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Q.C. CLAUDIA ARRONTE M.C. ANA ROSA CASTILLO GUERRERO MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA GENERAL UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE ODONTOLOGÍACAMPUS XALAPA
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA
GENERALQ.C. CLAUDIA ARRONTE M.C. ANA ROSA CASTILLO GUERRERO
UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE ODONTOLOGÍACAMPUS XALAPA
La Microbiología es una ciencia relativamente reciente con respecto a otras ramas de la Biología. El estudio de los microorganismos se inició a partir de que Anton van Leewenhoek en 1670 inventó el microscopio y que a partir de los estudios de Louis Pasteur en 1876, se logró el mayor desarrollo y reconocimiento de los microorganismos como actores de una diversidad de procesos.
Aunque durante mucho tiempo estos organismos causaron graves problemas de enfermedades en plantas, animales y humanos, también es cierto que desde la antigüedad algunas especies microbianas han sido utilizadas en procesos de producción de alimentos fermentados como quesos, vino, pan y cerveza, entre otros y actualmente se ha reconocido su importancia en diversas áreas de investigación básica, en la industria alimentaria, ambiental y farmacéutica.
El objetivo general del curso práctico de Microbiología General es que el alumno se inicie con el conocimiento de la biología básica de los microorganismos, en sus características morfológicas, nutricionales, de crecimiento, control y que adquiera las habilidades necesarias para su manipulación en el laboratorio.
Este manual está dirigido a estudiantes que iniciarán su experiencia en el manejo de los microorganismos, por lo que consideramos de gran importancia incluir al principio del mismo una serie de recomendaciones relacionadas con las reglas generales del laboratorio y los principales procedimientos que el estudiante deberá aprender, para que manipule en forma adecuada a los microorganismos y garantizar tanto su seguridad como la de sus compañeros.
Este manual contiene 10 prácticas, diseñadas para que el estudiante se familiarice gradualmente con los procedimientos de cultivo y observación de microorganismos.
En cada práctica se presentan los objetivos y una breve introducción para facilitar la comprensión de los mismos, después se indican los materiales necesarios y procedimientos a realizarse en forma de instrucciones numeradas que se complementan con figuras y esquemas.
Posteriormente en cada práctica se proponen formas de presentación de los resultados en cuadros, para que el alumno recopile sus observaciones. También se incluyen preguntas en forma de cuestionario que el estudiante deberá resolver consultando los materiales bibliográficos sugeridos al final de este manual.
REGLAS DE LABORATORIO
NORMAS GENERALES PARA EL TRABAJO EN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
1. Siempre deberá usar bata de algodón, de manga larga, abotonada, que deberá quitarse antes de abandonar el laboratorio
2. Se prohibe fumar, aplicarse cosméticos o tocarse la cara con las manos o algún otro objeto. Se deberá lavar meticulosamente las manos con agua y jabón antes de salir del laboratorio.
3. Evitar la acumulación sobre la mesa de trabajo de objetos no relacionados con la práctica de laboratorio. Colocar todos los objetos personales (libros, mochilas, etc.) en la zona especificada por el académico.
4. No se admiten visitas personales que distraigan la atención y pongan en riesgo la seguridad en el trabajo que se realiza.
5. Limpiar su sector de mesa , antes y después de trabajar , con un algodón embebido en solución desinfectante. Para ello se puede emplear bicloruro de mercurio, solución de formol al 5-10%, alcohol 70 grados, etc. (no corrosivas para la piel).
6. Tener siempre a mano sobre la mesa: a) un vaso de precipitado o similar llena con solución desinfectante para introducir las pipetas luego de ser utilizadas; b) un recipiente para colocar el material contaminado o sucio; c) mechero.
7. Tener en cuenta que el cultivo con el que se trabaja puede ser patógeno, razón por la cual hay que manejarlo siempre como si lo fuera.
8. Al recibir el cultivo NO LO DESTAPE, tome el tubo por su parte media apoyado sobre la palma de la mano de manera de ver fácilmente el contenido y la inscripción que lo identifica.
9. En caso de producirse un incendio o una herida personal, el alumno deberá notificarlo inmediatamante al académico. En el caso de derrame de cultivos o rotura de recipientes con cultivos activos, deberá conservar la calma y además de informar al académico, seguir inmediatamente el procedimiento:A)Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersión.
B)Poner abundante solución desinfectante sobre las toallas.C)Dejar transcurrir por lo menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el recipiente destinado a la eliminación de materiales contaminados.
10. En caso de heridas por accidentes durante el manipuleo del material infectado, debe prevenirse la posibilidad de infección. Comunique el hecho al personal de la cátedra.
11. Realice las técnicas bacteriológicas al abrigo de las corrientes de aire, con movimientos pausados, poco amplios y sin brusquedad. Evite hablar mientras realiza maniobras microbiológicas a fin de evitar que se contaminen los cultivos.
12. Debe siempre llevarse el asa al rojo antes y después de toda operación que se realice con ella.
13. No deben depositarse los tapones sobre la mesa, para evitar contaminaciones de y con los cultivos de trabajo.
14. Los tubos con medio de cultivo, ya sean líquidos o sólidos, sembrados o no, deben colocarse siempre sobre una gradilla y nunca sobre la mesa.
15. Los cultivos de descarte deben colocarse siempre en recipientes adecuados para luego ser esterilizados.
16. Tanto las placas como los tubos deben ser identificados con marcas o rótulos.
17. Los papeles de envoltura de material de vidrio deben arrojarse en los cestos destinados a tal fin.
18. No deberá pipetear oralmente ningún tipo de cultivo microbiano; esta actividad se realizará con pipetas automáticas o accionadas de forma mecánica, tratando de evitar la formación de aerosoles.
19. 16. Anotar concisamente todo lo nuevo que se observe en cada experiencia, completando con dibujos.
20. Al abandonar el laboratorio, debe controlar que los mecheros y llaves de gas, agua, así como las luces .
21. REQUIERA LA PRESENCIA DEL DOCENTE PARA QUE LO ASESORE CORRECTAMENTE TODA VEZ QUE TENGA DUDAS SOBRE LA REALIZACIÓN DE UNA TÉCNICA.
MATERIALES INDISPENSABLES EN CADA SESIÓN DE LABORATORIO
1. Bata de laboratorio limpia, de manga larga, con botones.2. El protocolo de la práctica y la bitácora de laboratorio.
3. Un pedazo de tela sin pelusa, cerillos, tijeras, maskin tape, marcador indeleble o etiquetas pequeñas. 4. Lentes de seguridad. 5. Jabón y toalla individual.
Contenido
REGLAS DE LABORATORIO..............................................................................................................2
NORMAS GENERALES PARA EL TRABAJO EN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA.....................2
MATERIALES INDISPENSABLES EN CADA SESIÓN DE LABORATORIO..............................................3
PRÁCTICA # 1..................................................................................................................................6
MICROSCOPÍA................................................................................................................................6
OBJETIVO....................................................................................................................................6
INTRODUCCIÓN..........................................................................................................................6
EL MICROSCOPIO........................................................................................................................6
MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO............................................................................................7
MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES..........................................................................................8
ACTIVIDADES..............................................................................................................................9
PRÁCTICA # 2................................................................................................................................10
TÉCNICAS DE TINCIÓN..................................................................................................................10
OBJETIVO..................................................................................................................................10
GENERALIDADES.......................................................................................................................10
TINCIÓN DE BACTERIAS............................................................................................................10
TIPOS DE TINCIÓN....................................................................................................................10
TINCIÓN SIMPLE.......................................................................................................................11
TINCIÓN NEGATIVA..................................................................................................................11
TINCIÓN DE GRAM...................................................................................................................12
TINCIÓN DE ESPORAS...............................................................................................................13
PRACTICA # 3................................................................................................................................17
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.......................................................................................17
OBJETIVO..................................................................................................................................17
GENERALIDADES.......................................................................................................................17
CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO...........................................................................17
MEDIOS DE CULTIVO DESHIDRATADOS....................................................................................18
PRÁCTICA # 4................................................................................................................................20
MORFOLOGÍA DE LAS COLONIAS BACTERIANAS..........................................................................20
OBJETIVO..................................................................................................................................20
GENERALIDADES.......................................................................................................................20
PRÁCTICA # 5................................................................................................................................25
PRUEBAS BIOQUÍMICAS...............................................................................................................25
OBJETIVO......................................................................................................................................25
GENERALIDADES...........................................................................................................................25
Caldos de carbohidratos con indicador de pH..............................................................................25
Agar de hierro y triple azúcar (TSI)...............................................................................................26
Agar de hierro y lisina (LIA)..........................................................................................................26
Prueba del citrato de Simmons....................................................................................................27
Prueba de la ureasa......................................................................................................................27
Medio MIO (Movilidad, Indol y Ornitina).....................................................................................27
MATERIAL Y EQUIPO....................................................................................................................28
TÉCNICA.......................................................................................................................................28
PRESENTACÍON DE RESULTADOS.................................................................................................29
PRÁCTICA # 6................................................................................................................................30
CONTROL BACTERIANO POR MEDIO DE AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS.....................................30
OBJETIVO..................................................................................................................................30
GENERALIDADES.......................................................................................................................30
RADIACIÓN ULTRAVIOLETA......................................................................................................30
TEMPERATURA.........................................................................................................................30
DESINFECTANTES.....................................................................................................................31
PRÁCTICA # 7................................................................................................................................35
OBSERVACIÓN EN FRESCO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS BUCALES..................................35
OBJETIVO..................................................................................................................................35
GENERALIDADES.......................................................................................................................35
PRÁCTICA # 1
MICROSCOPÍA
OBJETIVOConocer las partes y funcionamiento de un microscopio así como tomar conocimiento del cuidado, manejo y utilidad de un microscopio en el Laboratorio de Microbiología.
INTRODUCCIÓNCasi la totalidad de los organismos unicelulares son imperceptibles para el ojo humano, y para observarlos es esencial el microscopio. El uso de este dispositivo es indispensable en el Laboratorio de Microbiología para el estudio de la morfología y estructura de los microorganismos, así como su reacción a diferentes colorantes, lo cual junto con otros criterios, permitirá su identificación, por lo tanto, es importante conocer su adecuado manejo.Además de la ampliación de la imagen, en microscopía, hay que tener en cuenta dos factores más: el contraste y la resolución. Los objetos deben poseer un cierto grado de contraste con su medio circundante para poder ser percibidos a través del microscopio. Por ello es que la mayoría de los organismos necesitan ser previamente teñidos para poder distinguirlos del medio (tinciones simples). Para contrastar o realzar de forma específica distintas características morfológicas o estructurales se emplean tinciones diferenciales. Estas técnicas tienen un gran interés en la identificación y clasificación de las bacterias. La tinción diferencial más utilizada es la tinción de Gram. Otras tinciones de gran importancia son las que diferencian bacterias “ácido- alcohol resistentes”, las que diferencian estructuras significativas como las esporas o la tinción negativa de cápsulas.Por otra parte, el grado de resolución (la capacidad para ver separados dos objetos adyacentes muy próximos entre sí), depende de las características del sistema de lentes que posea el microscopio. Éste se encuentra limitado por la longitud de onda de la luz emitida, el índice de refracción del medio en el que se realiza la visualización y la apertura numérica del objetivo.
EL MICROSCOPIO
El microscopio compuesto es aquel que dispone de dos o más lentes de aumento. Un microscopio se divide en dos partes: el soporte y el sistema óptico.
1) Soporte. Es la pieza fija en la que sólo la platina y el condensador tienen un cierto movimiento. Sus principales partes son:
a) Base. Normalmente alberga la fuente de iluminación, en determinados modelos incorpora además, un sistema portafiltros con varios filtros y un diafragma de campo luminoso.
b) Brazo. Soporta todo el sistema óptico, el cabezal portaoculares y el revólver portaobjetivos. En él se dispone también un sistema de anclaje de la platina (movimiento de enfocado de la preparación).
c) Platina. Es la pieza donde se coloca la preparación microscópica para su observación.
d) Los tornillos macrométrico y micrométrico. Ambos permiten enfocar la preparación. El primero se emplea para un enfoque rápido cuando se trabaja con objetivo de menor aumento (10x), mientras que el segundo permite fijar el enfoque cuando se utilizan los objetivos de mayor aumento (40x, 100x).
2) Sistema Óptico. Está formado por un cuerpo tubular donde se instalan las lentes: los oculares en un extremo y los objetivos en el extremo opuesto.
MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO
1) Compruebe que las lentes del ocular y de los objetivos están limpias: de no ser así, límpielas cuidadosamente con papel especial para óptica. No tocar las lentes con los dedos.
2) Coloque la preparación (sin cubreobjetos y con la muestra en la parte superior) sobre la platina sujetándola con el dispositivo móvil. Compruebe previamente, que el objetivo de menor aumento está en posición de empleo.
3) Para bacteriología, iluminar la preparación bajando el condensador (más contraste), y con el diafragma abierto.
4) Ajuste los binoculares a la distancia interpupilar y ajuste el foco de cada ocular si el microscopio lo permite.
5) Coloque el objetivo de 10 aumentos (x10) y enfocar:
a) Acerque al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando para ello el macrométrico. No realizar dicha operación mirando por el ocular, pues correría el riesgo de “clavar” el objetivo en la preparación con el consiguiente destrozo de ambos.
b) Enfoque con el micrométrico observando por el ocular hasta obtener un enfoque nítido
6) Pase al objetivo de 40 aumentos (40x). Suba ligeramente el condensador. La imagen debe estar casi enfocada, afine el foco con el micrométrico. Si la imagen no está ni medianamente enfocada, es preferible volver a un enfoque con el objetivo de 10x. El objetivo de 40x trabaja muy cerca de la preparación y por ello es susceptible de dos tipos de accidentes: ser “clavado” en la preparación y resultar manchado con aceite de inmersión si se observa la preparación ya usada con éste último.
7) Empleo del objetivo de inmersión:
a) Gire el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el objetivo de 40x
b) Coloque una gota de aceite de inmersión sobre el punto de la luz.
c) Termine de girar el revólver hasta la posición del objeto de inmersión, asegurándose de que éste no toca la preparación, pero sí la gota de aceite.
d) Enfoque cuidadosamente con el micrométrico. Recuerde que la distancia entre el objetivo y la preparación es mínima.
e) Una vez que ya ha puesto aceite de inmersión sobre la preparación ya no puede volverse a colocar los objetivos de 10x y de 40x sobre ese campo. Por lo tanto, si desea enfocar otro campo, debe retirar el objetivo de inmersión girando el revólver hacia el objetivo de menor aumento (10x), seleccionando otro campo y empezando a enfocar desde éste último.
f) Finalizada la observación de una preparación, y antes de retirarla de la platina, se colocará el objetivo de menor aumento girando el revólver en el sentido hacia la lupa. Nunca retire la preparación con el objetivo de inmersión en posición de observación.
g) Retire la preparación y limpie el objetivo de inmersión cuidadosamente con un papel especial para óptica. Compruebe también que el objetivo de 40x está limpio.
MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES
1) No se deben tocar nunca las lentes con las manos, sino con pañuelos especiales para lente.
2) No dejar nunca una preparación sobre la platina cuando no esté usando el microscopio.
3) Para cambiar el objetivo, utilice siempre el revólver.
4) Después de utilizar el objetivo de inmersión límpielo. En caso de que el aceite se haya secado, avise al docente para limpiarlo con xilol.
5) No fuerce nunca los dispositivos giratorios del microscopio (macro y micrométricos, platina, revólver y condensador).
6) No cambie nunca de objetivo mientras está observando a través del ocular.
7) Cuando finalice el trabajo ponga el objetivo de menor aumento en posición de observación.
8) Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión de práctica.
ACTIVIDADES1) Siguiendo las indicaciones para el manejo del microscopio:a) Observar un examen en fresco de microorganismosb) Observar preparaciones coloreadas suministradas por el catedrático.2) Dibujar lo observado
Examen en Fresco Preparación Coloreada
PRÁCTICA # 2
TÉCNICAS DE TINCIÓN
OBJETIVO El alumno aprenderá y aplicará las técnicas básicas de tinción más frecuentes.
GENERALIDADESLa coloración es el proceso de teñir artificialmente los microorganismos con
colorantes o reactivos para facilitar su estudio microscópico forma, agrupación y estructuras)
Un colorante es un compuesto orgánico que consta de anillos bencénicos y grupos cromóforos (agrupación de átomos que da color a ciertos compuestos) y auxocromos (sustituyentes como el grupo oxidrilo o el amino que mejoran las características de absorción del cromóforo).
En el laboratorio de microbiología se pueden usar los colorantes de varias formas como:
a) Para teñir bacterias y hacerlas visibles al microscopiob) Para mostrar estructuras del organismo estudiado.c) Para la identificación de microorganismos en base a sus características de tinción,
por ejemplo, si son o no alcohol-ácido resistentes, si son Gram positivas o Gram negativas.
d) En los medios de cultivo para inhibir el desarrollo de algunas bacterias y así poder estudiar selectivamente a los microorganismos que si crecen.
TINCIÓN DE BACTERIASLa célula bacteriana intacta se tiñe fácilmente con colorantes básicos como el
cristal, azul de metileno y fucsina básica, pero relativamente mal con colorantes ácidos como la eosina.
Un colorante básico es aquel constituido por un agrupamiento de átomos orgánicos con carga positiva que será la parte activa del colorante ya que tendrá afinidad por los ácidos nucleicos. Un colorante ácido es aquel que se encuentra constituido por átomos orgánicos con carga neta negativa por lo cual tiene afinidad por el citoplasma.
TIPOS DE TINCIÓN1. Tinción simple. Conocida con ese nombre ya que solo nos sirve para hacer más
fácilmente visibles a las bacterias sin resaltar ninguna característica en especial. Una tinción simple se lleva a cabo cubriendo con colorante básico un frotis seco y fijado al calor. El frotis se deja reaccionar con las células por un minuto y se lava suavemente con agua. El frotis se puede dejar secar o usar papel secante para que quede listo para observarse.
2. Tinción negativa. Este método de tinción utiliza colorantes neutros o ácidos ya que tienen poca afinidad por la célula bacteriana por lo tanto como no se absorben se colorea el fondo en el que están las bacterias pero la célula queda incolora y
transparente, así pues las bacterias aparecen como pequeñas áreas iluminadas en un fondo oscuro. La tinción acídica con nigrosina, o neutral ( con tinta china) son las más usadas.
3. Tinción diferencial. Las bacterias se diferencian unas de otras tanto física como químicamente, por lo cual su reacción ante algunos colorantes también será diferente dando lugar así a grupos tintoreales característicos. Entre estos grupos están los que se originan por la tinción descubierta por Hans Christian Gram, esta tinción divide a las bacterias en Gram positivas o Gram negativas lo cual no solo sirve para diferenciarlas sino aún para elegir la terapia adecuada en algunos casos. Existen otras tinciones diferenciales de utilidad en microbiología clínica como la de Ziehl- Neelsen.
4. Tinción estructural. Existen diferentes tipos de colorantes que de acuerdo a su afinidad se utilizan para teñir y detectar ciertas estructuras de la célula bacteriana como son las esporas, los flagelos y las cápsulas.
TINCIÓN SIMPLEMATERIAL Y EQUIPO2 portaobjetosAsa bacteriológicaAceite de inmersiónMicroscopioMecheroAzul de metileno de LöefflerCepa de Escherichia coli, Staphylococcus aureusTÉCNICA1. Preparar un frotis de E. coli y se S. aureus de acuerdo a las indicaciones de la figura
1 y fijarlo al calor.2. Cubrir el frotis con azul de metileno y dejar en reposo por un minuto.3. Lavar con agua corriente suavemente y dejar secar.4. Observar con el objetivo de inmersión.
TINCIÓN NEGATIVAMATERIAL Y EQUIPO4 portaobjetosAsa bacteriológicaAceite de inmersiónMicroscopioVaso de precipitado de 200 ml con fenol al 5%Nigrosina o tinta chinaPuente de tinciónCepa de Klebsiella pneumoniae
TÉCNICA1. Hacer una suspensión ligera en solución salina de K. pneumoniae y mezclar una
gota de esta suspensión con una pequeña gota de nigrosina o tinta china en el borde central del portaobjetos.
2. Con el extremo de otro portaobjetos extender la gota a lo ancho del primer portaobjetos. Prepare un frotis delgado y otro grueso.
3. Deje secar al aire. NO SE DEBE FIJAR AL CALOR.4. Observe con el objetivo de inmersión.
TINCIÓN DE GRAMMATERIAL Y EQUIPO3 portaobjetosAsa bacteriológicaAceite de inmersiónMicroscopioMecheroPuente de tinciónCepas de Gram negativos (Escherichia coli) y de Gram positivos (Staphylococcus aureus).Cristal violetaYodo de GramEtanol al 95%Safranina
TÉCNICA1. De acuerdo a la figura 1 preparar un frotis de E. coli, uno de S. aureus y uno con
una mezcla de ambos microorganismos.2. Dejar secar y fijar al calor como se indica.3. Teñir con cristal violeta por un minuto.4. Enjuagar con agua corriente suavemente y escurrir.5. Cubrir el frotis con Yodo de Gram y dejar reposar por un minuto.6. Enjuagar con agua corriente y escurrir7. Decolorar con etanol al 95%. Para esto, incline el portaobjetos sobre la charola
de tinción y añada goteando el etanol, dejando que corra por todo el frotis. Para un frotis delgado es suficiente con 10 a 20 segundos.
8. Detener la acción decolorante lavando con agua.9. Contrastar con safranina por 20 a 30 segundos, enjuagar y dejar secar el frotis.10. Examinar con el objetivo de inmersión.
TINCIÓN DE ESPORAS
MATERIAL Y EQUIPO
2 portaobjetosAsa bacteriológicaAceite de inmersiónMicroscopioMecheroPapel filtroLámpara de alcoholCepa de Bacillus subtilisÁcido acético al 5%Azul de metileno de Löeffler
TÉNICA1. Hacer un frotis, secar y fijar al calor como se describe en la figura 1.2. Cubrir el frotis con fucsina fenicada y calentar con la lámpara de alcohol hasta
la emisión de vapores. Es importante que su puente de tinción esté bien nivelado para que la fucsina no se escurra y el frotis no se seque al calentar.
3. Dejar en reposo por 5 minutos4. Lavar con agua corriente5. Decolorar con ácido acético al 5% hasta que el frotis tome un ligero color rosa6. Lavar con agua corriente7. Teñir durante 3 minutos con azul de metileno de Löeffler8. Lavar nuevamente con agua corriente, dejar secar y observar con el objetivo de
inmersión
FIGURA 1PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO
PRESENTACIÓN DE RESULTADOS
1. Dibuje y coloree sus observaciones, indicando en cada caso:a) Tipo de tinciónb) Nombre de la bacteriac) Característica observada
Reportar las observaciones de forma, agrupación y tamaño relativo de cada uno de los microorganismos en el cuadro de resultados.Comparar sus observaciones con las reportadas en la literatura.
Cuadro 2Observaciones microscópicas de frotis de cultivos bacterianos
Tinción simple
Forma (cocos, bacilos, etc.)
Agrupamiento de las células (solos, pares,
cadenas, etc.)
Tinción negativa
Forma (cocos, bacilos, etc.)
Agrupamiento de las células (solos, pares,
cadenas, etc.)
Tinción simple Staphylococcus aureus Escherichia coli
Forma (cocos, bacilos, etc.)
Agrupamiento de las células (solos, pares, cadenas,
etc.)
Tinción simple Staphylococcus aureus Escherichia coli
Forma (cocos, bacilos, etc.)
Agrupamiento de las células (solos, pares, cadenas,
etc.)
PRACTICA # 3
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
OBJETIVO
El alumno aprenderá las técnicas básicas para preparar un medio de cultivo.
GENERALIDADES
Las bacterias al igual que otros microorganismos requieren para su crecimiento de una fuente de energía exógena y nutriente esenciales tales como agua, carbón, nitrógeno, minerales y factores de crecimiento, además de las condiciones ambientales apropiadas como son pH, temperatura, presión osmótica y oxígeno atmosférico. Cuando las bacterias se cultivan en el laboratorio tales requerimientos se llenan con los medios de cultivo los cuales pueden ser de muy variados tipos de acuerdo al microorganismo que se desee estudiar. Muchos materiales naturales como jugos, leche, vegetales y carnes pueden ser usados como bases para medios de cultivo.
El medio de cultivo puede ser líquido como los caldos, semisólido o sólido dependiendo de la consistencia que adquiere el medio líquido al agregar diferentes concentraciones de un solidificante como el agar, que es un extracto de algas marinas. El agar no es utilizado como nutriente por la mayoría de las bacterias, así pues actúa solamente como solidificante. Se funde alrededor de 100° C y permanece líquido hasta que se enfría de 42° a 43°C. La gelatina se puede usar también pero con el inconveniente de que funde a 25°C y puede ser hidrolizada por muchas bacterias.
CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Existen diversas clasificaciones de los medios de cultivo: se abocará a dos de uso práctico, una de acuerdo a su composición y la otra de acuerdo a su uso en el laboratorio:
A) Clasificación de los medios de cultivo de acuerdo a su composición:
+ Sintéticos. Son aquellos medios preparados con alta pureza y en los cuales la composición se conoce en forma precisa. Su uso es muy definido, por ejemplo medios para ensayo de vitaminas o para enriquecimiento.
+ No sintéticos. Estos se preparan a partir de una gran variedad de productos crudos como son extractos de carne, extractos de levaduras, hidrolizados proteicos (peptonas) etc. y aunque se conoce cuáles son los ingredientes, estos pueden variar ligeramente, por ejemplo el contenido de aminoácidos entre la carne de un animal y otro.
B) Clasificación de los medios de acuerdo a su uso en el laboratorio
~ Medios de cultivo de uso general. En este grupo se encuentran los medios qe contienen los nutrientes básicos y no contienen sustancias inhibitorias por lo que en ellos pueden crecer una gran variedad de heterótrofos. Entre estos medios tenemos Agar de soya y tripticaseína, agar de Müller Hinton, agar nutritivo, etc.
~ Medios de cultivo diferencial. Este tipo de medios es usado para distinguir entre diferentes tipos de bacterias. Usualmente contienen colorantes o indicadores de pH que darán un color característico a las colonias o viraran el color del medio de cultivo de acuerdo al microorganismo que se trate.
Un medio puede ser diferencial y selectivo al mismo tiempo.
~ Medios de cultivo selectivos. Este es un medio nutritivo al que se le añaden productos que actúan como agentes inhibitorios, de tal manera que sólo permiten el crecimiento de cierto grupo de microorganismos. Se usan para aislar organismos particulares e inhibir el crecimiento de los no deseados.
Entre los medios selectivos y diferenciales tenemos:
Agar de MacConkey el cual contiene una mezcla de sales biliares que inhiben a los microorganismos Grampositivos, además de lactosa y como indicador rojo de fenol para distinguir las bacetrias que fermentan la lactosa de las que no lo hacen.
Agar EMB (Eosina azul de metileno) mediante el azul de metileno y la eosina inhibe los organismos Grampositivos. Al mismo tiempo, al igual que el Agar de MacConkey, permite diferenciar bacterias que fermentan la lactosa y/o a la sacarosa de las que no lo hacen.
El Agar de sal y manitol, por su alto contenido de NaCl (7.5%) inhibe a las bacterias que no lo toleran, al mismo tiempo con el indicador rojo de fenol sirve para detectar la
fermentación del manitol. Se utiliza para el aislamiento y diferenciación del género Staphylococcus.
MEDIOS DE CULTIVO DESHIDRATADOS
Hasta 1930 la preparación de medios de cultivo requería de mucho tiempo ya que se debía de partir de materiales crudos que se iban pesando individualmente y algunos se tenían que preparar como las infusiones y extractos por métodos muy tediosos. Sin embargo, ahora se cuenta con medios de cultivo deshidratado que han simplificado mucho el trabajo ya que solo hace falta leer las instrucciones en cada frasco, disolver la cantidad necesaria en agua, ajustar el pH, dispensar en tubos y esterilizar.
DISOLUCIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Para disolver los medios de cultivo deshidratados se debe utilizar agua recién destilada o desmineralizada con un pH lo más cercano posible a 7.0. El recipiente que se utilice debe ser de preferencia un matraz Erlenmeyer con una capacidad mayor al volumen de medio que se va a preparar para que se pueda agitar fácilmente. Los medios que no contienen agar se pueden disolver fácilmente en agua fría o con un ligero calentamiento, sin embargo si el medio contiene agar o gelatina requerirá de calentamiento.
AJUSTE DEL pH
Si se utiliza agua neutra y un medio deshidratado de buena calidad el pH del medio usualmente quedará dentro de los límites adecuados, aún así es conveniente ajustar el pH lo que se puede hacer con un potenciómetro o en su defecto con papel pH 4.0-7.0.
Si el medio es sólido la medición y el eventual ajuste se hace a 45°-50°C ( aún está liquido) y en los medios líquidos se hace a temperatura ambiente. La corrección del pH se efectúa con HCl o NaOH 1N o 0.1 N tomando una muestra del medio de cultivo preparado y estéril, se mide el pH y si fuera necesario se ajusta en la muestra calculando después el volumen de ácido o base que sea requerido para el total de medio.
ESTERILIZACIÓN
Los medios que van en tubo se pueden esterilizar directamente en los tubos; en el caso de los medios en cajas de Petri se pueden esterilizar en tubos con el volumen para vaciar una placa (aprox. 20 ml cada uno) o bien matraces para varias placas.
Si en las instrucciones del medio no se indica otra cosa, la esterilización se lleva a cabo en autoclave a 121C por 15 minutos.
PRÁCTICA # 4
MORFOLOGÍA DE LAS COLONIAS BACTERIANAS
OBJETIVO
Aprender las diferentes características de la morfología colonial utilizadas en la identificación de bacterias.
GENERALIDADES
Una colonia es una agrupación de bacterias formada a partir de la reproducción de una Unidad Formadora de Colonia (UFC) sobre un medio sólido; aunque varía de tamaño generalmente es visible a simple vista.
Una UFC puede ser un solo microorganismo o bien un grupo de microorganismos de una misma especie como en el caso de bacterias que tienen tendencia a permanecer unidas como los estafilococos o los estreptococos.
Las colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura y en algunos casos color característicos, que aunque puede variar de acuerdo al medio en que se encuentren, es constante bajo condiciones controladas y depende de la especie bacteriana que la forme.
Debido a que las características de las colonias ocurren en varios grados y combinaciones dependiendo de las bacterias y son a menudo muy uniformes, sirven para identificar bacterias en cultivos mezclados. Sin embargo, además de éstas características se requiere también estudiar la fisiología y propiedades inmunológicas de las bacterias para poder realizar una identificación completa.
La morfología colonial es comparable a una estadística ya que se deriva de una célula individual pero es la característica de la masa celular.Así pues, por ejemplo, la pigmentación es aparente en la colonia, pero no en la célula individual, en el caso de la consistencia mucosa de algunas colonias esta se deriva de la sustancia capsular en aquellas bacterias con cápsula muy grande.
Medida de las colonias. ésta característica es bastante constante dentro de las especies y puede ir desde colonias muy diminutas hasta un diámetro de varios milímetros.
Forma. Está determinada por su borde y su espesor. En la figura 2 se pueden observar varias formas, elevaciones y bordes de colonias bacterianas.
Consistencia y textura. La consistencia de las colonias puede variar desde una colonia seca que puede moverse sobre el agar con el asa, hasta una colonia viscosa que se pega al asa y forma filamentos o hilos mucosos cuando se trata de separarla del agar..
La susperficie puede ser uniformemente brillante y suave o puede ser estriada con muescas concéntricas o quebradas. Al examinar la colonia con luz transmitida puede aparecer con textura granular o amorfa.
Pigmentación. Esta característica es muy común en las bacteria saprófitas en las que las colonias aparecen rojas, anaranjadas, amarillas, etc. De los microorganismos patógenos uno de los pigmentados más importantes es Staphylococcus aureus que tiene un color amarillo dorado. El pigmento no se aprecia en las células individuales a que se debe a gránulos intracelulares muy pequeños para verse con luz transmitida.
MATERIAL Y EQUIPOSe utilizarán las placas y tubos sembrados en la práctica anterior.1 mechero Bunsen1 asa bacteriológica
TÉRMINOS DESCRIPTIVOS PARA LA MORFOLOGÍA DE COLONIAS EN LA SUPERFICIE DE UN MEDIO SÓLIDO
SUPERFICIELisaRugosaPlegada
CONSISTENCIA (probarla con el asa)CremosaMembranosa
COLORSe usan términos comunes para definirlo y se especifica si el pigmento producido difusible o no.
CARACTERÍSTICAS ÓPTICASLUZ TRANSMITIDA (observar a traves de la colonia)
Opaca: no permite el paso de luzTraslúcida: Deja pasar la luz sin permitir la completa visibilidad de los objetos observados a través de la colonia.Transparente: Deja pasar la luz permitiendo ver claramentelos objetos observados a través de la colonia.
LUZ REFLEJADA (observar la superficie de la colonia)OpacaBrillante
CULTIVO EN CALDOAl igual que en los medios sólidos, en los medios líquidos las características de la bacteria sembrada se reflejan en las caracteristicas que presenta el caldo inoculado como son:Turbidez: Opacidad más o menos densa, signo de crecimiento.Película: Crecimiento casi contínuo sobre el líquidoSedimento: Depósito de células en el fondo del tubo que se resuspende al agitar.
PRESENTACIÓN DE RESULTADOSAnote las características coloniales de cada cepa en la tabla , basándose en el texto, las figuras:
AGAR EN SUPERFICIEBacteriaFormaBordeElevaciónSuperficieConsistenciaColorLuz transmitidaLuz reflejada
CALDOPelículaTurbidezSedimento
MEDIO SEMISÓLIDOMovilidad
PRÁCTICA # 5
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
OBJETIVO
El alumno observará algunas reacciones bioquímicas relacionadas con la fisiología bacteriana, a la vez aprenderá su utilización para la identificación de enterobacterias
GENERALIDADES
El estudio bioquímico que se lleva a cabo como complemento de otros estudios bacteriológicos es posible gracias a las reacciones fisiológicas y químicas que llevan a cabo los microorganismos. Para esto se emplean medios de cultivo enriquecidos con productos útiles para el metabolismo celular, los cuales además contienen algún indicador que hace cambiar el color del medio al efectuar dichos microorganismos sus funciones.
Los organismos varían en su capacidad para utilizar diferentes compuestos (por ejemplo: carbohidratos, urea, citrato, etc.) para algunos microorganismos que se usan en su identificación en el laboratorio. De acuerdo a los productos de su actividad química, las bacterias se pueden clasificar como:
1. Zimógenas: las que fermentan los carbohidratos, desdoblándolos en alcohol, ácido láctico o acético.
2. Aerógenas: las que producen gas como hidrógeno y dióxido de carbono como resultado de su actividad metabólica.
3. Anaerógenas: las que no producen cantidades visibles de gas durante su actividad metabólica.
4. Cromógenas: las que producen pigmentos solubles o insolubles.
5. Fotógenas: las que causan putrefacción y producen una débil fosforescencia (algunas bacterias marinas)
Entre las pruebas bioquímicas más comunes tenemos:
Caldos de carbohidratos con indicador de pH, rojo de fenol: Al fermentar algunos carbohidratos, muchas bacterias producirán ácido, y con un medio con pH original alrededor de 7.4 al bajar éste a 6.8 por el ácido que produce un cambio de color gracias a la incorporación de un indicador de pH como es el rojo de fenol.
Agar de hierro y triple azúcar (TSI)
El agar TSI es uno de los más usados para ver la fermentación de carbohidratos en la familia Enterobacteriaceae. Se pueden tener varias posibilidades de fermentación de acuerdo a las características metabólicas del microorganismo como son: Utilización de glucosa sola. Los microorganismos que fermentan solo la glucosa provocan en este medio una reacción alcalina en la superficie ( roja) sobre un fondo ácido (amarillo, k/a) debido a que realizan una degradación aeróbica de la glucosa en la superficie, convirtiendo el piruvato en agua y dióxido de carbono. Después de 18 a 24 horas de incubación como la concentración de glucosa es baja (0.1%), los microorganismos empiezan a utilizar las peptonas que se encuentran en el medio, causando la liberación de amoniaco y produciendo un pH alcalino ( rojo) gracias al rojo de fenol que tiene el medio como indicador de pH. En el fondo, como no hay oxígeno, se realiza una degradación anaeróbica y el piruvato se convierte en lactato con lo cual el pH disminuye quedando el pH ácido ( amarillo).
Utilización de lactosa y/o sacarosa. Algunos microorganismos tienen la facultad de fermentar la glucosa y la lactosa resultando una reacción ácida en la superficie (amarilla) y ácida en el fondo (amarilla, a/a). En este caso después de 18 a 24 hrs como la concentración de lactosa es alta (1.0%), o sea 10 veces más que la de la glucosa presente, no se ha utilizado completamente y la acidez persiste tanto en el fondo como en la superficie. En el caso de usar sacarosa la reacción sería la misma.
Sin utilización de ninguna de las anteriores. En el caso de no utilizar ninguno de los carbohidratos presentes (glucosa, lactosa y sacarosa), lo que se usaría serían las peptonas, ya sea aeróbicamente o anaeróbicamente. Sólo utilizándolas aeróbicamente daría una superficie alcalina (roja, k) sobre un fondo sin cambio (sc) o sea k/sc). Si las usara aeróbicamente daría una superficie alcalina (rojo) sobre fondo alcalino (rojo) o sea k/k.
En este medio también es posible detectar la producción de gas por la formación de burbujas dentro del medio, y la producción de ácido sulfhídrico, el cual reaccionará con un indicador con base de fierro dando un color negro debido al sulfuro de hierro formado.
Agar de hierro y lisina (LIA)
Algunos microorganismos son capaces de provocar la descarboxilacidon de los aminoácidos por inducción de enzimas específicas, el resultado de esta descarboxilación es la produccidon de una amina ( o diamina) y dióxido de carbono. Tal es el caso de la produccidon de la enzima lisina descarboxilasa la cual al actuar sobre la lisina produce una diamina llamada cadaverina.
En el medio LIA se puede detectar la producción de la lisina descarboxilasa ya que se produce una reacción coloreada por un cambio en el pH del medio, que contiene como indicador púrpura de bromocresol. Un cambio del color original del medio (morado) hacia amarillo en el fondo indica una reaccidon ácida por la fermentación de una pequeña cantidad de glucosa en el medio. Si el microorganismo produce lisina descarboxilasa, la acción de esta enzima sobre la lisina dará lugar a la cadaverina, la cual provocará un cambio de pH hacia la alcalinidad dando un color morado que sobrepasa la acidez debida a la glucosa. Así pues, un fondo amarillo indica que no se produce lisina descarboxilasa y un color morado que si es producida.
Prueba del citrato de Simmons
Ciertas bacterias tienen la capacidad de utilizar el citrato como única fuente de carbono en una serie de reacciones como sigue:
CITRATO OXALACETATO + ACETATO
OXALACETATO PIRUVATO + CO
2 PIRUVATO ACETATO + LACTATO + CO
Los ácidos orgánicos son posteriormente utilizados dando como producto final carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El pH alcalino así logrado hace que el indicador de pH en el medio, el azul de bromotimol vire de su color verde original a un azul intenso.
Prueba de la ureasa
La hidrólisis de la urea es catalizada en algunos microorganismos por una enzima específica, la ureasa, dando lugar a dos moléculas de amonio, agua y dióxido de carbono.
Todo esto da lugar a un cambio en el pH, lo que causa que cambie el color original del medio (amarillo) a un color rojo bugambilia por el indicador rojo de fenol. De acuerdo a la degradación de la urea el color será más o menos intenso.
(NH2)2C=O + 2H2O---> CO2+2NH3+H2O (NH4)2CO3
Medio MIO (Movilidad, Indol y Ornitina)
Este medio como su nombre lo indica sirve para observar la movilidad, la produccíon de indol y descarboxilación de la ornitina.
La movilidad se detectará por la presencia de turbidez alrededor del punto de inoculación.
El indol se formará si la bacteria tiene la capacidad de producir la enzima triptofanasa que desdoblará el aminoácido triptófano en indol, ácido pirúvico y amonio. El indol es incoloro pero al reaccionar con el reactivo de Kovacs (p-dimetil-aminobenzaldehido) que se adiciona después de que creció la bacteria, dará un color rojo violeta.
Por lo que respecta a la descarboxilacíon de la ornitina como el medio tiene púrpura de bromocresol y una pequeña cantidad de glucosa cuando esta se fermenta se produce un color amarillo en el fondo (ornitina descarboxilasa negativa), sin embargo al descarboxilarse la ornitina se produce putresina la cual es alcalina y sobrepasa la acidez dada por la fermentación de las glucosa resultando en un color morado en el fondo
MATERIAL Y EQUIPO
Aguja bacteriológica
Mechero de Bunsen
Gradilla
Medios de cultivo (4 tubos cada uno)
Agar de hierro y triple azúcar (TSI)
Agar de hierro y lisina (LIA)
Agar Citrato de Simmons
Agar Urea según Christensen
Medio de MIO
TÉCNICA
1. Marque perfectamente cada uno de sus tubos, usando una serie de TSI, LIA, Urea, Citrato y MIO
2. Inocule una serie para cada cepa como sigue:
MEDIO FORMA DE INOCULAR
TSI Superficie - picadura
LIA Superficie - picadura
Citrato de Simmons Superficie
Agar Urea Superficie
MIO Picadura
3. Tape los tubos procurando no apretar demasiado los tapones
4. Incube a 35° C por 24 hrs.
5. Lea e interprete los resultados de acuerdo a las tablas de identificación
PRESENTACÍON DE RESULTADOS
1. Anote las observaciones de cada tubo (antes y después de inocular), utilizando los colores apropiados.
2. Anote los resultados de cada prueba usando las abreviaturas correctas. En caso de no corresponder a la bacteria que se le dio con el resultado de sus pruebas bioquímicas, especifique de que bacteria se trata.
PRÁCTICA # 6
CONTROL BACTERIANO POR MEDIO DE AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS
OBJETIVO Observar el efecto de algunos agentes físicos y químicos utilizados como germicidas para el control de los microorganismos.
GENERALIDADES
Muchas prácticas de la vida cotidiana como la potabilización del agua, la pasteurización de la leche o la refrigeración de los alimentos, tienen por objeto controlar a las poblaciones microbianas. Este control tiene varias razones como prevenir la transmisión de enfermedades, evitar la contaminación de algunos productos y evitar la contaminación (alimentaria, ambiental, etc.)
Una variedad de agentes físicos y químicos son útiles para provocar la muerte bacteriana o para prevenir su multiplicación. Entre estos encontramos las radiaciones ultravioleta, la temperatura, los agentes desinfectantes y otros.
RADIACIÓN ULTRAVIOLETALa mayoría de los microorganismos mueren bajo grandes dosis de radiación electromagnética, especialmente en la zona ultravioleta (UV), ondas ultrasónicas de muy alta frecuencia y con pequeñas dosis de radiación ionizante, como los rayos gamma y rayos catódicos. La muerte se presenta por los daños causados al DNA y la variación en la resistencia, normalmente reflejada en las diferentes facultades de las células para reparar el DNA dañado por la radiación.
TEMPERATURAMuchas células son sensibles al calor húmedo, después de la exposición por algunos minutos a una temperatura más elevada que su máxima de crecimiento. La proporción de células muertas depende del tiempo de exposición y la temperatura.
El calor mata causando la desnaturalización de las macromoléculas como las proteínas, la muerte bacteriana es proporcional al grado de coagulación provocado por el calor húmedo.
La destrucción efectiva por temperaturas bajas rara vez ocurre. La causa del daño celular durante el congelamiento no es muy conocida, pero se sabe que la concentración de solutos durante el congelamiento rompe las membranas y causa la lisis durante el deshielo.
DESINFECTANTESLos desinfectantes son generalmente agentes químicos que matan a las bacterias y otros microorganismos. Dentro de estos tenemos:
1. Ácidos y álcalis> Tanto los ácidos y álcalis son muy bactericidas dado su grado de disociación. Entre estos se puede mencionar KOH, NaOH, HNO3 y H2SO4.
2. Agentes oxidantes. Entre éstos tenemos el cloro, el peróxido de hidrógeno, perborato de Sodio, Permanganato de Potasio y Cloruro de Calcio. Los cuales actúan oxidando las moléculas esenciales de la célula.
3. Compuestos orgánicos. Como los derivados del alquitrán de hulla, el cresol, tricresol, alcanfor, creosota, ácido fénico y el fenol que es el de uso más común. Actúan precipitando las proteínas. Esta acción guarda relación con la destrucción de la estructura de la membrana y sus funciones.
4. Detergentes. Éstos se dividen en tres grupos
a) compuestos aniónicos como las sales sódicas y potásicas de ácidos grasos de peso molecular elevado sulfatos de alquilo y los jabones.
b) compuestos catiónicos como los compuestos de amonio cuaternario y el cloruro de benzalconio.
c) compuestos no iónicos que incluyen poliésteres y ésteres de poliglicerol.
Los jabones no pueden considerarse antisépticos o desinfectantes efectivos puesto que solo son agentes que eliminan las bacterias mecánicamente de la piel por emulsión de secreciones lipoides en las cuales están incluidos los microorganismos.
Los otros grupos de desinfectantes se consideran bactericidas porque destruyen la integridad de la membrana por alteración de la interacción entre las proteínas y lípidos. Los detergentes catiónicos son los más eficaces debido a la interacción de la molécula del detergente (carga positiva) con la superficie de la membrana bacteriana (carga neta negativa)
ACCIÓN OLIGODINÁMICAAcción oligodinámica es la propiedad antibacteriana que presentan ciertos metales pesados en cantidades de partes por millón (ppm), lo cual se debe a la formación de sales pobremente disociables con los grupos sulfhidrilos de las proteínas.
EFECTO DE LA TEMPERATURAEl efecto de la temperatura en la eliminación de bacterias se ilustrará con un ejercicio en el cual se calentarán los tubos con una suspensión de la bacteria a estudiar por diferentes tiempos, evaluando después el efecto por conteo de células vivas.
MATERIAL Y EQUIPO
Asa bacteriológica
2 mecheros Bunsen
1 vaso de precipitado de 250 ml
Tela de asbesto
15 tubos de 13 x 100 con tapón de rosca, estériles
3 tubos de con10 ml solución salina estéril
3 pipetas de 5 ml estériles
1 asa calibrada de 0.001 ml
15 placas de agar de soya y tripticaseína
Cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli (24 hrs incubación), Bacillis subtilis (48 hrs de incubación).
TÉCNICA
1. Prepare una suspensión ligera de cada bacteria (con la misma turbidez todas).2. Deposite 1 ml de cada suspensión en 5 tubos para cada bacteria, los cuales irán
marcados con el tiempo de calentamiento (sin calentamiento, 5, 10, 15 y 20 minutos respectivamente).
3. Caliente los tubos en un baño de agua de ebullición constante por los tiempos indicados 5, 10, 15 y 20 minutos y deje un tubo de cada bacteria sin calentar.
4. Después del calentamiento siembre con el asa calibrada una asada de cada suspensión en las cajas marcadas para cada bacteria con el tiempo de exposición (5 cajas para cada bacteria).
5. Incube por 24 horas y cuente cuantas colonias crecen en cada placa para poder estimar el efecto del tiempo de exposición en cada caso.
PRESENTACIÓN DE RESULTADOS
1. Elabore una curva con el número de bacterias por ml (y) vs el tiempo de exposición (x).2. Concluya cual es el tiempo mínimo de exposición para eliminar al 50% de cada una de
las bacterias estudiadas.
ACCIÓN DE LOS METALES, CLORO, ÁLCALIS Y ÁCIDOS
Para demostrar el efecto de los metales sobre los microorganismos se utilizarán soluciones de los compuestos en cuestión que se aplicaran sobre el medio para que se difundan. Midiendo posteriormente el halo de inhibición producido por cada una.
MATERIAL Y EQUIPO
Asa bacteriológica
Mechero Bunsen
2 cajas de Petri estériles
2 tubos con 20 ml de agar nutritivo fundido
Cepas de Sarcina lutea, Pseudomonas aeruginosa
Cajas Petri con discos de papel filtro impregnados con las siguientes soluciones:
- Solución de Cloruro de Plata 0.4%
- Cloruro mercúrico 0.4%
- Acido sulfúrico 10%
- Hidróxido de Sodio al 10%
- Cloro 6%
- Fenol al 5%
- Benzal
Pinzas para sensidiscos
TÉCNICA
1. Inocular con cada cepa un tubo de agar nutritivo fundido y enfriado alrededor de 45 por separado.
2. Verter en una caja Petri estéril y dejar solidificar sobre una superficie nivelada.
3. Colocar un disco impregnado con cada solución en forma equidistante sobre las placas.
4. Dejar reposar 5 minutos para que se absorban las soluciones.
5. Incubar a 35 C por 24 hrs y observar la formación de halos de inhibición de crecimiento.
PRESENTACION DE RESULTADOS
1. Mide los halos de inhibición de crecimiento.
2. Menciona qué solución es más eficaz.
PRÁCTICA # 7
OBSERVACIÓN EN FRESCO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS BUCALES
OBJETIVO
El alumno aplicará los conocimientos obtenidos en el curso para identificar los microorganismos que habitan en la microbiota bucal.
GENERALIDADES
La identificación de bacterias es un trabajo un tanto detectivesco en el cual se deben reunir todas las características que se puedan obtener en el laboratorio como morfología colonial en medios selectivos o de uso general, morfología microscópica y coloración de Gram, etc.
La composición de la microbiota bucal varía desde el nacimiento y durante toda la vida influenciada por el desarrollo de la biopelícula dental, primero por la adherencia microbiana mediada por distintos mecanismos; a la adhesión de los primeros colonizadores le siguen fenómenos de coagregación, lo que constituye el denominado "mosaico de microorganismos", el cual varía de acuerdo con las propiedades biológicas y físicas del sitio.
El conocimiento de la ecología de la cavidad bucal permite determinar el proceso que involucra, fundamentalmente, la etiopatogenia de la caries dental y por consecuencia, su prevención: también contribuye a identificar las complicaciones sistémicas por la microbiota bucal.
MATERIAL Y EQUIPO3 portaobjetos1 cubreobjetos1 tubo de ensaye de 13 X 100 con tapón de rosca con solución salina estéril1 placa agar nutritivo1 placa agar EMB1 placa agar sal y manitol1 placa agar Mac ConkeyHisopos estérilesPuente de tinciónCristal violetaYodo de Gram o lugolEtanol al 95% o alcohol acetonaSafraninaAceite de inmersiónMecheroMicroscopios
TÉCNICA1. Tomar una muestra de alrededor de los dientes incluyendo las encías con un hisopo estéril, sembrar en las placas de agar nutritivo, EMB, MacConkey y sal y manitol. Incubar a36° C por 24 horas. Anotar resultados y observaciones.2. Con el otro hisopo tomar nuevamente muestra y realizar 2 extendidos e introducir el hisopo en el tubo con sol. salina estéril.3. Los extendidos secarlos con ayuda del mechero y proceder a teñir como indica la técnica de Gram.4. Observar al microscopio con objetivo de 100 X.5. Tomar una muestra con el hisopo en solución salina, colocarla en el portaobjetos y cubrir. Observar en 40 X.
PRESENTACIÓN DE RESULTADOS1. Investigar los microorganismos de la microbiota bucal, así como las características morfológicas en cada medio y microscópicas tintoreales.2. Anotar resultados y observaciones de las extensiones y de crecimiento en las placas de agar, obtenidas en la práctica.3. Anotar los géneros que crecieron en cada placa.
