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[Marca de agua: manuscrito aceptado]

Manuscrito Aprobado del Autor Refuerzo mecánicode cemento inyectablede fosfatode calcio/ compuesto de fibroínade seda (SF) mediante SF mineralizada Chengbin Cao, Hao Li, Jun Li, Chen Liu, Huilin Yang, Bin Li

www.elsevier.com/locate/ceramint

PII: S0272-8842(14)00846-3 DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.ceramint.2014.05.123 Referencia: CERI8659 Para encontrarlo en: Ceramics International Fecha de recepción: 21 de abril de 2014 Fecha de revisión: 26 de mayo de 2014 Fecha de aprobación: 27 de mayo de 2014 Citareste artículocomo: Chengbin Cao, Hao Li, Jun Li, Chen Liu, Huilin Yang, Bin Li, Mechanical reinforcement of injectable calcium phosphate cement/silk fibroin (SF) composite by mineralized SF, Ceramics International,http://dx.doi.org/10.1016/j.ceramint.2014.05.123 Éstees un archivo PDF de un manuscritosin editar que se ha aprobado para su publicación. Como un serviciopara nuestros clientes, proporcionamos esta versióninicial del manuscrito. Se someterá el manuscritoa corrección de texto, redacción, y revisión de la galerada resultante antes de su publicación en su forma citable final. Por favor nótese que durante el proceso de producciónse pueden descubrir errores que afecten el contenido, y se atañen todos los descargos legales de responsabilidad que apliquen al acta.

[Marca de agua: manuscrito aceptado] 1

MANUSCRITO APROBADO

Revisiónpara: Ceramics International

Refuerzo mecánico de cemento inyectable de fosfato de calcio/compuesto de fibroína de seda (SF)

mediante SF mineralizada

Chengbin Cao a, Hao Li b, Jun Li b, Chen Liu b, Huilin Yang b,*, Bin Li a,b,*

aEscuelade Química, Ciencia de Ingeniería Química y Materiales, InstitutoOrtopédico, Universidad de Soochow,

Suzhou, Jiangsu 215123, China

bDepartamentodeOrtopedia, El Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Soochow, 188 Shizi St, Suzhou,

Jiangsu 215006, China

* Correspondientea:

Bin Li, PhD

708 Renmin Rd, Rm 308 Bldg 1, Universidad de Soochow (Campus Sur), Suzhou, Jiangsu 215007,

China

Tel.: (+86) 512-6778-1163; Fax: (+86) 512-6778-1163

E-mail: [email protected]


MANUSCRITO APROBADO

Resumen

Los cementos de fosfato de calcio (CPC) son materiales ortopédicos inyectables prometedores con una

excelente biocompatibilidady osteoconductividad. Sin embargo, la fuerza mecánica inferior limitasu uso

únicamente a las áreasde bajo soporte. En este estudio, sintetizamos un complejo de hidroxiapatita (HA)-fibroína

de seda (SF) mediante el método de co-precipitación y se utilizó para complementar un compuesto CPC/SF

inyectable. Descubrimos que la fuerza compresivadel compuesto de tres componentes, CPC/HA-SF/SF, se

mantuvo en incremento con el contenido HA-SF si no excedía un porcentaje en peso de 3%. Dicho efecto de

refuerzo fue probablemente el resultado de una integridad interfacial mejorada y un crecimiento orientado de

cristales HA en el compuesto CPC/SF tras la complementación con HA-SF. El tiempo de fijación de los

compuestos CPC/HA-SF/SF disminuyó como una funcióndel contenido HA-SF, sin efecto aparente en la

capacidad de inyección. Más aún, los compuestos CPC/HA-SF/SF mostraron buena biocompatibilidadtanto in

vitro comoin vivo. Dichos compuestos resultan bastante prometedores para muchas aplicaciones ortopédicas,

incluyendo servir como materiales de rellenopara cirugías mínimamenteinvasivaspara tratar fracturas

vertebrales.

Palabras clave: Cemento de fosfato de calcio; fibroína de seda; hidroxiapatita; complejo;

refuerzo mecánico


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1. Introducción

Las fracturas de compresión vertebral (VCFs) son la complicación más común de la osteoporosis en la

población de edad avanzada. Ocurren aproximadamente 1.4 millonesde nuevas fracturas anualmente a nivel

mundial [1]. Las técnicas de cirugía mínimamente invasiva, tales como la vertebroplastia (VP) y la cifoplastia

(KP), se han usado ampliamente para el tratamiento de VCF relacionadas conosteoporosis debido a su capacidad

de fortalecer de manera instantánea el cuerpo vertebral [2]. El cemento óseo de polimetilmetacrilato (PMMA) es

el material de relleno utilizado con mayor frecuencia para VP/KP, pero posee limitantes intrínsecas, incluyendo

nodegradabilidad, baja biocompatibilidad, incompatibilidad mecánicacon tejido óseo vertebral, y necrosis de

tejido exotérmica inducidapor la fijación [3]. En contraste, los cementos biodegradables de fosfato de calcio

(CPC) presentan un buen potencialdebido a su excelentebiocompatibilidady osteoconductividad [4], pero su

fuerza mecánicaa menudo es menor y no cumple con los requisitos de refuerzo como material de relleno para

VP/KP [5].

Se han realizado varioscomplementos de polímeros sintéticos o naturales biodegradablespara mejorar las

propiedades mecánicasde los CPC [6, 7]. Sin embargo, los polímeros sintéticos popularestales como el

poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) y la policaprolactona (PCL) a menudo se asocian con efectos

secundarios desfavorables, incluyendo reacciones inflamatorias noinfecciosasdebido a la acidez de los

productos degradados [8]. Los polímeros naturales, incluyendo proteínasy polisacáridos, son por lo tanto una

mejor opción ya que forman parte de los tejidos nativos e inducen respuestas mínimas a cuerpos externos [9].

La fibroínade seda (SF), una proteína naturalderivada de la seda, se ha explorado ampliamente en una variedad

de aplicaciones biomédicasdebido a su excelentebiocompatibilidad, degradabilidadcontrolable, y propiedades

mecánicas notables [10].


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Al incorporarlo con la hidroxiapatita (HA), la SF podría favorecer la regeneración ósea al aumentar la

osteoconductividady proporcionar sitios de nucleaciónpara la sedimentación de minerales nuevos [11-13]. Se

ha demostrado también que la modificaciónde SF promueve el crecimiento y la diferenciaciónosteogénica de

células estromales de la médula ósea en andamiajes mesoporosos de bioglass [14]. Recientemente, descubrimos

que complementar CPC conSF podía mejorar la fuerza mecánica y la resistencia a la erosión de éste. Sin

embargo, la fuerza compresivade los compuestos CPC/SF era aún insuficientepara propósitos de VP/KP, lo

cual idealmente sería de aproximadamente50-90 MPa [15, 16].

La adhesión interfacialentre las fases incompatibles es un factor crítico para determinar las propiedades

mecánicasde compuestos híbridos de inorgánicos-polímeros [17, 18]. En los compuestos CPC/SF, la baja

compatibilidad interfacialentre las fases CPC y SF limita aún más el refuerzo de sus propiedades mecánicas. En

compuestos a base de polímeros donde el polímeroes la fase dominante, se han desarrollado variosmétodos de

acoplamiento e injertospara modificar la superficie de rellenos inorgánicosy se ha demostrado la mejora de la

adhesión interfacial [19, 20]. Sin embargo, los métodospara mejorar la integración de compuestos a base de

inorgánicos, en los cuales el componentedominante son los compuestos inorgánicostales como los fosfatos de

calcio, permanecen muy limitados.

El objetivode este estudio fue mejorar la fuerza mecánicadel compuesto CPC/SF al mejorar la

integracióninterfacial entre las fases inorgánicasy orgánicas. Esto se logró al utilizar una SF mineralizada, un

complejo HA-SF, en el cual las fases de HA y SF se acoplaron a nivel molecular.


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Se preparó el complejo HA-SF mediante un método de co-precipitacióny se complementócon los compuestos

CPC/SF como un nuevo reactivo de acoplamiento interfacial. Después se evaluaron la propiedad mecánica

eventualy las características microestructuralesde los compuestos CPC/SF complementados con HA-SF

(CPC/HA-SA/SF), así como la biocompatibilidadtantoin vitro como in vivo.

2. Experimentos

2.1 Síntesisdel complejo HA-SF

Se preparó una solución SF de Bombyx mori (gusano de seda) siguiendo el protocolo publicado [21]. El

complejo HA-SF se preparó utilizando un método de co-precipitación [22]. Brevemente, se mezclaron33.3 ml de la

soluciónSF (porcentaje en peso de 18%) con una suspensiónque contenía 10.32 g de Ca(OH)2y 120 ml de agua

destilada, después se añadieron9.64 g de solución H3PO4 (porcentaje en peso de 85%) gota a gota. Después de

ajustar el pH a 9.0, se agitó la mezcla durante 3 horas,y el complejo precipitado (HA-SF) se secó al vació y se

pulverizó finamente.

2.2 Preparaciónde los compuestos CPC/HA-SF/SF

Para preparar los compuestos CPC/HA-SF/SF, HA-SF se complementó una mezcla de polvo CPC

(ɑ-fosfato tricálcico, a-TCP, porcentaje en peso de 75%; fosfato tetracálcico, TTCP, porcentaje en peso de 20%;

fosfato dicálcico anhidro, DCPA, porcentaje en peso de 5%) y una solución SF con porcentaje en peso de 7.5%

(proporción polvo/líquido de 3 g/ml) con HA-SF. La pasta se endureció durante 1 hora y luego se colocó a 37

°C, humedad relativa de 100% durante 3 días antes de la prueba.


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2.3 Caracterización del complejo HA-SF y los compuestos CPC/HA-SF/SF

Se caracterizaron los compuestos HA-SF y CPC/HA-SF/SF utilizando difracción de rayos X (XRD)

(X’Pert-Pro MPD, PANalytical, Holanda), espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FTIR)

(Nicolet 6700, Thermo Scientific), microscopía electrónica de barrido (SEM) (Quanta 250 FEG, FEI), y prueba

mecánica (E10000, Instron). Se determinaron los tiempos iniciales y finales de secado utilizando el método de

aguja Gillmore de acuerdo con la bibliografía[23].

2.4 Pruebas MTT de los compuestos CPC/HA-SF/SF

Se examinó la citotoxicidadde los materialesin vitro usando un cultivo celular MC3T3-E1 en un formato de

cultivo de extracto(ISO 10993). Se sumergieron los discos de muestra en un medio

ɑ-MEM (proporción del área de la superficie del disco al volumen medio = 1.2 mm2/ml) a 37 °C durante 24

horaspara obtener los extractos de material. Se sembraron las células en una densidad de 40,000

células/pocilloen una placa de 96 pocillos. Después de 24 horas se reemplazó el medio de cultivocon ɑ-MEM

que contenía extractos de material. En intervalos de tiempo designados, se llevaron a cabo las pruebas MTT y

se midió la densidad ópticaa490 nm.

2.5 Pruebas en animales de los compuestos CPC/HA-SF/SF

El Comité Institucional para el Cuidado y Uso Animal (IACUC) de la Universidad de Soochow aprobó la

prueba in vivo. Se insertaron dos muestras de cada grupo de compuestos en bolsas bilaterales en el músculo dorsal

de los ratones. Se recolectaron los implantesy el tejido circundante después de dos semanas. Se sumergieron las

muestras de inmediato en formalina neutralizada amortiguada en 10% durante 24 horasy se les deshidrató usando

series de etanol seguidas de xileno.


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Después de retirar los cementoscuidadosamente, se integró parafina en los tejidos circundantes y

fueronseccionadospara una evaluación histológicausando coloración de hematoxilinay eosina (H&E).

2.6 Análisis estadístico

Se analizaron los resultados usando un análisis de varianza unilateral (ANOVA). Se considera la diferencia

entre grupos como estadísticamente significativasip es menor a 0.05.

3. Resultados y discusión

3.1 Síntesisdel complejo HA-SF

La Fig. 1A muestra los patrones XRD del complejoHA y HA-SF. Se identifican todos los picos típicos de

los planos de cristal, incluyendo (002), (211), (300), (202), (310), (222) y (213), delaHA en el espectro del

complejo HA-SF (verificadomediante el archivo JCPDS No.34-0010). En comparación con la HA pura

sintetizada bajo condiciones similares, la curva de difraccióndel HA-SF se amplía y una porción de los picos se

superpone. La anchura a media altura(FWHM) del plano (002) es de 0.385°, 0.278° para el HA-SF y la HA

pura, respectivamente, lo cual indica la cristalinidad relativamente baja de la HA en el complejo HA-SF [24].

Dicha cristalinidad baja podría favorecer la degradacióndel complejo HA-SF y promover la formación ósea.

En el análisis termogravimétrico (TGA, por sus siglas en inglés)del complejo HA-SF, la pérdida de peso

antes de aproximadamente 200oC, fue causada por la eliminación de agua libre o ligada, mientras que la pérdida de

peso a240 -700 oC fue el resultadode la descomposición térmica de la SF(Fig. 1B).


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Se puede estimar que el complejo HA-SF contenía alrededor de 12% de agua, 22% de SF, y 66% de HA,

respectivamente. La proporción de peso de HA a SF (66/22) fue similar a la proporción de peso de

mineral/orgánico del hueso humano (70/30) [25].

En el espectro de FTIR del complejo HA-SF, permanecen las bandas características de la SF a 1654 cm-1

(amida I), 1541 cm-1 (amida II) y 1239 cm-1 (amida III) (Fig. 1C). Sin embargo, ocurre un desplazamiento

notable en los picos debido a las interacciones molecularesentre el Ca2+en la HA y los grupos funcionales con

carga negativa tales como COO-y NH-de la SF [26]. Por ejemplo, la bandade amida II se desplaza de 1541 cm-

1a 1537 cm-1, mientras que la bandade amida III se desplaza de 1239 cm-1a 1228 cm-1. Al mismo tiempo,

aparece una nueva banda en 1634 cm-1debido a la absorciónde amida I en la conformación de hoja-P de la SF.

Morfológicamente, el complejo HA-SF presenta una apariencia de nano-cristalitos en forma de barras

uniformes con un diámetrode aproximadamente50 nm y una longitud de aproximadamente200 nm (Fig. 1D).

Esto es probablemente un resultado del efecto de regulación de la SF en la cristalización de la HA. La

presenciade la SF facilitó la cristalizaciónde la HA con un crecimiento orientado sobre el eje-c, dando como

resultado una estructura similar al hueso natural [12]. Aunque no existe evidencia directa, parece ser que una

porciónde la SF podría acumularse en los extremos de los nano-cristalitos (como lo indican las flechas en la

Fig. 1D). Es altamente probable que tales estructuras surgieran de las regiones amorfasde la SF, las cuales se

encontraban en conformación extendidaal mojarlas, pero que se agregaron al secarse.


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3.2 Preparaciónde los compuestos CPC/HA-SF/SF

La Fig. 2A muestra los espectros FTIR de los compuestos CPC/SF y CPC/HA-SF/SF. Las bandas a1454,

1422 y 874 cm-1se derivan a partir de CO32-, lo cual indica que los iones CO3

2- (sustitución de carbonato tipo-B)

reemplazaron parcialmente los iones PO43-en la HA. Por ende, los productos en secado tanto del CPC/SF como

del CPC/HA-SF/SF presentaron una HA con deficiencia de calcio (CDHA) [27]. En comparación con la HA, la

CDHA se degradamás rápido y es más similar en su composicióny estructura de cristalal mineral del hueso

natural, y por ende podría facilitar mejor el remodelado óseo [28]. Con la introduccióndel HA-SF en el CPC/SF,

las bandasde aproximadamente1536 cm-1 (amida II) y 1633 cm-1 (amida I en la conformación de hoja-ß de la SF)

se vuelven más fuertes.

La Fig. 2B muestra los patrones XRD de los compuestos CPC, CPC/SF, y CPC/HA-SF/SF, los cuales no

exhiben ninguna diferencia aparente entre sí y se pueden asignar al cristal HA. A juzgar por el FWHM, parece que

al complementar el CPC con SF redujo levemente la cristalinidadde su HA producido en el secado final, mientras

que complementarlo además con HA-SF ayudó a recuperar la pérdida de cristalinidad.

La Fig. 2C muestra la microestructurade la sección transversal de los especímenes CPC/SF y CPC/HA-

SF/SF. El CPC/SF consistede dominios formados por placas HA delgadas, y estos dominios están rodeados de

numerosas fibras en forma de barra con orientación aleatoria. En contraste, las barras HA al margen de los

dominios de la placa HA están orientados en el compuesto CPC/HA-SF/SF. Se cree que dicha orientación fina se

origina a partir de los aglomerados del complejo HA-SF [29]. Además, el análisis de espectroscopia dispersiva con

energía asociada a SEM (EDS) en el


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CPC/HA-SF/SF reveló una proporción Ca/P de 1.51 (no se muestran los datos), nuevamente indicando su

naturaleza deficiente de calcio.

3.3 Propiedades mecánicasy de manipulación de los compuestos CPC/HA-SF/SF

La fuerza compresivadel compuesto CPC/SF incrementó inicialmente de forma gradual al

complementarlo con HA-SF (Fig. 3A). Sin embargo, comenzó a disminuir cuando el contenido de HA-SF

excedió 3%. La mayor fuerza compresiva, 50.2±1.9 MPa, se logró cuando hubo 3% de HA-SF presente en el

compuesto. Esto fue un incremento notable (>50%) comparado con la fuerza compresivadel CPC/SF que no

contenía HA-SF (33.4±0.9 MPa). Además de esto, el modo de falla mayor de las muestras en las pruebas

compresivasfue de rompimiento axial para todos los compuestos que presentaban contenidos diferentes de HA-

SF (Fig. 3B). Esto implica que no hubo diferencia aparente en la macroporosidadde los especímenes [30].

La Fig. 4 muestra que el compuesto CPC/HA-SF/SF se podría inyectar fácilmente a través de una cánula

de KP. Con el incremento de HA-SF, los tiempos iniciales y finales de secado de los compuestos CPC/HA-

SF/SF se redujeron levemente (Tabla 1). Esta facilidad de inyección y reducción en los tiempos de secado

hacen viables los compuestos CPC/HA-SF/SF como materiales de relleno para VP/KP.

El refuerzo mecánicodel CPC/SF mediante un complejo HA-SF podría ser el resultado de los siguientes

mecanismos. En primer lugar, el complejo HA-SF, al ser un compuesto híbridoque contiene componentes tanto

orgánicos como inorgánicos, podría funcionar como un agente de acoplamiento para unir las fases CPC and SF que

de otra manera serían incompatibles. La integridad interfacial mejorada es propicia para las propiedades

mecánicasdel compuesto híbrido [18].


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Dicho mecanismo de refuerzo donde se mejora la adhesión interfacial mediante el uso de un complejo

inorgánico-orgánicose ha documentado adecuadamente en otros compuestos híbridos. Por ejemplo, cuando se

complementó el poli(L-lactida) (PLLA) con la misma cantidad de HA (porcentaje en peso de 4%), la HA sin

modificar causó una disminución en las propiedades mecánicas, mientras que la HA con injerto superficial de

PLLA (g-HA) resulto en propiedades mecánicas in considerablemente mejoradas [17]. En segundo lugar, el

complejo HA-SF mismo podría ayudar a mejorar la cristalinidadde la HA en el CPC al funcionar como semillas

de nucleación. Es bien sabido que la nucleación heterogénea es la causa del iniciode la cristalización [31]. Para

un CPC que contiene una pequeña cantidad de semillas de apatitatales como HA-SF, precipitarla

apatitapreferencialmente nucleadaalrededor de las semillas. Como resultado, ocurrió un crecimiento orientado, el

cual resultó en la fuerza mecánicaalta del compuesto CPC/HA-SF/SF. Sin embargo, una mayor concentraciónde

semillas HA limitó la tasa de disoluciónde TTCP o DCPA, posiblementemediante la formaciónde una capa de

HA en las partículas reactivas, y por ende debilitó la fuerza mecánicadel compuesto. Por tanto, existió un

contenido óptimo de HA-SF para el refuerzo de CPC/SF, el cual en este estudio fue de un porcentaje en peso

aproximado de 3%.

3.4 Biocompabilidadde los compuestos CPC/HA-SF/SF

En los ensayos MTT de las células MC3T3-E1, el valor OD para todas las muestras incrementó con el

tiempo de cultivo (Fig. 5). Además, los valores OD tanto para los gruposCPC/SF como para los grupos

CPC/HA-SF/SFson consistentemente mayores que aquellos del grupo de control (poliestireno de cultivo en

tejidos) a lo largo del transcurso completo del cultivo. Esto significa que todos los compuestos promovieron la

proliferaciónde células de tipo osteoblasto MC3T3-E1.


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Dicho fenómeno no es inesperado dado el hecho que tanto la SF como la HA son osteoconductivasy

promueven la proliferaciónde células osteoblásticas [11, 14, 21].La dureza moderada y la hidrofilicidade

hidrofobicidadbalanceadas de las superficies del compuesto también podrían considerarse de forma parcial para

esto [32, 33].

Tanto el CPC/SF como el CPC/HA-SF/SF no provocaron respuestas inflamatorias aparentes durante la

implantación subcutánea de 2 semanas en los ratones, lo cual se puede ver claramente a simple vista en los sitios

implantados (Fig. 6A). La evaluación histológicausando la coloración H&E reveló además una presencia muy

baja de células inflamatoriasen los tejidos circundantes (Fig. 6B). Juntas, tanto las pruebas in vitro como in vivo

confirmaron que los compuestos CPC/SF y CPC/HA-SF/SF tuvieron una biocompatibilidad decente.

4. Conclusiones

En este estudio, se sintetizó un complejo HA-SF uniforme mediante un método de co-precipitación. La

complementación de un compuesto CPC/SF con no más de 3% de porcentaje en peso de un complejo HA-SF

mejoró considerablemente su fuerza compresivaen una forma dependiente de contenido HA-SF. Sin embargo,

un incremento adicional de HA-SF debilitó el efecto de refuerzo mecánico. Dicho efecto de refuerzo del HA-

SF al CPC/SF fue posiblemente resultado de (a) una integridad interfacial mejorada entre los componentes

inorgánicos y orgánicoscon la incorporación del complejo HA-SF,y (b) la presencia de semillas de

nucleaciónlas cuales indujeron un crecimiento orientadode cristales HA. Junto con sus propiedades decentes de

manipulación y su biocompatibilidad, los compuestos CPC/HA-SF/SF presentan un buen potencial para

muchas aplicaciones clínicas, incluyendo servir como materiales de relleno para cirugías mínimamente

invasivaspara tratar fracturas vertebrales y otros defectos óseos.


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Agradecimientos

Este trabajo recibió el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturalesde China (81171479), La

Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (BK2011291), y el Programa Especial Provincial

de Jiangsu de Ciencia Médica (BL2012004).

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MANUSCRITO APROBADO

Inscripciones de las figuras

Fig. 1. Caracterizacionesdel complejo HA-SF. (A) Curvas de XRD del complejo HA y HA-SF. (B) Análisis

TGA del HA-SF complejo. (C) Espectros FTIR de (a) SF; (b) HA; (c) complejo HA-SF. (D)

ImagenSEM del complejo HA-SF. Las flechas amarillas indican posiblesregiones SF.

Fig. 2. Caracterizacionesdel compuesto CPC/HA-SF/SF. (A) Espectros FTIR de (a) CPC/SF; (b) CPC/HA-

SF/SF. (B) Curvas de XRD de (a) CPC; (b) CPC/SF; (c) CPC/HA-SF/SF. (C) Imágenes SEM de (a)

CPC/SF y (b) CPC/HA-SF/SF. Las imágenes fueron tomadas en la sección transversal de los

especímenes.

Fig. 3. Pruebas compresivas de los compuestos CPC/HA-SF/SF. (A) La fuerza compresivade los compuestos

CPC/HA-SF/SF como una funcióndel contenido HA-SF. (B) Fotografías de las muestras fracturadas

tras la prueba.

Fig. 4. Fotografías de la inyecciónde un compuesto CPC/HA-SF/SF que contiene un porcentaje en peso de 3%

de HA-SF a través de una cánula de Cifoplastia.

Fig. 5. Proliferaciónde células MC3T3-E1 en los compuestos CPC/SF y CPC/HA-SF/SF. Se cuantificó la

proliferaciónde células mediante el valor de densidad óptica (OD) en 490 nm usando un ensayo MTT.

Las células en el grupo de controlcrecieron en platos de poliestireno para cultivo de tejidos.

Fig. 6. Prueba in vivo de los compuestos CPC/SF y CPC/HA-SF/SF. (A) Fotografías de los

especímenesimplantados subcutáneamente en un ratón durante 2 semanas. (B) Coloración H&E de los

especímenes en tejidos circundantes.

MANUSCRITO APROBADO Fi

gura

1

MANUSCRITO APROBADO

Temperatura

Intensidad

Peso

Número de onda

Transmitancia


gura

2

MANUSCRITO APROBADO

Número de onda

Intensidad

Transmitancia


gura

3

MANUSCRITO APROBADO

Fuerza compresiva


gura

4

MANUSCRITO APROBADO


gura

5

MANUSCRITO APROBADO

Valor OD

Tiempo (día)


gura

6

MANUSCRITO APROBADO

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