mammaryepithelial cell proliferation in serum-free culture indirectly via mammary stroma-derived hepatocytegrowth factor. Endocrinology l43:3427-3434

Haslam SZ, Counterman LJ 1991Mammary stroma modulates hormonal responsiveness ofmammary epithelium in vivo in the mouse. Endocrinology [2922017-2023

Sunil N, Bennett JM, Haslam SZ 2002 Hepatocyte growth factor is required for progestin-inducedepithelial cell proliferation and alveolar-like morphogenesis in serum-free culture of normal mammaryepithelial cells. Endocrinology l43:2953-2960

Haslam SZ, Woodward TL 2003 Host microenvironment in breast cancer development: Epithelial­cell-stromal-cell interactions and steroid hormone action in normal and cancerous mammary gland.Breast Cancer Res 5:208-215

lmagawa W, Pedchenko VK, Helber J, Zhang H 2002 Hormone/growthfactor interactions mediatingepithelial/Stromal communication in mammary gland development and carcinogenesis. J SteroidBiochem Mol Biol 80:213-230

Zamecnik PC, Stephenson ML 1978 Inhibition of Rous sarcoma virus replicatr'onand celltransformation by a specific oligodeoxynucleotide. Proc Natl Acad Sci U S A 75:280-284

Gewirtz AM, Stein CA, Glazer PM 1996Facilitating oligonucleotide delivery: helping antisensedeliver on its promise. Proc Natl Acad Sci U S A 93:3161-3l63

Dervan PB 1989 Oligonucleotide recognition of double-helical DNA by triple-helix formation. In:Cohen JS (ed). Topic in Molecular and Structural Biology. Oligonucleotides: Antisense inhibitors ofgene expression, vol 12:

Yakubov LA, Deeva EA, Zarytova VF, lvanova EM, Ryte AS, Yurchenko LV, Vlassov VV 1989Mechanism of oligonucleotide uptake by cells: involvement of specific receptors? Proc Natl Acad Sci US A 86:6454-6458

161

160.

161.

162.

163.

165.

166.

167.

168.

169.

170.

l7l.

172.

173.

174.

175.

176.

l77.

Hannon GJ 2002 RNA interference. Nature 4182244-251

Nakal D, Selta T, Terasaki T, lwasa S, Shoji Y, Mizushima Y, Suglyama Y 1996Cellular uptakemechanism for oligonucleotídes: involvement of endocytosis in the uptake of phosphodiesteroligonucleotides by a human colorectal adenocarcinoma cell line, HOT-15. J Pharmacol Exp Ther278: 1362-1372

Leonett'l JP, Meehti N, Degols G, Gagnor C, Lebleu B 1991Intracellular distribution ofmicroinjected antisense oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A 88:2702-2706

Loke SL, Stein CA, Zhang XH, Mori K, Nakanishi M, Subasinghe C, Cohen JS, Neckers LM 1989Characterization of oligonucleotide transport into living cells. Proc Natl Acad Sci U S A 86:3474-3478

Hughes MD, Hussaln M, Nawaz Q, Sayyed P, Akhtar S 2001 The cellular delivery of antisenseoligonucleotides and n'bozymes. Drug Discov Today 6:303-315

Pawlak W, Zolnierek J, Saroslek T, Szezylik C 2000 Antisense therapy in cancer. Cancer Treat Rev26:333-350

Guvakova MA, Yakubov LA, Vlodavsky l, Tonkinson JL, Stein CA 1995Phosphorothioateoligodeoxynucleotides bind to basic fibroblast growth factor, inhibit its binding to cell surfacereceptors, and remove it from low affinity binding sites on extracellular matrix. J Biol Chem 270:2620­2627

Zhao Q, Zhou R, Temsamani J, Zhang Z, Roskey A, Agrawal S 1998Cellular distribution ofphosphorothioate oligonucleotide following intravenous administration in mice. Antisense Nucleic AcidDrug Dev 8:451-458

Zhao Q, Temsamani J, Zhou RZ, Agrawal S 1997Pattern and kinetics of cytokine productionfollowing administration of phosphorothíoate oligonucleotides in mice. Antisense Nucleic Acid DrugDev 7:495-502

Jansen B, Wadl H, lnoue SA, Trulzsch B, Selzer E, Duchene M, Elchler HG, Wolfl’K,Pehamberger H 1995Phosphorothioate oligonucleotides reduce melanoma growth in a SCID-humouse model by a nonantisense mechanism. Antisense Res Dev 5:271-277

Matsukura M, Shinozuka K, Zon G, Mitsuya H, Reitz M, Cohen JS, Broder S 1987Phosphorothioate analogs of oligodeoxynucleotides: inhibitors of replication and cytopathic effects ofhuman immunodeficiency virus. Proc Natl Acad Sci U S A 84:7706-7710

Stahel RA, Zangemeister-Wittke U 2003 Antisense oligonucleotides for cancer therapy-an overview.Lung Cancer 4l Suppl l:SBl-888

Clarke R 1996 Animal models of breast cancer: their diversity and role in biomedical research. BreastCancer Res Treat 39: 1-6

Pazos P, Lanari C, Meiss R, Charreau EH, Pasqualini CD 1992Mammary carcinogenesis inducedby N-methyl-N-nitrosourea (MNU) and medroxyprogesterone acetate (MPA) in BALB/c mice. BreastCancer Res Treat 20: 133-138

Callahan R l996 MMTV-induced mutations in mouse mammary tumors: their potential relevance tohuman breast cancer. Breast Cancer Res Treat 39233-44

Javier R, Shenk T l996 Mammary tumors induced by human adenovirus type 9: a role for the viralearly region 4 gene. Breast Cancer Res Treat 39:57-67

Fluck MM, Haslam SZ 1996Mammary tumors induced by polyomavirus. Breast Cancer Res Treat39:45-56

Clarke R 1996 Human breast cancer cell line xenografis as models of breast cancer. Theimmunobiologies of recipient mice and the characteristics of several rumorigenic cell lines. BreastCancer Res Treat 39269-86

162

178.

179.

180.

181.

182.

183.

184.

185.

186.

187.

188.

189.

190.

191.

192.

193.

194.

Amundadottir LT, Merlino G, Dickson RB 1996Transgenic mouse models of breast cancer. BreastCancer Res Treat 39:1 19-135

Laneri C, Molinolo AA, Pasqualínl CD 1986Inductíon of mammary adenocarcinomas bymedroxyprogesterone acetate in BALB/c female mice. Cancer Lett 33:215-223

Lanari C, Molinolo AA, Pasquelini CD 1986Inhibitory effect of medroxyprogesterone acetate onforeign body tumorigenesis in mice. J Nat] Cancer Inst 77: 157-164

Lanari C, Kordon E, Molinolo A, Pasqualini CD, Charreau EH 1989Mammary adenocarcinomasinduced by medroxyprogesterone acetate: hormone dependence and EGF receptors of BALB/c in vivosublines. Int J Cancer 43:845-850

Molinolo AA, Lanari C, Charreau EH, Sanjuan N, Pasqualinl CD 1987Mouse marnmarytumorsinduced by medroxyprogesterone acetate: immunohistochemislry and hormonal receptors. J Nat]Cancer Inst 79: 1341-1350

Kordon E, Lanari C, Meiss R, Charreau E, Pasquelini CD 1990Horrnonedependence of a mousemammary tumor line induced in vivo by medroxyprogesterone acetate. Breast Cancer Res Treat 17:33­43

Helguero LA, Viegas M, Asaithnmby A, Shyamela G, Lanari C, Molinolo AA 2003 Progesteronereceptor expression in medroxyprogesterone acetate-induced murine mammary carcinomas andresponse to endocrine treatment. Breast Cancer Res Treat 79:379-390

Maggi A, Sehrader WT, O'Malley BW 1984Progesterone-bindingsites of the chick oviduct receptor.Presence of a weaker ligand site which is destroyed by phosphatase treatment. J Biol Chem 259210956­10966

Mani SK, Blaustein JD, Allen JM, Law SW, O'Malley BW, Clark JH 1994Inhibitionof rat sexualbehavior by antisense oligonucleotides to the progesterone receptor. Endocrinology 135:1409-1414

Maní SK, Mitchell A, O'Malley BW 2001 Progesterone receptor and dopamine receptors are requiredin Delta 9-teu'ahydrocannabinol modulation of sexual receptivíty in female rats. Proc Nat] Acad Sci U SA 98: 1249-1254

Dran G, Luthy lA, Molinolo AA, Charreau EH, Pasqualini CD, Lanari C 1995Effect ofmedroxyprogesterone acetate (MPA) and serum factors on cell proliferation in primary cultures of anMPA-induced mammary adenocarcinoma. Breast Cancer Res Treat 35: 173-186

Pandis N, Heim S, Bardi G, Limon J, Mandahl N, Mitelman F 1992 Improved technique for short­term culture and cytogenetic analysis of human breast cancer [published erratum appears in GenesChromosom Cancer 1992 Nov;5(4):410]. Genes Chromosomes Cancer 5114-20

Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL 1951Protein measurements with the Folin phenol reagent. JBiol Chem l93:265-275

Laemmli UK 1970 Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacten'ophageT4. Nature 227:680-685

Clarke CL, Zaino RJ, Feil PD, Miller JV, Steek ME, Ohlsson-Wilhelm BM, Satyaswaroop PG1987 Monoclonal antibodies to human progesterone receptor: characterization by biochemical andimmunohistochemical techniques. Endocrinology 121:1123-1132

Shyamnla G, Schneider W, Schott D 1990Developmental regulation of murine mammaryprogesterone receptor gene expression. Endocrinology 126:2882-2889

Shyamala G, Yang x, Silberstein G, Barcellos-Hofl' MH, Dele E 1998Transgenic ¡nice carrying animbalance in the native ratio of A to B forms of progesterone receptor exhibít developmentalabnormalities in mammary glands. Proc Nat] Acad Sci U S A 95:696-701

163

195.

196.

197.

198.

199.

200.

202.

203.

204.

205.

206.

207.

208.

209.

210.

211.

Gavrieli Y, Sherman Y, Ben Sasson SA 1992 Identification of programmed cell death in situ viaspecific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol l 19:493-501

Lamb C, Simian M, Molinolo A, Pazos P, Lanari C 1999Regulation of cell growth of a progestin­dependent mun'ne marnmary carcinoma in vitro: progesterone receptor involvement in serum or growthfactor-induced cell proliferation. J Steroid Biochem Mol Biol 70: 133-142

Lanari C, Montecchia MF, Pazos P, Simian M, Vanzulli S, Lamb C, Molinolo AA 1997Progestin­induced marnmary adenocarcinomas in BALB/c mice. Progression from hormone-dependent toautonomous tumors. Medicina (B Aires) 57255-69

Wang H, Zeng X, Oliver P, Le LP, Chen J, Chen L, Zhou W, Agrawal S, Zhang R 1999 MDM2oncogene as a target for cancer therapy: An antisense approach. Int J Oncol 15:653-660

Linder C, Bystrom P, Engel G, Auer G, Aspenblad U, Strander H, Linder S 1998Correlationbetween basic fibroblast growth factor immunostaining of stromal cells and stromelysin-3 mRNAexpression in human breast carcinoma. Br J Cancer 77:941-945

Delabre K, Guioehon-Mantel A, Milgrom E 1993In vivo evidence against the existence ofantiprogestins disrupting receptor binding to DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 90:4421-4425

Beck CA, Weigel NL, Moyer ML, Nordeen SK, Edwards DP 1993The progesterone antagonistRU486 acquires agonist activity upon stimulation of CAMPsignaling pathways. Proc Natl Acad Sci U SA 90:4441-4445

Miyamoto H, Yeh S, Wilding G, Chang C 1998Promotion of agonist activity of antiandrogens by theandrogen receptor coactivator, ARA70, in human prostate cancer DU145 cells. Proc Natl Acad Sci U SA 95:7379-7384

Gagne D, Pons M, Philibert D 1985 RU 38486: a potent antiglucocorticoid in vitro and in vivo. JSteroid Biochem 23:247-251

Mani SK, Mitchell A, O'Malley BW 2001 Progesterone receptor and dopamine receptors are requiredin Delta 9-tetrahydrocannabinol modulation of sexual receptivity in female rats. Proc Natl Acad Sci U SA 98:1249-1254

Pietrzkowski Z, Mulholland G, Gomella L, Jameson BA, Wernicke D, Baserga R 1993Inhibitionof growth of prostatic cancer cell lines by peptide analogues of insulin-like growth factor l. Cancer Res53:1102-1106

Resnicoff M, Burgaud JL, Rotman HL, Abraham D, Baserga R 1995Correlation betweenapoptosis, tumorigenesis, and levels of insulin-like growth factor l receptors. Cancer Res 55:3739-3741

Zhu YG, Zhuo GS, Chen ZZ, Chen XC 2001 Cationic lipids enhanced cellular uptake and activity ofbol-2 antisense oligodeoxynucleotide G3l39 in HL-60 cells. Acta Pharmacol Sin 22: 1007-1012

Bertram J, Palfner K, Killian M, Brysch W, Schlingensiepen KH, Hiddemann W, Kneba M 1995Reversal of multiple drug resistance in vitro by phosphorothioate oligonucleotides and n'bozymes.Anticancer Drugs 6: 124-l34

Lanari C, Luthy l, Lamb CA, Fabris V, Pagano E, Helguero LA, Sanjuan N, Merani S, MolinoloAA 2001 Five novel hormone-responsive cell lines derived from murine marnmary ductal carcinomas:in vivo and ín vitro effects of estrogens and progestins. Cancer Res 61:293-302

Song HF, Tang ZM, Yuan SJ, Zhu BZ, Liu XW 2003 Antisense candidates against protein kinase C­alpha designed based on phylogenesis and simulant structure of mRNA. Acta Pharmacol Sin 242269­276

Briggs MH, Briggs M 1973 Glucocorticoid properties of progestogens. Steroíds 22:555-559

212.

213.

214.

215.

216.

217.

218.

219.

220.

221.

222.

223.

224.

225.

226.

227.

228.

Bullock LP, Bartbe PL, Mowszowicz l, Ortb DN, Bardin CW 1975The effect of progestins onsubmaxillary gland epiderrnal growth factor: demonstration of androgenic, synandrogenic andantiandrogenic actions. Endocrinology 97: 189-l95

Molinolo A, Simian M, Vanzulli S, Pazos P, Lamb C, Lanari C 1998 Involvement of EGF inmedroxyprogesterone acetate (MPA)-induced mammary gland hyperplasia and its role in MPA-inducedmammary tumors in BALB/c mice. Cancer Lett 126249-57

Elizalde PV, Lanari C, Molinolo AA, Guerra FK, Balana ME, Simian M, Iribarren AM,Charreau EH 1998 Involvement of insulin-like growth factors-I and -II and their receptors inmedroxyprogesterone acetate-induced growth of mouse mammary adenocarcinomas. J Steroid BiochemMol Biol 67:305-317

Turgeon JL, Waring DW 1994Activation of the progesterone receptor by the gonadotropin-releasinghormone self-priming signaling pathway. Mol Endocrinol 8:860-869

Apostolakis EM, Garai J, Fox C, Smith CL, Watson SJ, Clark JH, O'Malley BW 1996Dopaminergic regulation of progesterone receptors: brain D5 dopamine receptors mediate induction oflordosis by Dl-like agonists in rats. J Neurosci 16:4823-4834

Clemens JW, Roblrer RL, Kraus WL, Katzenellenbogen BS, Richards JS 1998Hormone inductionof progesterone receptor (PR) messenger ribonucleic acid and activation of PR promoter regions inovarian granulosa cells: evidence for a role of cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate but not estradiol.MolEndocrinol 12:1201-1214

Horwitz KB 1993 Mechanisms of hormone resistance in breast cancer. Breast Cancer Res Treat26:1 19-130

Mendoza-Alvarez H, Alvarez-Gonzalez R 2001 Regulationof p53 sequence-specific DNA-bindingby covalent poly(ADP-ribosyl)ation. J Biol Chem 276:36425-36430

Bagebi MK, Elliston JF, Tsai SY, Edwards DP, Tsai MJ, O'Malley BW 1988Steroid hormone­dependent interaction of human progesterone receptor with its target enhancer element. Mol Endocrinol2: 1221-1229

Kordon E, Lanari C, Molinolo AA, Elizalde PV, Charreau EH, Pasqualinl CD 1991Estrogeninhibition of MPA-induced mouse mammary tumor transplants. Int J Cancer 49:900-905

Montecebia MF, Molinolo A, Lanari C 1999Reversal of estrogen-resistance in murine mammaryadenocarcinomas. Breast Cancer Res Treat 54293-99

Vanzulli S, Efeyan A, Benavides F, Helguero L, Peters G, Shen J, Conti CJ, Lanari C, Molinolo A2002 p21, p27 and p53 in estrogen and antiprogestin-induced tumor regression of experimental mousemammary ductal carcinomas. Carcinogenesis 23:749-757

Miehna H, Nishino Y, Neef G, McGulre WL, Schneider MR 1992Progesterone antagonists: tumor­inhibiting potential and mechanism of action. J Steroid Biochem Mol Biol 41 :339-348

Brunner N, Spang-Thomsen M, Cullen K 1996The T61 human breast cancer xenograft: anexperimental model of estrogen therapy of breast cancer. Breast Cancer Res Treat 39287-92

Cbisamore MJ, Ahmed Y, Bentrem DJ, Jordan VC, Tonetti DA 2001 Novel antitumoreffect ofestradiol in athymic mice injected with a T47D breast cancer cell line overexpressing protein kinaseCalpha. Clin Cancer Res 7:3156-3165

Waters JS, Webb A, Cunningham D, Clarke PA, Raynaud F, di Stefano F, Cotter FE 2000 Phase Iclinical and pharmacokinetic study of bel-2 antisense oligonucleotide therapy in patients with non­Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol 1821812-1823

Wang H, Nan L, Yu D, Agrawal S, Zhang R 2001 Antisense anti-MDM2 oligonucleotides as a noveltherapeutic approach to human breast cancer: in vitro and in vivo activities and mechanisms. ClinCancer Res 7:3613-3624

165

229.

230.

231.

232.

233.

234.

235.

236.

237.

238.

239.

240.

241.

242.

243.

244.

245.

246.

Gao Y, Short RV 1994 Fertility control in laboratory rats and mice afier feeding with the antigestagenRU486. J Reprod Fertil 1012477-481

Gomm JJ, Smith J, Ryall GK, Baillie R, Turnbull L, Coombes RC 1991Localizaüon of basicfibroblast growth factor and transforming growth factor beta l in the human mammary gland. CancerRes 51:4685-4692

Yi WJ, Tang ZH, Yang ZL, Yu MY, Li YS, Chen GN 2003 [Difference in expression of VEGF,bFGF and their receptors between the young and postrnenopausal women with breast cancer].Zhonghua Zhong Liu Za Zhi 25: 141-144

Coleman-Kmaeik S, Rosen JM 1994Differential temporal and spatial gene expression of fibroblastgrowth factor family members during mouse mammary gland development. Mol Endocrinol 8:218-229

Presta M, Gualandris A, Urbinatl C, Rusnati M, Coltrini D, lsacchi A, Caccia P, Bergonzonl L1993 Subcellular localization and biological activity of M(r) 18,000 basic fibroblast growth factor: site­directed mutagenesis of a putative nuclear translocation sequence. Growth Factors 9:269-278

Baldin V, Roman AM, Bosc-Bierne l, Amalric F, Bouche G 1990Translocation of bFGF to thenucleus is Gl phase cell cycle specific in bovine aortic endothelíal cells. EMBO J 9:151l-1517

Rofstad EK, Halsor EF 2000 Vascular endothelíal growth factor, interleukin 8, platelet-den'vedendothelíal cell growth factor, and basic fibroblast growth factor promote angiogenesis and metastasisin human melanoma xenografis. Cancer Res 60:4932-4938

Cancilla B, Risbridger GP 1998Differential localization of fibroblast growth factor receptor-l, -2, -3,and -4 in fetal, imrnature, and adult rat testes. Biol Reprod 58:1138-1145

Blanckaert VD, Hebbar M, Louehez MM, Vilain M0, Schelling ME, Peyrat JP 1998Basicfibroblast growth factor receptors and their prognostíc value in human breast cancer. Clin Cancer Res4:2939-2947

Prudovsky I, Savion N, Zhan x, Friesel R, Xu J, Hou J, McKeehan WL, Maclag T 1994Intact andfimctional fibroblast growth factor (FGF) receptor-l trafficks near the nucleus in response to FGF-l. JBiol Chem 269231720-31724

Pedchenko VK, lmagawa WT 1998Mammogenic honnones differentially modulate keratinocytegrowth factor (KGB-induced proliferation and KGF receptor expression in cultured mouse mammarygland epithelium. Endocrinology 13922519-2526

Yl ES, Bedoya AA, Lee H, Kim S, Housley RM, Aukerman SL, Tarpley JE, Starnes C, Yin S,Pierce GF, . 1994 Keratinocyte growth factor causes cystic dilation of the marnmary glands of mice.lnteractions of keratinocyte growth factor, estrogen, and progesterone in vivo. Am J Pathol 145:1015­1022

Corsini C, Mancuso P, Paul S, Burlini A, Martinelli G, Pruneri G, Bertolini F 2003 Stroma cells: anovel target of herceptin activity. Clin Cancer Res 9: 1820-1825

Kurose K, Gilley K, Matsumoto S, Watson PH, Zhou XP, Eng C 2002 Frequent somatic mutationsin PTEN and TP53 are mutually exclusive in the suoma of breast carcinomas. Nat Genet 32:355-357

Dickson RB, Lippman ME 1995 Growth factors in breast cancer. Endocr Rev 16:559-589

Nawaz Z, Stancel GM, Hyder SM 1999The pure antiestrogen ICI 182,780 inhibits progestin-inducedtranscription. Cancer Res 59:372-376

Taylor AH, Pringle JH, Bell SC, Al Amwi F 2001 Specific inhibitionof estrogen receptor alphafunction by antisense oligodeoxyribonucleotides. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 11:219-231

Santagati S, Gianazza E, Agrati P, Vegeto E, Patrone C, Pollio G, Maggi A 1997Oligonucleotidesquelching reveals the mechanism of estrogen receptor autologous down-regulation. Mol Endocn'nOl11:938-949

166

247.

248.

249.

250.

251.

252.

253.

254.

255.

256.

257.

258.

259.

260.

Watson CS, Campbell CH, Gametchu B 2002 The dynamic and elusive membrane estrogen receptor­aJpha. Steroids 67:429-437

Montecchla MF, Lamb C, Molinolo AA, Luthy lA, Pazos P, Charreau E, Vanzulll S, Lanarl C1999 Progesterone receptor involvement in independent tumor growth in MPA-induced murinemammary adenocarcinomas. J Steroid Biochem Mol Biol 68111-21

Masamura S, Santner SJ, Heltjan DF, Santen RJ 1995Estrogendeprivation causes estradiolhypersensitivity in human breast cancer cells. J Clin Endocn‘nolMetab 80:2918-2925

Chun TY, Gregg D, Sarkar DK, Gorski J 1998Differential regulation by estrogens of growth andprolactin synthesis in pituitary cells suggests that only a small pool of estrogen receptors is required forgrowth. Proc Natl Acad Sci U S A 95:2325-2330

Endoh H, Sasaki H, Maruyama K, Takeyama K, Waga l, Shlmizu T, Kato S, Kawashlma H 1997Rapid activation of MAP kinase by estrogen in the bone cell line. Biochem Biophys Res Commun235:99-102

Weatherman RV, Fletterick RJ, Scanlan TS 1999Nuclear-receptor lígands and ligand-bindingdomains. Annu Rev Biochem 68:559-58]

Horwitz KB, Koseki Y, McGuire WL 1978 Estrogen control of progesterone receptor in human breastcancer: role of estradiol and antiestrogen. Endocúnology 103:1742-1751

mammary tumor. Cancer Res 37:3344-3348

Kaye AM, Spatz M, Waisman A, Sasson S, Tamir S, Vaya J, Somjen D 2001 Paradoxicalinteractions among estrogen receptors, estIogens and SERMS: mutual annihilation and synergy. JSteroid Biochem Mol Biol 76:85-93

Kordon EC, Molinolo AA, Pasquallnl CD, Charreau EH, Pazos P, Dran G, Lanarl C 1993Progesterone induction of mammary carcinomas in BALB/c female mice. Cor-relationbetweenprogestin dependence and morphology. Breast Cancer Res Treat 28:29-39

Chlebowsld RT, Hendrix SL, Langer RD, Stefanick ML, Gass M, Lane D, Rodabough RJ,Gilllgan MA, Cyr MG, Thomson CA, Khandekar J, Petrovltch H, McTiernan A 2003 Influenceestrogen plus progestin on breast cancer and mammography in healthy postmenopausal women: theWomen’s Health Initiative Randomized Trial. JAMA 289z3243-3253

Going JJ, Anderson TJ, Battersby S, Maclntyre CC 1988Proliferativeand secretory activity inhuman breast during natural and artificial menstrual cycles. American Journal of Pathology 130:193­204

Bergkvlst L, Adami H0, Persson l, Hoover R, Schalrer C 1989The n'sk of breast cancer afierestrogen and estrogen-progestin replacement. N Engl J Med 3212293-297

Watson C, Medina D, Clark JH 1977 Estrogen receptor characterization in a transplantable mouse ° o

of

Ross RK, Paganini-Hill A, Wan PC, Plke MC 2000 Effect of hormone replacement therapy on breastcancer n'sk: estrogen versus estrogen plus progestin. J Natl Cancer Inst 92:328-332

167