MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS DE

Hospital P. Alberto Hurtado Gerencia de Calidad Página 1 de 105

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS DE

MICROBIOLOGÍA

Fecha entra vigencia Fecha última actualización

Nº de actualizaciones Fecha Próxima revisión

AÑO 2000 Noviembre 2011 3 Noviembre 2016

En este manual se describen los procedimientos técnicos de exámenes microbiológicos y de bioquímica de deposiciones ACTUALIZADO POR: Tecnólogos Médicos de Sección Microbiología Unidad de Laboratorio Clínico Médico Microbiólogo REVISADO POR: Médico Microbiólogo Gerencia de Calidad APROBADO POR

_______________________

TM Patricio Gavilán Jefe Unidad Laboratorio Clínico y Banco de Sangre

Hospital Padre Hurtado


INDICE MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE MICROBIOLOGÍA

N° Nombre procedimiento

1 Siembra de muestras para cultivos aeróbicos

2 Tinciones 1. Tinción de Gram 2. Tinción de Kinyou 3. Tinta china 4. Tinción violeta-bicarbonato 5. Leucocitos fecales 6. Tinción de azul de toluidina para Pneumocystis jiroveci

3 Métodos convencionales y rápidos de identificación de bacterias aerobias

4 Procedimiento de urocultivo

5 Coprocultivo

6 Hemocultivo Cultivo punta de catéter

7 Cultivos de líquidos estériles 1. LCR 2. L. peritoneodiálisis 3. Otros l. estériles (articular, pericárdico, ascítico, pleural, amniótico)

8 Cultivos de secreciones del aparato respiratorio superior 1. Ocular, conjuntival 2. Otica 3. Faríngea 4. De senos paranasales

9 Cultivos de secreciones del aparato respiratorio inferior 1. Expectoración 2. Aspirado endotraqueal 3. Lavado broncoalveolar

10 Cultivos de secreciones de piel y tejidos blandos 1. Secreción de herida, absceso, úlcera 2. Tejido (biopsia)

11 Cultivos de tejido óseo

12 Cultivos de secreciones intraabdominales

13 Cultivos de secreciones del aparato genital 1. Uretral 2. Endocervical 3. Secreción o flujo vaginal

14 Cultivos microbiológicos de insumos clínicos: 1. Hemoderivados 2. Nutrición parenteral

15 Procedimiento de estudio de susceptibilidad a antibióticos 1. Antibiograma por difusión 2. Antibiograma por E-test (difusión-dilución en agar) 3. Detección de betalactamasa 4. Estudio de betalactamasa de espectro extendido (BLEE)

16 Cultivos de bacterias anaerobias

17 Procedimientos técnicos de diagnóstico de parasitología clínica


1. Parasitológico seriado de deposiciones 2. Test de Graham 3. Gota gruesa 4. Acarotest 5. Tinción para Cryptosporidium (Ziehl Neelsen modificado)

18 Procedimientos técnicos de diagnóstico de micología clínica

19 Procedimiento técnico para el diagnóstico por inmunofluorescencia 1. Inmunofluorescencia para virus respiratorios 2. Inmunofluorescencia directa para Bordetella pertussis

20 Mètodos de detección de antígenos y anticuerpos en microbiología 1. Rotavirus 2. Detección de toxina de Clostridium difficile 3. Serología para Mycoplasma pneumoniae 4. Reacción de Widal

21 Procedimientos técnicos de exámenes bioquímicos en deposiciones 1. Test de Benedict 2. Test de Sudan 3. Test de guayaco o detección de hemorragias ocultas 4. Esteatocrito ácido


Nº 1. PROCEDIMIENTO DE SIEMBRA DE MUESTRAS PARA CULTIVOS AERÓBICOS

OBJETIVO Realizar el procedimiento de siembra de las muestras microbiológicas que se reciben en laboratorio para cultivos aeróbicos en forma correcta para obtener resultados confiables. Esto permite obtener colonias aisladas de microorganismos para proceder a su estudio (identificación y susceptibilidad si corresponde).

ALCANCE

Sección Microbiología, Servicio de Laboratorio. Técnicos Paramédicos, Tecnólogos Médicos y Médico Microbiólogo de Sección Microbiología. RESPONSABILIDAD

Tecnólogo Médico: Responsable de la evaluación del cultivo y supervisión del procedimiento de siembra. Técnico Paramédico: Responsable de la siembra de la muestra en los medios establecidos DEFINICIONES

Siembra: técnica de inoculación de las muestras clínicas en los correspondientes medios de cultivo para ser sometidos a incubación en las condiciones establecidas para cada tipo de muestra. Medio de cultivo: constituído por sustancia nutritivas que permiten el desarrollo de diferentes microorganismos de acuerdo a sus requerimientos. Pueden tener suplementos nutritivos e inhibidores. Se clasifican según estado físico (sólidos, líquidos y semisólidos), presentación (en placas o tubos) y contenido de nutrientes. Medios básicos: son la base para la preparación de otros medios, contienen los nutrientes esenciales, se desarrollan bacterias poco exigentes. Medios mejorados o enriquecidos: son los medios básicos a los que se les ha agregado sustancias de alto valor nutritivo (por ejemplo sangre, vitamina) favoreciendo el desarrollo de bacterias más exigentes. Medios selectivos: Medio al cual se le agrega un inhibidor que permite el desarrollo de solo ciertas bacterias, inhibiendo a otras ej. Agar MacConkey. Medios diferenciales: medios de cultivo que permiten diferenciar microorganismos porque ponen en evidencia características metabólicas. Ej: agar citrato, agar Mac Conkey DESARROLLO DEL PROCESO

Insumos: Medios de cultivos sólidos y/o líquidos de acuerdo a proceso a realizar, pipetas pasteur, asa de micrón, gradilla de tubos, portaobjetos, guantes, mascarillas Equipos: estufa de incubación de atmósfera normal y de CO2, mechero, gabinete bioseguridad, vórtex, centífuga Software: Omega Consideraciones generales:

Mantener durante todo el proceso las precauciones estándares Utilizar técnica aséptica Durante el proceso mantener ventanas cerradas Realizar con mechero encendido, 5 centímetros proporciona un área no contaminada Reunir todos los materiales necesarios para la siembra (placas, portaobjetos etc.) Mantener área de trabajo despejada y cómoda para realizar procesos (sólo con material necesario) Esterilizar las asas antes de usarlas y enfriarlas antes de tomar muestra. Entre cada placa siempre esterilizar el asa Marcar placas y porta objetos con el Nº de petición de la muestra antes de la siembra


Procedimiento:

1. Técnico paramédico de la sección de microbiología o urgencia (según el horario) es responsable de la recepción de la muestra, verificar el nombre en el frasco o tórula con la orden de examen, ingreso al sistema informático, e impresión de las etiquetas con códigos de barra correspondientes para cada muestra (según procedimiento de recepción y almacenamiento de muestras biológicas en el laboratorio Clínico, Manual de Toma de Muestras)

2. Prende el mechero, se coloca guantes de procedimiento y mascarilla. 3. Verifica nuevamente el nombre del paciente con la orden de trabajo. Revisa las placas y los tubos de medios

de cultivo que corresponde utilizar según el tipo de muestra, (revisar Tabla: Medios de cultivo para la siembra de muestras de microbiología (anexo 1) que se encuentra en área de siembra, frente a mechero.)

4. Etiqueta con los códigos de barra las placas, tubo con caldo y portaobjeto (en caso necesario). 5. El procesamiento de la muestra para su siembra dependerá del tipo de muestra y de cómo haya sido tomada,

a saber, en tórula, líquidos y secreciones en recipientes estériles y trozos de tejido

El principio general es siempre sembrar primero el (los) medio(s) de cultivo sólido, luego el medio de cultivo líquido y por último realizar frotis para tinción. Para determinar la secuencia en que deben ser sembrados los medios de cultivo, siempre de debe empezar por el medio menos selectivo, para seguir con el medianamente selectivo y al final el más selectivo. (ver secuencia en anexo 1, orden de izquierda a derecha).

6. A continuación se describe la técnica de siembra según el tipo de medio de cultivo y de muestra. Siembra en placa Se obtiene colonia aisladas por medio del arrastre y separación. Con el asa ya esterilizada, se toma una gota de líquido o de una emulsión del producto patológico y se deposita en un costado del agar de una placa Petri, se estría a partir de ese. En caso de muestras que se reciben en tórulas, se realiza con ésta la primera de las estrías procediendo después a diseminar con el asa o pipeta. a. Esterilización simple: Utilizada principalmente para la mayoría de las muestras. Se inocula en el primer cuadrante. Se esteriliza el asa sólo una vez y luego se disemina el 2º y 3er cuadrante. Si tiene varias placas, inocule primero en el primer cuadrante todas las placas y luego disemine. b. Esterilización doble: Utilizada principalmente para muestras con mucho inóculo bacteriano, como deposición. La diferencia radica en agregar una segunda esterilización del asa entre el 2° y 3° cuadrante. Si tiene varias placas que sembrar, inocule primero en el primer cuadrante de cada una de las placas y luego disemine con asa. Siembra en tubos de agar tendido El borde del tubo debe ser flameado antes y después de ser sembrado. Con el asa previamente esterilizada a la llama, se toma una pequeña cantidad de la muestra y se lleva al fondo del tubo, luego se estría suavemente la superficie del medio en forma ondulante. Antes de introducir el tubo a la estufa de cultivo, debe dejarse suelto el tapón de goma para evitar que los gases expulsen el tapón. Ejemplo Agar Sabouraud, Agar Citrato


Siembra en superficie y picadura El inóculo es introducido con el asa recta o pipeta pasteur hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado en hacer el mismo trayecto de entrada que de salida, se retira hacia la superficie inclinada del agar haciendo suavemente una estría ondulada. Debe flamearse el borde del tubo antes y después de la siembra. Antes de introducir el tubo a la estufa de cultivo debe soltarse el tapón de goma para evitar que los gases expulsen el tapón. Ejemplo Agar TSI, Agar LIA Siembra en profundidad El inoculo se introduce como una picadura en el medio de cultivo cuidando que sea de manera recta y central hasta el fondo del tubo. Se debe hacer el mismo trayecto de entrada y salida. Ejemplo agar MIO Siembra de inóculo longitudinalmente y diseminación con estría única Recuento de colonias por siembra de un inóculo conocido a lo largo de la placa y diseminado posteriormente. Usado principalmente para orina y otras muestras respiratorias como Lavado broncooalveolar (LBA). Un inóculo determinado se siembra con una línea que atraviesa longitudinalmente la placa (en el caso de orina ¼ o 1/6 de la placa) y luego se disemina el inóculo primario con una estría única. Siembra en medio liquido Al inocular un medio líquido, el tubo se inclina y el material se extrae del asa por frotamiento contra la pared del tubo, cuando éste se endereza el material se encuentra bajo la superficie del medio. Al inocular el medio líquido con tórula o con inóculo líquido se deposita este en el fondo del tubo. Debe flamearse la boca del tubo antes y después de efectuada la siembra. Antes de introducir el tubo a la estufa de cultivo debe soltarse el tapón de goma para evitar que los gases expulsen el tapón. Ejemplos: thioglicolato, caldo soya

7. El procedimiento específico de siembra para otras muestras se describe en los procedimientos


correspondientes (ej tejidos en Cultivos de secreciones de piel y tejidos blandos) REFERENCIAS

1. Instituto de salud Pública de Chile. Procedimientos técnicos de Laboratorio Clínico, Vol I: Bacteriología

General, Enterobacterias, Tuberculosis, Serología de la Sífilis. Santiago: 1994 2. Montiel F., Lam M. Procedimientos para realizar cultivos aeróbicos según la muestra. En: Manual de

Microbiología Clínica. Santiago: Publicaciones Técnicas Mediterráneo Ltda., 2001; 53-85 3. Isenberg H. Aerobic bacteriology. En: Essentials Procedures for clinical microbiology. Washinton D.C.: ASM

Press, 1998; 37-126 ANEXOS

Anexo nº 1: Tabla de Medios de cultivo para siembra de muestras de microbiología.


ANEXO Nº 1: MEDIOS DE CULTIVO PARA SIEMBRAS DE MICR OBIOLOGÍA Laboratorio Microbiología H. Padre Hurtado

Cromo agar

A. sangre atm normal

A. sangre en CO2

A chocolate en CO2

Th. Martin en CO2

Agar Mac Conkey

Caldo thioglicolato

Agar Sabouraud

*

Agar SS

Agar TCBS

Gram Ex. al fresco

ORINAS

COPROCULTIVO

ASPIRADO ENDOTRAQUEAL (solo UPC)

EXPECTORACION

LAVADO BRONCOALVEOLAR

INTRAABDOMINAL (COLECC INTRAABD., LIQ.PERITONEAL, BILIS)

LIQ. ASCITICO O PERITONEAL (NO TOMADOS EN PABELLON)

LIQ. ARTICULAR, SINOVIAL, BURSAL

LCR

LIQ. PERITONEO-DIALISIS

LIQ. PLEURAL, LIQ. PERICÁRDICO

PIEL

PRÓTESIS (ARTICULAR, VALVULAR, ETC)

PUNTA DE CATÉTER

SEC. FARINGEA

SEC. NASAL

SEC. SENOS PARANASALES

SEC. OCULAR, CONJUNTIVAL

SEC. OTICA

SEC. CERVICAL, ENDOCERVICAL

SEC. VAGINAL

SEC. URETRAL

TEJIDO ÓSEO y BLANDOS (Horario Hábil)

TEJIDO ÓSEO y BLANDOS (Horario Inhábil)

TRASPASO HEMOCULTIVOS Y LIQUIDOS. EN VIAL

�� SEMBRAR EN SABOURAUD SI SE SOLICITA CULTIVO HONGOS ADEMAS DE LAS INDICADAS EN TABLA


Nº 2. PROCEDIMIENTO TÉCNICO DE TINCIONES DE MICROBIOLOGÍA

OBJETIVO

Realizar técnicas que requieren tinciones simples y diferenciales para el estudio microscópico de las muestras clínicas y aislamientos microbiológicos de acuerdo a métodos estandarizados para un adecuado diagnóstico microbiológico. En este Procedimiento se incluyen las Técnicas de ejecución de los siguientes exámenes: Tinción de Gram Tinción de Kinyou Tinta china Tinción violeta-bicarbonato Leucocitos fecales Tinción de azul de toluidina para Pneumocystis jiroveci La tinción de Ziehl Neelsen modificado para Cryptosporidium y Examen de gota gruesa están incluídos en procedimiento nº 17: P. Técnicos de diagnóstico de parasitología clínica de este manual. La tinción con KOH para hongos está incluída en procedimiento n° 18: P. Técnico de diagnóstico de micología clínica. ALCANCE

Tecnólogos Médicos, Técnicos Paramédicos y Médico Microbiólogo de Sección Microbiología y Sección Urgencia (Tinción de Gram), Servicio de Laboratorio. RESPONSABILIDAD

Tecnólogo Médico: Responsable de la lectura, interpretación y de la validación del informe. Auxiliar paramédico: Responsable de la realización de extendido, fijación y tinciones (excepto tinta china, Azul de toluidina para P. jiroveci y examen de gota gruesa que son realizados por TM) DESARROLLO DEL PROCESO

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La

principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativameute (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán. Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el ácido tánìco. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía, son suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células


bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe. La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas. Los métodos de tinción son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaución, ya que pueden conducir a errores. Las moléculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente. 1 TINCION DE GRAM − Hacer extendido, fijar a temperatura ambiente o calor suave − Colorear con cristal violeta al 1% o violeta genciana durante 60 segundos, cuidando que el colorante cubra toda la

preparación. − Eliminar el exceso de colorante y lavar rápidamente con un chorro suave de agua, manteniendo la lámina en

posición inclinada. − Cubrir la preparación con la solución de lugol (mordiente), dejándola actuar durante 60 segundos. Lavar

nuevamente con agua. − Decolorar con alcohol - acetona (mezcla 1: 1) durante 10 segundos. − Lavar con agua − Colorear con el colorante de contraste que es la safranina durante 30 segundos. − Lavar con agua, secar y observar al microscopio utilizando el objetivo de inmersión. − Las bacterias que retienen el colorante se denominan GRAM POSITIVAS y se observan de color AZUL − Las bacterias que se decoloran con el alcohol – acetona y se tiñen con la safranina se denominan GRAM

NEGATIVAS y se observan de color ROSADO. − La fase de decoloración con alcohol- acetona constituye la etapa más importante de la tinción de Gram y en ella

reside su carácter diferencial.

Gram Positivo Gram Negativo 2 TINCION DE KINYOU Se utiliza para diferenciar entre Actinomyces y Nocardia Técnica: − Hacer frotis, dejar secar a temperatura ambiente. − Cubrir la lamina con carbol-fucsina durante 3 minutos (no calentar) − Lavar y decolorar con agente decolorante durante 5 - 10 segundos. − Colocar azul de metileno como contraste por 30 segundos − Lavar con agua


− Secar − Interpretación: Es positivo cuando se tiñe rosa fuerte (Nocardia) − Es negativo cuando se tiñe azul (Actinomyces)

3 TINCION DE TINTA CHINA PARA Cryptococcus neoformans Tinción negativa o tinción de tinta china, que tiñe toda la preparación excepto la cápsula y permite hacer un diagnóstico presuntivo de criptococosis. La ejecución de este examen es responsabilidad del Tecnólogo Médico − Se realiza a partir del sedimento del LCR, tras centrifugación, colocando en un portaobjetos una gota de sedimento

y otra de tinta china comercial − Mezclar y poner un cubreobjetos − Observar al microscopio optico con objetivo 40x. Hay que examinar el porta completo. La sensibilidad de la tinción

oscila entre el 25-50% en los casos de meningitis, aunque en los pacientes con sida puede ser mayor. Pueden producirse falsos resultados positivos en presencia de levaduras de los géneros Rhodotorula y Candida, de otras especies de criptococos, Klebsiella pneumoniae, así como por artefactos. Es importante diferenciar bien la célula con doble pared refringente, con su cápsula, y hay que buscar células en fase de gemación. La técnica requiere personal entrenado y siempre hay que confirmar este diagnóstico inicial con el cultivo.

4 TINCION VIOLETA – BICARBONATO

Tinción utilizada para detectar la presencia de Campylobacter sp. - Se realiza un extendido de la muestra de deposición (idealmente muestra fresca). - Luego es teñido con partes iguales de Cristal Violeta y Bicarbonato de Sodio al 1%, durante uno a dos minutos. - Luego las láminas se leen con aumento de 100x y se considera positiva la presencia Bacilos Gram Negativos

de formas espirilares o semejantes a gaviotas. Se informa como “Se observa morfología sugerente de Campylobacter”.

- Si después de revisar 50 campos no se observan estas formas espirilares, se considera negativa.

5 LEUCOCITOS FECALES

5.1 OBJETIVOS: Diferenciar una diarrea infecciosa de tipo no inflamatorio (enterotoxina) de una diarrea de tipo inflamatoria (citotoxina). 5.2 FUNDAMENTO: La Tinción con Azul de Metileno, se usa en la búsqueda de leucocitos fecales, la cual permite una buena tinción de los núcleos de estas células (polimorfonucleares), y de esta manera se pueden visualizar al microscopio. 5.3 MATERIALES E INSUMOS • Frasco plástico de tapa rosca, debe estar limpio no necesariamente estéril • Laminas portaobjetos desengrasados • Tinción de azul de metileno • Cubreobjetos. 5.4 INSTRUMENTACION O EQUIPOS Y ACCESORIOS: Microscopio binocular con lentes objetivos 40x, 50x y 100x. 5.5 DESARROLLO DEL PROCESO


• En la recepción de la muestra se debe revisar que venga identificada con nombre y dos apellidos del paciente, los cuales deben coincidir con la orden, además la muestra debe corresponder con el tipo de examen solicitado.

• Una vez que el paramédico chequea la muestra debe procesarla, teniendo en cuenta medidas de bioseguridad: uso de guantes.

• La muestra se extiende en una lámina portaobjeto en forma circular en el centro de ésta. • Debe secarse a temperatura ambiente antes de ser teñida. • Luego, se tiñe con Azul de Metileno por tres minutos. • Para eliminar el exceso de colorante se lava con agua. • Dejar secar a temperatura ambiente por tres minutos. • La lámina con la preparación se lee al microscopio óptico con lentes de inmersión 50x o 100x. � Preparación al fresco:

- Se efectúa cuando la deposición es demasiado acuosa. - Se prepara entre lámina y laminilla, colocando 2 a 3 gotas de la deposición en un portaobjeto. - Agregar una gota de Azul de Metileno. - Colocar el cubreobjeto y mantener en una cámara húmeda (placa de petri) - Leer en microscopio óptico con objetivo 40x - Informar si hay presencia de leucocitos a también de glóbulos rojos, estimando la cantidad.

5.6 INFORME • Si el resultado es negativo debe informarse: “leucocitos fecales negativo” • Si el resultado es positivo debe informarse:

- Más de 25 por campo, visto con objetivo de 40x: leucocitos fecales abundantes - Menos de 25 por campo, visto con objetivo de 40x: leucocitos fecales regular cantidad. - Si hay uno que otro por campo, visto con objetivo de 40x: leucocitos fecales escasos

En el caso que se observe con lente de inmersión 50x, el informe es similar. Para registro interno del laboratorio se cuantifica en cruces, es decir, +, ++ y +++ para escaso, regular cantidad y abundantes respectivamente.

5.7 REGISTROS: Se ingresa el resultado al sistema informático.

6 TINCIÓN DE AZUL DE TOLUIDINA PARA PNEUMOCYSTIS JIROVECI 6.1 OBJETIVO: Identificar quistes o trofozoítos de Pneumocystis jiroveci (ex Pneumocystis carinii) en muestras de lavado broncoalveolar (y otras) con el objetivo de ayudar en el diagnóstico diferencial de neumopatías en pacientes inmunodeprimidos. 6.2 FUNDAMENTO:

El diagnóstico se basa en la demostración de la presencia del microorganismo en muestras de origen pulmonar o tejido pulmonar, principalmente se usa el lavado bronqueoalveolar, también pueden ser expectoraciones, muestras de cepillado transtraqueal y cepillado bronquial.

Se utilizan diferentes técnicas tintoriales, tales como: Azul de Toluidina O, Naranja de Acridina, Metenamina Argéntica de Gomori. En este laboratorio de parasitología se utiliza la tinción de Azul de Toluidina; es la tinción con colorante canónico más utilizada, sus efectos metacromáticos son fácilmente obtenidos y es una técnica muy sensible. 6.3 MATERIALES E INSUMOS

• Reactivos - Reactivo de Sulfatación: Acido Acético Glacial Acido sulfúrico concentrado - Solución de Tinción de Azul de Toluidina O: Azul de Toluidina O Acido Clorhídrico concentrado Alcohol Etílico al 100%

Tinción preparada según instructivo de tinciones

• Materiales: Coplin, portaobjetos, pipetas graduadas, pipetas Pasteur, mascarilla, guantes, aceite de inmersión

6.4 INSTRUMENTOS O EQUIPOS Y ACCESORIO


• Microscopio de luz con aumento objetivo 40x y 100x • Centrifuga

6.5 REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA Y PACIENTE Lavado broncoalveolar: Es la muestra ideal. Se debe tomar en un tubo cónico de tapa rosca, el cual debe ser estéril.

Cantidad mínima requerida 2 ml.

6.6 DESARROLLO DEL PROCESO 6.6.1 Procesamiento de la muestra:

Tipo de muestra: Lavado Broncoalveolar. • Primero se debe verificar que los datos del paciente en la muestra coincidan con los de la orden. • centrifugar la muestra a 2000 r.p.m por 5 minutos. • Eliminar el sobrenadante. • Luego realizar 4 frotis del sedimento, extendiendo la muestra en forma circular en el extremo de un portaobjeto

previamente identificado. • Dejar secar a temperatura ambiente (no secar en estufa). • De los cuatro frotis realizados, dos se tiñen y los otros dos se guardan como respaldo. • Una vez secado teñir.

Tipo de muestra: Expectoración. • La expectoración primero debe ser fluidificada Reactivos para fluidificar: - Ditiotreitol 1 gr/ lt, se debe mantener refrigerado a 4° C - Buffer fosfato pH 7,2 Técnica de fluidificación: - La muestra de expectoración debe tomarse en recipiente estéril - Colocar 2 a 3 ml de expectoración en un tubo estéril. - Agregar igual cantidad de Ditiotreitol 1 gr/lt. - Agitar vigorosamente en un vortex, hasta disolver la expectoración. - Incubar por 5 a 10 minutos a 37°C o 15 minutos a temperatura ambiente. - Agregue Buffer Fosfato pH 7.2 al tubo. - Centrifugar a 4000 r.p.m por 5 minutos. - Extraer el sobrenadante y dejar un pellet de 0.5 ml. - Tomar una gota del sedimento y extender en forma circular en portaobjeto. - Se deben realizar 4 frotis, de los cuales dos se tiñen y los otros se guardan. - Dejar secar a temperatura ambiente. - Teñir según técnica. 6.6.2 Procedimiento de tinción: - Colocar la(s) lamina(s) a teñir en el coplin que contiene el reactivo de sulfatación por 10 minutos. - Lavar bien con agua corriente, suavemente. - Dejar escurrir - Colocar la(s) lámina(s) con solución de Azul de Toluidina por 10 minutos. - Lavar bien con agua corriente, suavemente - Colocar en alcohol isopropílico por 1 segundo y dejar secar. - Montar - Leer las preparaciones con objetivo de 100x en forma ordenada y sistemática (Ver anexo 5) 6.7 INFORME • Si el resultado es negativo, se informa:

No se observan Quistes de Pneumocystis jiroveci Tinción: Azul de Toluidina O • Si el Resultado es positivo, se informa:

Se observan quistes de Pneumocystis jiroveci


Tinción: Azul de Toluidina O 6.8 RESPONSABILIDAD El procesamiento de muestras, lectura, interpretación e informe es responsabilidad del TM

REFERENCIAS

• Witebsky F. et all. Modified toluidine blue O stain for Pneumocystis carinii: further evaluation of some technical

factor. J. Clin microbiol 26:774-775. 1988 • Gosey L. et all. Advantages of modified toluidine blue O stain and bronchoalveolar lavage for the diagnosis

pneumocystis carinni pneumonia. J Clin Microbiol. 22: 803-807.1985. ANEXOS

Anexo : Quistes de Pneumocystis jiroveci


Nº 3. PROCEDIMIENTO TÉCNICO DE MÉTODOS CONVENCIONALES Y RÁPIDOS DE IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS AEROBIAS

OBJETIVO Realizar los procedimientos de identificación de bacterias de acuerdo a métodos estandarizados para obtener resultados confiables y reproducibles, que permitan identificar los agentes bacterianos obtenidos a partir de cultivos de muestras clínicas. QUIENES DEBEN APLICARLA Sección Microbiología, Servicio de Laboratorio. Técnicos Paramédicos, Tecnólogos Médicos y Médico Microbiólogo de Sección Microbiología. RESPONSABILIDADES Tecnólogo Médico: Responsable de la ejecución, lectura e interpretación de las técnicas para identificación de microorganismos obtenidos de las muestras clínicas, y de la validación del informe. Recepción, control de calidad de los medios de cultivos empleados en identificación. Técnico paramédico: Responsable de almacenamiento de los medios. MATERIALES, EQUIPOS Y SOFTWARE 1. Materiales:

• medios de cultivo diferenciales ( agar citrato, agar LIA, agar TSI, agar urea, agar MIO, agar cromógeno para orina, agar DNAsa, agar telurito, agar NaCl 6,5%, agar bilis esculina, etc)

• reactivos (reactivo de Kovacs, reactivo para Voges-Proskauer, reactivo para rojo metilo, tabletas diagnósticas con azúcares u otros sustratos, peróxido de hidrógeno, plasma para coagulasa, oxidasa, etc)

• técnicas de aglutinación por látex y serologías para identificación (kit serología para Streptococcus, látex para Staphylococcus aureus, etc)

• kit de identificación para bacilos gram negativos, Neisserias spp y bacilos gram negativos fastidiosos, cocos gram positivos.

2. Equipos: estufa de incubación, refrigerador, vórtex, mechero. 3. Software: Omega


DESARROLLO DEL PROCEDIMIENTO

Se entiende por identificación bacteriana al conjunto de técnicas y procedimientos que se aplican para establecer la identidad de un microorganismo. Métodos utilizados para la identificación microbiana:

1. Métodos basados en criterios morfológicos (estructurales) 2. Métodos basados en tinción diferencial 3. Métodos basados en pruebas bioquímicas 4. Métodos basados en pruebas serológicas

En la mayoría de los casos la identificación se realiza con la combinación de más de un método.

1. Métodos basados en criterios morfológicos:

Los rasgos morfológicos (estructurales) han ayudado a los taxonomistas por muchos años a clasificar organismos, pero con respecto a los microorganismos, éstos lucen bajo el microcoscopio tan similares que se dificulta su clasificación. Es decir, que estos microorganismos que se ven tan parecidos bajo un microscopio, pueden diferir en propiedades bioquímicas, fisiológicas y/o serológicas. Sin embargo, aun cuando la morfología celular dice poco sobre las relaciones filogenéticas, sigue siendo útil para la identificación bacteriana. Por ejemplo: la presencia de endosporas y su localización resulta de mucha utilidad en la identificación de bacilos esporulados.

2. Métodos basados en tinción diferencial:

Es posible sacar conclusiones en relación con la morfología de una bacteria, examinando una lámina que fue sometida a un proceso de tinción diferencial. Estos criterios morfológicos encabezan las primeras etapas del proceso de identificación bacteriana. La mayoría de las bacterias, teñidas con Gram, las podemos clasificar como gram positivas o gram negativas. Otras tinciones diferenciales, como la ácido resistente, se aplican a algunos tipos de bacterias, como por ejemplo micobacterias.

Los procedimientos de tinción que nos permiten aplicar los métodos 1 y 2, están descritos en Procedimiento nº

2: PT de tinciones de microbiología de este manual. 3. Métodos basados en pruebas bioquímicas:

Las pruebas bioquímicas han sido ampliamente utilizadas para diferenciar bacterias. Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el microorganismo es capaz de fermentar azúcares, la presencia de enzimas, la degradación de compuestos, la producción de compuestos coloreados, etc. Aun bacterias estrechamente relacionadas pueden separarse en dos especies diferentes en base a pruebas bioquímicas. Por ejemplo: las bacterias de familia Enterobacteriaceae.

4. Métodos basados en pruebas serológicas:

Son los métodos que utilizan anticuerpos específicos dirigidos contra antígenos de los microorganismos a identificar. Los más utilizados son aquellos en los anticuerpos están fijados a partículas de látex (test de aglutinación por látex) En nuestro laboratorio se emplean:

- Kit de aglutinación por látex para Streptococcus - Kit de aglutinación por látex para Staphylococcus aureus - Antisueros para Salmonella - Antisueros para Shigella - Antisueros para Yersinia enterocolítica - Antisueros para E coli O26, O111, O157

Técnicas a realizar según indicaciones del fabricante A continuación se detallan una serie de pruebas bioquímicas que se realizan en el laboratorio para la

identificación bacteriana:

• Catalasa: - Esta prueba se emplea para diferenciar el género Staphylococcus (catalasa positiva) del género

Streptococcus (catalasa negativa) y también en otros tipos bacterianos puede ser de utilidad (ej bacilos


gram positivos) - Prueba en portaobjeto: Transferir células bacterianas desde el centro de una colonia bien aislada a la

superficie de un portaobjeto de vidrio con una pipeta Pasteur. - Agregar una o dos gotas de peróxido de hidrógeno al 30 %. - La rápida aparición y sostenida producción de burbujas de gas o efervescencia constituyen un resultado

positivo. - Precauciones: Si la colonia a estudiar esta sembrada en un medio con sangre debe tenerse la precaución

de no arrastrar medio, pues los glóbulos rojos allí contenidos darían una reacción positiva falsa. Los cultivos para esta prueba deben ser de 18 a 24 horas, ya que colonias más viejas pueden perder su actividad, dando una reacción negativa falsa.

• Coagulasa:

- Esta prueba permite diferenciar Staphylococcus aureus (coagulasa positiva) del resto de especies de Staphylococcus que son coagulasa negativas.

- Se puede realizar de dos maneras: técnica en portaobjeto (coagulasa ligada) y la técnica en tubo (coagulasa libre)

- Prueba en tubo: En un tubo de Khan agregar 0.5 ml de una mezcla de plasma citratado más caldo soya tripticasa en proporción 1:1, resuspender una colonia aislada hasta una turbidez visible, incubar a 37°C durante 3 horas.

- Una prueba positiva está dada por la formación de un coágulo que no puede ser resuspendido por agitación. En caso de ser negativo (el medio continúa líquido) incubar hasta las 24 horas, ya que algunas cepas requieren tiempo prolongado de incubación.

- Prueba en portaobjetos: Preparar una suspensión densa de una colonia aislada en una gota de agua destilada o solución salina estéril situada en un portaobjeto, añadir una gota de plasma citratado, mezclar suavemente con un asa y observar si aparecen grumos (prueba positiva).

• DNAsa:

- Esta prueba permite identificar algunas bacterias (gram positivas o gram negativas), que poseen esta enzima extracelular, como es el caso de Staphylococcus aureus el cual es Dnasa positiva.

- Se realiza en una placa de medio sólido en la cual se ha incorporado el DNA, con un indicador (azul de toluidina o verde de metilo)

- Para realizar esta prueba se debe inocular una colonia sospechosa en una estría de aproximadamente 2 centímetros en la placa de agar DNAsa (Esto permite probar en la placa varios cultivos), incubar a 37° C por 24 horas (depende del tipo bacteriano a estudiar).

- Una prueba positiva está dada por la aparición de un halo transparente alrededor de la zona inoculada.

• Sensibilidad a Bacitracina - Esta prueba permite identificar presuntivamente a Streptococcus Beta hemolítico Grupo A

(Streptococcus pyogenes). - Para esta prueba se utiliza un sensidisco de Bacitracina de 0.04 unidades. - Se recomienda usar un inóculo puro abundante de la colonia sospechosa (beta hemolítica), a partir de un

caldo soya tripticasa con unas 6 horas de incubación. - Sembrar en césped sobre una placa de agar sangre de cordero y depositar el sensidisco. - Incubar la placa a 37°C en una atmósfera de CO2 durante toda la noche. - Cualquier tamaño de halo de inhibición indica prueba positiva, es decir, corresponde presuntivamente a

Streptococcus pyogenes, ya que son sensibles a la Bacitracina.

• Test de Camp - Este Test permite identificar a Streptococcus beta hemolítico del grupo B (Streptococcus agalactiae),

también a Listeria monocytogenes y algunas especies de Corynebacterium. - Para realizar este test se debe disponer de una cepa de Staphylococcus aureus productor de una

betalisina - Se debe trazar una franja del Streptococcus en estudio en forma perpendicular a una franja del

Staphylococcus aureus productor de betalisina, sin tocarla, es decir, se debe tener 1 cm de distancia entre ambas trazas. Todo esto sobre una placa de agar sangre de cordero.

- Incubar 18-24 horas a 37° C en atmósfera de 5-10% CO2.


- Los estreptococos del grupo B y otras bacterias que dan este test positivo producen una sustancia (Factor de CAMP) que agranda la zona de hemólisis producida por el estafilococo, para formar una típica cabeza o punta de flecha en la unión de ambos microorganismos (Test de CAMP positivo).

• Sensibilidad a Optoquina

- Esta prueba permite identificar a Streptococcus pneumoniae (diagnóstico presuntivo) - Seleccionar 4 - 6 colonias sospechosas y sembrar en césped directamente en un sector de una placa de

agar sangre o agar sangre Mueller Hinton. - Colocar el disco de Optoquina (etilhidrocupreina 7mm), luego incubar en una atmósfera de CO2 por 24

horas para estimular el desarrollo bacteriano. Leer el halo de inhibición, si este mide 14 o más milímetros corresponde a Streptococcus pneumoniae (diagnóstico presuntivo)

• Sensibilidad a Novobiocina - Esta prueba permite diferenciar a Staphylococcus saprophyticus de los demás Staphylococcus coagulasa

negativos. - La técnica consiste en hacer un inóculo de la colonia sospechosa a una turbidez de 0.5 Mac Farland,

después se debe sembrar a modo césped en una placa de agar Mueller Hinton, posteriormente colocar el sensidisco de Novobiocina (5 ug) e incubar por 18 horas a 37° C.

- Si el halo del sensidisco es menor de 5mm la bacteria es resistente. - Si el halo del sensidisco es mayor de 6mm la bacteria es sensible. - Staphylococcus saprophyticus es resistente a la Novobiocina.

• Test de bilis Esculina - Este test diferencia entre estreptococos grupo D y no grupo D. También tiene otras aplicaciones. - Se debe disponer del medio bilis esculina tendido en tubos, el cual es de un color amarillento claro - El medio debe ser inoculado en forma de estrías o picadura con una o tres colonias sospechosas. - Incubar a 37° C por 24 a 48 horas a atmósfera normal. - Reacción positiva: el medio se pone color negro (estreptococos grupo D) - Reacción negativa: no hay aparición de coloración negra.

• Prueba de tolerancia a la sal

- Permite evaluar la tolerancia a la sal de los Streptococcus bilis esculina positivo y otros Gram positivos (Aerococcus, Pediococcus y Staphylococcus. Dentro de los estreptococos grupo D, diferencia Enterococcus spp de verdadero Streptococcus grupo D.

- Se requiere de un medio de cultivo hipertónico que contiene 6.5% de cloruro de sodio, glucosa y púrpura de bromocresol como indicador.

- Se debe inocular dos o tres colonias de estreptococos en un tubo del medio de cultivo - Incubar el tubo de 24 - 48 horas a 37° C en atmósfera aeróbica. - Los estreptococcos grupo D enterococo producen un viraje del indicador del púrpura al amarillo, por lo

tanto, son tolerantes a la sal.

• Prueba de Voges-Proskauer - El Test Voges-Proskauer se usa en la diferenciación de bacterias de la familia Enterobacteriaceae y

también para diferenciar bacterias del grupo Streptococcus. - Preparar una suspensión bacteriana en 0.25ml de cloruro de sodio (0.9%) en un tubo de Khan - Agregar una tableta diagnóstica para VP y tapar el tubo con tapón de goma o algodón. - Incubar a 35-37°C por 4 horas - Leer la reacción agregando 2 gotas de solución de alpha-naphthol (5% en etanol) y después agregar una

gota de Hidróxido de potasio (KOH) al 40% y mezclar. - Incubar 5 minutos a temperatura ambiente. - Reacción positiva: color rojo o rosado - Reacción negativa: no hay cambio de color

• Oxidasa: - Esta prueba se utiliza para la identificación de la enzima citocromoxidasa presente en algunas bacterias


- La prueba se lleva a cabo por medio de dos métodos; uno de ellos es con un trozo de papel filtro o toalla de papel la cual se impregna con gotas del reactivo tetrametil-p-fenilendiamina, previamente preparado con agua destilada, una vez impregnado se debe inocular una colonia de la cepa en estudio en el papel.

- Otro método que se utiliza es con tiras reactivas comerciales en las cuales va impregnado el reactivo, las cuales deben ser inoculadas con la colonia a estudiar.

- Las colonias bacterianas que tienen actividad de citocromoxidasa (oxidasa positiva) desarollan un color azul oscuro en el sitio de la inoculación en 10 segundos.

- Las colonias oxidasa negativa no producen color.

• Factores de crecimiento X y V - La determinación de los requerimientos de los factores de crecimiento V (NAD) y X (hemina) permite

diferenciar distintas especies de Haemophilus, principalmente H. influenzae y H. parainfluenzae. - Preparar una suspensión de la cepa en estudio en caldo Mueller Hinton o caldo infusión cerebro corazón

con una turbidez 0.5 Mac Farland. - Sembrar con tórula a modo de césped sobre una placa da agar Mueller Hinton y colocar los discos que

están impregnados con los factores correspondientes (X, V, X+ V), la distancia entre los factores X y V en la placa debe ser de 2 cm; el factor X+V debe estar más separado de los anteriores.

- Incubar a 37°C, 18-24 horas, en 5-10% de CO2. - Observar el halo de crecimiento alrededor de los discos. - Si se observa solamente crecimiento alrededor del disco X+V corresponde a Haemophilus influenzae. - Si se observa crecimiento alrededor de los discos V y X+V corresponde a Haemophilus parainfluenzae.

• Test de fermentación de azúcares - El test de fermentación de azúcares se realiza mediante tabletas diagnósticas que contienen el azúcar

especifico (glucosa, sacarosa, maltosa, arabinosa, fructosa etc.), el cual es ocupado por algunas bacterias como por ejemplo: Neisseria gonorrhoeae.

- La técnica consiste: preparar una densa suspensión bacteriana en 0.25 ml de suero fisiológico en un tubo de khan.

- Agregar al tubo la tableta diagnostica del azúcar que se quiere probar. - Incubar a 37°C por 4 horas o durante toda la noche (ver instrucciones del fabricante). - La reacción positiva se caracteriza por el viraje del color rojo (indicador rojo fenol) a amarillo. - En la reacción negativa no hay cambio de color.

• Prueba de O/F (oxidación y fermentación): - Se usa el medio básico de Hugh y Leifson con un pH de 7,1. Es un medio semisólido de color verde que

se inocula por picadura. Contiene carbohidratos como: glucosa, lactosa, sacarosa o maltosa al 10%. Como indicador de pH tiene Azul de Bromotimol.

- Se inoculan los dos tubos con la bacteria por picadura. - Uno de los tubos queda sin aceite y otro con aceite o vaselina sellándolo. Se incuban a 37°C por 24

horas. - Se lee la reacción según siguiente tabla:

Tipo de Metabolismo Tubo abierto ( sin vaselina )

Tubo cerrado ( con vaselina )

Oxidador fermentador Amarillo Amarillo

Oxidativo ( BGN NF )

Amarillo en superficie Verde ( sin viraje )

Inactivo Verde ( sin viraje ) Verde ( sin viraje )


• Medio M.I.O. ( Motilidad – Indol – Ornitina) El medio de Motilidad – Indol – Ornitina (M.I.O.) es un medio de cultivo ampliamente utilizado para la diferenciación de bacilos Gram negativos entéricos, sobre la base de la producción de Indol, la actividad de la enzima ornitina descarboxilasa y la capacidad de motilidad. Las peptonas y el extracto de levadura aportan aminoácidos y nutrientes esenciales, la dextrosa constituye una fuente de energía. El agar actúa como agente gelificante. Los cambios en el pH se verifican gracias al indicador púrpura de bromocresol. La actividad de la ornitina descarboxilasa se observa como un viraje hacia el color púrpura, en tanto que la ausencia de la enzima produce un viraje hacia color amarillo. La motilidad se observa como un desplazamiento del desarrollo microbiano desde el inóculo. Se deben observar estas características antes de efectuar la evaluación del indol. La producción de indol se verifica mediante la adición de algunas gotas de reactivo de Kovacs en la superficie del medio de cultivo. La producción de un compuesto color rojo fucsia es considerado como Indol positivo. - Inoculación: sembrar las muestras mediante una picadura vertical y profunda en centro del tubo. Incubar

por 24 horas a 37°C. - Lectura e interpretación de Resultados: una vez completado el periodo de incubación, observar motilidad y

actividad de ornitina decarboxilasa, y luego realizar la prueba del Indol. a. Motilidad:

- Resultado positivo: presencia de desarrollo microbiano que se observa como enturbiamiento del medio de cultivo en todo el tubo, o desplazado fuera de la picadura de inoculación.

- Resultado negativo: el desarrollo microbiano esta restringido solo en el trayecto de la picadura de inoculación.

b. Ornitina descarboxilasa: - Resultado positivo: se verifica como alcalinización del medio de cultivo con un viraje hacia el púrpura. - Resultado negativo: se observa acidificación con viraje hacia amarillo o no se observan cambios

significativos en el pH. c. Producción de indol: Agregar 3 a 4 gotas de Reactivo de Kovacs sobre la superficie del medio de cultivo y agite cuidadosamente.

- Resultado positivo: producción de un anillo de color rojo fucsia. Cualquier indicio de color es considerado positivo.

- Resultado negativo: producción de un anillo de color amarillo. • Citrato

- El agar citrato de Simmons es un medio diferencial utilizado para el estudio de bacilos Gram negativos entéricos, sobre la base de la utilización del citrato como una fuente de carbono, y la utilización de sales de amonio inorgánico como única fuente de nitrógeno. Estas reacciones metabólicas son dependientes del aporte de oxígeno. - El sulfato de magnesio aporta cofactor magnesio para diversas reacciones enzimáticas, en tanto que el fosfato de potasico actúa como agente tamponante. Los cambios en pH se verifican gracias al indicador azul de bromotimol. - Inoculación: sembrar las muestras mediante estría en superficie. El aporte de oxigeno es fundamental para observar una buena reacción positiva, para mejorar los resultados se puede cambiar el tapón de goma por algodón cardé. Incubar por 24 horas a 37° C. - Lectura e interpretación de Resultados:

Una vez completado el período de incubación, observar el desarrollo de colonias en la superficie del agar y el viraje de pH por alcalinización, de verde a azul. - Resultado positivo: solamente los microorganismos que pueden utilizar el citrato como fuente de carbono presentarán desarrollo. El medio cambiará de verde a azul. - Resultado negativo: no se observará desarrollo ni cambios en el color

• Ureasa

- El agar urea de Christensen es un medio de cultivo ampliamente utilizado para la identificación de bacilos Gram negativos entéricos sobre la base de la degradación de urea en amonio. Esta cualidad es propia de bacterias del género Proteus, Morganella, Providencia y también puede verificarse en otras como Klebsiella spp. Bordetella spp. y Brucella spp. - Los cambios en el pH se verifican gracias al contenido de rojo de fenol: la producción de ácido se ve como


cambio del color de rojo anaranjado a amarillo, en tanto que la alcalinización se observa como viraje hacia el rojo fucsia. El valor del pH se eleva cuando existe degradación de la urea y producción de amonio. - Inoculación: sembrar abundantemente las cepas mediante estría en la superficie tendida. - Incubar por 24 horas a 37° C. - Lectura e interpretación de Resultados:

Una vez completado el período de incubación, se debe observar el desarrollo microbiano en la superficie tendida y el viraje de pH por alcalinización a rojo fucsia.

-Resultado positivo: Degradación de la urea, desarrollo y viraje del indicador de pH a color rojo fucsia. -Resultado negativo: medio de cultivo sin cambios, no hay viraje del indicador de pH.

• Medio L.I.A. - El medio de agar Lisina y hierro (L.I.A.) es un medio de cultivo ampliamente utilizado para la diferenciación

de bacilos Gram negativos entéricos, especialmente miembros del género Salmonella con capacidad de fermentación de lactosa, sobre la base de la producción de H2S y la actividad de la enzima lisina descarboxilasa. También es posible observar cambios debidos a la actividad de la enzima lisina deaminasa, características del genero Proteus y Providencia.

- Las peptonas y el extracto de levadura aportan aminoácidos y nutrientes esenciales, la dextrosa constituye una fuente de energía. El citrato de amonio férrico y el tiosulfato de sodio actúan como marcadores de la producción de H2S, en este caso se observa el desarrollo de sulfuro de hierro negro en el tubo. El agar actúa como agente gelificante.

- Los cambios de pH se verifican gracias al contenido de púrpura de bromocresol: la producción de acido se ve como cambio del color a amarillo con valores de pH inferiores a 5.2, en tanto que la alcalinización como cambio del indicador hacia el púrpura con valores de pH sobre 6.8. La actividad de la lisina descarboxilasa se observa como un viraje hacia el color púrpura en todo el medio de cultivo, o bien como medio de cultivo sin cambio (neutro) en la columna de agar, en tanto que la ausencia de la enzima produce un viraje hacia el color amarillo en la columna y neutro en la zona inclinada. La actividad de la lisina deaminasa, se observa como color rojizo en la zona inclinada, con fondo amarillo en el tubo. También puede observarse producción de gas por efecto de fermentación de la glucosa.

- Inoculación: sembrar las muestras mediante estría en la superficie tendida y una picadura vertical y profunda en el centro del tubo.

- Lectura e interpretación de Resultados: Una vez completado el período de incubación, observar el desarrollo microbiano en la superficie tendida y en la columna del tubo. Considerar el viraje de pH por alcalinización (púrpura) o acidificación (amarillo). Además se debe observar la producción de H2S como color negro en el tubo y la generación de gas.

a. Producción de H2S: - Resultado positivo: el desarrollo microbiano produce coloración negra en el medio de cultivo en todo

el tubo. - Resultado negativo: ausencia de coloración negra.

b. Lisina descarboxilasa: - Resultado positivo: se verifica como alcalinización (K) del medio de cultivo con un viraje hacia el

púrpura en todo el tubo, o como medio de cultivo neutro - Resultado negativo: se observa acidificación (A) con viraje hacia el amarillo en la columna del tubo y

alcalinización (color púrpura) en la zona inclinada. c. Lisina deaminasa:

- Resultado positivo: producción de color rojo granate (R) en la superficie inclinada. - Resultado negativo: ausencia de color rojo granate.

• Medio T.S.I.

- El agar T.S.I. es un medio de cultivo ampliamente utilizado para la diferenciación de bacilos Gram negativos entéricos en base a la fermentación de carbohidratos y la producción de H2S.

- Las peptonas y el extracto de levadura aportan aminoácidos y nutrientes esenciales, la dextrosa, lactosa y sacarosa constituyen fuentes de energía y sustratos para la diferenciación basada en la actividad fermentativa sobre los azúcares. El sulfato ferroso y el tiosulfato de sodio actúan como marcadores de la producción de H2S, en este caso se observa el desarrollo de sulfuro de hierro negro en el tubo. El cloruro de sodio contribuye al equilibrio osmótico. El agar actúa como agente gelificante.

- Los cambios en el pH se verifican gracias al contenido de rojo fenol: la producción de ácido se ve como


cambio del color de rojo anaranjado a amarillo, en tanto que la alcalinización se observa como viraje hacia el rojo. También puede observarse producción de gas por efecto de fermentación de la glucosa.

- Inoculación: sembrar las muestras mediante estría en la superficie tendida y una picadura vertical y profunda en el centro del tubo.

- Lectura e interpretación de Resultados: Una vez completado el período de incubación, observar el desarrollo microbiano en la superficie tendida y en la columna del tubo. Considerar el viraje de pH por alcalinización hacia el rojo (K) o acidificación (A) hacia el amarillo. Además se debe observar la producción de H2S como color negro en el tubo y la generación de gas por efecto de la fermentación.

a. Producción de H2S:

- Resultado positivo: el desarrollo microbiano produce coloración negra en el medio de cultivo en todo el tubo.

- Resultado negativo: ausencia de coloración negra. b. Fermentación de carbohidratos:

- Resultado positivo: se observa acidificación (A) con viraje hacia el amarillo en la columna del tubo, incluyendo o no la superficie inclinada.

- Resultado negativo: se verifica como alcalinización (K) del medio de cultivo con un viraje hacia el rojo en todo el tubo o como medio de cultivo neutro.

c. Producción de gas: - Resultado positivo: burbujas de gas o rotura de la columna de agar en el tubo por presión de gas

acumulada en los tubos cerrados. - Resultado negativo: no se observa gas.

Prueba del Telurito de potasio

- Esta prueba permite diferenciar entre especies del género Enterococcus, ya que es positiva para Enterococcus faecalis y negativa para Enterococcus faecium. La bacteria E. faecalis tiene la propiedad de reducir el telurito de potasio a telurio, dando colonias negras en el agar Telurito de Potasio, en cambio, E. faecium crece en el agar pero da colonias de color gris.

- Esta prueba también es positiva para bacterias del género Corynebacterium spp. por lo tanto, permite diferenciar entre bacilos gram positivos.

- Se requiere para esta prueba de una placa de agar Telurito de Potasio. - Sembrar una pequeña estría de la colonia sospechosa, en una región de la placa de agar. - Incubar a 37 ºC en atmósfera normal de 18 – 24 horas. - Si el crecimiento son colonias negras, la prueba es positiva. - Si crecen colonias grises, la prueba es negativa.

• Prueba Arginina dihidrolasa (ADH)

- Esta prueba permite diferenciar a Enterococcus faecium y Enterococcus faecalis (prueba positiva) de otros Enterococcus, también es positiva para algunos bacilos gram negativos no fermentadores como Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, entre otros.

- Se basa en la actividad arginina dihidrolasa de la bacteria, donde el sustrato es la arginina y los productos de la ornitina, CO2 y amonio, produciendo una alcalinización del medio lo que provoca un cambio de color del indicador de amarillo a rojo.

- Se debe preparar una suspensión de la bacteria en estudio con suero fisiológico (0.25 ml) en tubo de khan.

- Agregar una tableta diagnóstica de ADH y 3 gotas de aceite de parafina estéril. - Cerrar el tubo. - Incubar a 37ºC por 4horas, puede ser 24 horas. - Reacción positiva: rojo. - Reacción negativa: amarillo a blanco.

• Prueba de la PYRROLIDONYL AMINOPEPTIDASA (PYR)

- PYR es una prueba colorimétrica rápida para la determinación de actividad PYRrolidonasa en estreptococos y Citrobacter spp. entre otros

- La prueba utiliza tarjetas impregnadas con ácido L-piroglutámico 7 amoni –4 metil cumarica (7AMC) y


dimetilaminocinamaldehído para la detección de la actividad de PYRrolidonasa. La hidrólisis enzimática del sustrato por los enterococos, estreptococos grupo A y Citrobacter spp. Provoca la aparición de un color morado tras la adición de una solución de revelado.

- Procedimiento: 1. aplicar una colonia (0.5 mm o mayor) sobre el área de reacción con un asa de plástico o vidrio. 2. humedecer el área de reacción con 1 gota de Tampón (viene en kit). 3. incubar la tarjeta inoculada a temperatura ambiente (15-30 °C) durante 5 minutos. 4. añadir 1 gota de Solución de Revelado al área de reacción. La aparición de un vívido de color

morado en y alrededor de las colonias en 20 segundos, es confirmatoria de actividad PYRrolidonasa.

• Prueba de aislamiento con éter

- Esta prueba permite aislar cocáceas gram positivas (Staphylococcus y Enterococcus) de Proteus invasores.

- Realizar una emulsión de la colonia a aislar en 1 ml de suero fisiológico, evitando la formación de grumos. - A la emulsión anterior agregar 1 ml de Eter Proanalisis (evitar contacto con mechero por peligro de

inflamación). - Vorterear por 1 minuto. - Sembrar con asa o pipeta Pasteur en agar sangre de cordero, aislando colonias. - Incubar 18 – 24 horas en estufa normal a 37ºC.

• Prueba de solubilidad en bilis Se utiliza esta prueba para diferenciar entre Streptococcus pneumoniae, soluble en bilis y otras especies de estreptococos alfa hemolíticos, “insolubles” en bilis. Esta prueba controla la capacidad de las células bacterianas de producir lisis en presencia de sales biliares, en un tiempo y a una temperatura específica. Las sales biliares utilizadas son el desoxicolato de sodio o el taurocolato de sodio. Las sales biliares hacen descender la tensión superficial en la interfase medio-membrana, provocan una descomposición de la membrana celular y aceleran el proceso autolítico natural del neumococo activando las enzimas por combinación de las sales biliares con el neumococo. - A partir de cultivo puro, preparar una suspensión en suero fisiológico, con una turbidez 1 de Mac Farland. - Tomar dos tubos: uno para la prueba y otro como control. Colocar 0.5 ml de la suspensión en cada tubo. - Colocar 0.5 ml de desoxicolato de sodio al 2% al tubo de la prueba y 0.5 ml de suero fisiológico al tubo

control. - Incubar a 35ºC por dos horas. - Resultados positivos: lisis del cultivo, por aclaración del mismo, después de la incubación. - Examinar el tubo control (microorganismo más solución salina) el cual debe estar turbio. - Un resultado de solubilidad parcial es interpretado como positivo.

REFERENCIAS

1. Instituto de Salud Pública de Chile. Procedimientos técnicos de Laboratorio Clínico, Vol I: Bacteriología General, Enterobacterias, Tuberculosis, Serología de la Sífilis. Santiago: 1994

2. Montiel F., Lam M. Métodos microbiológicos convencionales y rápidos usados en la identificación de bacterias aeróbicas. En: Manual de Microbiología Clínica. Santiago: Publicaciones Técnicas Mediterráneo Ltda., 2001; 87-137


Nº 4. PROCEDIMIENTO DE UROCULTIVO

OBJETIVO Realizar procesamiento de las muestras de orina para urocultivo de acuerdo a métodos estandarizados para recuperar agentes patógenos en el diagnóstico microbiológico de infección del tracto urinario (ITU). QUIENES DEBEN APLICARLA Sección Microbiología, Servicio de Laboratorio. Técnicos Paramédicos, Tecnólogos Médicos y Médico Microbiólogo de Sección Microbiología. RESPONSABILIDADES Tecnólogo Médico: Responsable de la evaluación del cultivo, identificación de las cepas en desarrollo, de realizar los inóculos para antibiogramas si corresponde, y de la validación del informe. Técnico paramédico: Responsable de la siembra de la muestra en los medios establecidos y de realizar frotis para tinción de Gram de screening MATERIALES, EQUIPOS Y SOFTWARE Insumos: placas de agar cromógeno para orina, placa de agar Mac Conkey, placa de agar sangre, asa calibrada de 1 µL y de 10 µL, láminas portaobjetos, cubreobjetos, kit de tinción de gram. Pruebas de identificación microbiana (baterías bioquímicas, DNAsa, látex para Streptococcus, etc), Ver según Procedimiento de métodos convencionales y rápidos de identificación de bacterias aerobias. Equipos: estufa de incubación, mechero Software: Omega DEFINICIONES Urocultivo: es el cultivo de muestra de orina obtenida en forma aséptica, permite la recuperación de bacterias no fastidiosas y hongos (levaduras). También se puede realizar cultivo anaerobio de orina, para lo que se deben seguir las condiciones de toma de muestra y procesamiento específicas. (Ver Manual toma de muestras, Procedimiento de cultivo bacterias anaerobias). El urocultivo incluye un recuento de colonias, y debe ser correlacionado con la observación microscópica del sedimento urinario o tinción de gram directa de la muestra para su interpretación e informe final. Más del 95% de las infecciones urinarias son monobacterianas y el microorganismo más frecuente es Escherichia coli, principalmente en pacientes ambulatorios. En pacientes con infecciones recurrentes y de origen intrahospitalario, aumenta la frecuencia de otros microorganismos tales como Proteus, Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas, Enterococcus y Staphylococcus. Placa agar Mac Conkey: es un medio de cultivo selectivo y diferencial usado para el aislamiento y estudio de bacilos gram negativos. Placa de agar cromógeno para orina: es un medio de cultivo que permite el desarrollo de bacterias gram positivas y negativas, además de levaduras, y diferencia por aspecto y color los distintos géneros o grupos bacterianos. Placa de agar sangre: medio de cultivo enriquecido y no selectivo que permite el crecimiento de la mayoría de las bacterias habituales y levaduras. Asas calibradas: asas estériles usadas para la siembra de un inóculo conocido y estandarizado de la muestra de orina.


DESARROLLO DEL PROCEDIMIENTO

1. Recepción, ingreso y numeración: se sigue el procedimiento común de muestras microbiológicas. 2. Siembra: responsable es el Técnico paramédico.

La muestra debe ser sembrada dentro de 2 hrs de haber sido tomada, si se mantiene a tº ambiente; si la muestra se ha mantenido refrigerada puede ser sembrada hasta dentro de 4 hrs. Orinas de 2a micción y por catéter permanente: primero se debe agitar bien la muestra con movimientos suaves para homogeneizarla, se introduce asa inmediatamente por debajo de la superficie líquida y se toma una gota con asa de 1 µL, llevarla en forma vertical y sembrar en placa de agar cromógeno para orina, haciendo una línea central y luego pasando en forma horizontal el asa desde el inicio de la línea hasta el final de ella, sin cortar los trazos (como zigzag). Se siembran de 4 a 6 muestras por placa. En forma paralela a la siembra de la muestra de orina se realiza frotis para tinción de gram, se puede fijar hasta 10 orinas en una lámina y se usa para ello el asa calibrada de 1 µL. Estas se tiñen y pueden ser observadas cuando exista discordancia entre el cultivo y el sedimento y cuando no exista sedimento. Orina por sondeo: proceder de la misma manera que orina de 2º chorro, y agregar además siembra con asa de 10 µL, en placas de agar sangre y agar Mac Conkey, de la misma forma explicada anteriormente. Orina por punción vesical: Siembre con asa de 10 µL, en placa de agar cromógeno para orina de la misma forma explicada anteriormente. Además sembrar con pipeta de vidrio aprox. 0,1 ml diseminando con bagueta de vidrio en rastrillo por toda la superficie de una placa de agar sangre y agar Mac Conkey Orina tomada directamente de uréter o riñón (de pabellón)): se siembra con pipeta en agar sangre y agar Mac Conkey (como una secreción), se disemina con bagueta de vidrio estéril en rastrillo, no se evalúa recuento.

3. Incubación en estufa de cultivo a 35° a 37ºC a atmósfera normal por 18 a 24 hrs. 4. Las muestras de orina deben guardarse refrigeradas hasta obtener el resultado del cultivo. En caso de

resultados discordantes se recurrirá a la muestra almacenada para repetir los análisis. 5. Las placas de urocultivos incubadas “overnight” son examinadas por Tecnólogo Médico para determinar

presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio. En los cultivos positivos se determina recuento de colonias, identificación de microorganismo y estudio de susceptibilidad según criterios de interpretación mencionados a continuación y en Anexo 1: Interpretación e informe de resultados de urocultivo. Las placas que tienen escaso desarrollo o que son de muestras obtenidas por métodos invasivos se reincuban.

6. Recuento de colonias: nº colonias x 1.000 (siembra con asa de 1 µL) ó

nº colonias x 100 (siembra con asa de 10 µL)

7. Interpretación del cultivo: el responsable es el Tecnólogo médico Para la interpretación del resultado, se debe relacionar el recuento de colonias con la clínica del paciente, con el sedimento urinario o tinción de Gram, con el método de recolección de la muestra y con antecedentes clínicos del paciente. Respecto a la tinción de gram directa, la presencia de una bacteria por campo de inmersión tiene buena correlación con un recuento > 100.000 ufc/ml en el 85% de los casos

Para interpretar e informar un urocultivo se compara con el sedimento, de manera que no haya discordancia en ambos resultados (sedimento sugerente de ITU: leucocitos o piocitos > 5 - 6 por campo de 40x y bacterias regular o abundante cantidad. La presencia de células descamativas y/o mucus, sugiere contaminación vaginal).


8. Conductas a seguir en discordancias entre cultivo y sedimento Antes de informar el resultado, comparar con el sedimento, para evaluar si existe discordancia en ambos resultados Urocultivo positivo con sedimento normal: informar recuento y agente identificado para que el médico tome decisión basándose en cuadro clínico.

Urocultivo negativo sedimento alterado: se debe observar gram de muestra directa en busca de bacterias y células inflamatorias (leucocitos, piocitos); si Gram es sugerente de proceso infeccioso incubar por 48 horas para dar por negativo el urocultivo. Se debe agregar comentario en informe: “discordancia entre sedimento y urocultivo, evaluar según clínica”

9. Tiempo de respuesta:

a. Cultivo negativo a las 48 horas b. Cultivo positivo: 48 a 72 hrs. hábiles

10. Informe: a. Cultivo negativo a las 48 horas b. Cultivo polimicrobiano: si existe desarrollo de 3 o más bacterias se informa “Resultado

polimicrobiano” c. Cultivo positivo: se informa recuento de colonias aproximado hasta 100.000 unidades

formadoras de colonia por mL (UFC/mL). Recuentos mayores de 100.000 se informan >100.000 UFC/mL hubo desarrollo de….

antibiograma

11. Registros: El resultado quedará registrado en sistema informático Omega y en reverso de orden de examen.

METODOS DE SUPERVISION Y RESPONSABLES: Calidad de toma muestra: se evalúa indicador muestras urocultivo polimicrobianas / total urocultivos por servicio de procedencia. Ver Procedimiento de Control de Calidad de Microbiología. Responsable: Tecnólogo Médico sección Microbiología designado según rotación REFERENCIAS

1. Comité de Microbiología Clínica. Diagnóstico microbiológico de la infección urinaria. Rev Chil Infectología 2001; 18(1) 34-38

2. Montiel F., Lam M. Procedimientos para realizar cultivos aeróbicos según la muestra. En: Manual de Microbiología Clínica. Santiago: Publicaciones Técnicas Mediterráneo Ltda., 2001; 53-85

3. Isenberg H. Aerobic bacteriology. En: Essentials Procedures for clinical microbiology. Washinton D.C.: ASM Press, 1998; 37-126

4. Diagnóstico microbiológico de las infecciones del tracto urinario, 2010 Procedimientos de Microbiología. Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades infecciosas y Microbiología Clínica.


ANEXOS

TABLA 1: INTERPRETACION E INFORME DE RESULTADOS DE UROCULTIVO

RECUENTO DE COLONIAS (UFC/ML)

MÉTODO DE TOMA DE MUESTRA

SEDIMENTO URINARIO

MICROORGA NISMO(s)

AISLADO(s)

INTERPRETACIÓN/ CONDUCTA

RECOMENDABLE 0 (<100 o 1.000 según tipo)

independiente del resultado

Urocultivo negativo

Cualquier recuento Punción suprapúbica y obtenida de riñón


cualquier microorganismo

identificación y antibiograma

Cualquier recuento Cualquier método y condición


Cultivo puro de levadura

Identificación

≥1.000 Cateterización transitoria


≤ 2 especies uropatógenas

idem

≥1.000 Cualquier método en paciente varón



idem

≥10.000 Segunda micción en paciente especial *



idem

≥10.000 orina por catéter permanente

patológico ≤ 2 especies uropatógenas

idem

≥ 10.000 Segunda micción patológico ≤ 2 especies uropatógenas

idem

≥100.000 Segunda micción patológico 2 uropatógenos y otra bacteria con rcto 10 veces menos

identificación y antibiograma sólo de uropatógenos

≥100.000 Segunda micción sin antecedente de sedimento


identificación y antibiograma

≥100.000 - - ≥ 3 microorg, sin predominio de alguno

Cultivo polimicrobiano. Solicite nueva muestra

*: PACIENTE ESPECIAL: embarazada, diabético, urológico (CRS Urología), UCI-UTI, paciente pediátrico y de Neonatología.


Nº 5. PROCEDIMIENTO DE COPROCULTIVO

OBJETIVO

Realizar procesamiento de las muestras de deposiciones para coprocultivo de acuerdo a métodos estandarizados para recuperar agentes bacterianos enteropatógenos en el diagnóstico microbiológico de diarreas, intoxicación alimentaria e investigación de portadores asintomáticos (como en el caso de manipuladores de alimento o en personas inmunosuprimidas). ALCANCE

Sección de microbiologia, servicio laboratorio clínico Técnicos paramédicos, tecnólogos médicos y médico microbiólogo de sección microbiologia. RESPONSABILIDAD

Tecnólogo Médico: Responsable de la evaluación del cultivo, identificación de las cepas en desarrollo, de realizar los inóculos para antibiogramas si corresponde, y de la validación del informe. Técnico paramédico: Responsable de la siembra de la muestra en los medios establecidos y de realizar frotis para tinción de Campylobacter cuando se solicita. DEFINICIONES

Coprocultivo: es el cultivo de deposiciones en medios diferenciales y selectivos para la recuperación de bacterias enteropatógenas. Los agentes buscados rutinariamente en coprocultivo realizado por nuestro laboratorio incluyen: Salmonella spp, Shigella spp, y Yersinia enterocolítica. En caso de solicitud específica o según criterios mencionados en este protocolo se busca presencia de Escherichia coli 0157 / 0111/ 055/ 026 y Vibrio spp Placa SS: medio de cultivo sólido medianamente selectivo usado para el aislamiento de bacterias de los géneros Salmonella y Shigella, inhibiendo en parte bacterias gram negativas coliformes y entéricas no patógenas. Placa TCBS: agar selectivo para recuperar cepas de Vibrio spp a partir de muestras clínicas. Placa Mac Conkey: es un medio de cultivo selectivo y diferencial usado para el aislamiento y estudio de bacilos gram negativos. MATERIALES, EQUIPOS Y SOFTWARE

Insumos: • Tórula con medio de transporte Cary Blair • Asa de siembra • Placa agar Mac Conkey • Placa agar SS • Placa agar TCBS (en caso de vigilancia o búsqueda de Vibrio spp). • Medios de cultivo para pruebas bioquímicas (baterías) • Sueros para aglutinación

Equipos:

• Equipo de lectura de aglutinación


• Estufa de incubación. Software: OMEGA DESARROLLO DEL PROCEDIMIENTO

Se estudiarán los siguientes enteropatógenos: A. En adultos:

De rutina: Salmonella spp. Shigella spp.

Si se solicita: Yersinia spp. EHEC 0157 / 0111/ 055/ 026 (inmunodeprimidos) B. En niños: De rutina Salmonella spp. Shigella spp.

Yersinia spp. EHEC 0157 / 0111/ 055/ 026 (en caso de disentería, especialmente en menores de 5 años)

Tinción de Campylobacter (en niños menores de 5 años) C. Estudio de Vibrio spp Si la muestra tiene indicada búsqueda de “Vibrio” o tiene antecedente de sospecha de intoxicación alimentaria, debe adicionarse una placa de TCBS. Para efectos de vigilancia epidemiológica activa se estudiará en horario hábil, según protocolo del Minsal (se siembra en placa de agar TCBS cada 10 coprocultivos de pacientes menores de 18 años y cada 5 de pacientes mayores de 18 años); cada muestra de coprocultivo debe marcarse en el registro Vigilancia Activa de Vibrio, para determinar las muestras que deben sembrarse en TCBS.

Procedimiento: 1. Recepción, ingreso y numeración: se sigue el procedimiento común de muestras microbiológicas. 2. Siembra: responsable es el Técnico paramédico. Se siembra en placa de agar Mac Conkey y una de agar SS

(en ese orden), las cuales se identifican con sus respectivos códigos de barra. Se debe tener especial cuidado de realizar aislamiento en tres cuadrantes, esterilizando el asa entre cada uno. (Ver Procedimiento nº 1: Siembra de muestras para cultivos aeróbicos, de este manual)

Si la muestra tiene indicada búsqueda de “Vibrio” o tiene antecedente de sospecha intoxicación alimentaria, debe adicionarse una placa de TCBS; lo mismo si corresponde según vigilancia activa de Vibrio.

3. Las placas sembradas se introducen en la estufa de incubación, incubándose a atmósfera normal entre 35 y 37º C.

4. Después de 18 a 24 horas de incubación, el TM procede a verificar crecimiento de cepas, realizar pruebas de identificación y antibiograma según corresponda. Se incuba la placa de agar Mac Conkey por otras 24 horas a temperatura ambiente (aprox. 22º C) para la recuperación de Yersinia enterocolítica. Cuando se completan las pruebas para la identificación y antibiograma, el tecnólogo médico registra los resultados en hoja de trabajo y valida informe final en sistema informático.

OBSERVACIONES: En el caso de aislar alguna de los siguientes agentes: Salmonella spp, Shigella spp, E coli presuntivamente enterohemorrágico, Yersinia enterocolítica, y Vibrio spp, se debe guardar cepa para ser enviada posteriormente a ISP (según normativa ministerial de Vigilancia de Laboratorio)

INFORME:

• Hubo desarrollo de flora habitual, escasa, regular o abundante cantidad • Negativo para…..…. (Cada microorganismo investigado) • Si se aísla patógeno, nombre de la bacteria (especie y serotipo si corresponde). • Si hay desarrollo de Vibrio cholerae o Vibrio parahaemolyticus, se informa nombre y antibiograma de

microorganismo, y se agrega comentario “identificación presuntiva”


• Si se observa alguna alteración de la microbiota intestinal, por ejemplo cultivo muy puro de Pseudomonas aeruginosa, levaduras o ausencia de flora, puede informarse como observaciones.

• Informar antibiograma en: Salmonella, Shigella y Yersinia. TIEMPO DE RESPUESTA:

• Cultivo negativo: 48 a 72 horas hábiles • Cultivo positivo: 3 a 4 días hábiles.

REGISTROS: Sistema informático del laboratorio, en reverso de orden de examen. Se guarda en secuencia de ingreso en sobres marcados como secreciones y éstos en caja indicando el mes y año, en archivos. REFERENCIAS

1. Instituto de salud Pública de Chile. Procedimientos técnicos de Laboratorio Clínico, Vol I: Bacteriología General, Enterobacterias, Tuberculosis, Serología de la Sífilis. Santiago: 1994


3. Alvarez M., Buesa J., Castillo J., Vila J. Diagnóstico microbiológico de las infecciones gastrointestinales 2008. Procedimientos de Microbiología Clínica. Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades infecciosas y Microbiología Clínica. En: www. seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/cap30.asp.


Nº 6. PROCEDIMIENTO TÉCNICO DE HEMOCULTIVOS

OBJETIVO Realizar procesamiento de las muestras de sangre para hemocultivos de acuerdo a métodos estandarizados para el diagnóstico de bacteriemias y fungemias. En este procedimiento se incluyen el proceso e interpretación para el diagnóstico de infecciones asociadas a catéter vascular: Tiempo diferencial de positividad de hemocultivos pareados Cultivo de punta de cáteter vascular ALCANCE

Tecnólogos Médicos y Técnicos Paramédicos de Sección Microbiología, Servicio de Laboratorio. RESPONSABILIDAD

Tecnólogo Médico: Responsable de la lectura e interpretación de gram, evaluación del cultivo, identificación de las cepas en desarrollo, de realizar los inóculos para antibiogramas si corresponde, y de la validación del informe. Técnico Paramédico: Responsable del ingreso de viales al equipo de hemocultivos automatizado, de la siembra de las muestras positivas en los medios establecidos y de realizar frotis MATERIALES, EQUIPOS Y SOFTWARE

Insumos: Viales de hemocultivo Bactec aerobio adulto, aerobio pediátrico, anaerobio

Medios de cultivo: agar sangre, agar chocolate suplementado, agar Mueller Hinton y Mueller Hinton sangre, medios de cultivo diferenciales para identificación. Jeringas asa estéril Kit para tinción de Gram

Equipos: Equipo de hemocultivos automatizado Bactec 9240, Becton Dickinson Estufa de incubación de CO2 5% microscopio Software: Omega y Epicenter DEFINICIONES

Hemocultivo: cultivo de muestra de sangre para el diagnóstico de bacteriemias o fungemias, en medios de cultivo líquidos enriquecidos para la obtención de microorganismos habituales y fastidiosos (la mayoría) Bacteriemia: paso a la vía sanguínea de bacterias desde un foco infeccioso. Las bacteriemias pueden ser transitoria (paso desde un sitio colonizado que es manipulado o en etapa inicial de algunas infecciones sistémicas), intermitentes (paso a la sangre desde un foco infeccioso), y continuas (diseminación sanguínea producida por infección que se localiza en torrente circulatorio como por ej endocarditis bacteriana) Fungemia: la misma definición previa aplicada a hongos. Infección del torrente sanguíneo asociada a catéter vascular central (ITS asoc CVC): Bacteriemia o fungemia en un paciente con un dispositivo vascular generalmente con uno o más hemocultivos periféricos positivos, con manifestaciones clínicas de infección (fiebre, calofríos y/o hipotensión) y sin otra fuente aparente de infección del torrente sanguíneo.


DESARROLLO DEL PROCESO FUNDAMENTO

El cultivo de sangre se realiza en medio con caldo enriquecido en vial aeróbico, que permite el desarrollo de la mayoría de los agentes microbianos causantes de septicemia o bacteremia (bacterias u hongos) o en vial anaerobio cuando se sospecha de una bacteremia cuyo foco primario indica presencia de anaerobios (absceso, peritonitis, etc.)

El estudio se realiza en equipo automatizado que corresponde a un instrumento Bactec (Becton Dickinson) de la serie fluorimétrica. Cada vial contiene un sensor químico que detecta los cambios de CO2 ocurridos en el vial, produciéndose un aumento en la fluorescencia del sensor. El equipo hace una lectura continua cada 10 minutos de cada vial generando una curva con los datos obtenidos, mediante algoritmos predefinidos y según el tipo de vial y protocolo de incubación es capaz de detectar las muestras que estarían positivas, lo que es indicado a través de un sistema de alarma al mismo tiempo que transmite los datos a un computador que contiene los datos del paciente (digitados previamente). 1. PROCEDIMIENTO HEMOCULTIVOS SISTEMA AUTOMATIZADO 1.1 Verificar que los datos de la solicitud de exámen se correspondan con los del vial, dar el número que corresponda al exámen y revisar lo que el médico solicita en la orden, para definir protocolo de estudio (ver anexo 1). Colocar etiqueta de código de barra de Omega en vial y en solicitud de examen. 1. 2 Ingreso al equipo automatizado:

• Abrir puertas de equipo Bactec • Escanear código de barra del vial, y luego escanear código de barra de Omega • Se encenderá una luz de color mitad verde y mitad roja continua señalando la posición en que se debe colocar

el vial. • Introducir vial en la posición señalada. • Si hay más de un vial, escanear uno a uno e ir introduciendo el vial en posición que va indicando la luz. • Al terminar cerrar puertas de equipo.

El equipo está programado para asumir automáticamente un protocolo de 5 días, por lo que se debe cambiar en caso de necesitar otro protocolo. (esto lo debe hacer TM) 1.3 Extracción de viales sospechosos de positivos

• El equipo avisa con alarma sonora y luminosa que hay vial positivo. • Abrir puerta de equipo Bactec • Escanear código de barra (que está en parte interna de puerta del equipo) que dice extracción de viales

positivos • Se encenderá una luz mitad verde y mitad roja parpadeante en el lugar que se ubica vial positivo. • Retirar vial positivo • Escanear código de barra del vial, la correcta lectura la comprobará al escuchar sonido de 3 tiempos. • Cerrar puertas de equipo

1.4 Procesamiento de frasco positivo 1.4.1 Viales positivos corrientes (adultos y pediátricos)

Los viales detectados como positivos por el equipo deben subcultivarse en agar sangre y agar chocolate junto con realizar tinción de Gram. Colocar vial(es) en orden numérico, rotular las placas y portaobjetos a utilizar previamente y colocar en orden junto a vial correspondiente. Poner vial en posición vertical y desinfectar tapón de goma con una tórula de algodón estéril con alcohol 70º. Tras invertir los frascos con una suave agitación, se extraen con jeringa aproximadamente 2 ml de sangre. Se inoculan unas 3 a 5 gotas en cada placa de agar sangre y agar chocolate, y por último se pone una gota en zona central de un portaobjeto. Extender la gota suavemente con pipeta o asa estéril, y dejar secar el frotis a temperatura ambiente (preparar 2 frotis por muestra) Diseminar las gotas inoculadas en las placas con asa estéril. Incubar las placas en estufa de CO2 5% a 35 º C. Dejar los frascos en interior de estufa atmósfera normal


Lo antes posible se debe proceder a realizar tinción de Gram y hacer su lectura e informe (existen plazos de tiempos de respuesta para preinforme de gram de hemocultivos positivos, (ver Manual de Control de Calidad de Microbiología) Enviar un informe preliminar del hemocultivo positivo indicando tinción de gram. A la vez que se debe comunicar telefónicamente al médico o enfermera a cargo del paciente para informar el resultado del gram. (ver procedimiento en Norma de tiempo de respuesta de exámenes críticos) Responsable es el Tecnólogo Médico. Si en la tinción de Gram se observan simultáneamente microorganismos gram positivos y gram negativos se debe agregar subcultivo en agar Mac Conkey. Si en la tinción de gram se observan levaduras subcultivar en agar sabouraud.

En caso de no observar microorganismos en la tinción de gram, se debe considerar como presuntivamente positivo. En este caso se debe reingresar el vial al instrumento. Las placas de subcultivo se deben incubar por 3 días antes de darlas por negativas para crecimiento. Las placas de cultivo de los viales positivos se incubarán en estufa de CO2 a 35° C por 18 a 24 horas.

1.4.2 Viales positivos anaerobios Reunir material necesario:

placa de agar sangre anaerobio agar sangre anaerobio con inhibidores caldo thioglicolato para anaerobios regenerado también agregar una placa de agar sangre corriente jarra de anaerobiosis sobre generador de anaerobiosis tira indicador de anaerobiosis

Rotular las placas y tubos con número correspondientes Desinfectar tapón de goma con alcohol 70º. Con jeringa extraer aprox 2 a 3 ml de muestra. Inocular 2 a 3 gotas en cada placa de medio de cultivo y en tubo de caldo thiglicolato Diseminar con asa estéril en las placas, esterilizando entre primer y segundo cuadrante, sin esterilizar entrte 2º y tercer cuadrante. Colocar las placas para cultivo de anaerobio y tubo en la jarra. Introducir el sobre y la tira indicadora en la jarra y cerrar rápidamente. Marcar nº de muestra y fecha de incubación en exterior de jarra La placa de agar sangre corriente se debe incubar en estufa de CO2 a 35-37º C

1.5 Identificación y antibiograma preliminares:

En el caso de que en un corto período se hayan detectado 2 o más muestras positivas de un mismo paciente, se procederá a realizar algunas pruebas de identificación y antibiograma preliminares utilizando como inóculo algunas gotas extraídas de uno de los viales positivos, que se inoculan en un tubo de caldo de cultivo (thioglicolato, Mueller Hinton, Brain Heart o suero fisiológico) Dependiendo del resultado de la tinción de Gram, se seguirá el siguiente esquema: • Cocos gram positivos en racimo: antibiograma en agar Mueller Hinton para Staphylococcus secreciones • Cocos gram positivos en cadenas o diplococos: se espera desarrollo de subcultivo • Diplococos gram negativos: se espera desarrollo de subcultivo • Bacilos gram negativos: pruebas bioquímicas de identificación (TSI, LIA, Citrato, MIO, urea) y antibiograma en

agar Mueller Hinton para bacilos gram negativos secreciones • Bacilos gram positivos: se espera desarrollo de subcultivo • Cocobacilos gram negativos pequeños: se espera desarrollo de subcultivo • Bacterias gram negativas y gram positivas en misma muestra: se espera desarrollo de subcultivo • Levaduras: se espera desarrollo de subcultivo

Los medios de cultivo y antibiogramas preliminares se incubarán según las condiciones establecidas en los procedimientos correspondientes. Al día siguiente se procede a su lectura e interpretación. Cualquier resultado dudoso o de valor límite no será informado hasta tener resultado de pruebas de estudio definitivas.


1.6. Procesamiento de los subcultivos Después de incubadas las placas de subcultivo, se revisa si hay desarrollo. Se debe confirmar si es necesario con gram de las colonias si es concordante con lo observado con la tinción de gram directa del vial efectuada anteriormente. Proseguir el estudio según corresponda de acuerdo a la morfología y afinidad tintorial del microorganismo desarrollado, para su identificación y correspondiente estudio de susceptibilidad. Los microorganismos aislados que se consideren significativos se identificarán en forma definitiva y se les realizará en caso necesario el antibiograma correspondiente. Los microorganismos considerados contaminantes se identificarán sólo a nivel de género. En general se considerarán contaminantes los siguientes microorganismos aislados en solo una muestra del set del paciente:

Bacillus spp Corynebacterium spp Otros bacilos gram positivos Streptococcus grupo viridans Staphylococcus coagulasa negativa También se considerará contaminación cuando hay desarrollo de distintos tipos bacterianos en una misma

muestra y sólo en una muestra del set 1.7 Procesamiento de los viales negativos: Una vez cumplido el protocolo de incubación, se extraerán los viales negativos y después de revisar con órdenes de exámenes, se eliminan siguiendo protocolo de eliminación de desechos biológicos.

Si al final del período de análisis un vial negativo parece positivo a simple vista, debe subcultivarse, realizar tinción de gram según lo señalado anteriormente.

1.8 Informe:

1. Informe preliminar: tinción de Gram de muestras positivas, según protocolo mencionado previamente. Si alguna de las muestras ha sido tomada por catéter vascular central (CVC) se informa tiempo de positividad.

2. 2º informe preliminar: Cuando ya hay desarrollo bacteriano y se pueden realizar algunas pruebas rápidas de identificación, se informa en sistema informático de laboratorio (SIL), aún cuando cepa continúe en estudio para antibiograma u otro. Esto aplica especialmente a algunos Streptococcus beta hemolíticos y Staphylococcus aureus.

3. Informe definitivo de resultados positivos: se informa identificación de microorganismo y antibiograma si corresponde. Tiempo de positividad si corresponde. El tiempo de respuesta del informe final en general será de 48 a 72 hrs después de hacerse positivo. Informe de resultados negativos: los hemocultivos negativos completarán su período de incubación de 5 a 21 días según sea el caso (ver anexo 1) y transcurrido ese tiempo, se informarán como negativos ( a los 5 días, a los 10 días, etc)

1.9 Registros: En SIL (Omega y Epicenter), en orden de examen. Los preinformes de hemocultivos positivos además de quedar registrados en SIL, si es horario inhábil se imprime el informe y se deja en sección de microbiología 2. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE ITS ASOCIADA A CVC El objetivo es identificar la presencia de microorganismos causantes de bacteriemia asociada a CVC. Cuando se sospecha el diagnóstico de ITS asoc CVC, se puede tomar la conducta de retirar o mantener el catéter, según esto el estudio microbiológico a seguir será según los siguientes esquemas: 2.1 Cuando hay sospecha de infección y se retira catéter

• Cultivo semicuantitativo con técnica de Maki. (punta de catéter) • Y tomar hemocultivos periféricos (2 muestras) (10 ml cada muestra en pacientes adultos) • Si hay secreción purulenta en sitio de inserción tomar muestra con tórula estéril para cultivo corriente. (indicar

tipo de muestra sitio inserción CVC)


2.1.1 Cultivo semicuantitativo de punta de catéter (Técnica de Maki) Muestra: segmento de catéter (5 cm del extremo distal) en frasco estéril Procedimiento de siembra: Se hace rodar el segmento del catéter ayudándose con una pinza o tórula estéril, sobre la superficie de una placa de agar sangre 4 veces hacia adelante y atrás. Se retira el segmento y se deja en recipiente en que venía. La placa se incuba durante 24 horas a 35-37° C atmósfera normal. Al día siguiente se observa si hay desarrollo, si no es así se mantiene en incubación hasta por 48 hrs. Si hay evidencias de crecimiento se cuentan las colonias (UFC) considerando como significativo la presencia de 15 o más ufc por placa. Se inician los estudios de identificación y antibiograma según corresponda Si el recuento es menor de 15 UFC, y especialmente son distintos tipos bacterianos no se realizará estudio. 2.2 Cuando hay sospecha y no se retira catéter: Técnica de tiempo diferencial

• Hemocultivos pareados de muestras por punción periférica y por CVC. Se compara el tiempo diferencial de positividad (si se ha aislado el mismo microorganismo en ambas muestras)

• Primero se toma muestra periférica y luego por CVC (para saber cuánto volumen se debe extraer) • Debe ser mismo volumen y simultáneos (no más de 10 minutos de diferencia). Si no tienen el mismo volumen

no se puede aplicar criterio de tiempo diferencial. • Rotular frasco por vía periférica y por CVC (o central) • En CVC de más de un lumen se debe obtener de puerta más distal o el más usado, o por el que está pasando

nutrición parenteral, o de todos los lúmenes (rotular muestra adecuadamente) • Si hay secreción purulenta en sitio de inserción tomar muestra con tórula estéril para cultivo corriente. (indicar

tipo de muestra sitio inserción CVC) 2.2.1 Muestra: Llegarán 2 muestras en viales de hemocultivos rotuladas, una como hemocultivo periférico y otra obtenida a través de CVC (esta última la denominaremos muestra central). 2.2.2 Procedimiento:

Verificar rotulación Introducir a equipo Bactec 9240 los dos viales de hemocultivos al mismo tiempo. El protocolo de incubación será 5 días o en el caso de solicitud de hongos 10 días Escribir en orden de examen al lado de cada etiqueta del código de barra si se trata de muestra periférica o por CVC En caso de positividad trabajar como cualquier hemocultivo, con informe preliminar de tinción de Gram identificación y estudio de suscceptibilidad según corresponda.

2.2.3 Interpretación: Si ambos hemocultivos resultan positivos y el hemocultivo central se hace positivo por lo menos 2 horas antes que el periférico, se interpreta como diagnóstico de infección asociada al catéter vascular (criterio microbiológico, siempre se debe correlacionar con clínica) 2.2.4 Informe: Se sigue las mismas indicaciones señaladas anteriormente. Si no hay crecimiento en ambos viales: hemocultivo periférico o central negativo, en sus respectivos informes. Si la (s) muestras son positivas: Siempre escribir en tipo de exámen: hemocultivo central o periférico, Cultivo corriente o cultivo hongos o ambos. Informar cada hemocultivo con su respectivo aislamiento bacteriano y susceptibilidad. Si la muestra periférica y central han resultado positivas al mismo microorganismo, informar tiempo de positividad de la siguiente forma: hemocultivo (periférico o central) positivo a las ….. horas 3. Retiro del CVC por término de indicación y sin infección local ni sospecha de infección sistémica por catéter:

• Retirar catéter • No realizar cultivo de rutina


REFERENCIAS

1. Loza E., Planes A., Rodríguez M. Procedimientos en Microbiología Clínica, Hemocultivos. 1993. Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, Madrid.


3. García P., Paya E., Olivares R., Cotera A., Rodriguez J., Sanz M. Consenso: Diagnóstico de las infecciones asociadas a catéteres vasculares centrales. Rev Chil Infect 2003; 20(1): 41-50

ANEXOS

Anexo 1. Protocolos de estudio

Protocolo Tiempo de incubación Cultivo corriente 5 días Cutivo bacterias anaerobias 5 días Cultivo de hongos 10 días Sospecha de endocarditis bacteriana subaguda 14 días ( por h.a.c.e.k) Gram y subcultivo a ciega a 7 y 14

días en agar chocolate y agar sangre manteniendo placas, por lo menos 72 horas a 37°C en estufa CO2

Brucella se incuba por 21 días , gram y subcultivo a ciegas a los 7, 14 y 21 días en agar sangre y agar chocolate.

Anexo 2. Diagnóstico microbiológico de ITS asociadas a CVC

Sospecha Infección torrente sanguíneo asociado a Catéter Vascular

Sí se decide retirar catéter No se retira catéter

Se envía punta de CVC (5 cm.) para

cultivo

Tomar 2 hemocultivos

periféricos (10 cc cada uno)

Se toman hemocultivos pareados por punción periférica y por CVC, para comparar el tiempo diferencial de positividad Primero tomar hemocultivo periférico (para determinar el volumen a extraer). Luego se toma por CVC. Ambos deben tener la MISMA cantidad de sangre (8-10 cc) Y deben ser simultáneos (no más de 10 minutos de diferencia entre uno y otra toma) Rotular 1 frasco periférico y el otro por CVC (o central) Si CVC posee más de un lumen, tomar del más usado, o el que esté pasando nutrición parenteral


Nº 7. PROCEDIMIENTO CULTIVO DE LÍQUIDOS DE CAVIDADES ESTÉRILES

OBJETIVO Realizar procesamiento de las muestras de líquidos estériles de acuerdo a métodos estandarizados, para identificar la presencia de microorganismos causantes de cuadros infecciosos de estas localizaciones. Esto incluye líquido cefalorraquídeo (LCR), líquido articular, líquido pleural, líquido ascítico o peritoneal (estudio de peritonitis primaria), líquido de peritoneodiálisis, líquido pericárdico y amniótico.

. INTRODUCCIÓN

El cultivo microbiológico de líquidos biológicos, como LCR, líquido pleural, ascítico o articular, tiene como objetivo determinar la presencia o ausencia de microorganismos ante la sospecha clínica de un proceso infeccioso a nivel de cavidades, que en un individuo sano son estrictamente estériles. Un diagnóstico microbiológico precoz, es fundamental, ya que los procesos infecciosos en estas localizaciones son generalmente graves y con posibilidades de dejar secuelas en los pacientes afectados. Para el cultivo de estas muestras se utilizan medios de cultivo mejorados y enriquecidos (agar sangre cordero triptosa) y a veces es necesario utilizar medios con factores de crecimiento (agar chocolate suplementado), para la recuperación de bacterias fastidiosas. ALCANCE

Tecnólogos Médicos, Técnicos Paramédicos y Médico Microbiólogo de Sección Microbiología, Servicio de Laboratorio. RESPONSABILIDAD

Tecnólogo Médico: Responsable de la lectura e interpretación de gram, evaluación del cultivo, identificación de las cepas en desarrollo, de realizar los inóculos para antibiogramas si corresponde, y de la validación del informe. Técnico Paramédico: Responsable de la siembra de la muestra en los medios establecidos, de ingreso de viales al equipo automatizado (cuando corresponde) y de realizar frotis DESARROLLO DEL PROCESO

1. LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO (LCR) El procesamiento de las muestras de LCR siempre debe ser considerado como una urgencia clínica y microbiológica. Se deben realizar los procedimientos microbiológicos que proporcionen información clínica relevante en el menor tiempo posible. No se recomienda rechazar o no procesar ninguna muestra (por ejemplo, derramamiento durante el transporte) sin consultar previamente con el clínico responsable del paciente. Se procesará, indicando en el informe sobre la posibilidad de contaminación debida al estado de la muestra a la llegada al laboratorio. 1.1. Materiales, equipos y software Insumos: agar sangre agar chocolate caldo thioglicolato

pipeta estéril Portaobjetos Kit tinción Gram asa estéril medios de cultivos para identificación bacteriana Equipos: Estufa de incubación atmósfera de CO2, estufa de incubación atmósfera normal, mechero. Software: Omega


1.2 Procedimiento

12. Recepción, ingreso y etiquetado: se sigue el procedimiento común de muestras microbiológicas. 13. Siembra: responsable es el Técnico paramédico.

La muestra llegará en frasco estéril. Debe ser sembrada lo antes posible después de haber sido tomada, mantenida a tº ambiente (ver Manual de Toma de Muestras)

• Centrifugar la muestra en eppendorf estéril a 2500 rpm por 5 min. • tomar el sedimento de la muestra con pipeta pasteur • Colocar 2-3 gotas en un costado de la placa agar sangre y placa agar chocolate • Depositar 2-3 gotas en caldo thioglicolato hasta el fondo y luego retirar mezclando el líquido con el medio • realizar 2 frotis, extendiendo una gota entre 1-2 cm de diámetro; elegir un frotis para teñirlo inmediatamente. • diseminar siembra en las placas en 3 cuadrantes, sin esterilizar el asa entre el 1° - 2° cuadrante, terminar en

estría.

14. Incubación: las placas de agar sangre y agar chocolate se incuban a 35-37 º C en estufa CO2, el caldo thioglicolato se incuba en estufa normal.

15. Las placas de cultivos ya incubadas 24 horas son examinadas por Tecnólogo Médico para determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio, teniendo en cuenta los microorganismos de importancia clínica en cada caso. Según esto se realiza pruebas de identificación de microorganismo y estudio de susceptibilidad. Examinar las placas cada 24 horas, hasta un total de 72 hrs. Examinar el caldo cada 24 horas, para la detección de crecimiento macroscópico (turbidez)

16. Si los cultivos presentan crecimiento: Correlacionar los aislados con los morfotipos observados en la tinción de Gram. Trasladar al facultativo peticionario un informe preliminar con la identificación presuntiva. Identificar los aislados a nivel de especie y realizar pruebas de sensibilidad a los antibióticos según las normas estandarizadas vigentes Si el crecimiento se produce sólo en los caldos de cultivo y no en las placas, realizar subcultivo del caldo en medios sólidos (agar sangre, agar chocolate) y correlacionar el aislado con el morfotipo observado en la tinción de Gram. Cuando en el caldo se observe por tinción de Gram microorganismos que no crecen en el subcultivo, proceder a subcultivar en medios nutricionalmente más ricos y en diferentes condiciones de incubación.

17. Tinción de Gram Inmediatamente después de recepcionar y sembrar muestra se debe teñir frotis para tinción de Gram. El T. Médico realiza su lectura, interpretación e informe. Los resultados de la observación de tinción de Gram directa quedarán registrados en la orden de trabajo correspondiente a la muestra y en el sistema informático. En el caso de estar positivo a la presencia de microorganismos se informará lo antes posible a clínico responsable de paciente.

1.3 Informe:

• Gram directo: Informar ausencia o presencia de leucocitos polimorfonucleares y ausencia o presencia de uno o varios morfotipos bacterianos y su cantidad en descripción cualitativa (escasos, regular, abundante)

• Cultivo: - negativo 72 horas de incubación - hubo desarrollo de escasa, regular o abundante cantidad de…. - antibiograma cuando corresponde.

1.4 Tiempo de respuesta

- negativo, 72 horas de incubación (informe a las 48 a 72 hrs hábiles - positivo, 24 a 72 horas hábiles

1.5 Registros: Sistema informático del laboratorio, en reverso de orden de examen, se guarda en secuencia de ingreso en sobres marcados como secreciones y estos en caja indicando el mes y año, en archivos.


2. LÍQUIDOS ESTÉRILES NO LCR (LÍQUIDO PLEURAL, ASCÍTICO, ARTICULAR, AMNIÓTICO 2.1 Materiales, equipos y software Insumos: agar sangre agar chocolate caldo thioglicolato Vial de hemocultivo adulto (5 a 10 ml de muestra) o pediátrico (menos de 5 ml de muestra)

pipeta estéril Portaobjetos Kit tinción Gram asa estéril medios de cultivos para identificación bacteriana Equipos: Estufa de incubación atmósfera de CO2, estufa de incubación atmósfera normal, mechero. Software: Omega 2.2 Muestra:

generalmente llegará en frasco estéril o jeringa estéril sin medio de transporte. Puede llegar inoculada en un vial de hemocultivo adulto y en tubo estéril para realizar gram

2.3 Procedimiento 1. Recepción, ingreso y etiquetado: se sigue el procedimiento común de muestras microbiológicas. 2. Siembra: responsable es el Técnico paramédico.

Debe ser sembrada lo antes posible después de haber sido tomada, mantenida a tº ambiente (ver Manual de Toma de Muestras) Se procede a realizar siembra en los medios de cultivo correspondiente según tipo de muestra, según técnica de siembra descrita en Procedimiento de Siembra de muestras para cultivos aeróbicos de este manual. • centrifugar a 2500 rpm por 5 min. (tubo estéril) • realizar 2 frotis del sedimento de la muestra en tubo. • elegir un frotis para teñirlo inmediatamente. • colocar vial en el equipo de hemocultivo, sacando la etiqueta del código de barra y pegarla en la orden de

examen (según procedimiento habitual) 3. Incubación: las placas de agar sangre y agar chocolate se incuban a 35-37 º C en estufa CO2, el caldo

thioglicolato se incuba en estufa normal. 4. Diagnóstico microbiológico

Tinción de Gram: Inmediatamente después de recepcionar y sembrar muestra se debe teñir frotis para tinción de Gram. El Tecnólogo Médico realiza su lectura, interpretación e informe. Los resultados de la observación de tinción de Gram directa) quedarán registrados en la orden de trabajo correspondiente a la muestra y en el sistema informático. En el caso de estar positivo a la presencia de microorganismos se informará lo antes posible a clínico responsable de paciente. Cultivo: Las placas de cultivos ya incubadas 24 horas son examinadas por Tecnólogo Médico para determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio, teniendo en cuenta los microorganismos de importancia clínica en cada caso. Según esto se realiza pruebas de identificación de microorganismo y estudio de susceptibilidad. Examinar las placas cada 24 horas, hasta un total de 72 hrs. Examinar el caldo cada 24 horas, para la detección de crecimiento macroscópico (turbidez)

2.4 Informe

- gram directo, - informar presencia de leucocitos y cantidad o no se observan leucocitos - informar morfología bacteriana y cantidad - cultivo negativo 72 horas de incubación Si la muestra llegó o se inoculó en vial de hemocultivo se completa

incubación de 5 días - hubo desarrollo de…. - antibiograma cuando corresponde.

2.5 Tiempo de respuesta: negativo, 72 horas hábiles, si muestra se inoculó en vial de hemocultivo 5 días de incubación positivo, 48 a 72 horas


2.6 Registros: Sistema informático del laboratorio y en reverso de orden de examen. Esta se guarda en secuencia de ingreso en sobres marcados como secreciones y estos en caja indicando el mes y año, en archivos. 3. LIQUIDO DE PERITONEODIÁLISIS 3.1 Introducción: La peritonitis, inflamación de la membrana peritoneal, es la complicación más frecuente en pacientes que deben someterse a peritoneo diálisis. El estudio microbiológico del líquido peritoneal tiene bajo rendimiento El cultivo del líquido abdominal obtenido de la primera bolsa en que se observa líquido turbio tiene mayor probabilidad de cultivo positivo. Los microorganismos más frecuentes aislados son Staphylococcus coagulasa negativa, Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Pseudomonas spp, entre otros. Sin embargo en este tipo de pacientes se pueden presentar infecciones por agentes inusuales, de lento crecimiento y distintos tipos de hongos. 3.2 Insumos:

Vial de hemocultivo adulto aerobio Placas de agar sangre, chocolate y tubo agar Sabouraud

Jeringa Alcohol 70°, tórulas de algodón 3.3 Equipos y software: Cámara de flujo laminar, centrifuga, estufa de incubación, equipo de hemocultivos automatizado.

Software: Omega 3.4 Procedimiento: 3.4.1 Técnico paramédico que recepciona debe:

• verificar rotulación de bolsa. • verificar funcionamiento de gabinete de bioseguridad • lavado de manos clínico • retire bolsa externa • colocarse guantes

3.4.2 desinfecte la superficie de la bolsa con alcohol a 70° utilizando algodón. Las tórulas de algodón se pasan sólo una vez y se eliminan.

• Retire sello de vial de hemocultivos adulto aerobio y desinfecte goma con alcohol 70° • Con jeringa estéril puncione bolsa en el lugar desinfectado. • Aspire 8- 10 cc. e introduzca estos 8 a 10 cc en el vial adulto.

3.4.3 Vuelva a desinfectar una zona de la bolsa con alcohol 70° con algodón, puncione con jeringa y obtenga unos 5 cc de muestra. Inocule algunas gotas de muestra en una placa de agar sangre, agar chocolate y un tubo de agar sabouraud. Disemine en 3 cuadrantes en caso de las placas y en estría en el caso del tubo. 3.4.4 Incube las placas de agar sangre y chocolate en estufa de CO2 a 5% a 35° C, y el tubo de agar Sabouraud en estufa normal a 35° C. 3.4.5 Ingrese vial a equipo automatizado de hemocultivos. No olvide rotular el vial. (ver protocolo de ingreso en Procedimiento n° 6: Hemocultivos de este manual)

3.5 Diagnóstico microbiológico: Si el equipo entrega alarma de positividad, realizar tinción de gram y siembra en placas de agar sangre y agar chocolate y posteriormente el estudio de identificación bacteriana de los cultivos con procedimientos habituales ya sea en caso de aerobios, aerobios facultativos u hongos. 3.6 Informe si no hay crecimiento, se informa como: negativo 5 y 10 días de incubación. si existe crecimiento: se informa el microorganismo aislado y antibiograma. 3.7 Registros Sistema informático del laboratorio. Reverso de orden de examen guardada en sobre correspondiente.


REFERENCIAS

1. Instituto de Salud Pública de Chile. Procedimientos técnicos de Laboratorio Clínico, Vol I: Bacteriología General, Enterobacterias, Tuberculosis, Serología de la Sífilis. Santiago: 1994


3. Isenberg H. Aerobic bacteriology. En: Essentials Procedures for clinical microbiology. Washinton D.C.: ASM Press, 1998; 37-126

4. Diálisis peritoneal crónica pediátrica en Chile. Estudio multicentrico. Rev. Chil. Pediatr. 73 (2); 116-126, 2002 5. Diálisis peritoneal: complicaciones más frecuentes. Revista de Posgrado de la Cátedra de Medicina, 2010; N°

16 :199 6. Complicaciones infecciosas en diálisis peritoneal crónica. Rev. Chil. Pediatr, 2008; vol. 79 n° 5 Santiago


Nº 8. PROCEDIMIENTO CULTIVOS DE SECRECIONES DEL APARATO RESPIRATORIO SUPERIOR

OBJETIVO

Realizar procesamiento de las muestras de secreciones del aparato respiratorio superior de acuerdo a métodos estandarizados, para identificar la presencia de microorganismos causantes de cuadros infecciosos de esta localización, como faringoamigdalitis (muestra faríngea), sinusitis (senos paranasales), otitis (secreción ótica), conjuntivitis (secreción ocular). Cabe considerar que la muestra faríngea también se obtiene para estudio de portación de S. aureus. Además también recordar que la secreción nasal solo sirve para estudio de portación. ALCANCE

Sección de microbiologia, servicio laboratorio clínico Técnicos paramédicos, tecnólogos médicos y medico microbiólogo de sección microbiologia. RESPONSABILIDAD

Tecnólogo Médico: Responsable de la evaluación del cultivo, identificación de las cepas en desarrollo, de realizar los inóculos para antibiogramas si corresponde, y de la validación del informe. Técnico paramédico: Responsable de la siembra de la muestra en los medios establecidos y de realizar frotis para tinción. MATERIALES, EQUIPOS Y SOFTWARE

Insumos: agar sangre agar chocolate agar Mac Conkey Portaobjetos Kit tinción Gram asa estéril medios de cultivos para identificación bacteriana Equipos: Estufa de incubación atmósfera de CO2, estufa de incubación atmósfera normal, gabinete de bioseguridad, mechero eléctrico. Software: Omega DESARROLLO DEL PROCESO

1. Recepción, ingreso y etiquetado: se sigue el procedimiento común de muestras microbiológicas. 2. Siembra: responsable es el Técnico paramédico.

La muestra generalmente llegará en tórula con medio de transporte Stuart o tórula estéril sin medio de transporte. Debe ser sembrada lo antes posible después de haber sido tomada, mantenida a tº ambiente (ver Manual de Toma de Muestras) Se procede a realizar siembra en los medios de cultivo correspondiente según tipo de muestra, según técnica de siembra descrita en Procedimiento de Siembra de muestras para cultivos aeróbicos de este manual.

• Secreción nasofaríngea: Agar sangre. Incubar en estufa normal • Secreción de senos paranasales: Agar sangre y agar chocolate. Incubar en estufa de CO2. Si se

solicita búsqueda de hongos se debe sembrar en agar Sabouraud e incubar por 5 días • Secreción conjuntival: Agar sangre y agar chocolate. Incubar en estufa de CO2. Si se solicita

búsqueda de hongos se debe sembrar en agar Sabouraud e incubar por 5 días • Secreción ótica: Agar sangre, agar chocolate y agar Mac Conkey. Incubar en estufa de CO2, Mac

Conkey en estufa atmósfera normal. Si se solicita búsqueda de hongos se debe sembrar en agar Sabouraud e incubar por 5 días


3. Incubación en estufa de cultivo a 35° a 37ºC a atmósfera con 5% CO2 por 48 hrs. 4. Las placas de cultivos ya incubadas 24 horas son examinadas por Tecnólogo Médico para determinar

presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio, teniendo en cuenta los microorganismos de importancia clínica en cada caso. Según esto se realiza pruebas de identificación de microorganismo y estudio de susceptibilidad. Los más frecuentes son:

- Secreción faríngea: Streptococcus pyogenes Streptococcus beta hemolítico grupo C o G.

- Secreción senos paranasales: Streptococcus pneumoniae

Haemophilus influenzae Haemophilus sp. Branhamella catharralis Staphylococcus aureus

- Secreción ocular: Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Haemophilus spp. Branhamella catharralis Staphylococcus aureus Bacilos Gram negativos

- Secreción ótica: Bacilos Gram negativos (Pseudomonas, Proteus, etc.) Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Haemophilus spp. Staphylococcus aureus

5. Las placas que tienen escaso desarrollo o que permanecen negativas se incuban hasta por 48 hrs., excepto

aquellas en que se solicite cultivo de hongos en que se incubará hasta por 5 días. 6. En paralelo a la siembra se realiza frotis en lámina portaobjetos, para tinción de gram, excepto secreción

faríngea. Informe: Gram directo, excepto en secreción faringea Informar:

- presencia de leucocitos y cantidad - o no se observan leucocitos - informar morfología bacteriana y cantidad

Cultivo: - negativo 48 horas de incubación - desarrollo de flora habitual - hubo desarrollo de escasa, regular o abundante cantidad de…. - antibiograma cuando corresponde.

Tiempo de respuesta

- negativo, 48 horas hábiles - positivo, 72 horas hábiles

Registros: Sistema informático del laboratorio, en reverso de orden de examen, se guarda en secuencia de ingreso en sobres marcados como secreciones y estos en caja indicando el mes y año, en archivos.


9. PROCEDIMIENTO CULTIVO DE SECRECIONES DEL APARATO RESPIRATORIO INFERIOR

OBJETIVO

Realizar estudio de secreciones del aparato respiratorio inferior de acuerdo a métodos estandarizados para identificar microorganismos causantes de infecciones en esta localización. Las infecciones del tracto respiratorio inferior comprometen tráquea bronquios, bronquiolos, alvéolos y parénquima pulmonar. El diagnóstico etiológico presenta dificultades porque depende de la calidad de la muestra, por lo que se debe evitar la posible contaminación orofaríngea. Las muestras para estudio de infecciones del tracto respiratorio bajo son generalmente expectoraciones, aspirados traqueales y lavados broncoalveolares. ALCANCE


Tecnólogo Médico: Responsable de la lectura e interpretación de tinción de gram directa de muestra, evaluación del cultivo, identificación de las cepas en desarrollo, de realizar los inóculos para antibiogramas si corresponde, y de la validación del informe. Técnico paramédico: Responsable de la siembra de la muestra en los medios establecidos y de realizar frotis DEFINICIONES

Expectoración espontánea: Obtención de esputo por parte del paciente, para diagnóstico en cuadros de neumonías adquiridas en la comunidad (NAC) o estudio de TBC. Expectoración inducida: Obtención de esputo en paciente que no puedan expectorar por sí solos, para diagnóstico en cuadros de neumonías adquiridas en la comunidad, intrahospitalarias o control en pacientes con fibrosis quística. Aspirado traqueal o endotraqueal: Es la muestra obtenida por la aspiración a través del tubo endotraqueal, se usa en pacientes intubados y con ventilación mecánica. Fibrobroncoscopia: procedimiento que tiene por objeto la obtención de muestras de la vía aérea o al segmento pulmonar. Las muestras más empleadas son el cepillado bronquial, el lavado broncoalveolar (LBA), pero también se emplean el lavado bronquial y la biopsia transbronquial. Lavado Bronquial: Consiste en la instilación de suero fisiológico estéril en un bronquio, seguida de una aspiración inmediata para recoger la muestra. La muestra recogida no representa material bronquiolar ni alveolar y es equivalente a un aspirado endotraqueal. Lavado Broncoalveolar: Es una mezcla entre secreciones bronquiales y suero fisiológico y es obtenido por medio de un fibrobroncoscopio en el segmento del bronquio afectado. Placa agar MacConkey: es un medio de cultivo selectivo y diferencial usado para el aislamiento y estudio de bacilos gram negativos. Placa de agar sangre: medio de cultivo enriquecido y no selectivo que permite el crecimiento de la mayoría de las bacterias habituales y levaduras. Placa de agar Chocolate: medio de cultivo enriquecido y no selectivo, contiene suplemento nutritivo que permite la recuperación de microorganismos fastidiosos como Haemophilus spp. MATERIALES, EQUIPOS Y SOFTWARE Insumos: Medios de Cultivo: placa Agar Sangre, Agar MacConkey, Agar chocolate suplementado, Agar Sabouraud y medios para identificación. Suero fisiológico estéril en tubos de 5 ml y 9,9 mL

Portaobjetos, kit para Tinción de Gram Pipetas Pasteur Micropipeta y puntas estériles


Perlas de vidrio estériles Asas estériles Equipos: estufa de incubación, mechero, vórtex Software: Omega DESARROLLO DEL PROCESO

1. Recepción, ingreso y numeración: se sigue el procedimiento común de muestras microbiológicas. 2. Para el procesamiento primero se realiza tinción de gram y luego la siembra. 2.1 Evaluación de calidad de la muestra: por medio de la Tinción de Gram, en donde se evalúa la presencia de células epiteliales y de polimorfonucleares, lectura a objetivo 10X por lo menos 10 campos.

- Células epiteliales: se evalúa si hay presencia de 10 o más células por campo. - Polimorfonucleares: se cuantifica más de 25 pmn por campo, Entre 10 y 25 pmn por campo y

Menos de 10 pmn por campo Criterio de rechazo de la muestra: está dado por la presencia de 10 o más células por campo lo que indica contaminación con flora respiratoria alta, siendo poco representativa del tracto respiratorio inferior. 3. Siembra: responsabilidad de técnicos paramédicos. Es de acuerdo al tipo de muestra y del volumen que llega al laboratorio. Debe ser sembrada lo antes posible. Se describen a continuación las técnicas para el procesamiento según muestra (ver anexo 1 Tabla resumen) 3.1 Expectoración y aspirados endotraqueales con volumen menor a 0.5 mL, se realiza cultivo simple (o cualitativo) Aspirado endotraqueal en horario inhábil se realiza cultivo simple Vorterear muestra por lo menos 1 minuto o hasta que este homogénea. Seleccionar la porción más purulenta de la muestra Con pipeta recoger una porción de la muestra e inocular en cada placa. Sembrar y aislar con asa estéril en tres cuadrantes. 3.2 Aspirado endotraqueal, en horario hábil, se realiza cultivo cuantitativo:

1. Vorterear la muestra hasta que esté homogénea 2. Diluir con suero fisiológico 0.9% agregando igual cantidad de suero que volumen de la muestra. 3. Agitar la muestra con las perlas de vidrio estériles durante 2 a 3 minutos. 4. Extraer con micropipeta 100 µL (0,1 mL) de muestra y diluir con 9,9 mL de suero fisiológico 0.9%, agitar.

(Dilución 1:100) 5. Sembrar 100 µL (0,1 mL) de esta dilución en placa de agar sangre y agar Mac Conkey. Marcar estas placas

como D1 6. Sembrar 10 µL (con asa estéril de 10) las placas de agar sangre y agar MacConkey marcadas como D2 con

estría unidireccional. 3.3. Lavado broncoalveolar: se realiza cultivo cuantitativo

Homogeneizar la muestra En mitad de cada placa sembrar con asa de 1 uL haciendo una línea central y luego pasando por la línea en forma de zig zag. En la otra mitad de la placa sembrar de igual modo pero con un asa de 10 uL. Si se solicita hongos sembrar cuatro tubos de sabouraud.

4. Incubación de las placas MacConkey es en atmósfera normal a 35 - 37 °C y las placas sangre y chocolate en atmósfera de 5% CO2 a 35°C. A las 24 horas de incubación la mitad de los tubos sabouraud se deja incubando a temperatura ambiente y la otra mitad se mantiene a 35-37°C. 5. Las muestras se almacenan en un contenedor destinado para tal fin hasta completar el estudio microbiológico y se realice el informe final. 6. Las placas de cultivo son observadas al día siguiente por el profesional a cargo discriminando entre desarrollo de flora habitual del desarrollo de microorganismos patógenos, si corresponde se hará recuento de colonias, identificación y estudio de susceptibilidad. Las muestras negativas se vuelven a incubar hasta completar su tiempo de estudio.


Interpretación del cultivo: el responsable es el Tecnólogo Médico. Son de importancia clínica Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Bacilos gram negativos, Nocardia, Haemophilus spp, entre otros. Si es predominante se informa Moraxella spp. En los cultivos cuantitativos el recuento indica probabilidad de colonización o infección por el microorganismo aislado. También se debe informar si hubo desarrollo de flora habitual.

Se considera para la descripción cualitativa de cantidad:

Informe Desarrollo en las placas de cultivo Muy escaso desarrollo Crecimiento de muy pocas colonias aisladas (1 a 3 cols) Escaso desarrollo crecimiento en primera parte de la siembra en placa Moderado desarrollo crecimiento en la primera y segunda parte de la siembra en placa Abundante desarrollo crecimiento en la primera, segunda y tercera parte de la siembra en

placa Interpretación de recuento cuantitativo:

Aspirado endotraqueal Placas dilución 1(D1) Placas dilución 2 (D2)

1 colonia = 2.000 UFC/ mL (2 x 103) 1 colonia = 20.000 UFC/ mL (2 x 104) Ausencia colonias = <10 3 UFC/ mL Ausencia colonias = <10 4 UFC/ mL 50 colonias = 100.000 UFC/ mL 50 o más colonias en D2 = >106 UFC/ mL

Lavado broncoalveolar nº colonias x 1.000 (siembra con asa de 1 µL)

nº colonias x 100 (siembra con asa de 10 µL)

Tiempo de respuesta: Cultivo negativo a las 72 hrs.

Cultivo positivo: 48 a 96 hrs. hábiles Cultivo no apto: dentro del día hábil.

Informe: Tinción de gram

Cultivo no apto: Muestra respiratoria rechazada, Gram de screening alterado Cultivo negativo: Negativo a las 72 horas hábiles. Cultivo positivo: se indica el recuento si corresponde. Hubo desarrollo ........... de .............. con su correspondiente antibiograma. El informe debe incluir un detalle de cada microorganismo aislado, con su recuento y antibiograma correspondiente.

Registros: El resultado quedará registrado en sistema informático y en reverso de orden de examen. REFERENCIAS

Fica A., Cifuentes M. y Hervé B. Comité de Infecciones Intrahospitalarias, Sociedad Chilena de Infectología. Actualización del Consenso “Neumonía asociada a ventilación mecánica” Primera parte. Aspectos diagnósticos. Rev Chil Infect 2011, 28(2):130.-151 ANEXOS

Anexo 1: Resumen de tipo de cultivo según muestra

Muestra Tipo de cultivo a realizar Expectoración Siempre Cultivo simple Aspirado endotraqueal Volumen < 0.5 mL Cultivo simple Aspirado endotraqueal Volumen > 0.5 mL en horario hábil Cultivo cuantitativo Aspirado endotraqueal En horario inhábil Cultivo simple Lavado broncoalveolar Siempre Cultivo cuantitativo


Nº 10. PROCEDIMIENTO PARA CULTIVO DE SECRECIONES DE PIEL Y TEJIDOS BLANDOS

OBJETIVO Realizar procesamiento de las muestras clínicas de acuerdo a métodos estandarizados, para identificar la presencia de microorganismos causantes de infecciones de piel y tejidos blandos, incluyendo a todas aquellas que afectan a piel, tejidos subcutáneo y muscular.

ALCANCE


Tecnólogo Médico: Responsable de la evaluación del cultivo, identificación de las cepas en desarrollo, de realizar los inóculos para antibiogramas si corresponde, y de la validación del informe. Técnico paramédico: Responsable de la siembra de la muestra en los medios establecidos y de realizar frotis DEFINICIONES

Placa agar Mac Conkey: es un medio de cultivo selectivo y diferencial usado para el aislamiento y estudio de bacilos gram negativos. Placa de agar sangre: medio de cultivo enriquecido y no selectivo que permite el crecimiento de la mayoría de las bacterias habituales y levaduras. Caldo Thioglicolato: medio que contiene medios nutritivos para el crecimiento de bacterias aerobias y anaerobias MATERIALES, EQUIPOS Y SOFTWARE

Insumos: Medios de cultivo: placa agar Sangre, agar MacConkey, caldo thioglicolato Portaobjetos

kit para Tinción de Gram Pipetas pasteur asa estéril medios de cultivos y kits para identificación bacteriana Equipos: estufa de incubación atmósfera normal, mechero Software: Omega DESARROLLO DEL PROCESO

1. Recepción, ingreso y numeración: se sigue el procedimiento común de muestras microbiológicas. 2. Siembra: responsable es el Técnico Paramédico.

La muestra generalmente llegará en tórula con medio de transporte Stuart o tórula estéril sin medio de transporte. Debe ser sembrada lo antes posible después de haber sido tomada, mantenida a tº ambiente (ver Manual de Toma de Muestras) Si la muestra viene en tórula seca se debe sembrar lo antes posible (2 horas), en caso que venga en un medio de transporte (Stuart) se puede mantener hasta 8 horas a temperatura ambiente. Se procede a realizar siembra en los medios de cultivo correspondiente según tipo de muestra, según técnica de siembra descrita en Procedimiento de Siembra de muestras para cultivos aeróbicos de este manual. Se siembra en tres cuadrantes cada placa de medio de cultivo y se realiza frotis para gram. En el caso de muestras de trozos de tejidos blandos (biopsia de piel, tejido subcutáneo, tejido muscular, fascia, etc) se procederá según lo descrito en procedimiento nº 11: Cultivos de tejido óseo. En un mortero


estéril se coloca la muestra con un poco de caldo soya o tioglicolato y se macera hasta obtener una muestra homogénea. Luego por medio de pipeta pasteur se siembra en tres cuadrantes en placa agar sangre y placa agar MacConkey además de realizar dos frotis para gram. Después de finalizada la siembra, las muestras se almacenan en un contenedor destinado para tal, hasta la obtención del informe final.

3. Las placas se incuban en estufa de cultivo a 35° a 37ºC a atmósfera normal por 18 a 24 hrs. 4. Las placas de cultivo ya incubadas son observadas al día siguiente por el Tecnólogo Médico a cargo para

determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio, teniendo en cuenta los microorganismos de importancia clínica en cada caso (ver interpretación de cultivo). Según esto se realiza pruebas de identificación de microorganismo y estudio de susceptibilidad. En cambio las muestras que estén negativas se dejarán en incubación hasta un período de 48 horas.

5. Se considera para la descripción cualitativa de cantidad:

Informe Desarrollo en las placas de cultivo

Muy escaso desarrollo Crecimiento de muy pocas colonias aisladas Escaso desarrollo crecimiento en primera parte de la siembra en placa Moderado desarrollo crecimiento en la primera y segunda parte de la siembra en placa Abundante desarrollo crecimiento en la primera, segunda y tercera parte de la siembra en

placa

6. Interpretación del cultivo: el responsable es el Tecnólogo Médico. Este tipo de muestra tiene una alta probabilidad de desarrollarse flora habitual que puede ser del mismo paciente como del ambiente. Se informa como desarrollo de flora habitual cuando hay presencia de Corynebacterium spp., Staphylococcus coagulasa negativo, Neisseria spp. no patógenas, y estreptococos alfa y no-hemolítico. Puede haber excepciones, se estudiaran cuando se encuentren en estado puro y se relacione con la clínica del paciente. Se informan como microorganismos patógenos a estreptococos beta-hemolíticos, Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa y otros bacilos gramnegativos como las Enterobacteriaceae, tanto en las heridas agudas como en las crónicas.

Tiempo de respuesta:

Cultivo negativo a las 48 horas, (si muestra corresponde a tejido se incuba 72 hrs) Cultivo positivo: 48 a 96 hrs. hábiles

Informe: Tinción de Gram. Cultivo negativo a las 48 horas hábiles

Cultivo positivo: se informa Hubo desarrollo de ........ cantidad de .............. con su antibiograma.

Registros: El resultado quedará registrado en sistema informático y en reverso de orden de examen.


Nº 11. PROCEDIMIENTO CULTIVO DE TEJIDO ÓSEO

OBJETIVO Realizar procedimientos para el diagnóstico microbiológico de infecciones de huesos y de tejidos obtenidos mediante biopsia de acuerdo a métodos estandarizados para obtener resultados confiables.

ALCANCE


Tecnólogo Médico: Responsable de la evaluación del cultivo, identificación de las cepas en desarrollo, de realizar los inóculos para antibiogramas si corresponde, y de la validación del informe. Técnico paramédico: Responsable de la siembra de la muestra en los medios establecidos y de realizar frotis DEFINICIONES

Biopsia: procedimiento con técnica aséptica en que obtiene muestras de tejido para su posterior análisis microbiológico e histopatológico. Placa Agar Mac Conkey: es un medio de cultivo selectivo y diferencial usado para el aislamiento y estudio de bacilos gram negativos. Placa de Agar sangre: medio de cultivo enriquecido y no selectivo que permite el crecimiento de la mayoría de las bacterias habituales y levaduras. Caldo Tioglicolato: medio que contiene medios nutritivos para el crecimiento de bacterias aerobias y anaerobias MATERIALES, EQUIPOS Y SOFTWARE

Insumos: Medios de Cultivo (placa agar sangre, agar Mac Conkey, caldo tioglicolato Portaobjetos, kit para Tinción de Gram Pipetas pasteur Mortero Equipos: estufa de incubación, mechero Software: Omega DESARROLLO DEL PROCESO

1. Recepción, ingreso y numeración: se sigue el procedimiento común de muestras microbiológicas. 2. Siembra: responsable es el Técnico paramédico y de acuerdo al horario de recepción se realiza siguiente

procedimiento:

Horario hábil: En un mortero estéril se coloca la muestra con un poco de caldo soya o tioglicolato y se macera hasta obtener una muestra homogénea. Luego por medio de pipeta pasteur se siembra en tres cuadrantes en placa agar sangre y placa agar MacConkey además de realizar dos frotis para gram. Si la muestra es un tejido que no se puede macerar (ej cartílago o hueso denso) se coloca caldo thioglicolato en el frasco de la muestra en cantidad suficiente para dejar la muestra totalmente inmersa. Horario inhábil Se agrega al frasco en que viene la muestra caldo tioglicolato, en cantidad suficiente para dejar la muestra totalmente


inmersa en el caldo, (como alternativa se puede usar caldo soya)

3. Incubación en estufa de cultivo a 35° a 37ºC a atmósfera normal por 18 a 24 hrs. 4. Las muestras deben guardarse refrigeradas hasta obtener el resultado del cultivo. 5. Las placas de cultivo incubadas son observadas al día siguiente por el profesional a cargo. Aquellas muestras

consideradas positivas se realiza identificación microbiana y estudio de susceptibilidad. Las muestras negativas se mantienen en incubación, hasta su informe final siendo revisadas cada día. Las muestras que están en caldo se siembran con el mismo procedimiento del horario hábil, se observa si presenta turbidez cada día y antes de completar los cinco días de estudio se traspasa a placas de agar sangre y agar Mac Conkey.

6. Interpretación del cultivo: el responsable es el Tecnólogo médico

La presencia de microorganismo de flora habitual solo se informará si es clínicamente significativa. Se consideran patógenos a estreptococos beta-hemolíticos, Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Pseudomonas aeruginosa y otros bacilos gramnegativos como las Enterobacteriaceae. Aunque cabe considerar que por ser este tipo de muestras normalmente estériles, cualquier microorganismo podría tener significado clínico. La presencia de bacterias anaerobias se puede observar por la presencia de turbidez en caldo tioglicolato, las placas incubadas en atmósfera normal serán negativas. En estos casos la tinción de gram del caldo turbio y el gram directo de la muestra pueden orientar a la presencia de anaerobios.

7. Tiempo de respuesta: Cultivo negativo 5 días hábiles Cultivo positivo: 48 a 72 hrs. hábiles

8. Informe: Tinción de Gram: si la muestra es sugerente de presencia de anaerobios agregar comentario.

Cultivo negativo a los 5 días de incubación Cultivo positivo: Hubo desarrollo de.................. con su correspondiente antibiograma

9. Registros: El resultado quedará registrado en sistema informático y en reverso de orden de examen.


Nº 12. PROCEDIMIENTO DE CULTIVOS DE SECRECIONES INTRAABDOMINALES

OBJETIVO Realizar procesamiento de las muestras de secreciones intraabdominales de acuerdo a métodos

estandarizados, para identificar la presencia de microorganismos causantes de cuadros infecciosos de esta localización. Esto incluye secreciones de peritonitis secundaria y terciaria, colecciones intraabdominales y retroperitoneales, y bilis. Se excluyen las muestras de líquido peritoneal o ascítico de peritonitis primaria (peritonitis bacteriana espontánea que se incluye en Cultivo de líquidos estériles)

INTRODUCCIÓN

La peritonitis bacteriana se produce por la contaminación de la cavidad abdominal por materia intestinal o del tracto genito-urinario, puede ser secundaria a una apendicitis o a una diverticulitis u otro proceso en que se produzca perforación del tracto intestinal, necrosis isquémica de la pared o por translocación bacteriana. Los abscesos intraabdominales pueden corresponder a infecciones intraabdominales evolucionadas que se presentan ya como abscesos intraabdominales en el momento del diagnóstico inicial. Las peritonitis secundarias también pueden ser postoperatorias (por dehiscencia de sutura o perforación iatrogénica) o pueden aparecer tras un traumatismo abdominal penetrante o cerrado (peritonitis postraumáticas). La peritonitis bacteriana espontánea (PBE) en adultos se presenta en pacientes con cirrosis hepática y ascitis. En general la peritonitis secundaria suele estar causada por una flora polimicrobiana mixta aerobia y anaerobia con predominio de enterobacterias, E.faecalis, Bacteroides fragilis y estreptococos anaerobios ALCANCE

Sección de microbiologia, servicio laboratorio clínico Técnicos paramédicos, tecnólogos médicos y medico microbiólogo de sección microbiología. RESPONSABILIDAD

Tecnólogo Médico: Responsable de la evaluación del cultivo, identificación de las cepas en desarrollo, de realizar los inóculos para antibiogramas si corresponde, y de la validación del informe. Técnico paramédico: Responsable de la siembra de la muestra en los medios establecidos y de realizar frotis para tinción. DEFINICIONES

Placa agar Mac Conkey: es un medio de cultivo selectivo y diferencial usado para el aislamiento y estudio de bacilos gram negativos. Placa de agar sangre: medio de cultivo enriquecido y no selectivo que permite el crecimiento de la mayoría de las bacterias habituales y levaduras. DESARROLLO DEL PROCESO

MUESTRA: Líquido peritoneal, líquido abdominal, líquido biliar o bilis, líquido pancreático, colección abdominal, absceso pared abdominal u otro contenido: hepático, vesicular, mesentérico, renal.


SIEMBRA: En los medios establecidos (placa de agar sangre y agar Mac Conkey) realizando aislamiento en tres cuadrantes y según procedimiento descrito (Procedimiento nº 1: Siembra de muestras para cultivos aeróbicos). En caso de solicitar estudio de anaerobios se procederá de acuerdo a procedimiento descrito para ello (nº 16: Cultivos de bacterias anaerobias). DIAGNOSTICO MICROBIOLÓGICO: Informe de tinción de gram Cultivo: Se estudiarán todos los microorganismos predominantes o microbiológicamente relevantes, desarrollados en los medios de cultivos, de acuerdo a evaluación realizada por TM. TIEMPO DE RESPUESTA:

a. Cultivo negativo a las 72 horas b. Cultivo positivo: preinforme a las 24 o 48 hrs. según corresponda Informe definitivo de cultivo y antibiograma a las 48 o 72 horas hábiles (excepcionalmente puede requerir más tiempo (cepas de lento crecimiento, cultivos mixtos, necesidad de repetición de pruebas de identificación y/o susceptibilidad)

INFORME

a. Negativo a las 72 hrs. b. Cultivo positivo: Hubo desarrollo de: …… Antibiograma (si corresponde)

REGISTROS: El resultado quedará registrado en sistema informático Omega y en reverso de orden de examen.


13. CULTIVOS DE SECRECIONES DEL APARATO GENITAL

OBJETIVO Realizar el procesamiento de muestras de secreciones del aparato genital de acuerdo a métodos estandarizados, para el diagnóstico microbiológico de infecciones de esta localización. También se aplica al estudio de portadores de algunos agentes (ejemplo: Streptococcus agalactiae en mujeres embarazadas)

ALCANCE


Tecnólogo Médico: responsable de la lectura e interpretación de tinción de gram directa de muestra y examen al fresco, evaluación del cultivo, identificación de las cepas obtenidas y de la validación del informe. Técnico paramédico: Responsable de la siembra de la muestra en los medios establecidos y de realizar los frotis según corresponda. MATERIALES, EQUIPOS Y SOFTWARE

Insumos: Medios de Cultivo: placa Agar Sangre, Agar chocolate, agar Thayer Martin, agar Sabouraud, caldo Todd Hewitt y medios para identificación.

Tubos con suero fisiológico estéril Portaobjetos, kit para Tinción de Gram Pipetas Pasteur Asas estériles Equipos: estufa de incubación, mechero, vórtex Software: Omega DESARROLLO DEL PROCESO

1. SECRECION URETRAL La uretritis (inflamación del conducto por donde pasa la orina en el hombre) se subdivide en gonocócica (causada por Neisseria gonorrhoeae) y no gonocócica (causada por Chlamydia trachomatis y Ureaplasma urealyticum). Material:

Tórula estéril con Stuart Agar Sangre – Agar Chocolate – Agar Sabouraud Agar Thayer Martin (para cultivo de gonococo)

Muestra: 1° tórula para cultivo corriente 2° tórula para cultivo de gonococo y gram

Procedimiento: 1. Recepción, ingreso y numeración: se sigue el procedimiento común de muestras microbiológicas. 2. Siembra: 2.1. Inocular con la tórula en el primer cuadrante de la placa agar sangre y placa agar chocolate. 2.2. Sembrar en el Agar Sabouraud en estría. 2.3. Inocular con la 2ª tórula en primer cuadrante de placa de agar Thayer Martin 2.3. Realizar un frotis, girando suavemente (nunca frotar) en un área no mayor a 2 cm. con la tórula. 2.4. Diseminar todas las placas, en 3 cuadrantes, esterilizar el asa entre 1° - 2° cuadrante. Terminar en estría. 3. Incubar a 35-37 °C en estufa CO2 las placas de agar sangre, agar thayer Martin y agar chocolate; y en estufa normal el agar Sabouraud.


4. Las placas de cultivo ya incubadas son observadas al día siguiente por el Tecnólogo Médico a cargo para determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio, teniendo en cuenta los microorganismos de importancia clínica en cada caso. Según esto se realiza pruebas de identificación de microorganismo y estudio de susceptibilidad. En cambio las muestras que estén negativas se dejarán en incubación hasta un período de 48 horas. Si hay desarrollo de diplococos gram negativos, se realizan pruebas bioquímicas para Neisseria (oxidasa y sistema comercial pruebas bioquímicas). Informe: Tinción de Gram: Cuando existe sospecha de gonorrea, la tinción de Gram es suficiente para confirmar el diagnóstico clínico, aunque igual debe realizarse el cultivo. En infecciones agudas por gonococo, se observan diplococos gram negativos, intra y extracelulares, con aspecto de granos de café. En las formas crónicas o en el inicio de la enfermedad, pueden hallarse diplococos gram negativos solo extracelulares. Cultivo corriente y gonococo: informe final 48 – 72 hrs hábiles.

2. FLUJO VAGINAL / SECRECION VAGINAL Las infecciones vaginales son principalmente causadas por Trichomonas vaginalis, Candida albicans o se trata de una vaginosis bacteriana. En niñas prepúberes pude haber infecciones por otros agentes como Enterobacterias, Streptococcus pyogenes, entre otros. A estas muestras se realiza: cultivo corriente Cultivo de hongos (levaduras) Tinción de Gram Examen al fresco Cultivo de gonococo sólo a niñas prepúberes en caso de sospecha. En resto de pacientes

siempre debe ser muestra cervical Material:

Agar Sangre – Agar Chocolate – Agar Sabouraud Agar Thayer Martin (sólo si se solicita cultivo de gonococo) Considerar que las muestras vaginales no son la muestra indicada para estudio de gonococo, sólo se aplicará estudio para pacientes menores.

Muestra: Debe venir con 2 tórulas (para cultivo corriente, cultivo de hongos, gram y examen al fresco) Procedimiento: 1. Recepción, ingreso y numeración: se sigue el procedimiento común de muestras microbiológicas. 2. Siembra: 2.1. Inocular con la tórula en el primer cuadrante de la placa agar sangre y placa agar chocolate. 2.2. Sembrar en el Agar Sabouraud en estría. 2.3. Realizar un frotis, girando suavemente (nunca frotar) en un área no mayor a 2 cm. con la tórula. 2.4. Diseminar en 3 cuadrante, esterilizar el asa entre 1° - 2° cuadrante. Terminar en estría. 3. Incubar a 35-37 °C en estufa CO2 las placas de agar sangre y agar chocolate; y en estufa normal el agar Sabouraud 4. Las placas de cultivo ya incubadas son observadas al día siguiente por el Tecnólogo Médico a cargo para determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio, teniendo en cuenta los microorganismos de importancia clínica en cada caso. Según esto se realiza pruebas de identificación de microorganismo y estudio de susceptibilidad si corresponde. En cambio las muestras que estén negativas se dejarán en incubación hasta un período de 48 horas.

Informe Tinción de gram Examen al fresco: en la observación directa se informan células descamativas, leucocitos y bacterias, debe informarse la presencia o ausencia de elementos compatibles con Trichomonas vaginalis y levaduras Cultivo corriente, de hongos y gonococo: informe final 48 – 72 hrs. hábiles

3. SECRECIÓN CERVICAL La secreción cervical es aquella que proviene del cérvix (cuello uterino); la infección cervical (cervicitis) es, por lo general, causado por Neisseria gonorrhoeae y Chlamidia trachomatis


Material: Tórula estéril con Stuart Agar Sangre Agar Thayer Martin (para cultivo de gonococo)

Muestra: Una tórula para cultivo corriente y cultivo de gonococo y gram

Procedimiento: 1. Recepción, ingreso y numeración: se sigue el procedimiento común de muestras microbiológicas. 2. Siembra: 2.1. Inocular con la tórula en el primer cuadrante de la placa agar sangre y Thayer Martin. 2.2. Diseminar en 3 cuadrante, esterilizar el asa entre 1° - 2° cuadrante. Terminar en estría. 3. Incubar a 35-37 °C en estufa CO2 las placas de agar sangre y agar Thayer Martin, y en estufa normal el agar Sabouraud. 4. Las placas de cultivo ya incubadas son observadas al día siguiente por el Tecnólogo Médico a cargo para determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio, teniendo en cuenta los microorganismos de importancia clínica en cada caso. Según esto se realiza pruebas de identificación de microorganismo y estudio de susceptibilidad. En cambio las muestras que estén negativas se dejarán en incubación hasta un período de 48 horas. Si hay desarrollo de diplococos gram negativos, se realizan pruebas bioquímicas para Neisseria (oxidasa y sistema comercial pruebas bioquímicas). Informe: Cultivo corriente y gonococo: informe final 48 – 72 hrs hábiles.

4. SECRECION INTROITO / SECRECION PERIANAL Consiste en la pesquisa de la colonización vaginal y/o rectal de Streptococcus beta hemolítico grupo B (S agalactiae) a las mujeres embarazadas entre las 35 y 37 semanas para luego administrar antibióticos intraparto a aquellas con cultivos positivos. Materiales: Agar Sangre Caldo Todd Hewitt Tórula estéril con medio de transporte Stuart Muestra: Debe venir en medio transporte stuart En la orden de examen, vendrá como: secreción perianal, introito, o portación de Streptococcus β hemolítico grupo B. Procedimiento: 1. Introducir la tórula del medio de transporte en caldo todd hewitt 2. incubar por 3 hrs. a 37º C en estufa normal 3. después del período de incubación, agite la tórula en el caldo 4. saque la tórula del caldo y sembrar en la placa agar sangre 5. diseminar en 3 cuadrante, esterilizar el asa entre 1° - 2° cuadrante, terminar en estría. 6. incubar placa de agar sangre a 35-37 °C en estufa normal por 24 a 48 hrs. 7. Las placas de cultivo ya incubadas son observadas al día siguiente por el Tecnólogo Médico a cargo para determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio. Informe: Cultivo corriente: informe final 48 – 72 hrs hábiles


14. CULTIVOS MICROBIOLÓGICOS DE INSUMOS CLÍNICOS OBJETIVO

Realizar procesamiento de acuerdo a métodos estandarizados, de muestras de soluciones preparadas que son administradas a pacientes por vía oral o parenteral, con fines terapéuticos, para el estudio de eventos adversos asociados a contaminaciones de estas soluciones. Este documento incluye cultivo de:

Hemoderivados Nutrición parenteral

ALCANCE

Sección de microbiologia, servicio laboratorio clínico Técnicos paramédicos, tecnólogos médicos y médico microbiólogo de sección microbiología. RESPONSABILIDAD

Tecnólogo medico: responsable de la evaluación del cultivo, identificación de as cepas obtenidas y de la validación del informe. Técnico paramédico: responsable de la siembra de la muestra según el procedimiento y de ingresar los viales de cultivo al equipo automatizado. DEFINICIONES

Hemoderivados: componentes derivados de sangre usados para transfusión a pacientes Nutrición parenteral (NP): solución que contiene una mezcla de nutrientes, que se administra por vía parenteral a través de un catéter de acceso vascular central o periférico según el tipo de NP. En el hospital se uitilizan soluciones listas para su uso de fabricación comercial. DESARROLLO DEL PROCESO

1. CULTIVO DE HEMODERIVADOS 1.1 Objetivo: Identificar presencia o ausencia de microorganismos en concentrado de glóbulos rojos, plasma, sangre total u otro hemoderivado. Se realiza en caso de presentarse alguna reacción adversa en un paciente que esté siendo transfundido. 1.2 Materiales e insumos

- vial de hemocultivo aerobio para adulto - placa de agar sangre - jeringas

1.3 Instrumentación o equipos y accesorios - estufa de incubación atmósfera normal - campana de flujo laminar para siembra - Equipo automatizado de hemocultivos


1.4 Procedimiento: 1.4.1 La vía de infusión del hemoderivado al paciente, debe ser retirada por el tecnólogo médico de banco de sangre y enviada al laboratorio de microbiología con todos los datos del paciente. El estudio microbiológico incluye bacterias aerobias y hongos. 1.4.2 Técnico paramédico que recepciona debe:

• verificar rotulación de bolsa. • verificar funcionamiento de gabinete de bioseguridad • lavado de manos clínico • retire bolsa externa • colocarse guantes • desinfecte la superficie de la bolsa con alcohol a 70° utilizando algodón estéril. Las tórulas de algodón se

pasan sólo una vez y se eliminan. • Repita este procedimiento en a lo menos 2 oportunidades. • retire sello de 1vial de hemocultivo adulto y desinfecte goma con alcohol 70°. • con jeringa estéril atraviese bolsa en el lugar desinfectado. • aspire 8- 10 cc. e introduzca estos 8 a 10 cc en un vial adulto. • luego siembre en agar sangre unas gotas del conector de la bolsa. Disemine en 3 cuadrantes, sin

esterilizar el asa entre cuadrantes • incubar las placas en estufa CO2 a 35-37°. • ingrese vial a equipo automatizado de hemocultivos. No olvide rotular el vial.

1.4.3 Diagnóstico microbiológico: Si el equipo entrega alarma de positividad, realizar tinción de gram y siembra en placas de agar sangre y mac conkey y posteriormente se realiza el estudio de identificación bacteriana con procedimientos habituales ya sea en caso de aerobios u hongos. 1.5 Informe

- si no hay crecimiento, se informa como: negativo a los 10 días de incubación. - si existe crecimiento: se informa el microorganismo aislado.

1.6 Registros Sistema informático del laboratorio. Reverso de orden de examen guardada en sobre correspondiente. 2. CULTIVO DE NUTRICIÓN PARENTERAL 2.1 Objetivo: Identificar presencia o ausencia de microorganismos en la nutrición parenteral. Se realiza en caso de sospecha de bacteremia asociada a nutrición parenteral (si proviene de un paciente), o como evaluación indirecta de la técnica aséptica, en la preparación de dicha nutrición (como control de calidad). El estudio microbiológico de la nutrición parenteral incluye bacterias aerobias, anaerobias, anaerobias facultativas y hongos. 2.2. Materiales e insumos:

- viales de hemocultivos: 1 frasco aerobio para adultos y 1 frasco anaerobio. - agar sangre - jeringas

2.3 Instrumentación o equipos y accesorios - estufa de incubación corriente - campana de flujo laminar para siembra - Equipo automatizado de hemocultivos


2.4 Procedimiento: 2.4.1 Técnico paramédico que recepciona debe:

• verificar rotulación de bolsa. • verificar funcionamiento de gabinete de bioseguridad • lavado de manos clínico • retire bolsa externa • colocarse guantes

2.4.2 desinfecte la superficie de la bolsa con alcohol a 70° utilizando algodón estéril. Las tórulas de algodón se pasan sólo una vez y se eliminan.

• Repita este procedimiento en por lo menos 2 oportunidades. • Retire sello de vial de hemocultivos adulto aerobio y desinfecte goma con alcohol 70° • Con jeringa estéril atraviese bolsa en el lugar desinfectado. • Aspire 8- 10 cc. e introduzca estos 8 a 10 cc en el vial adulto.

2.4.3 Nuevamente realice desinfección de bolsa • retire sello de hemocultivo anaerobio y desinfecte tapón de goma con alcohol 70º • abra nueva jeringa • aspire 8- 10 cc. e introduzca estos 8 a 10 cc en un vial anaerobio

2.4.4 Luego siembre en agar sangre varias gotas del conector de la bolsa. Disemine en 3 cuadrantes, sin esterilizar el asa entre cuadrantes. Incubar placa en estufa CO2 a 35-37°. Nota: la nutrición parenteral proveniente de farmacia no llegará con conector o bajada de suero.

2.4.5 Ingrese viales a equipo automatizado de hemocultivos. No olvide rotular los viales.

2.5 Diagnóstico microbiológico: Si el equipo entrega alarma de positividad, realizar tinción de gram y siembra en placas de agar sangre y mac conkey y posteriormente el estudio de identificación bacteriana de los cultivos con procedimientos habituales ya sea en caso de aerobios, aerobios facultativos, anaerobios u hongos. 2.6 Informe

- si no hay crecimiento en ambos viales, se informa como: negativo - si existe crecimiento en uno o más viales: se informa el microorganismo aislado.

2.7 Registros Sistema informático del laboratorio. Reverso de orden de examen guardada en sobre correspondiente.


Nº 15. PROCEDIMIENTO DE ESTUDIO DE SUSCEPTIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS

OBJETIVO

Determinar la susceptibilidad de un microorganismo a uno o varios antimicrobianos, de acuerdo a métodos estandarizados, con el propósito de emplear en una primera aproximación, su resultado como factor predictivo de la eficacia clínica de la terapia en el paciente. En este procedimiento se describen:

Antibiograma por difusión en agar o Técnica de Kirby-Bauer Antibiograma por difusión-dilución en agar (E-test)

ALCANCE


Tecnólogo Médico: Responsable de definir estudio, preparación de inóculos para antibiograma, de la lectura e interpretación, registro de resultados y de la validación del informe. El TM a cargo de la muestra en estudio que requiera antibiograma es el responsable directo. Técnico paramédico: Responsable de la ejecución de los antibiogramas por difusión en agar con los inóculos de las cepas ya preparados por T. médico. DEFINICIONES

Antibiograma: estudio en que se define la actividad in vitro de un antibiótico frente a un microorganismo determinado y refleja su capacidad para inhibir el crecimiento de una bacteria o población bacteriana El término sensible indica que la infección ocasionada por la cepa para la que se ha determinado la CMI o su correspondiente halo de inhibición puede tratarse de forma adecuada empleando las dosis habituales de antimicrobiano, en función del tipo de infección y de la especie considerada. El término intermedio indica que el halo de inhbición traducido en valores de CMI se aproxima a las concentraciones de antimicrobiano alcanzables en sangre o tejidos y que puede esperarse eficacia clínica en aquellas localizaciones en las que se alcanzan altas cocentraciones de antimicrobiano (p. ej. orina) o cuando se emplean dosis más elevadas de lo habitual. El CLSI también incluye en esta categoría aquellos casos de antimicrobianos con márgenes de toxicidad estrechos en los que pequeños errores técnicos podrían suponer cambios de interpretación en la categoría clínica. Finalmente, el término resistente se refiere a aquellos microorganismos que no se inhiben por las concentraciones habitualmente alcanzadas en sangre/tejidos del correspondiente antimicrobiano, o a aquellos microorganismos en los que existen mecanismos de resistencias específicos para el agente estudiado en los que no ha habido una adecuada respuesta clínica cuando se ha usado como tratamiento el correspondiente antimicrobiano. DESARROLLO DEL PROCESO

1. ANTIBIOGRAMA POR DIFUSIÓN EN AGAR (TÉCNICA DE KIRBY-BAUER) 1.1 Fundamento: El antibiograma por difusión en agar consiste en depositar, en la superficie de agar de una placa previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel filtro impregnados con los diferentes antibióticos a testear. Tan pronto el disco se pone en contacto con la superficie húmeda del agar, el antibiótico difunde al agar. Esta difusión es radial a través del espesor del agar a partir del disco formándose un gradiente de concentración. Transcurridas 18-24 horas de incubación los discos aparecen rodeados por una zona de inhibición. La concentración de antibiótico en la interfase entre bacterias en crecimiento y bacterias inhibidas se conoce como concentración crítica y se aproxima a la concentración mínima


inhibitoria (CIM) obtenida por métodos de dilución. Sin embargo, este método no permite una lectura directa del valor de la CIM. Por ello, se compara con valores definidos de punto de corte que se han extrapolado de un gran número de cepas de CIM conocidas que han estado previamente determinadas por otros métodos de determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos (ej.: método de dilución). Existen, por lo tanto, unos diámetros de inhibición, expresados en mm, estandarizados para cada antimicrobiano. La lectura de los halos de inhibición debe interpretarse como sensible (S), intermedia (I) o resistente (R) según las categorías establecidas por el CLSI , vigentes para cada año. 1.2 Materiales, equipos y software Insumos:

Placas de agar Mueller Hinton y agar Mueller Hinton sangre Sensidiscos comerciales Tórulas estériles Tubo con suero fisiológico o agua destilada estéril regla para medición de halo pinzas

Equipos: Densitómetro (medidor de turbidez) Calibrador Mac Farland 0,5 Vórtex Estufa de incubación atmósfera normal y CO2

Dispensadores de sensidiscos Software: Omega 1.3 Procedimiento 1.3.1 mantención de sensidiscos:

Todos los discos deben almacenarse en desecadores a temperaturas de menos 20° C (freezer). Los cartridge que están en uso permanecen refrigerados en el dispensador. Sensidiscos de betalactámicos como ampicilina, oxacilina, penicilina, cefazolina, cefalosporinas de 3° generación, cefoperazona-sulbactam, deben permanecer refrigerado sólo la cantidad que se usará durante la semana, el resto debe permanecer congelado. Imipenem debe siempre permanecer congelado para su uso. Deben abrirse sólo después de que la temperatura interior del contenedor se haya equilibrado con el medio ambiente, a fin de evitar la condensación de humedad en los discos. Retire del refrigerador 15-20 minutos y del congelador 1 hora antes de ser utilizados Sólo aquellos discos con fecha de expiración del fabricante dentro del plazo pueden ser usados.

1.3.2 Preparación del inóculo:

Esta es la variable que influye más poderosamente en el tamaño de la zona de inhibición. Los inóculos muy concentrados darán zonas de inhibición más pequeñas, y por el contrario, los muy diluídos darán zonas de diámetros mayores, en ambos casos se falsean los resultados. El inóculo debe estandarizarse ajustando su turbidez a la de un estándar 0,5 Mac Farland. Existen 2 métodos de preparación de inóculo método directo se toman 3-4 colonias de iguales características morfológicas de un cultivo de no más de 24 horas, y que sea de un medio no selectivo, y ajustar el inóculo a una turbidez equivalente al 0.5 de la escala de MacFarland 0.5 en suero fisiológico. Agitar en un vortex durante 15-20 segundos. La suspensión directa se realizará para todas las bacterias, a menos que exista muy pocas colonias en ese caso se realizará método de crecimiento sólo si es una enterobacteria, Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa método de crecimiento: Se toman 3 a 5 colonias de iguales características morfológicas, se suspenden en 4 a 5 ml. de caldo nutritivo (caldo Mueller Hinton). Incube a 35° C por 2 a 6 horas, hasta que alcance o exceda la turbidez estándar 0.5 MacFarland. Ajuste turbidez a 0.5 Mac Farland, con caldo Mueller Hinton. Utilice el lector de turbidez. Sólo puede ser utilizado para bacterias no fastidiosas


1.3.3 Inoculación en placas agar a utilizar: agar mueller hinton: enterobacterias

acinetobacter pseudomonas aeruginosa

burkholderia cepacia Stenotrophomonas maltophilia staphylococcus enterococcus

agar mueller hinton suplementado con 5% de sangre de cordero streptococcus pneumoniae otros streptococcus spp

Características generales del agar que debe objetivar

debe cubrir uniformemente la placa. su profundidad debe ser de 4 mm. las placas deben ser perfectamente planas.

Antes de que transcurran 15 minutos de haber ajustado el inóculo, Se sumerge una tórula estéril en tubo con el inóculo de la cepa a estudiar, haciendo rotar la tórula 2 o 3 veces y presionando firmemente la pared interior del tubo, para remover el exceso de inóculo. Se inocula toda la superficie de la placa de agar que corresponda, sin dejar ninguna zona libre. Esto se consigue pasando la tórula en tres direcciones (rotando la placa en 60° cada vez), pasando la tórula de izquierda a derecha en líneas una tras otra hasta completar toda la placa, en cada dirección se realiza lo mismo. Dejar secar la superficie entre 3 a 5 minutos, pero nunca más de 15 minutos, la tapa de la placa puede quedar entreabiertas. Esto se realiza para permitir que el exceso de humedad de la superficie se absorba antes de aplicar el disco con el antibiótico.

1.3.4 Aplicación de sensidiscos

Se aplican los discos con los antimicrobianos a determinar. Esto puede ser con dispensadores automáticos o utilizando pinzas. Los sensidiscos no pueden estar más próximos entre sí que una distancia de 24 mm. , medida de centro a centro de los discos. No más de 9 sensidiscos en placa de 10cm Un disco no debe ser relocalizado una vez que haya tomado contacto con la superficie del agar.

1.3.5 Incubación de placas

Las placas son invertidas y puestas en estufa a 35°C en el lapso de 15 minutos después de aplicados los discos. se debe incubar en estufa corriente por 16-18 horas.

Enterobacterias Pseudomonas aeruginosa. Enterococus y Staphylococcus (excepto para lectura de vancomicina y oxacilina)

se debe incubar en estufa corriente por 24 horas para

Detección de resistencia a cefoxitina (cloxacilina) en Staphylococcus spp. Sin embargo, puede informarse si resulta resistente a las 18 horas de incubación. Detección de resistencia a vancomicina en Enterococcus y Stapylococccus

Nota: se debe leer los otros antimicrobianos testados a las 16-18 horas de incubación y se debe dejar incubando por 24 horas para la lectura de cefoxitin ( oxacilina) y vancomicina.


Se debe incubar en estufa corriente por 20-24 horas:

Acinetobacter

Burkholderia cepacia Stenotrophomonas maltophilia

Se debe incubar en estufa CO2 por 20-24 horas:

streptococcus pneumoniae otros streptococcus.

1.3.6 Lectura de las placas e interpretación de los resultados

Lectura Después de 16 a 18 horas se debe realizar lectura de los siguientes halos: Todos los antimicrobianos testados en

Enterobacterias Pseudomonas aeruginosa.

Todos los antimicrobianos, excepto vancomicina y oxacilina testados en Enterococcus y Staphylococcus spp

Entre 20-24 horas de incubación se debe realiza lectura de los siguientes halos Todos los antimicrobianos testados en

Streptococcus pneumoniae y otros streptococcus spp. Burkholderia cepacia Acinetobacter Stenotrophomonas maltophilia

A las 24 horas de incubación se debe realiza lectura de los siguientes halos vancomicina en enterococcus y staphylococcus oxacilina y cefoxitina en staphylococcus.

Las zonas de inhibición resultante debe ser uniformemente circular, en una capa homogénea de crecimiento, si aparecen colonias individuales, el inóculo puede haber estado muy diluído y debe repetirlo. Los diámetros son medidos en mm pasando por el centro del sensidisco.

Lectura con uso de luz reflejada con fondo oscuro (que llega de arriba) La placa de petri se mantiene a una distancia de pocos centímetros sobre un fondo negro no reflactante y se ilumina con luz reflejada. Si es agar Mueller Hinton sangre las zonas son medidas en la superficie superior del agar iluminado con la luz reflejada sacando la tapa. Stx puede producir un doble halo, se miden los márgenes más obvios. En Proteus spp ignore invasión Un crecimiento pobre de pequeñas colonias, las que se detectan con lente de aumento al borde de la zona de crecimiento inhibido, son ignoradas Cuando se usa medio con sangre debe medir zona de inhibición no de hemólisis. Ignore colonias pequeñas intrahalo (excepto vancomicina y oxacilina (pero estos se leen con luz transmitida). Cefoxitina se debe leer con esta técnica

Lectura con uso de luz transmitida ( luz que llega de abajo) Se utiliza para medir los halos de vancomicina y oxacilina en staphylococcus y enterococcus La placa de petri se ilumina con luz transmitida (placa se mantiene hacia la luz). El halo se mide midiendo el margen de la zona que no muestra evidencia ocular de cultivo visible Ignore las colonias diminutas con lupa en el margen Subcultive las colonias existentes dentro de las zonas de inhibición neta.

Consideraciones En general, se testearán y/o informarán, los antimicrobianos de segunda línea en:

• Todas las cepas aisladas en unidad de paciente critico adulto o pediatría.


• Todas las cepas aisladas de líquidos estériles (sangre y LCR) • Cepas resistentes a todos los antimicrobianos testeados o sensible sólo a 1 antimicrobiano

clínicamente útil. • Cualquier duda consulte al microbiologo o infectólogo.

1.3.7 Interpretación Los tamaños de las zonas de inhibición son interpretados según tablas de CLSI (actualizadas anualmente) para ser informados como: sensible, Intermedio o Resistente Se deben seguir las indicaciones de CLSI respecto a consideraciones que dependen de combinación microorganismo y antibiótico. A continuación se señalan las principales: • En enterococcus spp si es beta lactamasa (+) informe como resistente a ampicilina • Detección de resistencia inducida a clindamicina en Streptococcus pyogenes. y staphylococcus :

resistencia a eritromicina solamente y clindamicina sensible : (halo pequeño de resistencia en eritromicina y halo de inhibición de sensibilidad en clindamicina) resistencia a eritromicina y clindamicina ( halos pequeños de resistencia en los dos) resistencia a eritromicina y clindamicina (inducible) ( halos pequeño de resistencia en eritromicina y asimétrico en clindamicina con aplanamiento al lado de la eritromicina ). Lo que indica que la eritromicina indujo la expresión de resistencia en clindamicina. Se informa como resistente a ambos

• Detección de producción de BLEE: ver instrucciones en tabla CLSI vigente (del año)

• Enterobacter spp, citrobacter spp y serratia spp pueden desarrollar resistencia durante la terapia prolongada con cefalosporinas de 3ª generación. Por lo tanto, estos aislados pueden ser inicialmente susceptibles y luego resistentes después de 4 días de tratamiento.

• Staphylococcus spp puede desarrollar resistencia durante el tratamiento prolongado con quinolonas. Por lo

tanto, puede ser inicialmente sensible y luego resistente.

• La vancomicina en Staphylococcus y Enterococcus debe incubarse 24 horas y la presencia de halo o cualquier crecimiento en la zona de inhibición indica resistencia. Debe realizarse método que determine CIM

• Para enterococcus de sangre y LCR se debe realizar prueba de betalactamasa. Beta lactamasa (+) ⇒ se informa resistente a ampicilina y/o penicilina, aunque por disco resultan sensibles.

1.3.8 control de calidad interno: Ver Manual de control calidad microbiología

1.3.9 Informe

• Si la cepa es productora de betalactamasa de espectro extendido (BLEE) se debe informar resistente a todas las cefalosporinas incluyendo cefepime y aztreonam. Además se debe escribir en el informe cepa productora de BLEE (no con abreviatura si no nombre completo)

• Se debe informar los antimicrobianos determinados para la bacteria, el servicio y la muestra en estudio,

según lo establecido en el laboratorio de microbiología del Hospital Padre Hurtado. Se debe revisar esquema de antibiograma con infectólogos adulto y pediátrico, comité de IIH y Farmacia periódicamente .

• Cada antibiótico será informado como: sensible, resistente e intermedio, según tablas de CLSI

actualizadas anualmente.


• Resistencia a eritromicina y clindamicina (inducible) (halos pequeño de resistencia en eritromicina y asimétrico en clindamicina con aplanamiento al lado de la eritromicina ). Lo que indica que la eritromicina indujo la expresión de resistencia en clindamicina. Se informa como resistente a ambos

• Cefoxitina se debe informar como cloxacilina en satphylococcus spp • Oxacilina se debe informar como penicilina en streptococcus pneumoniae • En orina positivas de pacientes hospitalizados se debe informar: cefalotina predice la susceptibilidad a

todas las cefalosporinas de 1° generación excepto cefazolina.

1.3.10 Registros Se debe registrar el halo en mm de todos los antimicrobianos testados en pacientes hospitalizados. Siempre escribir los datos en el cuaderno correspondiente, agregando la medida de los halos y el resultado de laboratorio y otros mecanismos de resistencia detectados, por ejemplo producción de BLEE y beta lactamasa

2. ANTIBIOGRAMA POR DIFUSIÓN-DILUCIÓN EN AGAR (E-TEST) 2.1. Fundamento: Consiste en una tira de plástico que contiene una gradiente de concentraciones predefinidas de un antimicrobiano con 15 diluciones dobles seriadas. El protocolo para preparar el inóculo es el mismo que para la difusión en disco. Siguiendo el método de difusión, una vez inoculado la placa de agar con el microorganismo, se coloca la tira de Etest sobre su superficie, produciéndose de forma inmediata una difusión del antibiótico desde el soporte hasta el agar, creándose de este modo a lo largo de la tira un gradiente exponencial de las concentraciones del antimicrobiano. Tras la incubación de las placas, se puede observar una zona de inhibición elipsoidal y simétrica. Después de la incubación la CMI será el valor obtenido en el punto en el que el extremo de inhibición intersecciona con la tira. 2.2 campo de aplicación: En nuestro laboratorio se utiliza para la determinación de susceptibilidad en determinados microorganismos en relación con determinados antimicrobianos que no están estandarizados por la técnica de kirby bauer o es la recomendación vigente. De acuerdo a nuestra realidad local, se realizará e-test (según corresponda) a las siguientes bacterias aisladas de muestras clínicas que sean clínicamente significativas:

• Streptococcus pneumoniae para determinar susceptibilidad a penicilina, cuando el halo de inhibición por técnica kirby bauer es menor o igual 19 mm. Siempre cuando se trata de infecciones sistémicas

• Streptococcus pneumoniae para determinar susceptibilidad a cefalosporinas de 3° generación. • En enterococcus y satphylococcus para confirmar resistencia a vancomicina. • En streptococcus viridans, incluyendo grupo anginosus con significancia clínica en penicilina • Otras bacterias multiresistentes: imipenem/ colistin

2.3 Materiales e insumos: agar Mueller Hinton /agar Mueller Hinton sangre tiras impregnadas con antimicrobiano (comerciales) tórulas estériles 2.4 Instrumentación o equipos y accesorios medidor de turbidez 0.5 Mac Farland calibrador Mac Farland 0.5 Vortex estufa de incubación corriente y CO2

2.5 Procedimiento 2.5.1 Mantención de tiras de e.test:

Todos los deben almacenarse en desecadores a temperaturas de menos 20°c (freezer). Deben retirarse del congelador sólo al ser utilizadas Retire del congelador 1 a 2 horas antes de utilizarlos Sólo aquellas tiras con fecha de expiración del fabricante dentro del plazo pueden ser usados.


2.5.2 Preparación del inóculo: se aplica lo descrito en 1.3.2 2.5.3 Inoculación en placas: se aplica lo descrito en 1.3.3 2.5.4 Aplicación de tiras Se aplican las tiras con los antimicrobianos a determinar. Maximo 2 tiras por placa de 10 mm Una tira no debe ser relocalizada una vez que haya tomado contacto con la superficie del agar. 2.5.5 Incubación de placas: se aplica lo descrito en 1.3.5 2.5.6 Lectura de las placas e interpretación de los resultados

Lectura A las 24 horas de incubación se debe realiza lectura de los siguientes halos

vancomicina en enterococcus y staphylococcus los antimicrobianos testados en streptococcus pneumoniae y otros streptococcus spp. Los diámetros son medidos en mg/ ml.

Lectura con uso de luz reflejada con fondo oscuro (ojo desnudo)

• La placa de petri se mantiene a una distancia de pocos centímetros sobre un fondo negro no reflactante y se ilumina con luz reflejada.

• Si es agar miller hinton sangre las zonas son medidas en la superficie superior del agar iluminado con la luz reflejada sacando la tapa.

• Cuando se usa medio con sangre debe medir zona de inhibición no de hemólisis.

Lectura con uso de luz transmitida (ojo desnudo) • Se utiliza para medir los halos de vancomicina y oxacilina en staphylococcus y enterococcus • La placa de petri se ilumina con luz transmitida ( placa se mantiene hacia la luz

2.5.7 Interpretación

Los tamaños de las zonas de inhibición son interpretados según tablas de CLSI (actualizadas anualmente)para ser informados como sensible, intermedio o resistente.

2.6 Control de calidad interno: Ver manual de control calidad de microbiología 2.7 Informe

Se debe informar los antimicrobianos según lo establecido en el laboratorio de microbiología del HPH Cada antibiótico será informado con su CIM en ug/ml y además calificada como: sensible, resistente e intermedio, según tablas de CLSI actualizadas anualmente.

2.8 Registros Se debe registrar el valor de CIM de todos los antimicrobianos testados en pacientes hospitalizados, en orden de examen y sistema informático.

REFERENCIAS 1. Instituto de Salud Pública. Instructivo sensibilidad por difusión en placas agar, 2009 en sitio web: www.ispch.cl 2. García JA., Cantón R., García JE., Gomez-Lus M., martinez L., Rodriguez C., Vila J. Métodos básicos para el

estudio de sensibilidad a los antimicrobianos. 2000. Procedimientos de Microbiología Clínica. Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades infecciosas y Microbiología Clínica. En: www. seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia


ANEXOS Anexo 1: posición de tiras de e-test en placas de medio cultivo

Copiado de inserto de Etest® AB Biodisk


Nº 16. PROCEDIMIENTO CULTIVO PARA BACTERIAS ANAEROBIAS

OBJETIVO

Realizar procesamiento de las muestras clínicas de acuerdo a métodos estandarizados para recuperar agentes patógenos en el diagnóstico microbiológico de infecciones producidas por anaerobios o mixtas. ALCANCE


Tecnólogo Médico: Responsable de la evaluación del cultivo, identificación de las cepas en desarrollo y de la validación del informe. Técnico Paramédico: Responsable de la siembra de la muestra en los medios establecidos y de realizar frotis DEFINICIONES

Jarra de anaerobiosis: jarra plástica con tapa hermética usada para generar e incubar muestras en atmósfera de anaerobiosis Atmósfera de anaerobiosis: se logra introduciendo dentro de una jarra plástica, que contiene en su interior las placas sembradas con la muestra en estudio, un sobre con un sistema generador de gas y cerrando inmediatamente con tapa hermética. Rápidamente se absorbe el O2 atmosférico de la jarra con la generación simultánea de CO2. MATERIALES, EQUIPOS Y SOFTWARE

Insumos:

Placas de agar sangre con suplemento para anaerobios Placas de agar sangre con suplemento más inhibidor Placas de agar sangre Placas de agar chocolate con suplemento Caldo tioglicolato Hemocultivos para anaerobios generador de gas para anaerobiosis asa estéril mortero estéril jarra de anaerobiosis indicador de anaerobiosis reactivos para tincion de Gram y Kinyoun kit con batería de pruebas para identificación de anaerobios Equipos: Estufa de incubación Software: Omega


DESARROLLO DEL PROCESO Consideraciones de la muestra: De no contar con medio de transporte para anaerobios, se debe avisar al laboratorio unos 15 minutos antes de extraer la muestra para tener tiempo de preparar el material para su estudio y enviar inmediatamente luego de su obtención, para minimizar al máximo su exposición al oxígeno. Puede enviarse en la misma jeringa, sin aguja y con tapón de plástico. (Ver procedimiento de obtención de las muestras y muestras apropiadas y no apropiadas para estudio de bacterias anaerobias en Manual de toma de muestras).

1. Responsable de recepción y siembra: Técnico Paramédico. 1.1 Los líquidos estériles deben venir inoculados en frasco de hemocultivo para anaerobios. Ingresar a equipo de hemocultivos (mismo procedimiento que resto de hemocultivos). 1.2 Las muestras de pus, abscesos o colecciones sembrar en:

- placa agar sangre con suplemento para anaerobios - placa agar sangre con suplemento más inhibidor - y caldo thioglicolato

Introducir estos cultivos en la jarra de anaerobiosis, agregar indicador de anaerobiosis y el sobre generador de gas inmediatamente luego de sacarlo de su envoltorio. Cerrar rápidamente con la tapa hermética. (se deben reunir todos los materiales necesarios previamente). Incubar en estufa normal a 35°C En paralelo sembrar:

- placa de agar sangre - placa agar chocolate

Incubar estas placas en estufa de CO2 a 35°C. 1.3 Los trozos de tejido se deben moler en un mortero estéril con 2 o 3 ml de caldo thioglicolato y luego proceder como se indica anteriormente. 2. Simultáneamente se realiza frotis de la muestra para tinción de gram y kinyou. 3. Diagnóstico microbiológico 3.1 Observar tinción de gram directa de la muestra 3.2 Abrir jarra de anaerobiosis después de 48 hrs. de incubación, observar desarrollo de colonias en ambas placas bajo lupa estereoscópica. 3.3. Paralelamente observar placas incubadas en atmósfera de 5% CO2, para descartar bacterias facultativas. Para ello traspasar cada tipo de colonia a una placa de agar sangre normal y otra con suplemento para anaerobios (dividir la placa en cuadrantes) y numerar cada colonia con numero idéntico en ambas placas. 3.4 Incubar ambas placas en atmósfera según corresponda en CO2 o anaerobiosis por 48 hrs. Luego de la incubación proceder a descartar bacterias facultativas y estudiar las cepas anaerobias. 3.5 Realizar tinción de gram a cada colonia y según observación macroscópica, características de la colonia; microscópica, (morfología microbiana), y pruebas bioquímicas, proceder a su identificación de acuerdo a esquemas de diferenciación.

Informe

- Si no hay crecimiento en los cultivos en anaerobiosis y aerobios después de 5 días de incubación, informar: no hubo desarrollo de microorganismos. - Si hay desarrollo idéntico en placa en aerobiosis y anaerobiosis, informar: no hubo desarrollo de bacterias anaerobias. hubo desarrollo de bacterias facultativas (según corresponda). - Si hay desarrollo de anaerobios, informar:

hubo desarrollo de… (nombre de la o las bacterias correspondientes). Registros: Sistema informático del laboratorio y al reverso de la orden de examen que se guarda según fecha de ingreso de la muestra en archivos, por un periodo de 3 años.


Nº 17. PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS DE DIAGNÓSTICO DE PARASITOLOGÍA CLÍNICA

OBJETIVO

Realizar procesamiento de las muestras clínicas para el diagnóstico de enfermedades parasitarias de acuerdo a métodos estandarizados. Los parásitos que pueden provocar enfermedad en el ser humano, incluyen protozoos, helmintos y algunos artrópodos. Son causa de enfermedades sistémicas y localizadas. Presentan diversas formas evolutivas como son huevos, larvas, quistes, trofozoítos, etc., y dependiendo del agente y cuadro clínico de sospecha, se emplearán determinados métodos de laboratorio para su diagnóstico. En este Procedimiento se incluyen las Técnicas de ejecución de los siguientes exámenes:

• Parasitológico seriado de deposiciones • Test de Graham • Gota gruesa • Acarotest • Tinción de Cryptosporidium (Ziehl Neelsen modificado)

ALCANCE

Sección Microbiología, Servicio de Laboratorio. RESPONSABILIDAD

Tecnólogo Médico: Corresponde al Tecnólogo Médico a cargo del laboratorio de parasitología, quien efectúa la lectura del examen y la validación del informe. Auxiliar paramédico: Responsable de la recepción, ingreso, preparación de la muestra para su lectura (si corresponde), preparación del material para la toma de muestras para exámenes parasitológicos y de realizar frotis (si corresponde) DOCUMENTOS RELACIONADOS

Orden de examen Manual de Toma de Muestras Reglamento de Traslado de Muestras de Laboratorio Manual de Procedimientos de Control de Calidad de Microbiología DESARROLLO DEL PROCESO

1. PARASITOLÓGICO SERIADO DE DEPOSICIONES (MÉTODO DE BURROWS) 1.1.- OBJETIVO ESPECÍFICO: Diagnosticar enteroparasitosis. 1.2.- FUNDAMENTO El método de Burrows otorga un buen rendimiento para el diagnostico de quistes y trofozoítos por ser un método de concentración por sedimentación en dos fases, una para determinar quistes y otra para trofozoítos. El método en si consiste en macerar la deposición con el fijador (PAF) para así formar una solución homogénea la que después es centrifugada varias veces, eliminando el sobrenadante y resuspendiendo con suero fisiológico hasta lograr un sobrenadante limpio, el que finalmente también se elimina. El sedimento restante se analiza microscópicamente, colocando una gota de este con una gota de colorante entre lámina y laminilla; en este deberían aparecer formas evolutivas de algún parásito si lo hubiere.


Los colorantes utilizados de preferencia son MIF y Tionina los cuales dan un buen contraste a las muestras y permiten ver mejor los quistes con sus estructuras internas, en caso necesario también se puede utilizar Lugol como colorante. 1.3.- MATERIALES E INSUMOS • Paletas de madera de 1-1,5 cm. de ancho por 5- 10 cm. de largo. • Vasos corrientes plásticos o de vidrio, de 150ml o más capacidad. • Mallas de acero inoxidable, cortadas en cuadrados de 10 x 10 cm., aproximadamente. • Portaobjetos corrientes. • Cubreobjetos de 20 x 20mm o de 22 x 22 mm. • Pipetas de 10 ml, 5 ml y 1 ml. • Pipetas Pasteur. • Tubos para centrifuga de fondo cónico, de 15 ml de capacidad. • Gradilla para tubos de centrifuga. • Bandeja de plástico o vidrio, 20 x 30 x 4 cm., con tapa de vidrio (cámara húmeda). • Papel filtro (para cámara húmeda) • Aceite de inmersión • Eter Sulfúrico o etilíco. • Solución de PAF (Phenol, Alcohol (etanol al 95%), Formaldehyde 40%). • Solución de MIF (Merthiolate, lugol, formaldehído) • Solución de Tionina 10mg/dl. • Solución de Lugol • Cloruro de Sodio. • Agua destilada. 1.4.- INSTRUMENTACION O EQUIPOS Y ACCESORIOS • Centrifuga clínica, con tacómetro. • Microscopio binocular con lentes objetivos de 10x, 40x, 100x y oculares de 10x. 1.5.- DESARROLLO DEL PROCESO • Técnico Paramédico debe corroborar que la muestra venga identificada con los datos del paciente y con su orden

respectiva. • Técnico Paramédico realiza la preparación de la muestra. Se recomienda el uso de guantes de goma o

desechables, los que deben ser lavados, sin retirarlos con agua y jabón entre cada muestra diferente. • Numerar 2 portaobjetos, 2 vasos y 2 tubos de centrifuga con el mismo número asignado a cada muestra (número de

ingreso a sistema omega). Marcar un portaobjeto con la letra T (trofozoítico) y otro con la letra Q o E (quístico o éter).

• Abrir el frasco y resuspender la emulsión fecal con una paleta de madera. • Vaciar el contenido de cada frasco en un vaso y agregar fijador si la emulsión es muy espesa. • Tamizar la emulsión a través de la malla de acero hacia un vaso limpio. Una vez terminado el proceso de la muestra

la malla debe ser lavada con agua y detergente y posteriormente flameada al mechero. • Observar el material retenido en el tamiz para buscar parásitos macroscópicos. • Colocar aproximadamente 10ml del tamizado en un tubo centrifuga. Para cada muestra se tendra dos tubos. • Balancear los tubos de manera que queden de igual peso en capachos opuestos de la centrifuga. • Centrifugar entre 1500 a 1800 r.p.m. durante 3 minutos. • Eliminar sobrenadante invirtiendo el tubo. • Resuspender el sedimento en solución salina isotónica (NaCl 0.85%) hasta completar aproximadamente 10 ml. • Centrifugar nuevamente entre 1500 a 1800 r.p.m durante 3 minutos.


• Eliminar sobrenadante invirtiendo el tubo. • Volver a resuspender con NaCl y centrifugar hasta obtener un sobrenadante relativamente limpio (suelen ser

necesarias 2 a 4 centrifugaciones). • Colocar 1 gota de tinción de Tionina o de MIF en el portaobjeto marcado con la letra T, separadas 3 cm. entre si. • Colocar 2 gotas del sedimento, de uno de los tubos, una junto a cada gota de tinción. • Con un ángulo de un cubreobjetos mezclar sedimento y tinción; cubrir. • Guardar en cámara húmeda. Esta es la Fase Trofozoítica de la técnica. • En el otro tubo de centrifuga ya resuspendido con solución salina agregar una columna de aproximadamente 1cm

de altura de éter sulfúrico. • Ocluir el tubo con el dedo pulgar (enguantado) o con parafilm y agitar enérgicamente. Destapar lentamente para

reducir la presión generada. • Centrifugar por 4 minutos entre 1500 y 1800 r.p.m. • Vaciar el sobrenadante en forma brusca, invirtiendo el tubo. • Colocar 1 gota de tinción de Tionina o de MIF en el portaobjeto marcado con la letra Q, separadas 3 cm. entre si. • Colocar 2 gotas del sedimento, una junto a cada gota de tinción. • Con un cubreobjeto mezclar sedimento y tinción. • Colocar el mismo cubreobjeto sobre la mezcla. Esta es la Fase Quística de la técnica. • Colocar en cámara húmeda hasta el momento de la lectura que puede ser hasta 24 horas después de preparadas si

se conserva la cámara en refrigerador a 4ºC. • Tecnólogo Médico realiza la lectura. Leer ambas preparaciones de la fase quística con aumento de 100x (oculares

10x y objetivos 10x), 400x (oculares 10x y objetivos 40x) y si fuera necesario 1000x (oculares 10x y objetivos 100x), por ejemplo para el diagnóstico de Entamoeba histolytica.

• Leer ambas preparaciones de fase trofozoítica con aumento de 400x (oculares de 10x y objetivos 40x) y si fuera necesario con aumento de 1000x (oculares de 10x y objetivo 100x), para el diagnóstico de Entamoeba histolytica.

• La lectura debe ser ordenada y sistemática, abarcando toda la preparación. (ver anexo nº 1) • Después de informar el examen, se puede eliminar el resto de muestra que quedo en los frascos. 1.6.- CONTROL DE CALIDAD INTERNO Ver procedimiento de Control de calidad de Microbiología 1.7.- INFORME Se registra los resultados en el Sistema Informático Omega. Si el resultado es negativo debe informarse:

“No se observan elementos parasitarios”. Si el resultado es positivo debe informarse según el siguiente ejemplo:

-Trofozoítos de Entamoeba histolytica. -Quistes de Giardia lamblia. -Huevos de Hymenolepis nana

El tiempo de demora en entregar el resultado del examen es como máximo dentro de 3 días hábiles.


2. TEST DE GRAHAM 2.1.- OBJETIVO: Este examen confirma la sospecha de enterobiosis, la infección intestinal producida por el helminto Enterobius vermicularis, mediante el hallazgo de las larvas o sus huevos. 2.2. FUNDAMENTO:

Se basa en el hecho de que en la Enterobiasis, la hembra grávida emigra del intestino ciego a la zona perianal, generalmente durante las últimas horas de la tarde o por la noche, y deposita los huevos en los pliegues de la piel perianal, los cuales quedan adheridos a la piel por una sustancia gomosa. Estos son rescatados en la mañana al adherir la cinta scotch alrededor del orificio anal y así se pueden visualizar al examinar las láminas por microscopía.

2.3- MATERIALES E INSUMOS • Cinta scotch de 1 ó 2 cm. de ancho • Láminas portaobjetos desengrasados • Bolsas contenedoras • Mascarillas

El set por paciente consta de 5 láminas con cinta adhesiva (scotch) y una hoja de instrucciones para la toma de muestra los cuales serán entregados en una bolsa.

2.4.- INSTRUMENTACIÓN O EQUIPOS Y ACCESORIOS • Microscopio óptico • Normas de bioseguridad: la lectura de las láminas debe efectuarse con mascarilla por el riesgo de inhalación de

huevos. 2.5.- DESARROLLO DEL PROCESO • Al recepcionar muestras se debe corroborar identificación correcta del paciente, número de láminas, y que cumpla

con los requisitos de muestra adecuada. (Ver Manual de toma de muestras) • Las láminas se leen directamente, la lectura la realiza Tecnólogo Médico encargado de Parasitología. • Emplear aumento de 10x y para diferenciar un huevo de una burbuja, utilizar 40x. • Leer sistémica y ordenadamente la superficie de la cinta, cuidando que los límites de los recorridos se superpongan

entre sí, para no dejar áreas sin examinar. • Si se encuentra otro elemento parasitario, continuar la lectura en búsqueda del huevo de E. vermicularis. • Detener la lectura al encontrar huevos de este parásito. (Ver anexo nº 2) 2.6.- CONTROL DE CALIDAD INTERNO: Ver Procedimiento de Control de calidad de Microbiología (Parasitología) 2.7.- INFORME

• Se ingresa los resultados en el sistema informático de acuerdo el número de petición para cada examen y paciente.

• En caso de ser menor a 5 láminas se debe consignar el nº de láminas leídas. • Si es negativo debe informarse:

Test de Graham No se observan huevos de Enterobius vermicularis.

• Si es positivo se debe informar: Test de Graham Huevos de Enterobius vermicularis

• Si se encuentran otros elementos parasitarios, se identifican e ingresan como resultado en la misma petición.


3. EXAMEN DE GOTA GRUESA 3.1 OBJETIVOS:

- Realizar el diagnóstico de hemoparasitosis, por la visualización directa de los parásitos o sus estadios de desarrollo.

- Esta técnica se aplica ante la sospecha de Enfermedad de Chagas, malaria, filariasis y trypanosomiasis africana, fundamentalmente en la etapa aguda de estas parasitosis, momento en el cual existe una alta parasitemia.

3.2 FUNDAMENTO

El método habitual para diagnosticar los parásitos en sangre, es el estudio de las películas de ésta. Se preparan dos tipos de películas: fina y gruesa. La primera corresponde al frotis que se utiliza en hematología para la lectura del hemograma, teñido con May Gruenwald-Giemsa. El examen de gota gruesa tiene las ventajas de que, permite concentrar la sangre del paciente, con lo que aumentan las probabilidades de detectar infecciones mínimas; también permite disminuir el tiempo necesario para efectuar un exámen fiable, en 5 minutos se puede examinar aproximadamente la misma cantidad de sangre con lentes de inmersión en aceite, que en una película delgada en 30 minutos. Esta técnica consiste en concentrar la sangre en una pequeña porción del portaobjeto. Luego desfibrinarla con aguja hipodérmica y deshemoglobinizar con Giemsa. Durante la tinción los eritrocitos se lisan, por consiguiente sólo serán visibles los leucocitos y los parásitos, si éstos últimos están presentes.

3.3 MATERIALES E INSUMOS

• Lancetas , agujas hipodérmicas o alfiler • Algodón o gasa • Alcohol de 70% • Portaobjetos desengrasados • Pipetas pasteur • Agua destilada

3. INSTRUMENTACIÓN O EQUIPOS Y ACCESORIOS • Microscopio binocular con lentes objetivos de 10,40 y 100x. 3.5 REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA Y PACIENTE • La muestra debe venir con los datos del paciente (nombre y dos apellidos, servicio y diagnostico) y con su orden

respectiva. • Durante la toma de muestra, lectura y descarte de material, se deben observar rigurosamente todas las medidas de

bioseguridad que corresponden al trabajo con fluidos corporales, en especial sangre. • El sitio de punción ideal es la yema del dedo anular o medio. La zona debe estar tibia, lo que se logra al colocar el

dedo en agua tibia si fuese necesario. Otros sitios de punción son el lóbulo de la oreja y en recién nacidos, el talón del pie. La muestra ideal debe tomarse con lanceta; en caso de realizar punción venosa, tomar la muestra directamente de la aguja.

• El sitio de punción se debe limpiar y desinfectar con gasa o algodón al 70%. Luego secar la zona con gasa estéril; es preferible al algodón, el que puede dejar fibras que dificulten la lectura.

• Pinchar la zona elegida con lanceta estéril. • La primera gota de sangre se debe limpiar con gasa. • La segunda gota se coloca en el portaobjeto. • Se requiere preparar como mínimo 6 láminas. • Estas se dejan en cámara húmeda para que las gotas no se sequen. • Luego se procede a desfibrinar al lado del paciente. • Transportar al laboratorio en cámara de bioseguridad. 3.6 DESARROLLO DEL PROCESO

• Colocar dos o tres gotas de la sangre en el portaobjetos, directamente del dedo del paciente. (Se recomienda no comprimir el dedo).


• Desfibrinar la muestra mediante movimientos circulares de la gota con aguja hipodérmica o alfiler durante 3 minutos.

• Dejar secar al ambiente por 4-8 horas o en una estufa a 37°C por 90 minutos. No colocar al calor directo, porque interfiere con los pasos siguientes.

• Deshemoglobinizar, colocando por 5 minutos Giemsa diluido (1 gota de Giemsa por 2 ml de agua destilada). El frotis debe adquirir un color rojizo por la hemoglobina disuelta.

• Repetir 2 o 3 veces este proceso; cambiar el Giemsa cada vez. El frotis debe adquirir un color azulino transparente a los 15 o más minutos, debido a la débil tinción de glóbulos blancos, plaquetas y parásitos y a la desaparición de glóbulos rojos.

• Cubrir la lámina con Giemsa concentrado (1 gota de Giemsa por 1 ml de agua destilada). • Dejar la tinción por 45 a 50 minutos. • Lavar la lámina colocándola dentro de una cubeta con agua destilada por 3 a 5 minutos. No lavar al chorro de

agua, porque se puede desprender la preparación. • Secar al ambiente en posición vertical. • Este exámen tiene mejor rendimiento si se realiza en forma seriada. • La lectura se realiza recorriendo el preparado completamente con aumentos de 40 y 100x, cuidando de no

dejar zonas sin observar. (Ver anexo 3) 3.7 CONTROL DE CALIDAD INTERNO

Las preparaciones del paciente deben procesarse junto con un control biológico positivo. Esto permitirá demostrar que la tinción se ha realizado exitosamente. 3.8 INFORME

Se ingresa los resultados en el sistema informático. • Si el resultado es negativo debe informarse: "No se observan elementos parasitarios" • Si el resultado es positivo debe informarse: "Se observan formas circulantes de Trypanosoma cruzi" (en el caso

de E. de Chagas) 3.9 RESPONSABLE DIRECTO

Corresponde al Tecnólogo Médico a cargo del Laboratorio de Parasitología, quien realiza la técnica y efectúa la lectura del exámen.

.


4. ACAROTEST 4.1 OBJETIVO: Pesquisar los diferentes estadios evolutivos del parásito (Sarcoptes scabiei) y así confirmar la sospecha

clínica de escabiosis y como control de tratamiento. 4.2 FUNDAMENTO: Consiste en raspar lesiones sospechosas con un portaobjeto adhiriendo la cinta scotch en la piel

para obtener el material que será visualizado al microscopio en la búsqueda de huevos y ejemplares de Sarcoptes scabiei. Se deben tomar 10 muestras.

4.3 MATERIALES E INSUMOS

• Diez portaobjetos por paciente • Cinta adhesiva transparente de 1 a 2 cm de ancho • Guantes y pechera plástica • Povidona yodada • Algodón

4.4 INSTRUMENTACIÓN O EQUIPOS Y ACCESORIOS

• Microscopio óptico 4.5 REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA Y PACIENTE

• Se deben ubicar lesiones directas representadas por el surco acarino (que corresponde a los túneles o galerías causadas por las hembras grávidas); se aprecian como trazos lineales de algunos milímetros hasta 1.5 cm de longitud, son delgados, algo levantados, de color amarillento sucio y en su extremo suele encontrarse una pequeña vesícula serosa transparente, es la vesícula perlada de Bazin donde se encuentra acantonada la hembra.

• El paciente no deberá haberse aplicado ningún acaricida (Ej.: gamexano o lindano) por lo menos una semana antes del exámen. Tampoco debe aplicarse talco, pues dificultaría la lectura.

• Las láminas deben ser transportadas al laboratorio en una bolsa cerrada, identificándola con el nombre y los apellidos del paciente.

4.6 DESARROLLO DEL PROCESO

• Utilizar guantes y pechera plástica para la realización de este exámen. • Las láminas se leen al microscopio con aumento de 10x y cuando sea necesario con aumento de 40x. • Leer sistemáticamente toda la superficie de la cinta adhesiva, cuidando que los límites de los recorridos no se

superpongan para no dejar áreas sin examinar. • Detener la lectura al encontrar ejemplares de Sarcoptes scabiei o de sus huevos.

El ácaro mide 150 micrones el macho y 300-350 micrones la hembra. Su forma es oval, con 4 pares de patas, 2 anteriores y 2 posteriores. El cuerpo posee numerosas cerdas y espinas quitinosas dirigidas hacia atrás. Los huevos son ovales y miden 150-180 micrones. (Ver anexo 4)

4.7 CONTROL DE CALIDAD INTERNO: Se evaluará semestralmente la observación microscópica., ya sea, observando un control positivo y uno negativo, antes de ver las muestras problema. 4.8 INFORME

• Debe incluir el nombre completo del paciente, Rut, procedencia, en el sistema informático. • Se debe consignar el número de láminas leídas • Si es negativo se debe informar:

No se observan ejemplares ni huevos de Sarcoptes Scabiei • Si es positivo se debe informar:

Se observan ejemplares o huevos de Sarcoptes Scabiei, según corresponda.

4.9 RESPONSABLE DIRECTO: Corresponde al Tecnólogo Médico a cargo del Laboratorio de Parasitología, quien efectúa la lectura del Acarotest.


5. TINCIÓN PARA CRYPTOSPORIDIUM (ZIEHL NEELSEN MODIFICADO) 5.1 OBJETIVOS: Detectar ooquistes de Cryptosporidium parvum. Examen indicado para determinar la etiología de una diarrea acuosa sin sangre en pacientes inmunocomprometidos. 5.2 CAMPO DE APLICACIÓN: Se solicita principalmente en pacientes inmunocomprometidos como personas infectadas con VIH, pacientes en quimioterapia, transplantados en tratamiento con inmunosupresores. También se hace en todo niño menor de 2 años en forma simultánea con el parasitológico seriado, ya que pueden exponerse al parásito por tener contactos con animales y sus excretas o ingerir alimentos contaminados con ooquistes. 5.3 FUNDAMENTO: La Tinción de Ziehl-Neelsen se basa en la capacidad que tienen algunos parásitos y bacterias de resistir a la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos (fucsina). Esta propiedad se correlaciona con el alto contenido de lípidos en su envoltura celular, que confiere un ambiente hidrófobo. El colorante fucsina básica se compone de fenol, lo que facilita la penetración de la fucsina en la envoltura celular; este proceso de tinción requiere de calentamiento, ya que el calor ayuda a que el colorante atraviese la pared celular que contiene ceras. En la etapa posterior se decolora con un decolorante orgánico que es una mezcla de ácido y alcohol (HCl y alcohol etílico 95%), con lo cual se logra extraer el colorante (fucsina) a todas las células excepto a las alcohol-ácido resistentes. La posterior tinción con el colorante de contraste (Azul de Metileno) tiñe a las células que no resistieron el tratamiento orgánico, por lo tanto, se tiñen de azul, y de esta manera resaltan los organismos alcohol-ácido resistentes los cuales están teñidos de rosa. Dentro de los parásitos coccidios el Crytosporidium parvum, se caracteriza por sus propiedades de alcohol-ácido resistencia. 5.4 MATERIALES E INSUMOS • Vasos corrientes plásticos o de vidrio, de 150 ml o más capacidad. • Mallas de acero inoxidable. • Portaobjetos corrientes. • Tubos de centrifuga de fondo cónico. • Gradilla para tubos de centrifuga. • Aceite de inmersión. • Solución PAF. • Azul de Metileno. • Acido Clorhídrico. • Alcohol etílico 95%. • Fucsina básica. • Pinzas de madera. • Mechero Bunsen o de alcohol. 5.5 INSTRUMENTACION O EQUIPOS Y ACCESORIOS • Microscopio óptico con lente de inmersión 100x • Centrifuga clínica. 5.6 REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA Y PACIENTE:

La muestra es deposición. La toma de muestra es la misma que para el parasitológico seriado de deposiciones. (ver Manual de toma de muestras) Las muestras fijadas pueden ser almacenadas durante varias semanas en un lugar fresco y si es posible en refrigerador a 4ºC.

5.7 DESARROLLO DEL PROCESO

Se debe corroborar que la muestra venga con nombre y apellidos, servicio y con su respectiva orden. Confección del frotis: • Homogeneizar la muestra de deposición tomada con fijador PAF, diluyéndola con suero fisiológico si fuera

necesario. • Tamizar con malla fina de acero inoxidable. • Centrifugar 5 minutos a 1500 r.p.m.


• Botar el sobrenadante. • Con una gota del sedimento, hacer un extendido en un portaobjetos. • Dejar secar a temperatura ambiente. Tinción: • Cubrir la lámina con fucsina completamente • Calentar la lámina hasta la emisión de vapores blancos (sin que hierva) • Dejar 15 minutos y lavar con agua • Decolorar con alcohol ácido durante 1 minuto. • Lavar con agua. • Cubrir la lámina con azul de metileno durante 7 minutos • Lavar con agua • Secar a temperatura ambiente. Lectura: Se debe recorrer el frotis completamente con objetivo de inmersión 100 x. Los ooquistes de cryptosporidium se tiñen de color rojo y se puede reconocer pared y contenido. (Ver anexo 6) 5.8 CONTROL DE CALIDAD INTERNO: Es imprescindible aplicar controles biológicos al preparar nuevos colorantes y

al efectuar tinciones de muestras problemas, es decir, se debe tener muestras positivas con Cryptosporidium parvum, con las cuales se realiza un frotis para luego teñir con los nuevos colorantes junto a las muestras problemas para así asegurar un resultado fidedigno y evitar falsos positivos y negativos. El resultado de este control se debe registrar en planilla correspondiente.

5.9 INFORME: Se ingresa los resultados al sistema informático:

Si el resultado es positivo se debe informar: “Tinción Ziehl Neelsen modificado: Positiva al observar ooquistes de Cryptosporidium parvum” Si el resultado es negativo se debe informar: “Tinción Ziehl Neelsen modificado: Negativo al No observar ooquistes de Cryptosporidium parvum”

5.10 RESPONSABLE DIRECTO: Corresponde al Tecnólogo Médico a cargo del laboratorio de parasitología, quien efectúa la lectura del examen. MÉTODOS DE SUPERVISIÓN Y RESPONSABLES

Los responsables de supervisión son Médico Jefe Laboratorio de Microbiología y Tecnólogo Médico encargado de Parasitología.

REFERENCIAS

• Atías A., Neghme A. Parasitología Clínica, 3ª edición. • Manual de Control de Calidad en el Laboratorio Clínico, Ministerio de Salud 1998, Instituto de Salud Pública de

Chile. • Procedimientos en Parasitología, Berbeli Astorga, Instituto de Salud Pública de Chile, 1993. • Diagnósticos y tratamientos clínicos por el laboratorio, John Bernard Henry, 9ª edición, Masson • Parasitología al día 9, 80-83, 1985. • http://www.seimc.org/control/infdef2001/pdf/para101.pdf • http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/html • http://www.members.tripod.com • http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/html


ANEXOS

Huevo de Ascaris lumbricoides Quiste de Endolimax nana

Huevo de Hymenolepis diminuta Quiste de Entamoeba histolytica

Huevo de Fasciola hepatica Huevo de Hymenolepis nana

Anexo 1. Imágenes al microscopio de formas evolutivas de algunos enteroparásitos.


Anexo 3. Gota gruesa

Formas circulantes de Tripanosoma cruzi Forma anillo de Malaria falciparum

Huevo de Sarcoptes scabiei.

Anexo 4: Acarotest

Ejemplar adulto octópodo de Sarcoptes scabiei.

Anexo 2: Imágenes al microscopio de Huevos de Enterobius vermicularis


Anexo 5: Ooquistes de Cryptosporidium parvum, tinción de Ziehl-Neelsen. Aumento 100 x


Nº 18. PROCEDIMIENTO TÉCNICO DE DIAGNÓSTICO DE MICOLOGÍA CLÍNICA OBJETIVO: Realizar procedimientos de diagnóstico microbiológico de micosis superficiales y sistémicas, de acuerdo a métodos estandarizados y según las recomendaciones nacionales e internacionales. QUIENES DEBEN APLICARLA: Tecnólogos Médicos, Médico Microbiólogo y Técnicos Paramédicos de sección Microbiología de Laboratorio RESPONSABLE DE SUPERVISAR: Tecnólogos Médicos encargados de exámenes micológicos (según rotación) RESPONSABILIDADES: Técnicos Paramédicos: responsables de toma de muestras (en caso de micosis superficiales), recepción e ingreso de muestras. Tecnólogo Médico es responsable de la siembra de muestras para dermatofitos, evaluación de cultivos, ejecución de pruebas y subcultivos para identificación, ejecución y lectura de exámenes microscópicos, informe y validación de resultados. DESARROLLO DEL PROCEDIMIENTO Se describe proceso por separado para muestras clínicas de micosis superficiales y micosis sistémicas o profundas. I. Micosis superficiales En las micosis superficiales están involucrados principalmente: dermatofitos, Candida spp. y Fusarium (uñas).

1. TIPO DE MUESTRAS

• Piel • Cabello y Pelo • Uñas

2. TOMA DE MUESTRAS Consideraciones generales:

• Cantidad suficiente • Bordes activos de las lesiones • Paciente sin tratamiento antifúngico previo (en caso contrario suspenderlo a lo menos 1 semana antes

si es tópico o 15 días si es oral). • Paciente limpio. Baño o limpieza solo con agua y jabón (no desinfectante) • Antisepsia de piel con alcohol 70°

Piel • Raspado del borde activo de la lesión con bisturí, espátula o portaobjetos estéril • Si existen vesículas debe cortarse el techo. • Raspado y cinta adhesiva transparente (en Pitiriasis versicolor)


Intértrigo • Raspar escamas • Si esta macerado tomar con tórula humedecida en suero estéril

Uñas • Las uñas no deben estar pintadas • Tomar escamas mas profundas posibles, límite entre uña sana y enferma. • Raspado en la porción distal del espacio subungueal donde se acumula la hiperqueratosis (áreas blancas) • En caso de onicomicosis superficial se raspa la cara externa de la uña

Pelos • Limpiar cuero cabelludo con alcohol • Arrancar 10-20 pelos cortados del borde de la alopecia con pinzas • Muestra de cuero cabelludo se raspa con bisturí


Otras muestras

• Ojos : - conjuntival (tórula estéril) - cornea (procedimiento médico)

• Oídos: - con tórula estéril tomar material purulento o costroso

• Cavidad oral: - aseo oral - raspar lesiones blanquecinas

• Flujo vaginal - con espéculo

• Glande, prepucio, región anal y perianal - tomar con tórula estéril

Transporte de muestra • Envase limpio y seco • Las escamas, pelos, costras o raspados se depositan: en placa de petri estéril

Rechazo de Muestra • Muestra escasa. • Paciente en tratamiento. • Muestra sin orden de examen y/o diagnóstico presuntivo. • Muestra sin datos mínimos del paciente y de la lesión.

3. PROCEDIMIENTO 3.1. Examen microscópico directo con KOH 10%

El examen microscópico directo del material clínico es uno de los procedimientos más simples y útiles en el diagnóstico de infecciones fúngicas. La observación de elementos fúngicos en escamas de piel, pelos uñas pueden proporcionar una clara indicación del tipo de micosis superficiales envueltas: dermatofitosis, candidiasis o pitiriasis versicolor.

1. Colocar el material a estudiar en un porta-objeto y se cubre con una a dos gotas de KOH al 10%. 2. Luego cubrir la preparación con un cubre-objeto. Nunca se debe presionar el cubre-objeto con los dedos,

ya que los ácidos grasos naturales de la piel dificultan la observación. Cuando la muestra es muy espesa es aconsejable presionar el cubre-objeto con una pinza u otro objeto. De esta manera el hongo puede ser liberado del material biológico, lo que permite su visualización.

3. Guardar en cámara húmeda hasta el momento de la lectura. 4. Observar con objetivo 40 X


5. Informe de resultados: - Se observan levaduras en +, ++, +++ - Se observan pseudohifas en +,++,+++ - Se observan levaduras y pseudohifas en +, ++, +++ - Se observan hifas y levaduras en +, ++, +++ - Se observan hifas septadas en +, ++, +++ - Se observan artroconidios en +, ++, +++ - Se observan clamidosporas en +, ++, +++ - No se observan elementos micóticos.

3.2. Cultivo de hongos:

1. Se siembra la muestra en Agar Sabouraud en placa y en tubo. 2. Incubación a 25ºC. 3. Tiempo de desarrollo: 4 semanas (dermatofitos).

4. Luego se realiza un directo de la colonia con azul de metileno: se coloca una gota de azul de metileno en un porta objeto, se toma un trozo de cinta adhesiva se pasa se manera suave por encima de la colonia y después se coloca sobre la gota de azul de metileno en el porta, se observa al microscopio con objetivo 40 x.

Trichophyton rubrum Trichophyton mentagrophytes

T. rubrum T. mentagrophytes


CRITERIOS DE INTERPRETACION

II. Micosis invasivas o sistémicas

1. INTRODUCCION Las enfermedades fúngicas invasivas son entidades cada vez más frecuentes, dado el aumento de pacientes

susceptibles por la utilización de fármacos inmunosupresores. Hay que tenerlas en cuenta en el diagnóstico diferencial de las infecciones en los pacientes con factores de riesgo y solicitar las pruebas diagnósticas específicas, ya que el diagnóstico precoz puede mejorar el pronóstico de estas infecciones, de alta mortalidad.

2. TIPO DE MUESTRAS • Sangre • Líquidos estériles • Biopsias

3. TOMA DE MUESTRAS

Examen: HEMOCULTIVO TRADICIONAL con búsqueda de hongos

Preparación paciente:

Afebril Antes uso de Antifúngicos

Técnica de recolección:

Antisepsia de piel con OH 70% Desinfección de tapa con OH 70% Simultáneos, pero distintos sitios punción

Material: Frascos de hemocultivo (mínimo 2),para adultos o pediátrico según corresponda

Transporte: < 2 h, T º Ambiente

Cantidad: 10 mL adultos, 3-5 mL niños, 1 mL neonatología.


4. PROCEDIMIENTO • Siembra en Medio Sabouraud (tubo) muestras líquidas (LCR, biopsias). • Hemocultivo tradicional Tinción de gram

Realizar cultivo.

III. Candidiasis Las candidiasis constituyen un grupo de infecciones causadas por un hongo oportunista del género Candida, de los cuales Candida albicans es la más frecuente. Pueden producir una infección clínica en prácticamente en cualquier sistema orgánico. El espectro de infecciones abarca desde la enfermedad mucosa y cutánea superficial hasta la diseminación hematógena extensa con afectación de órganos diana como el hígado, bazo, riñón, corazón y cerebro. En la mujer, la mucosa vaginal también constituye un lugar frecuente de infección. Se puede transmitir por ropas, objetos y también por contacto sexual. Estos hongos están siempre presentes en la piel y en la mucosa del tracto digestivo, genitourinario y respiratorio de la mayoría de las personas, pero se encuentran controlados por otros microorganismos no patógenos. Cuando se produce un desequilibrio, el aumento desmedido de la población de hongos produce esta u otras micosis. 1. Muestra clínicas:

• Raspados de piel y fanéreos • Secreciones (heridas, flujo vaginal) • Sangre y líquidos estériles • Lavado broncoalveolar (LBA) • Dispositivos implantables (catéteres, prótesis)

2. Procesamiento 2.1. Microscopía:

• Examen directo: Pueden observarse blastoconidias y en algunos casos la presencia de

Muestras Sistémicas (Sangre)

Directo KOH 20% + Tinta Gram Giemsa

Tubos de SabouraudCon CAF

25 C 35 C

Hemocultivos Importante observar

*. Turbidez*. Gas*. Hemólisis*. Presencia de Colonias


pseudohifas. • KOH 20% en muestras clínicas, principalmente procedentes de la piel, fanéreos y mucosas.

Blastoconidios Pseudohifas

• Tinción de Gram

2.2. Cultivos

• Agar Sabouraud: siembra primaria. Cuando hay desarrollo de levadura se siembra en otros medios para su identificación.

• Agar cromógeno: Permite identificar presuntivamente algunas especies de Candida, pero fundamentalmente identifica C. albicans.

Candida albicans Candida krusei


Identificación por microcultivo Agar de harina de maíz (“Corn Meal Agar”): para diferenciar distintas especies de Candida y para realizar subcultivos ya que estimula la esporulación de hongos miceliales.

• Colocar un trozo circular de papel filtro sobre el fondo de una placa Petri. Colocar un par de varillas de madera dentro de la placa encima del papel, éstas funcionaran como apoyo de un porta objeto de vidrio.

• Colocar un trozo pequeño de agar Corn Meal sobre el porta objeto. • Inocular el agar, haciendo tres lineas con una pequeña porción de la colonia a estudiar. • Humedecer el papel filtro, y colocar el porta objeto sobre las varillas, tapar la placa e incubar a 37ºc po 48

hrs. • Luego de la incubación, colocar un cubre objeto sobre el agar inoculado y observar el desarrollo al

microscopio con objetivo 40x.


Nº 19. PROCEDIMIENTO TÉCNICO PARA EL DIAGNÓSTICO POR INMUNOFLUORESCENCIA

OBJETIVO

Realizar procesamiento de las muestras de secreciones respiratorias de acuerdo a métodos estandarizados para ddeterminar la etiología de cuadros respiratorios (bronquitis, neumonías, etc.), utilizando técnicas de inmunofluorescencia. En este procedimiento se incluyen las técnicas de diagnóstico para: Inmunofluorescencia para Virus respiratorios (parainfluenza, influenza A y B, virus sincicial respiratorio y adenovirus) Inmunofluorescencia directa para Bordetella ALCANCE


Tecnólogo Médico: Responsable de la lectura, interpretación de resultados y validación del informe. Auxiliar paramédico: Responsable de la recepción, ingreso y preparación de la muestra. DEFINICIONES

Inmunofluorescencia: Es una técnica que emplea anticuerpos conjugados o fluorocromos. Puede ser directa en un solo paso que detecta antígeno o indirecta en el que se detecta anticuerpo. FITC: conjugado de isotiocianato de fluoresceína, fluorocromo más utilizado, que es una molécula química que absorbe energía a cierta longitud de onda y emite fluorescencia en otra, Se utiliza unido a anticuerpos específicos para antígenos del agente a detectar. La cantidad de fluorescencia con la cual una célula se tiñe es proporcional a la cantidad de sitios de unión. DESARROLLO DEL PROCESO

Las muestras deben llegar a la hora fijada, por razones de procesamiento y entrega oportuna de resultados por el laboratorio. 1. Detección de Virus Respiratorios 1.1 Fundamento del test

El proceso que se realiza para identificar virus respiratorios consta de dos etapas; la primera consiste en hacer un screening para el virus sincicial respiratorio (VRS), diferenciándolo de otros virus como adenovirus, Influenza A o B y Parainfluenza 1, 2 y 3, mediante una inmunofluorescencia directa (ID). Para realizar esta técnica en el laboratorio se dispone de un kit llamado Simulfluor ® Respiratory Screen, el cual contiene 2 componentes, el primero de ellos esta dirigido contra Adenovirus, Influenza (A y B) y Parainfluenza (1, 2, 3), mientras que el segundo esta dirigido contra VRS.

Para realizar la reacción antígeno-anticuerpo, primero se debe tener fijada la muestra con acetona fría en un pocillo de un portaobjeto, la función que cumple la acetona es fijar la muestra y permeabilizar la membrana de la célula facilitando la entrada de los anticuerpos a ella; después se agrega el reactivo Simulfluor, se incuba en estufa a 37ºC, para que de esta manera ocurra la reacción antígeno-anticuerpo y posteriormente se lava con buffer (PBS), para sacar el exceso de anticuerpo no fijado a las células. El primer componente del kit se une a las células infectadas con alguno de los virus ya mencionados, dándoles un tono verde manzana, debido a que los anticuerpos de este componente están marcados con FITC, en cambio, el segundo componente del kit se une a las células infectadas con VRS dándoles un color amarillo oro; las células no infectadas se tiñen de rojo debido a la presencia de Azul de Evans en el reactivo, estas tinciones se aprecian con microscopio de luz ultravioleta. Si se observan células teñidas de amarillo oro, indica VRS positivo, puede haber además


células teñidas de verde manzana, lo que indica la presencia de uno de los otros virus mencionados, por lo tanto, se deben diferenciar realizando la segunda etapa. En la segunda etapa, primero se debe tener fijada la muestra en el portaobjeto (4 pocillos), se agregan los anticuerpos antivirales monoclonales (adquiridos al ISP) contra cada uno de los virus restantes (uno en cada pocillo), se incuba a 37 ºC, se lava con PBS, y posteriormente se agregan los anticuerpos antiespecie que van marcados con FITC; este anticuerpo se uniría al anticuerpo monoclonal anterior que estaría unido al antígeno viral en la célula, por lo tanto, se va a observar en el pocillo donde se encuentre el antígeno para el anticuerpo monoclonal especifico, una fluorescencia color verde manzana en las células, transmitida por el FITC bajo luz ultravioleta. Esta técnica es una Inmunofluorescencia Indirecta (IFI). 1.2.- Materiales y Equipo

Micropipeta automática para volumen de 20 uL Punta de micropipeta automática (Tips) Cámara húmeda Cubreobjetos Portaobjetos Kit (I.S.P): Anticuerpos anti-virales y anticuerpos anti-especie marcados con FITC Kit (comercial) Simulfluor® Respiratory Screen Solución Tampón Fosfato (PBS), pH 7.2 Medio de montaje pH 8.5-9.0 Agua destilada Microscopio de inmunofluorescencia Cámara estufa a 37ºC Congelador a –20ºC Vórtex Reloj o Timer.

1.3 Procedimiento 1.3.1 Primera etapa: inmunofluorescencia directa

a) Procesamiento de la muestra. Vortear la muestra hasta obtener turbidez, (desprendimiento de células) Depositar 10 uL de muestra sobre un portaobjeto con pocillo limpio Dejar secar a 37ºC Fijar con acetona fría por 10 minutos Secar a temperatura ambiente, se debe teñir lo antes posible, si es necesario guardarlos coloque los portaobjetos en un contenedor a <20 ºC.

b) Tinción inmunofluorescente directa (instructivo Simulfluor® Respiratory Screen) Agregar una gota de DFA Reagent, debe ser suficiente para cubrir la muestra Incubar en cámara húmeda a 37 ºC por 15 minutos

Enjuague el portaobjeto con una piseta de PBS para eliminar el exceso de anticuerpo Secar cuidadosamente los bordes del portaobjeto.

c) Montaje

Agregar una gota de medio de montaje (pH 8.5) Cubrir con cubreobjeto

d) Lectura Leer de inmediato con aumento de 40X. Si esto no es posible, los portaobjetos se deben guardar protegidos de la luz entre 2 a 8 ºC.

1.3.2 Segunda etapa: Inmunofluorescencia indirecta

Se realiza una vez leída los portaobjetos de la primera etapa y se busca identificar células infectadas con virus que no sean VRS en aquellas muestras con fluorescencia positiva. Repetir procesamiento indicado en letra a), para cada muestra se utilizarán cuatro pocillos.


Una vez seco agregar una gota de globulina antiviral (monoclonal) de cada virus (Adenovirus, Influenza A o B, Parainfluenza) en el pocillo correspondiente.

Incubar en cámara húmeda a 37 ºC por 30 minutos Agregar una gota de medio de montaje (pH 8.5) y cubrir

Realizar lo antes posible lectura con aumento 40X, en caso contrario guardar los portaobjetos protegidos de la luz a temperatura entre 2 a 8 ºC. La muestra es positiva cuando se observa células con fluoresceína en alguno de los cuatro pocillos, y negativa si están las células de color rojo.

1.4 Interpretación Se considera muestra positiva si tiene al menos 3 células teñidas, un resultado negativo, es indicado por ausencia de fluoresceína en un mínimo de 20 células observándose estas de color rojo. Una muestra con menos de 20 células se considera “Muestra Escasa”.

Las células infectadas por adenovirus, Influenza A o B, y Parainfluenza 1, 2, 3 mostrarán fluorescencia verde manzana brillante en el núcleo, en citoplasma o ambas se acuerdo al virus. Las células infectadas con virus sincicial muestra una fluorescencia de color amarillo oro o dorado anaranjado en el citoplasma. 1.5 Informe: Si es positivo para uno o dos virus, se debe indicar con palabras “positivo” e informar el resto de los virus como “negativo”. Se informa cada virus que ha sido estudiado.

1.6 Tiempo de Respuesta: dentro del día hábil (si la muestra ha sido recepcionada antes de 10:00 hrs) 1.7 Registro: Sistema informático del laboratorio y en la orden de examen. 2. Detección de Bordetella pertussis

Es un bacilo gram negativo pequeño mide entre 0.2 - 0.7 µm es un microorganismo muy exigente por lo que si aislamiento es difícil, utilizándose para su diagnostico técnicas de inmunofluorescencia o mas sensibles como PCR. Causan patologías respiratorias principalmente en niños pequeños y lactantes, los cuales pueden presentar cuadros de bronquiolitis, laringotraquitis, etc; acompañados de síntomas como congestión nasal, estornudos y fiebre; una de sus características la tos grave, repetitiva y convulsiva, siendo esta etapa la mas contagiosa. 2.1 Fundamento del test

La técnica de ID implica la preparación de un frotis a partir de la muestra clínica o aislado de cultivo se hace la tinción con un anticuerpo específico que está unido a un marcador fluorescente (FITC) dirigido contra B. pertussis. Después de la incubación con la preparación de anticuerpos, se examinan con un microscopio de fluorescencia.

2.2 Materiales y Equipos

Micropipeta automática para volumen de 20 uL Punta de micropipeta automática (Tips) Cámara húmeda Cubreobjetos Portaobjetos Difco FA Bordetella Pertussis ® (Becton Dickinson) Solución Tampón Fosfato (PBS), pH 7.2 Medio de montaje pH 8.5-9.0 Agua destilada Microscopio de inmunofluorescencia Cámara estufa a 37ºC Congelador a –20ºC Vortex Las muestras deben llegar a la hora fijada, por razones de procesamiento y entrega oportuna de resultados por el laboratorio.

2.3 Procedimiento

a) Procesamiento de la muestra


Vortear la muestra hasta obtener turbidez, (desprendimiento de células) Depositar 15 uL de muestra sobre un portaobjeto nuevo (esparcir) Dejar secar a temperatura ambiente.

Fijar con acetona fría por 1-2 minutos Secar a temperatura ambiente, se debe teñir lo antes posible, si es necesario guardarlos coloque los portaobjetos en un contenedor a <20 º C.

b) Tinción inmunofluorescente directa

Agregar 15 uL de conjugado, debe ser suficiente para cubrir la muestra Incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente por 30 minutos

Enjuague el portaobjeto con una pisceta de PBS para eliminar el exceso de anticuerpo Lavar 10 minutos en buffer PBS, enjuagar con agua destilada

Dejar secar

c) Montaje Agregar una gota de medio de montaje (pH 8.5) Cubrir con cubreobjetos

d) Lectura Leer de inmediato con aumento de 100X. Si esto no es posible, los portaobjetos se deben guardar protegidos de la luz entre 2 a 8 º C.

2.4 Interpretación Se considera muestra positiva si se observan bacilos minúsculos teñidos con fluoresceína dando un color verde intenso, se debe tener cuidado con tinción no especifica sobre algunos diplococos gram negativos, cocos gram positivos y bacilos similares a difteroides

2.5 Informe: Si es positivo para Bordetella pertussis, se debe indicar con palabra “positivo”, en caso contrario informar como “negativo”. 2.6 Tiempo de Respuesta: dentro del día hábil 2.7 Registro: Sistema informático del laboratorio y en la orden de examen. REFERENCIAS

Curso de inmunofluorescencia 2010 para virus respiratorios (Instituto de Salud Publica). ANEXOS

Anexo 1:

En la fotografía se observan células nasofaríngeas infectadas con virus (verde) y células negativas (rojo).


Nº 20. MÉTODOS DE DETECCIÓN DE ANTÍGENOS Y ANTICUERPOS EN MICROBIOLOGÍA

OBJETIVO

Realizar determinaciones de tipo cualitativos o cuantitativos para la detección de antígenos y anticuerpos de agentes microbiológicos de acuerdo a métodos estandarizados para obtener resultados confiables en el diagnóstico de patologías infecciosas. ALCANCE

Sección de microbiologia, servicio laboratorio clínico Técnicos paramédicos, tecnólogos médicos y medico microbiólogo de sección microbiologia. RESPONSABILIDAD

Tecnólogo Médico: Responsable de la evaluación del resultado obtenido en el kit, ingresar resultados al sistema informático y de la validación del informe. Técnico paramédico: Responsable de la realización de la determinación de acuerdo al protocolo entregado por el proveedor. DEFINICIONES

Antígeno: Son aquellas sustancias que inducen una respuesta por parte del sistema inmune al reconocerla como extraña. Puede ser ambiental como químicos o microorganismos. Anticuerpo: O inmunoglobulinas son glicoproteínas empleadas por el sistema inmune para neutralizar elementos extraños. Cada tipo de anticuerpo es único y defiende al organismo de un tipo específico de antígeno. Inmunocromatografía: Técnica que consiste en una membrana sólida en la cual se encuentra los anticuerpos dirigidos contra el antígeno que se quiere detectar en la muestra clínica. DESARROLLO DEL PROCESO

1. Determinación de Rotavirus Es el responsable mas común de de las gastroenteritis aguda en niños pequeños, es transmitido vía fecal oral y tiene un periodo de incubación de uno a tres días, siendo entre los días dos y quinto de la enfermedad los mejores para realizar pesquisa de este virus. Debido a que el virus es difícil de cultivar no es apropiado usar métodos de aislamiento del virus, por eso hoy en día existe una gran variedad de técnicas de enzimoinmunoensayo. En nuestro hospital se utiliza un kit comercial de ensayo inmunocromatográfico de detección cualitativa. 1.1 Fundamento del kit Consiste en una determinación en placa de un solo paso, en donde la membrana de la placa es precubierta con un anticuerpo antirotavirus (banda de prueba), durante la prueba el espécimen migra por la membrana por acción capilar y en la banda reacciona si hay presencia del virus formándose una línea coloreada. 1.2 Materiales y Equipos

Suministrados por el kit: placas, cuentagotas, tubos colectores. Los reactivos se deben mantener refrigerados entre 2 y 8 ºC No requiere equipo

1.3 Procedimiento Antes de usar se debe temperar placa y buffer. La muestra viene recolectada de acuerdo al Manual de Toma de Muestra

• Procesamiento muestras sólidas:


Desenrosque la tapa del tubo colector, luego al azar clave el aplicador en la muestra fecal al menos en tres sitios distintos para colectar aprox. 50 mg. de heces. Ajuste la tapa del colector y luego agite vigorosamente para mezclar buffer con la muestra.

• Procesamiento muestras líquidas Sostenga el gotero, aspire muestra fecal y transferir dos gotas (50uL) dentro del tubo colector. Ajuste la tapa del colector y luego agite vigorosamente para mezclar buffer con la muestra.

Sostenga el tubo colector hacia arriba y rompa la punta del tubo. Invierta y transfiera 2 gotas de la mezcla al pocillo correspondiente a la muestra en la placa. Leer a los 10 minutos y no más de 20 minutos. Visualizar dos líneas coloreadas una corresponde al control interno y la otra a la muestra en estudio. 1.4 Interpretación Positivo: Dos líneas coloreadas aparecen. La intensidad del color puede variar dependiendo de la carga viral. Negativo: una línea coloreada que corresponde al control interno. No válido: la línea de control no aparece. Revisar procedimiento y repetir prueba. 1.5 Informe: Positivo o negativo para rotavirus 1.6 Tiempo de Respuesta: 2 horas 1.7 Registro: Sistema informático del laboratorio y en la orden de examen. 2. Determinación de toxina A (o A y B) de Clostridium difficile Este agente es responsable del 90% de los casos de colitis pseudomembranosa y de aproximadamente 20% de los casos de diarrea asociada al uso de antibióticos. Uno de los factores de virulencia es la toxina A, esta enterotoxina interfiere a nivel de células epiteliales del intestino. El diagnóstico de referencia se realiza por medio de cultivos celulares pero este método en poco práctico en un laboratorio por lo que los test de enzimoinmunoensayo son de preferencia. En el hospital se utiliza un kit comercial. 2.1 Fundamento del kit

Esta dado por la formación del complejo antígeno-anticuerpo en una placa que tiene anticuerpos mono y policlonal para la detección del antígeno (toxina A o ambas toxinas). La formación de este complejo se visualiza por la formación de una línea coloreada en la placa. 2.2 Material y Equipo

Suministrado por el kit: Placas, Solución de extracción, Pipetas Los reactivos se deben mantener refrigerados entre 2 y 8 ºC Centrífuga.

2.3 Procedimiento

Antes de usar se debe dejar los reactivos a temperatura ambiente La muestra viene recolectada de acuerdo al Manual de toma de muestra

• Procesamiento de muestras sólidas: Colocar una pequeña muestra dentro del tubo con la solución de extracción

• Procesamiento de muestras líquidas: Transferir 200 uL de la muestra al tubo con la solución de extracción

Agitar hasta obtener una mezcla homogénea. Centrifugar a 1000 rpm por 1 minuto Usando la pipeta colocar 6 gotas en el pocillo de la placa o decantar la muestra Leer los resultados a los 15 minutos.


2.4 Interpretación

Positivo: Se observan dos líneas coloreadas una de ellas corresponde al control interno y la otra a la muestra. Negativo: Se observa solo una de las líneas que corresponde al control interno. No válido: No se observan líneas, se debe repetir la prueba.

2.5 Informe

Positivo o negativo para toxina A, o para ambas toxinas (depende del kit en uso) 2.6 Tiempo de Respuesta: 2 horas 2.7 Registro: Sistema informático del laboratorio y en la orden de examen. 3. Detección de anticuerpos para Mycoplasma pneumoniae

La infección por Mycoplasma pneumoniae es causa frecuente de infecciones respiratorias agudas en niños, siendo responsable de hasta 40% de las neumonías adquiridas en la comunidad (NAC). Diversos estudios sugieren que esta enfermedad comprende entre el 15 y el 50% de todos los casos de neumonías en adultos e incluso más en los niños en edad escolar. Las manifestaciones clínicas son inespecíficas, los síntomas más frecuentes son fiebre, tos, compromiso del estado general y cefalea. El diagnóstico se puede establecer determinando niveles de IgM en fase aguda. 3.1 Fundamento del kit.

Detecta los anticuerpos de tipo IgM para Mycoplasma pneumoniae. El suero es incubado en las placas marcadas con el antígeno, si existe presencia de anticuerpo se formará el complejo antígeno-anticuerpo el cual está marcado con el conjugado emitiendo una fluorescencia visible en el microscopio, en caso no haber anticuerpos no habrá formación de complejo ni emisión de fluorescencia. 3.2 Material Y Equipos

Micropipeta automática Punta de micropipeta automática (Tips) Tubos kahn Cámara húmeda Cubreobjetos Portaobjetos Kit (comercial) Zeus Scientific Mycoplasma Pneumoniae IgM antibody® Solución Tampón Fosfato (PBS), pH 7.2 Medio de montaje pH 8.5-9.0 Microscopio de inmunofluorescencia Cámara estufa a 37ºC Congelador a –20ºC Vórtex

3.3 Procedimiento La muestra utilizada es suero, y es obtenida de acuerdo al manual de Toma de Muestras. En caso de no procesar en el mismo día se debe almacenar a -20 ºC. Almacenamiento del Kit Placas con sustrato de Mycoplasma pneumoniae se deben guardar a -20ºC Suero control Positivo/Negativo se almacenan refrigerado entre 2 y 8 ºC Conjugado marcado (FITC) almacenar refrigerado entre 2 y 8 ºC

• Retirar la placa del freezer y esperar a que adquiera temperatura ambiente • Preparar una dilución 1:8 del suero del paciente con buffer PBS • Dispensar alrededor de 15-20 ul de la dilución en el pocillo correspondiente. • Incubar en cámara húmeda a 37ºC por 60 minutos


• Remover el exceso de muestra con un papel absorbente y lavar suavemente usando piseta con buffer PBS • Lavar dos veces por 5 minutos cada vez y con agitación usando PBS • Remover el exceso de buffer y dejar secar • Disponer 15 ul del conjugado en cada uno de los pocillos • Incubar en cámara húmeda a 37ºC por 30 minutos • Retirar el exceso de conjugado • Lavar suavemente con piseta con buffer • Lavar dos veces por 5 minutos cada vez y con agitación usando PBS • Remover exceso y dejar secar • Dispensar una gota de medio de montaje • Cubrir con cubreobjetos • Leer a 10X y 40X en microscopio de inmunofluorescencia

3.4 Lectura

Positivo: se observa una fluorescencia verde en el pocillo Negativo: no se observa fluorescencia

3.5 Tiempo de Respuesta Se realiza los jueves (en caso de fuerza mayor excepcionalmente se cambiará día). 3.6 Informe: Positivo o Negativo. 3.7 Registro: Sistema informático del laboratorio y en la orden de examen. 4. Reacción de Widal (pruebas tíficas) El objetivo de esta prueba es detectar en suero la presencia de anticuerpos contra los antígenos febriles de Salmonella Typhi y Paratyphi. Almacenamiento del kit de antisueros: se almacenan refrigerado entre 2 y 8 ºC Procedimiento: Sacar previamente el kit de reactivos a temperatura ambiente. En una placa de vidrio se delimitan con lápiz demarcador las áreas de reacción. Dispensar una gota de cada reactivo por área. Añadir a cada área (con su respectivo reactivo) una gota de suero del paciente. Extender cada mezcla en el área de reacción. Rotar suavemente la placa de vidrio. La reacción positiva no tarda más de 2 min. Interpretación: Resultado Positivo: aparece aglutinación con uno o más de los reactivos. Resultado Negativo: No aparece aglutinación. Cuando el resultado es positivo se realizan diluciones: 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640. Informe de resultados:

Positivo: Se informa positivo y la última dilución a la que se produjo aglutinación. Negativo: Se informa negativo.

Registro: Sistema informático del laboratorio y en la orden de examen


Nº 21. PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS PARA EXÁMENES BIOQUÍMICOS EN DEPOSICIÓN

OBJETIVO

Realizar procesamiento de muestras de deposición para la determinación de analitos de acuerdo a métodos estandarizados. ALCANCE

Sección Química de deposiciones a cargo de Tecnólogo Médico de Parasitología, Servicio de Laboratorio. Este protocolo incluye los procedimientos técnicos de los siguientes exámenes:

• Test de Benedict • Test de Sudan • Test de Guayaco o detección de hemorragias ocultas en deposición. • Esteatocrito ácido

RESPONSABILIDAD

Tecnólogo Médico: Responsable de la ejecución de las técnicas, de la interpretación de resultados y de la validación del informe. Auxiliar paramédico: Responsable de recepción, registro en cuaderno de recepción, ingreso a sistema informático de petición y preparación de muestras. DOCUMENTOS RELACIONADOS

Orden de examen Manual de Toma de Muestras Microbiológicas DESARROLLO DEL PROCESO

1. TEST DE BENEDICT: DETERMINACIÓN DE MONOSACÁRIDOS Y POLISACÁRIDOS EN DEPOSICIONES

1.1 OBJETIVOS • Identificar carbohidratos en deposición, que indiquen alteración en la absorción intestinal de algunos glúcidos. • Determinar la etiología de un cuadro diarreico posterior al consumo de alimentos con lactosa. 1.2 FUNDAMENTO Existen varios test para detectar carbohidratos en deposición, uno de ellos es el test de Benedict, método de tipo cualitativo, presenta muy buena sensibilidad; aquí se aprovechan las propiedades reductoras de los azúcares para identificarlos. Se basa en la propiedad de los azúcares (grupos aldehído o cetona libres) de reducir con rapidez el cobre (agente oxidante) de la solución alcalina del reactivo de Benedict, haciéndolo pasar de ion cúprico a oxido cuproso, con formación de un precipitado de color rojo ladrillo; dicha coloración evidencia la presencia de azúcares en deposición. Esta técnica presenta dos fases; si la primera fase es positiva refleja la presencia de monosacáridos, y si esta fase da negativa se debe realizar la segunda fase para determinar polisacáridos; en ésta se usa ácido clorhídrico y temperatura para romper los enlaces glicosídicos y de esta manera obtener monosacáridos con poder reductor; con esto se explica que la primera fase dé negativa y que pueda dar positiva la segunda. 1.3 MATERIALES E INSUMOS • Reactivo de Benedict


• Acido clorhídrico 0.1 N • Tubos de vidrio de 16 x 160 cc. • Vaso precipitado • Propipeta • Mechero • Trípode 1.4 INTRUMENTACION O EQUIPOS Y ACCESORIOS Esta técnica no requiere de equipos. 1.5 REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA Y PACIENTE • La muestra debe venir identificada con los datos del paciente (nombre, dos apellidos y servicio) y con su orden

respectiva. • Tipo de muestra: deposición • Dieta previa no requiere. • La muestra debe ser fresca. • Debe ser transportada en un frasco plástico limpio con tapa rosca por razones de bioseguridad. • No se debe llenar excesivamente el frasco, solo se requiere una pequeña cantidad. • La muestra debe llegar al laboratorio identificada con los datos del paciente. 1.6 DESARROLLO DEL PROCESO • Verificar que la muestra venga identificada con nombre y dos apellidos del paciente, además servicio y orden

respectiva. • Procesar la muestra:

� Fase I: Determinación de monosacáridos - Emulsionar aproximadamente 1 gramo de deposición en 5 ml de agua. - Dejar decantar o centrifugar a 1500 r.p.m. por 5 minutos. - Agregar 0.2 ml del sobrenadante a un tubo con 2 ml de reactivo de Benedict. - Poner a hervir por 6 minutos a baño María. - Leer la reacción. (Ver anexo 1) - La reacción es positiva cuando la solución toma una de las siguientes coloraciones:

Color verde: indicios Color ladrillo suave: + Color ladrillo intenso: ++ Color rojo ladrillo: ++++ Color anaranjado suave: +++

- La reacción es negativa cuando la solución permanece del mismo color (celeste). � Fase II: Determinación de polisacáridos. - Agregar dos gotas de HCl 0.1 N a 0.2 ml de sobrenadante. - Hervir a baño María por 1 a 2 minutos. - Retirar del fuego y agregar 2 ml del reactivo de Benedict. - Poner a baño María por 6 minutos. - Leer e informar igual que la fase anterior.

pH en deposición: Si además del test de Benedict, se solicita pH en deposición; este último se debe determinar con la cinta reactiva de pH la cual al estar en contacto con la deposición vira de color, este color resultante se compara con una gama de colores donde cada uno corresponde a un determinado pH. Las determinaciones del pH de las deposiciones indican si se producen cantidades significativas de ácidos orgánicos (láctico, acético) a partir de los carbohidratos no absorbidos. Un pH menor a 6 en individuos con diarrea puede reflejar problemas en la absorción de carbohidratos.


1.7 CONTROL DE CALIDAD INTERNO: De rutina no se requiere, pero para dudas diagnósticas se puede controlar en forma mensual el reactivo de Benedict, utilizando agua con glucosa, con la cual la reacción debe dar positiva. 1.8 INFORME • El informe debe incluir: nombre completo del paciente, procedencia y fecha de emisión, según formato del sistema

informático. • Si el resultado es positivo se informa “Test de Benedict positivo”. • Si el resultado es negativo se informa “Test de Benedict negativo”. 1.9 RESPONSABLE DIRECTO: Corresponde al Tecnólogo Medico a cargo de la sección de Parasitología y Química de deposición. 2. TEST DE SUDAN. DETERMINACIÓN DE GRASAS Y ÁCIDOS GRASOS EN DEPOSICIÓN 2.1 OBJETIVOS • Ayudar en el diagnóstico de patologías asociadas a alteraciones en la absorción intestinal de grasas. • Detectar un cuadro de esteatorrea. 2.2 FUNDAMENTO

Las grasas presentes en la deposición se colorean selectivamente de rojo anaranjado en presencia de la solución alcohólica de Sudan III. Este colorante es soluble en aceite (lipofílico), por lo tanto, difunde en las gotas de grasa, tornándolas rosadas anaranjadas (gotas de grasas neutras, vistas en la primera fase).

Existe una segunda fase en la cual se repite el procedimiento añadiendo varias gotas de ácido acético al 36% a la mezcla de heces y colorante, posteriormente se calienta sobre una llama, transformando las grasas neutras en ácidos grasos, que también se tiñen con Sudan III.

2.3 MATERIALES E INSUMOS • Reactivo de Sudan III • Alcohol 76° • Acido Acético glacial • Tubos de vidrio cónico • Portaobjetos • Cubreobjetos • Placas de Petri • Mechero • Gradilla. 2.4 INSTRUMENTACION O EQUIPOS Y ACCESORIOS • Microscopio binocular con lente objetivo 40x. 2.5 REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA Y PACIENTE} • La muestra debe venir identificada con los datos del paciente (nombre y dos apellidos y servicio) y con su respectiva

orden. • Tipo de muestra: Deposición recién emitida • Cantidad requerida: Debe ser del tamaño de una nuez. • Transporte: Se debe transportar al laboratorio en un frasco plástico limpio y seco con tapa rosca, el cual debe estar

rotulado con los datos del paciente. Este frasco es suministrado por el laboratorio. • Dieta previa: No requiere; pero para evitar resultados poco fidedignos el paciente no debe haber ingerido purgantes

oleosos. 2.6 DESARROLLO DEL PROCESO


• Verificar que la muestra venga identificada con los datos del paciente. • Técnica: (ver anexo 2)

- Diluir una punta de espátula de Sudan III en 2 ml de alcohol corriente. - Agitar y dejar decantar. - Sacar 1 ml del sobrenadante y hacer una emulsión con igual cantidad de deposición. - Poner una gota entre lámina y laminilla. - Observar al microscopio con lente objetivo 40x. - Si se observan 60 o mas gotas de grasa por campo la reacción es positiva; indica la presencia de grasas

neutras. • Al ser la reacción anterior positiva se puede determinar la presencia de ácidos grasos de la siguiente manera:

- Agregar 3 gotas de ácido acético glacial a la emulsión de deposición y sudan III. - Mezclar bien y calentar al mechero. - Poner una gota entre lámina y laminilla. - Observar al microscopio con aumento objetivo 40x. - Si se observan 60 o más gotas de grasa por campo, la reacción es positiva, indica presencia de ácidos grasos. - Reacción negativa: no se observan gotas de grasa o gotas aisladas.

* Si se observaran menos de 60 gotas de grasa por campo, pero más que gotas aisladas, se debe tener criterio para informar, ya sea, considerando el diagnóstico del paciente, y además teniendo en cuenta que existe un margen normal de grasa en deposición. Discútalo con su Jefe. 2.7 CONTROL DE CALIDAD INTERNO Realizar trimestralmente un control positivo del reactivo de Sudan III de la siguiente manera: • Disponer en una gradilla dos tubos de ensayo. • Colocar en ambos tubos 2 ml de aceite. • Añadir a uno 4 a 5 gotas de Sudan III, al otro añadir 4 a 5 gotas de tinta roja. • Agitar ambos tubos y dejar reposar. • Se observara en el tubo al que se le añadió Sudan, que todo el aceite aparece teñido, en cambio, en el frasco que

se añadió tinta roja, la tinta se va al fondo y el aceite aparece sin teñir. 2.8 INFORME • El informe debe incluir al menos nombre y dos apellidos del paciente, numero de ficha, procedencia y fecha de

emisión, según formato del sistema informático. • Si el resultado es positivo el informe debe decir: "Test de Sudan III positivo". • Si el resultado es negativo el informe debe decir: " Test de Sudan III negativo". 2.9 RESPONSABLE DIRECTO: Corresponde al Tecnólogo Médico a cargo del laboratorio de parasitología, quien efectúa la lectura del examen.


3. TEST DE GUAYACO, TEST DE HEMORRAGIAS OCULTAS 3.1 OBJETIVOS: Detectar sangre en deposiciones, lo que apoya al diagnóstico de enfermedades tales como: cáncer de colon y determinar etiologías de anemia ferropénica de origen indeterminado. 3.2 FUNDAMENTO: El “test de sangre oculta en deposición” se fundamenta en la capacidad de las enzimas catalasa y peroxidasa presentes en la hemoglobina humana que frente al peróxido de hidrogeno oxida un compuesto fenólico incoloro (guayaco) a una estructura quinona provocando así un viraje en su coloración. La oxidación del guayaco produce una coloración azul. Este test cualitativo es el más utilizado porque es un método rápido, pero tiene el siguiente inconveniente, además de detectar hemoglobina humana, detecta hemoglobina no humana, es decir, puede arrojar falsos positivos con la ingesta de determinados alimentos (carnes rojas, vísceras, productos con peroxidasas) y fármacos (AINES, hierro), también da falsos negativos con el consumo de vitamina C, ahí radica la importancia que tiene la dieta previa.

El Kit comercial de hemorragias ocultas que dispone el laboratorio es Hema screen ®. Presenta tarjetas donde se hace la reacción bioquímica, impregnadas con el guayaco, solución reveladora que contiene peróxido de hidrogeno. 3.3 MATERIALES E INSUMOS • Kit comercial HEMA SCREEN ® • Timer o reloj. 3.4 INSTRUMENTACION O EQUIPOS Y ACCESORIOS: No requiere de equipos o instrumentos.

3.5 REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA Y PACIENTE • La muestra debe venir identificada con los datos del paciente (nombre, dos apellidos y servicio) con su orden

respectiva. • Tipo de muestra: Deposición. Indicaciones de toma de muestra en Manual de Toma de muestras 3.6 DESARROLLO DEL PROCESO • Revisar las muestras; que venga con los datos requeridos y condiciones adecuadas. • Abrir la caja del Kit Hema screen ® y sacar tres sobres para la reacción de hemorragias ocultas, siempre y cuando

sea seriado el examen. • La muestra de deposición se expande en la zona circular que esta en uno de los dos lados del sobre de reacción. • Luego se debe cerrar el sobre de reacción, de modo que la superficie con la deposición quede tapada. • Al reverso de este sobre se agrega una gota de la solución reveladora, justo en la zona donde dice Neg – Pos, con

el objetivo de controlar la técnica, agregar otra gota del revelador en la zona para la muestra problema, lo mismo se hace para las otras muestras.

• Después de 30 segundos y antes de 2 minutos leer los resultados. • Cualquier coloración azul en la zona para la muestra problema se considera positiva. • Si no da la coloración azul se considera negativa. • A veces puede resultar una coloración verde azulada, la cual también se considera positiva. • Para validar la técnica el control positivo debe dar azul y el negativo incoloro después de los treinta segundos,

independientemente del resultado de la muestra problema. 3.7 CONTROL DE CALIDAD INTERNO: El control de calidad se realiza en forma simultánea con una muestra problema, esto se realiza agregando gotas de peróxido de hidrógeno en una zona indicada en el sobre de reacción. 3.8 INFORME • Se ingresa los resultados en el sistema informático del laboratorio. • Si el resultado es positivo se informa : “Test de Guayaco positivo” • Si el resultado es negativo se informa: “Test de Guayaco negativo” 3.9 RESPONSABLE DIRECTO: El responsable es el Tecnólogo Médico a cargo del laboratorio de parasitología y química de deposiciones, quien supervisa al técnico paramédico que realiza la técnica.


4. ESTEATOCRITO ÁCIDO 4.1 OBJETIVOS: Determinar semicuantitativamente el porcentaje de grasas presentes en una muestra de heces en pacientes con sintomatología de mala absorción intestinal. 4.2 CAMPO DE APLICACIÓN: En pacientes con sospecha, de insuficiencia pancreática, y en pacientes con fibrosis quística siendo usado además en estos como seguimiento del progreso de la terapia. La prueba de esteatocrito ácido confirma la esteatorrea y es un micrométodo simple con mayor sensibilidad que otros métodos como el clásico “Van de Kamer” 4.3 FUNDAMENTO: Consiste en separar mediante centrifugación una muestra de heces en fase sólida, acuosa y lipídica, la cual previamente es acidificada. Se lee con un lector de microhematocrito obteniéndose el porcentaje de grasas presente en las heces. 4.4 MATERIALES E INSUMOS • Tubos Khan • Pipetas Vidrios • Capilares • Plasticina • Acido perclorico 5M (ver Instructivo Preparación de reactivos) • Lupa 10X 4.5 INSTRUMENTACION O EQUIPOS Y ACCESORIOS • Centrifuga microhematocrito • Sonicador 4.6 REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA Y PACIENTE • La muestra debe venir identificada con los datos del paciente (nombre, dos apellidos y servicio del paciente) y con

su orden respectiva. • Dieta previa: no requiere • Obtener la muestra por eliminación espontánea. • Cantidad mínima requerida, ½ cucharadita de té. • Depositar la muestra en un frasco limpio no estéril; debe ser un frasco tapa rosca por condiciones de seguridad. • En el caso que se trate de un lactante:

- La muestra debe tomarse directamente del pañal con una espátula de madera. - Cantidad mínima requerida, un tercio de la espátula.

4.7 DESARROLLO DEL PROCESO 1.- Introducir una muestra de heces en un tubo khan limpio alrededor de 0.5 gr. Y se diluye con dos partes de agua destilada. 2.- Tapar y homogenizar en vórtex por 2 minutos 3.- Colocar en el sonicador por 30 a 40 minutos 4.- Colocar 0.5 ml del homogenizado en un tubo khan y se agrega 0.1 ml de ácido perclórico 5 M, mezclar en vórtex 5.- La mezcla, se introduce por capilaridad en un capilar de los utilizados para microhematocrito. Se cierra por un extremo con plastilina, se realiza dos capilares por cada muestra. 6.- Se centrifuga por 15 minutos a 13.000 rpm Lectura Se diferencian cuatro fases: 1. FMF: Fase formada por la materia fecal 2. FA: Fase formada por el agua, parte intermedia. 3. FHF: Fase heces flotantes 4. FG: Fase formada por la grasa, sobrenadante


Fase Sólida corresponde a (FMF+FHF) Se lee en un lector de hematocrito el porcentaje de Fase Grasa (FG) respecto a la Fase (F Sólida +FG). El resultado se expresa en porcentaje: ESTEATOCRITO (%) =FG/ (FG+FS) * 100 Valores de referencia Normales de 0 a 2 % Patológicos: superiores a 5 % 4.8 INFORME Se ingresa el resultado del porcentaje en el sistema omega y se deja por escrito en la orden del paciente. 4.9 RESPONSABLE DIRECTO: Corresponde al Tecnólogo Médico a cargo del laboratorio de parasitología, quien efectúa el examen y la lectura del mismo.

REFERENCIAS

• http://bioweb.wku.edu/courses/Biol121/Carbo/carbo1.asp • www.umanitoba.ca/.../lab2/images/benedict.jpeg • Diagnósticos y tratamientos clínicos por el laboratorio, John Bernard Henry, 9ª edición, Masson. • http://www.geocites.com/CapeCanaveral/Campus/1768/esteato.html • http://www.Laboratoriodomingo.com/Labodata/Producto.asp • http://www.aecirujanos.es/formacion/coloproc/hemorragias.html • Guia Clinica Minsal Nº 51 Fibrosis Quistica 2007

ANEXOS

Anexo 1: Test de Benedict

La sacarosa es un azúcar no reductor, razón por la cual, da negativo el test de Benedict


Anexo 2: Técnica de Test de Sudan

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS DE

Documents

Transcript of MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS DE