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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICAPARA INSTRUMENTACIÓN QUIRÚRGICA

Dr. MIGUEL A. MIYARES CALÁS.Doctor en Medicina. Universidad de Oriente. Cuba.Especialista de Segundo Grado en Bioquímica ClínicaDoctor en Ciencias BiológicasProfesor de Bioquímica de UNIBOYACÁ

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA DE BOYACÁCENTRO DE INVESTIGACIONES PARA EL DESARRO-

LLOTUNJA

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PRESENTACIÓN

La enseñanza de la Bioquímica en las distintas áreas de Ciencias de laSalud requiere de una metodología específica con énfasis en los aspectospropios de cada una, orientados a dar una formación más profunda, es elcaso de la Carrera de Instrumentación Quirúrgica para la cual el profesorMiguel Miyares ha preparado el presente manual que permitirá a nuestrosestudiantes contar con un instrumento práctico y didáctico para coadyuvaren el proceso enseñanza-aprendizaje.

El manual, fruto del trabajo docente tanto teórico como práctico presentaen forma clara el desarrollo de los laboratorios y los ejercicios que deberealizar cada estudiante para un mejor resultado académico.

El presente aporte se halla enmarcado dentro de las líneas de Investigaciónde la Facultad de Ciencias de la Salud y avalado por el Centro de Investi-gación para el Desarrollo – CIPADE – a la vez responde a la políticainstitucional de que nuestros docentes respalden su tarea con los resulta-dos de la búsqueda permanente de nuevas metodologías y nuevos desarro-llos científicos.

ROSITA CUERVO PAYERASAsesora Centro de Investigaciones para el DesarrolloCIPADE.

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PRÁCTICA # 1INDUCCIÓN AL LABORATORIO

El desarrollo de la asignatura de Bioquímica sería extraordinariamente árido y de difícilcomprensión si no se acompañara de algunas actividades complementarias que permitanilustrar algunos de los complejos eventos moleculares que transcurren en el interior de lascélulas y tejidos, por lo que se hace necesario instrumentar algunas prácticas de laboratorioque cumplan con esta función.

Desgraciadamente la realización de las prácticas de bioquímica son usualmente de largaduración, gran complejidad y requieren de importantes recursos materiales, por lo que resul-ta difícil adecuar estas necesidades con la realidad que impone el tiempo curricular, la habi-lidad y destreza de los estudiantes en estos momentos iniciales de su formación y los recur-sos de que dispone el centro de altos estudios. De aquí se desprende que seleccionar experi-mentos que puedan ilustrar eficientemente los conocimientos de bioquímica a los estudian-tes de Ciencias de La Salud resulta una tarea difícil, aunque imprescindible.

De cualquier forma e independientemente del grado de complejidad y actualización de losprocedimientos empleados en esta tarea, se hace necesario que el estudiante rote por el labo-ratorio de bioquímica y que conozca toda una serie de normas y cuidados que requiere estadependencia.

En UNIBOYACÁ existe un laboratorio de Bioquímica, por donde pasan los estudiantes quecursan estas asignaturas en las diferentes carreras de la universidad y que cuenta con unreglamento que debe ser conocido antes de iniciar el trabajo en esta instalación, por lo cual acontinuación pasamos a transcribirlo textualmente:

REGLAMENTO INTERNO DEL LABORATORIO.

El laboratorio es un sitio exclusivo de trabajo, en él se aprende observando, ensayando,compartiendo las dudas e inquietudes con los compañeros y el profesor; es un lugar querequiere un comportamiento muy especial y cuidadoso, porque cualquier error, imprevisión,mal manejo o descuido pueden ocasionar graves perjuicios personales a los compañeros o ala Institución.

Se presentan a continuación las normas que los estudiantes deberán seguir al asistir a estadependencia:

1.- El estudiante debe ser puntual en su práctica y disponer adecuadamente de su tiempo enel laboratorio, para no trastornar las prácticas de los grupos siguientes. Es indispensableleer, analizar y despejar dudas e inquietudes sobre la guía de trabajo correspondienteantes de ingresar al laboratorio.

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2.- Siempre se debe usar la bata blanca de trabajo, de manga larga y mantenerla totalmenteabotonada durante toda la práctica; el estudiante que no porte debidamente la bata no seráadmitido en el laboratorio. La bata es de uso exclusivo de esta dependencia.

3.- Colocar en el sitio asignado, por el personal del laboratorio, los útiles, sacos y demás objetospersonales. Nunca colocarlos sobre las mesas de trabajo. No utilizar las mesas de trabajocomo asientos.

4.- Revisar el material asignado antes de iniciar la práctica, verificar si está completo y en buenestado. Los estudiantes deben firmar la hoja de control y entregarla al Coordinador o alLaboratorista. TODO EL SUBGRUPO O EQUIPO DE TRABAJO ES RESPONSA-BLE DEL MATERIAL ASIGNADO Y TODO EL GRUPO ES RESPONSABLE DELMATERIAL DE USO GENERAL Y DE LA INSTALACIÓN. Después de entregar fir-mada la hoja de control no se acepta ninguna reclamación.

5.- Localizar las duchas de emergencia, el extintor de incendios y el botiquín de primeros auxilios.Conocer y hacer uso correcto de ellos.

6.- Se prohibe fumar, ingerir alimentos sólidos o líquidos dentro del laboratorio y durante lapráctica.

7.- El laboratorio es un sitio de trabajo serio, donde las bromas y los juegos pueden ocasionargraves accidentes. Se debe mantener cordura, disciplina y un tono de voz adecuado.

8.- Durante la práctica mantener ORDEN Y LIMPIEZA, en las mesas de trabajo, así como en elsitio asignado para materiales y reactivos de uso general.

9.- Antes de usar un reactivo o solución LEER LAS ETIQUETAS E INTERPRETAR LOSSÍMBOLOS DE SEGURIDAD, evitar el contacto con la piel, los ojos o la ropa. Utilizar losmedios de protección existentes, entre ellos las caretas asignadas para evitar la inhalación degases o vapores tóxicos.

10.- Utilizar adecuadamente pipetas, pipeteadores o espátulas asignadas para cada uno de losreactivos o soluciones preparadas, evitar contaminaciones y por ende la pérdida total de losreactivos. NO SE DEBEN RETIRAR LOS REACTIVOS Y/O LAS SOLUCIONESDEL SITIO ASIGNADO, taparlos después de su uso.

11.- Manejar cuidadosamente los equipos siguiendo las indicaciones dadas por el Profesor, elLaboratorista o el Coordinador del laboratorio. No descuidar los equipos que se encuentrenen funcionamiento. Los equipos eléctricos enciéndalos únicamente cuando sea necesario.

12.- Rotular adecuadamente con Nombre, código estudiantil, grupo, carrera y materia los monta-jes y ensayos realizados que requieran de un seguimiento por varios días. Ubicarlos en elsitio asignado dentro del laboratorio. No interferir ni alterar dichos ensayos.

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EN EL LABORATORIO EXISTE UN PROGRAMA PARA MANEJO Y DISPOSI-CIÓN DE RESIDUOS SÓLIDOS Y LÍQUIDOS. PARA ELLO TENGA EN CUENTALAS SIGUIENTES NORMAS:

13.- No arrojar desechos sólidos, papeles, fósforos, agujas, lancetas, etc. al lavabo, al piso oa las mesas de trabajo, deséchelos en forma adecuada y en los recipientes asignados paratal fin:

* Canecas de basura.* Recipiente para desecho de agujas y lancetas.* Recipiente para desecho de material de vidrio.* Recipiente para desecho de materia orgánica como filtrados, vísceras, sangre, etc. y los

que se necesiten en cada una de las prácticas.

Los reactivos químicos se deben desechar en los COLECTORES dispuestos para tal fin; alterminar la práctica el estudiante debe diluir en agua los reactivos utilizados y verterlos en loscolectores según la naturaleza química de estos. Al iniciar la práctica el Profesor o Laboratoristaadvertirán en cuales de los colectores que se mencionan a continuación deben ser dispensa-dos los residuos líquidos resultantes:

* COLECTOR A: Disolventes orgánicos y soluciones de sustancias orgánicas exentas dehalógenos.

* COLECTOR B: Disolventes orgánicos y soluciones de sustancias orgánicas que con-tengan halógenos.

* COLECTOR C: Soluciones salinas.

De esta forma se evitará el deterioro de tuberías de desagüe, la contaminación del sitio detrabajo y de los cuerpos de agua receptores,

14.- Al finalizar la práctica y después de disponer correctamente de los residuos, lavar elmaterial con precaución, limpiar el sitio de trabajo y ubicar las butacas debajo de lasmesas de trabajo; organizar el material y entregarlo a la persona encargada, para reci-bir el visto bueno de entrega. LOS ESTUDIANTES NO SE DEBEN RETIRARDEL LABORATORIO SIN HABER REALIZADO CORRECTAMENTE LAENTREGA.

15.- En caso de pérdida, ruptura de materiales o contaminación de algún reactivo, los estu-diantes responsables deberán retornarlo al laboratorio antes de la práctica siguiente, delo contrario no podrán ingresar al laboratorio y su paz y salvo será retenido. El materialrepuesto debe tener las mismas condiciones o especificaciones del perdido y debe pre-sentarse la factura correspondiente.

16.- Verificar las llaves de gas, grifos de agua e instalaciones eléctricas utilizadas. Disponerde ellas únicamente cuando sea necesario.

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«PARA CUALQUIER ORIENTACION Y/O DUDA EN SU TRABAJO PRÁCTICO,DIRÍJASE A SU PROFESOR, LABORATORISTA O MONITOR, ASÍ EVITARÁ ELINCUMPLIMIENTO DE LAS NORMAS DISPUESTAS EN ESTE REGLAMENTO.DE SU RESPONSABILIDAD FRENTE AL LABORATORIO DEPENDE EL ÉXITOO EL FRACASO DE LAS PRÁCTICAS».

La incidencia en las faltas de disciplina y negligencia dará lugar a sanciones que se notifica-rán a las respectivas Direcciones de Carrera.

Las normas generales anteriormente expuestas son aplicables a cualquier asignatura que tra-baje en el laboratorio de Química y Bioquímica de UNIBOYACÁ. En particular la asignatu-ra de Bioquímica y Laboratorio de la Carrera de Instrumentación Quirúrgica tiene caracterís-ticas propias que deben ser normadas adicionalmente:

NORMAS ADICIONALES DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DEBIOQUÍMICA PARA LOS ESTUDIANTES DE LA CARRERA DE INSTRUMEN-

TACIÓN QUIRÚRGICA.

1.- Los estudiantes podrán asistir a la práctica sólo en el día y hora asignados en la programa-ción del semestre. Si un alumno se ausentara a una práctica, aún por motivos muy justifi-cados, NO PODRÁ RECUPERARLA EN NINGÚN OTRO HORARIO. Si la ausen-cia fuera injustificada su evaluación será de 0, en caso contrario se desestimará en elmomento de sacar el promedio de calificación de las actividades de evaluación periódica.

2.- La entrada al laboratorio será a la hora exacta, NO SE PERMITIRÁ LA ENTRADAAL MISMO DESPUÉS DE CERRADA LA PUERTA DE ACCESO, y se consideraráconsecuentemente como una ausencia injustificada.

3.- Para poder realizar la práctica el estudiante debe llevar su MANUAL DE PRÁCTICASDE BIOQUÍMICA, caso contrario no se le permitirá su ingreso al laboratorio y se con-siderará como ausencia injustificada.

4.- El estudiante no podrá abandonar injustificadamente el laboratorio durante el transcursode la práctica, so pena de que se le considere ausencia injustificada. Si por cualquiermotivo de causa mayor tuviera que abandonar el local, se le considerará como ausenciajustificada. Una vez que se abandone el local, por cualquier causa, el estudiante no sepodrá reintegrar al mismo.

5.- Para el desarrollo del trabajo práctico los estudiantes se agruparán en equipos de trabajointegrados por un máximo de 5 estudiantes. Los equipos de trabajo se conformarán en laprimera práctica mediante la asociación voluntaria de sus integrantes. Una vez conforma-dos los equipos no se aceptarán modificaciones

6.- Durante el desarrollo del trabajo práctico el estudiante debe ir haciendo los apuntes que sele orientan en el cuaderno de trabajo e ir respondiendo las preguntas que se le postulan enel mismo.

7.- En la siguiente actividad académica, posterior al laboratorio, el profesor seleccionará uno

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de los Manuales de Prácticas por cada equipo para realizar su revisión y calificación. Estacalificación será extensible al resto de los integrantes del equipo. El profesor devolverá elCuaderno ya calificado el próximo día hábil después de entregados los Cuadernos. Casocontrario deberá asignarle la máxima calificación a todos los estudiantes que realizaronel trabajo práctico. Los estudiantes recogerán su cuaderno en el propio laboratorio o en elsalón de clases.

8.- Los estudiantes, también por equipos de trabajo, entregarán en el modelo correspondien-te el informe de la práctica. La fecha de entrega será siempre en la primera actividaddocente de la semana siguiente a la realización de la práctica. Caso de no entregarse enfecha este informe la calificación será de 0. El profesor debe entregar el resultado de lacalificación del informe de práctica en la próxima actividad evaluada que tenga el estu-diante. Caso contrario deberá asignarle a los estudiantes la máxima calificación de esteaspecto.

9.- En Bioquímica se trabaja con sustancias tóxicas, cáusticas y con material biológico dealto riesgo, como son tejidos animales, sangre animal y humana y saliva humana. LAMANIPULACIÓN DE TODO ESTE MATERIAL DEBE REALIZARSE TOMANDOTODAS LAS MEDIDAS DE PRECAUCIÓN NECESARIAS.

10.- La mayor parte de los llamados «accidentes de laboratorio» son el resultado del incumpli-miento de alguna de las normas de trabajo o a negligencias, por lo que cualquier accidente quese produzca en el laboratorio será analizado y si resultara de este análisis que fuera responsa-bilidad directa de algún estudiante o grupo de estudiantes, los mismos serán sancionados conla obtención de 0 en la práctica correspondiente o la desaprobación de la asignatura, de acuer-do con la magnitud de los daños ocasionados. Esta medida se aplicará independientemente delas sanciones legales y/o resarcimiento económico que deriven de los hechos producidos.

11.- Cualquier repercusión en la salud de un estudiante o grupo de estudiantes, como conse-cuencia de faltar al presente reglamento, especialmente en cuanto a la manipulación desustancias tóxicas, cáusticas y contaminantes, es responsabilidad exclusiva del estudian-te o grupo de estudiantes y exime a la Institución de cualquier perjuicio que de elloderive.

12.- Al finalizar la última práctica del semestre los estudiantes entregarán el Manual de Prác-ticas para su calificación. El profesor los calificará en el transcurso de la semana siguien-te y entregará el resultado a los estudiantes en el propio laboratorio o lugar que previa-mente se acuerde.

13.- La calificación integral del Manual de Prácticas tendrá un valor de 0,5 puntos de la nota finalde la asignatura, y será informada a los estudiantes mediante la publicación de una lista dosdías antes de la celebración del acto del examen final.

14.- Las calificaciones de cada uno de los trabajos prácticos de laboratorio serán promediadasy tendrán un valor total de 2,0 puntos para cada uno de los informes de las evaluacionesperiódicas. Los otros 3,0 puntos serán determinados por el promedio de las calificacio-nes de los "quizes".

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A continuación se desglosa la forma en que será evaluado cada uno de los trabajos prácticos:

CALIFICACIÓN DEL TRABAJO PRÁCTICO.

Todos los trabajos prácticos serán calificados sobre la base de una escala que va de 0,0 a 5,0y de acuerdo con la siguiente distribución:

1.- Exposición y análisis de los resultados obtenidos en larealización de los experimentos durante la práctica. 3,0 puntos

3.- Informe de la práctica. 2,0 puntos._________

TOTAL 5,0 puntos

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA.

1.- Organización del trabajo del laboratorio.

2.- Creación de los equipos de trabajo.

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA.

1.- Recepción de los estudiantes por parte del personal del laboratorio. Presentación de los mis-mos.

2.- Formación de los equipos de trabajo. Los estudiantes se agruparán en equipos de hasta 6alumnos que conformarán el grupo de trabajo durante todo el semestre. Esta asociación serávoluntaria. Caso de no llegar a acuerdo el Profesor designará los equipos. Cada equipo seránumerado y responderá por el material que se le asigne en cada práctica, así como por elmaterial general de trabajo de forma rotativa.

3.- Asignación del puesto de trabajo. Cada equipo de trabajo será ubicado en un lugar que será supuesto fijo de trabajo durante todo el semestre.

4.- Análisis del reglamento general del laboratorio. El Profesor o el Laboratorista impondrán a losestudiantes de las cláusulas del reglamento general y harán las aclaraciones pertinentes alrespecto tanto de oficio como a instancia de los estudiantes.

5.- Análisis de las normas adicionales para Bioquímica. El Profesor impondrá a los estudiantes delas normas adicionales que deben ser cumplidas durante las prácticas de Bioquímica y hará lasaclaraciones pertinentes al caso.

6.- Despedida de la práctica. Los estudiantes deberán organizar su puesto de trabajo y abandonarel local.

NOTA: ESTA PRIMERA PRÁCTICA NO TIENE CALIFICACIÓN. ES SÓLO IN-

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FORMATIVA.INFORME DE LA PRÁCTICA

INSCRIPCIÓN

Nombre del Estudiante____________________________________. Código:_____________

Semestre Académico _____________________________________. Grupo______________

Día de la semana en que se efectúa la práctica: _____________

Hora en que se efectúa la práctica: _____________

Número del Equipo de Trabajo asignado: _____________

Nombre del resto de los integrantes del equipo de trabajo.

1.- _______________________________________________________________________

2.- _______________________________________________________________________

3.- _______________________________________________________________________

4.- _______________________________________________________________________

Hago constar que me han sido leídos los reglamentos generales de trabajo en el laboratorio ylas normas particulares para Bioquímica, por lo que estoy impuesto de todas sus cláusulas yme someto a ellas:

______________________________________.Firma del Estudiante.

NOTA: ESTE PRIMER INFORME CONSTITUYE UNA CONSTAN-CIA Y NO SE DEVUELVE.

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PRÁCTICA # 2PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LOS

AMINOÁCIDOS

INTRODUCCIÓN.

Los aminoácidos son importantes compuestos químicos que cumplen un número variado defunciones dentro de la célula. Entre ellas tenemos:

1.- Constituyen las unidades monoméricas de las proteínas.

2.- Representan la única fuente de nitrógeno metabólicamente utilizable.

3.- Aportan entre un 10 y un 20 por ciento de la energía que utiliza diariamente la célula.

Desde el punto de vista químico pueden definirse como aquellos compuestos químicos orgá-nicos que poseen al menos un grupo amino y otro carboxilo. Sin embargo esta definición tanamplia debe restringirse, pues en la célula eucarionte no existen sino los denominadosaminoácidos proteínicos, que serían aquellos que tuvieran enlazados sus grupos amino ycarboxilo a un mismo átomo de carbono (alfa) y que además pertenecen a la serie estérica L,toda vez que su síntesis es estereoespecífica.

Insertar AADe lo anteriormente expuesto se desprende que en estos compuestos existeuna parte constante representada por el carbono alfa, el grupo amino y elgrupo carboxilo; por consiguiente todos los aminoácidos tendrán propie-dades físico-químicas comunes que derivan de esta característica estruc-tural. Sin embargo en ellos existe también una cadena lateral o grupo R,de estructura variable, que identifica a cada aminoácido particular, pero

que además se emplea para efectuar su clasificación, toda vez que entre estas cadenas latera-les de los aminoácidos se pueden encontrar rasgos comunes. Por supuesto que este grupo Rle estará confiriendo a cada aminoácido características físico-químicas diferenciales.

Entre los diversos criterios que se pueden utilizar para establecer una clasificación de losaminoácidos hemos seleccionado, para la presente práctica, el que considera la polaridad dela cadena lateral de los aminoácidos, pues es el que más aplicación tendrá de acuerdo con losobjetivos que nos proponemos en el presente trabajo. Así tenemos que los aminoácidos,siguiendo este criterio, pueden subdividirse en:

1.- Aminoácidos no polares.

2.- Aminoácidos polares. a.- Sin carga eléctrica apreciable b.- Con carga eléctrica apreciable: ácidos. básicos

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La presencia de los elementos estructurales invariantes en los aminoácidos le confieren aestos compuestos características físicas y químicas comunes, tales como: ser sustancias pola-res y por consiguiente presentar un elevado punto de fusión y de ebullición y ser solubles ensolventes también polares. En cuanto a sus características químicas manifestarán las reaccio-nes propias de los grupos químicos que poseen - de hecho los aminoácidos experimentantodas las reacciones posibles de los grupos amino y carboxilo- por lo que estas reacciones nopueden ser utilizadas para caracterizar a los aminoácidos.

Sin embargo en la presente práctica se aprovechará la reacción de los aminoácidos con laninhidrina, en la que participan tanto el grupo carboxilo como el amino, para la identifica-ción de la presencia de estos compuestos y su utilización en el revelado de la cromatografía.

Desde el punto de vista químico la ninhidrina no es más que el hidrato de tricetohidrindeno:

Esta ninhidrina, como ya se ha mencionado, en presencia de com-puestos que posean al menos un grupo amino y otro carboxilo reac-ciona formando un derivado coloreado, generalmente de azul, y condesprendimiento estequiométrico de dióxido de carbono, lo que per-mite que esta reacción sea a la vez un método general para la estima-ción cuantitativa y cualitativa de los aminoácidos.

La presencia de color permitiría la detección cualitativa de los aminoácidos; y aunque tam-bién se utiliza ampliamente en la estimación cuantitativa, su utilidad queda limitada por ladificultad que implica el hecho de que no todos los aminoácidos expresan igual tonalidad decolor con este reactivo, incluso la prolina y la hidroxiprolina desarrollan una coloraciónamarilla en vez de azul. Por lo tanto la medición de la intensidad de luz absorbida por eldesarrollo del color no resulta una magnitud exacta y este método debe ser preferentementeutilizado con fines cualitativos.

Si se deseara emplear esta técnica con fines cuantitativos lo mejor sería la mediciónmanométrica del dióxido de carbono liberado. Sin embargo las mediciones manométricashacen que la manipulación sea de mucho mayor complejidad técnica y por ello en el trabajoclínico diario, en el que no se requiere de extraordinaria exactitud, se prefiere utilizar elmétodo colorimétrico. Si se tratara de un trabajo de investigación básica o fundamental síresulta imprescindible el uso de la técnica manométrica.

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CARACTERÍSTICAS PARTICULARES DE LOS AMINOÁCIDOS.

La presencia de la cadena lateral (R) variable en los aminoácidos le estará confiriendo a cadauno de ellos características muy particulares que permitirán realizar su diferenciación en ellaboratorio por medio de diferentes procedimientos tanto químicos como físicos.

De hecho, la variabilidad existente en estos grupos posibilitará que el aminoácido particularreaccione de modo diverso ante la presencia de reactivos que sean específicos para determi-nados grupos; por ejemplo si el aminoácido presentara un grupo fenilo en su cadena R reac-cionaría con el ácido nítrico.

Desde el punto de vista de su solubilidad, aunque en sentido general todos los aminoácidosson solubles en agua debido a la presencia de su estructura invariante, su solubilidad variaráde acuerdo con la polaridad que presente su cadena lateral de manera que los aminoácidosclasificados como polares iónicos serán mucho más solubles en agua que aquellos que po-sean grupos hidrofóbicos en su cadena R. Esta propiedad permitió aplicarle a los aminoácidosuna técnica de separación basada en la diferente solubilidad que presentan las sustancias anteuna mezcla de solventes de diferente polaridad. A este método analítico se le denominóCROMATOGRAFÍA, por haber sido descrito por primera vez al separar colorantes vegeta-les.

CROMATOGRAFÍA

En 1906 el botánico ruso Tswett hizo un descubrimiento que en su momento resultóintranscendente; pero que con el decursar de los años dio origen a uno de los métodos másutilizados y eficientes de la química analítica actual. Tswett empleando una bureta llena decarbonato de calcio logró la separación de la clorofila y la xantofila aplicando una soluciónde las mismas en el extremo superior de la bureta y dejando fluir continuamente un solventeapropiado. Para su gran regocijo, comenzaron a aparecer en la columna de carbonato decalcio una serie de bandas verdes, azules y amarillas que correspondían a los distintospigmentos de la mezcla, con lo cual comprendió que había logrado separarlos entre sí. Tswettpublicó su hallazgo en una revista científica; pero su descubrimiento pasó prácticamenteinadvertido y se le consideró como una curiosidad de laboratorio.

Varios años después comenzó a surgir la idea de que el cromatograma de Tswett podía utili-zarse, haciéndole las adaptaciones y modificaciones oportunas, como un procedimiento sen-cillo y rápido para la separación de sustancias complejas, cosa que por métodos químicosresultaba muy lento y engorroso. Con el trabajo de numerosos investigadores, el procedi-miento cromatográfico se ha desarrollado enormemente y hoy día es uno de los métodosanalíticos más empleados.

En los años de trabajo y de desarrollo de esta técnica, la misma se ha ido modificando yganando en complejidad; pero al mismo tiempo en exactitud y precisión, por lo que ya esposible su utilización con fines cuantitativos. Sin embargo para nuestros efectos prácticos deformación del instrumentador quirúrgico no consideramos oportuno pasar a describir lasmúltiples variantes que han surgido a partir de la idea original y nos limitaremos solamente a

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describir una de ellas, la cromatografía de partición en soporte de papel.CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN EN SOPORTE DE PAPEL

Este método se basa en la propiedad que tienen ciertos compuestos de ser solubles, aunqueen magnitud diferente, en dos o más solventes que son inmiscibles entre sí y que se hallan encontacto. Cuando se permite que pase un tiempo suficiente para alcanzar el equilibrio, elcompuesto se encuentra distribuido entre las dos fases líquidas de un modo característico. Laexpresión numérica de esta propiedad es el llamado «coeficiente de partición» (o de «distri-bución») K, que se define como la relación que existe entre la concentración [A] del com-puesto en el solvente A y su concentración [B] en el solvente B, lo cual se expresaría de lasiguiente forma: [A] K= [B]

Como puede deducirse , K resulta característica para un determinado compuesto químico, unsistema de solvente y todo otro conjunto de condiciones, dentro de las cuales se incluyen lasambientales, ya que su valor quedará influenciado por cualquier factor que afecte la solubilidaden cada uno de los solventes utilizados. Algunos de los factores más importantes serían: latemperatura, la presión atmosférica y la presencia de otros solutos; podríamos seguir enun-ciando otros factores, pero entonces la lista se haría muy extensa y se excederían los objeti-vos trazados.

En este método uno de los dos solventes permanece estacionario y se le denomina fase fija,en tanto que el otro se desplaza continuamente, por lo que se le denomina la fase móvil. Unode los sistemas de solventes más sencillos que puede aplicarse es el de fenol saturado enagua. En este caso concreto se utilizaría un soporte de papel de filtro donde se aplicaría lamezcla de sustancias a separar y comoquiera que el papel tiene una película invisible de aguaque lo recubre en toda su superficie, esta agua estaría constituyendo la fase estacionaria, entanto que el fenol aplicado a uno de los extremos del papel comenzaría a desplazarse, porcapilaridad, a lo largo del mismo y se constituye así en una fase móvil. Por supuesto que lassustancias más solubles en agua se irán quedando más cerca del punto de aplicación, en tantoque las que sean más solubles en el fenol, que es un compuesto relativamente apolar, iránavanzando junto con este solvente y por lo tanto se irán separando.

Comoquiera que el tiempo que transcurre para la realización de este tipo de cromatografía enla que la fase móvil se desplaza en contra de la fuerza de gravedad, demora mucho tiempo, ennuestra práctica preferimos hacer la llamada cromatografía circular, en la que un papel defiltro se coloca horizontalmente y así se evita el efecto anteriormente mencionado. Luego secoloca el papel de filtro sobre una placa de Petri que contenga el solvente, se le adiciona unsistema capilar que posibilite que el solvente alcance el papel de filtro, se tapa y se deja quela fase móvil alcance el borde del papel.

Este procedimiento tiene la ventaja de ser muy simple (no necesita de equipos especiales) yrápido, por lo que resulta ideal para que el personal inexperto obtenga resultados que seandemostrativos.

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Otra de las ventajas de la cromatografía en papel es que si se mantienen la condicionesestables, es decir que se emplee el mismotipo de papel, los mismos solventes y lasmismas condiciones ambientales, la movi-lidad de una mancha correspondiente a unasustancia pura es constante y por lo tanto esposible identificar esa mancha por compa-ración directa con una mancha patrón. Esmás, aún en ausencia de patrones es posi-ble la identificación a partir de los llamadosvalores Rf, que es la relación que existe entrela distancia recorrida por la mancha y la re-corrida por el solvente.

Distancia de la manchaRf = Distancia del solvente

En el esquema mostrado anteriormente se ha representado un cromatograma donde se mues-tra en tres de sus cuadrantes la corrida de una aminoácido puro y en el otro cuadrante seaprecia la separación obtenida al aplicar una mezcla de los aminoácidos anteriores.

REACCIONES QUÍMICAS DE LOS AMINOÁCIDOS

Entre las múltiples reacciones químicas que pueden experimentar los aminoácidos hemosescogido tres representativas, que permiten efectuar la diferenciación y/o identificación dealgunos de ellos.

REACCIÓN DE ADAMKIEWICS.

La reacción de Adamkiewics es específica para los grupos indoles.

Se basa en la propiedad que tiene este grupo químico de reaccionar congran número de aldehídos, entre ellos el formaldehído, a través de una

reacción de condensación mediada por la presencia de un agente deshidratante como el ácidosulfúrico y generando así un derivado coloreado característico. Esta reacción es propia deltriptófano.Insertar Adam

Debe señalarse que las proteínas que contengan a este aminoácido también darían positiva lareacción, pues el ácido sulfúrico presente provocaría la desnaturalización de la proteína con

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la subsiguiente exposición al medio de los grupos indólicos existentes en las cadenas latera-les de los aminoácidos, entre ellos las del triptófano.Además la acción del sulfúrico es tan enérgica que provocaría la hidrólisis proteica y laliberación del susodicho aminoácido

REACCIÓN XANTOPROTEICA:

La reacción xantoproteica es específica para los grupos fenilos sustituidos.Insertar feniloEn ella ocurrirá la nitración del grupo fenilo que posea una molécula orientadorapara posiciones orto del anillo cuando se ponga en contacto con el ácido nítri-co. La nitración de este anillo determinará que el compuesto resultante tengaun color amarillo; si en este estado se procede a modificar el pH del mediotornándolo básico mediante la adición de un hidróxido de alguno de los meta-

les alcalinos se obtendría la sal correspondiente que tomaría color naranja.Insertar Xanto

De acuerdo con lo postulado anteriormente todos los aminoácidos que presenten en su es-tructura grupos fenilo sustituídos, como la tirosina y el triptófano darían positivo con lareacción xantoproteica.

En esta reacción el ácido nítrico producirá la desnaturalización e hidrólisis parcial de lasproteínas y por lo tanto las proteínas que contengan a los aminoácidos mencionados anterior-mente también darían positivo con esta reacción.

REACCIÓN DE LOS TIOGRUPOS:

La presencia de grupos -SH (sulfihidrilo o tiol) en un compuesto orgánico permite quetranscurra una reacción en presencia del acetato de plomo en medio alcalino en la cual seobtendrá un precipitado negro de sulfuro de plomo de acuerdo con la siguiente secuenciaInsertar tio

Entre los tres aminoácidos azufrados que existen: cisteína, cistina y metionina, sólo los dosprimeros darán positiva la reacción de los tiogrupos, mientras que la metionina daría nega-tivo al tener bloqueado su grupo tiol por la presencia del metilo.

OBJETIVOS

En la presente práctica nos proponemos los siguientes objetivos:

1.- Demostrar la utilidad de la reacción de la ninhidrina para la identificación de losaminoácidos.

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2.- Realizar la separación de los aminoácidos contenidos en una mezcla por medio de lacromatografía circular en papel.

3.- Comprobar la efectividad de la reacción de Adamkiewics para la identificación de losgrupos indoles e identificar el aminoácido que contiene este grupo funcional.

4.- Ratificar la utilidad de la reacción xantoproteica en la detección de grupos fenolessustituidos e identificar los aminoácidos que contienen este grupo funcional.

5.- Demostrar que la reacción de los tiogrupos identifica a los grupos sulfihidrilos y com-probar su utilidad en la detección de aminoácidos que posean este grupo funcional.

DESARROLLO

EXPERIMENTO # 1. REACCIÓN DE LA NINHIDRINA:

Prepare 4 tubos de ensayo según se muestra en el cuadro siguiente:

Agite todos los tubos de ensayo y colóquelos en un baño de agua en ebullición durante 5minutos.

Dibuje en el espacio siguiente los resultados obtenidos:Insertar tubos4

¿Qué conclusiones puede Ud. sacar de estos resultados?

1 2 3 4Tubo #Reactivo

Albúmina de huevo 0,5 ml - - -

Solución de aminoácidos - 0,5 ml - -

Sacarosa - - 0,5 ml -

Agua destilada - - - 0,5 ml

Ninhidrina 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml

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EXPERIMENTO # 2. CROMATOGRAFÍA CIRCULAR EN PAPEL.

Para la realización de esta experiencia Ud. debe utilizar guantes quirúrgicos o de labo-ratorio de látex, ya que en sus manos se encuentran presentes diversos aminoácidosque contaminarían todo el material; además el sistema de solventes utilizado contieneuna elevada concentración de fenol que es altamente cáustico.

Después de colocados los guantes y utilizando un lá-piz y regla, divida el papel de filtro que tiene en supuesto de trabajo en 4 cuadrantes simétricos, tal comose le muestra en la figura siguiente y proceda a apli-car lo más próximo al orificio central y en forma debandas finas las soluciones de aminoácidos de acuer-do a la distribución que se le orienta en la propia figu-ra.

Cuando termine de realizar la aplicación proceda acolocar el capilar que se encuentra en su puesto detrabajo en contacto con el centro del papel de filtro yubique dicho papel sobre la placa de Petri que contie-

ne el sistema de solventes. Inmediatamente tape la placa de Petri y deje correr el solventehasta alcanzar el borde del papel.

Al terminar la corrida cromatográfica extraiga el papel de filtro de la placa de Petri y déjelosecar mediante su exposición al calor en contacto directo con una resistencia eléctrica. Debetener cuidado de no quemar el papel de filtro. Finalizado este procedimiento de secado, delea su profesor el papel de filtro para que éste proceda a sumergirlo en un vidrio reloj en el quepreviamente se coloca suficiente cantidad del reactivo de la ninhidrina. Se saca de inmediatoel papel de filtro del vidrio reloj y se coloca en el horno a 120°C durante 5 minutos o hastaque aparezcan en el mismo las manchas azul-violáceas características de los aminoácidoscon la reacción de la ninhidrina.

Represente en el dibujo siguiente el resultado obte-nido y calcule el valor de Rf de cada uno de losaminoácidos conocidos así como el de o los que seencuentran en la mezcla de aminoácidos.Insertar cromato2

Una vez calculados estos valores de Rf, proceda aidentificar las diferentes manchas que se obtuvieronde la corrida cromatográfica de la mezcla deaminoácidos, considerando como # 1 la que se en-cuentra más cerca del orificio central del papel:

1.-

2.-

3.-

´

21

Explique la razón por la cual se produce esta separación de los aminoácidos:

EXPERIMENTO # 3. REACCIÓN DE ADAMKIEWICS.


Debe tomar en cuenta dos medidas imprescindibles para que la técnica funcione correcta-mente:

1.- Después de añadir el formaldehído Ud. debe agitar los tubos de ensayo.

2.- Añadir el ácido sulfúrico muy lentamente y por las paredes del recipiente y no agitar eltubo de ensayo.

Recuerde que la reacción de deshidratación mediada por el ácido sulfúrico es altamen-te exotérmica y si lo adiciona muy rápido la solución puede ebullir e incluso saltar yproducirle quemaduras.

La positividad se expresará mediante la formación de un anillo de color violeta que se apre-ciará en la interfase del sulfúrico y el resto de la solución.

A continuación dibuje en el espacio siguiente los resultados obtenidos:Insertar tubos4

Explique brevemente estos resultados:


Gelatina 0,5 ml - - -Albúmina de huevo - 0,5 ml - -Triptófano - - 0,5 ml -Agua destilada - - - 0,5 mlFormaldehído 3 gotas 3 gotas 3 gotas 3 gotas

Ácido sulfúrico 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

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Precise por qué existen diferencias entre el resultado obtenido con la albúmina de huevo ycon la gelatina.

EXPERIMENTO # 4. REACCIÓN XANTOPROTEICA.


Llevar los tubos al baño de agua hirviente y mantenerlos ahí durante un minuto, ¿Qué obser-va?

Enfríe los tubos de ensayo y añádale a todos ellos 5 ml de solución de hidróxido de sodio al20 %. ¿Qué observa?

Dibuje en el espacio siguiente los resultados obtenidos:

Insertar tubos5

1 2 3 4 5Tubo #Reactivo

Albúmina de huevo 2 ml - - - -Fenol - 2 ml - - -Triptófano - - 2 ml - -Fenilalanina - - - 2 ml -Agua destilada - - - - 2 mlÁcido nítrico. 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

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Explique brevemente los resultados obtenidos y diga a qué conclusión se puede llegar.

Compare los resultados obtenidos con el triptófano y la fenilalanina. Explique la diferenciaobservada.

EXPERIMENTO # 5. REACCIÓN DE LOS TIOGRUPOS.

Prepare tres tubos de ensayo de la forma siguiente:

Llevar al baño de agua hirviente y mantenerlo ahí por espacio de 10 minutos. Transcurridoeste tiempo proceda a comparar el resultado del experimento.

Dibuje los resultados obtenidos:Insertar tubos3

Explique por qué la albúmina manifiesta este resultado.

1 2 3Tubo #Reactivo

Albúmina de huevo 1 ml - -

Cisteína - 1 ml -

Agua destilada - - 1 ml

Hidróxido de potasio al 40 % 1 ml 1 ml 1 ml

Acetato de plomo al 10 % 3 gotas 3 gotas 3 gotas

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INFORME DE LA PRÁCTICA

PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LOSAMINOÁCIDOS

EQUIPO #____________DÍA_________________HORA_____________.

INTEGRANTES:1.-___________________________________________________________________2.-___________________________________________________________________3.-___________________________________________________________________4.-___________________________________________________________________5.-___________________________________________________________________

1.- ¿Por qué se utiliza agua destilada en todos los experimentos químicos de esta práctica?

2.- ¿Por qué la albúmina de huevo tiene diferente resultado cuando se realiza la reacción dela ninhidrina con relación al resto de los resultados?

3.- De acuerdo con sus resultados diga qué aminoácidos se encuentran formando parte de laalbúmina de huevo.

4.- Sobre la base de la estructura química de los aminoácidos utilizados, explique por qué seproduce diferente migración en la cromatografía

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PRÁCTICA # 3PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LAS PROTEÍ-

NAS

INTRODUCCIÓN

Las proteínas son macromoléculas compuestas por unidades de L-α-aminoácidos que seunen entre sí mediante enlaces peptídico y que alcanzan un peso molecular igual o superiora 5 000 D.

El enlace peptídico, característico de estos compuestos, resulta de la reacción del grupocarboxilo de un aminoácido con el grupo amino de otro aminoácido, lo cual da lugar a unenlace covalente de tipo carbamida y que tiene algunas características peculiares como son:

1.- El enlace C-N tiene cierto carácter de doble enlace, por lo cual le confiere rigidez a lamolécula

2.- El oxígeno y el nitrógeno quedan en posición trans.

3.- Todos los elementos que componen el enlace se encuentran ubicados en el mismo plano.

4.- La rotación de la molécula formada queda restringida a los carbonos α.

El gran número de aminoácidos que componen a la molécula proteica determina que suestructura sea extraordinariamente compleja, y que para poder estudiarla nos veamos preci-sados a dividirla artificialmente en los llamados «niveles de organización de la estructuraproteica», de los cuales se describen habitualmente 4, aunque algunos autores llegan a des-cribir 5 y más.

Por supuesto que toda organización estructural que implique determinado orden requiere dela presencia de una fuerza estabilizadora, que en el caso de las proteínas estaría constituidapor diferentes tipos de enlaces o interacciones físicas y químicas que se enuncian en el cua-dro siguiente:

Nivel de organización Enlaces que lo mantienen.Primario Enlace peptídicoSecundario Puentes de hidrógeno entre los elementos del enlace peptídico

Puentes de hidrógeno entre las cadenas laterales de losaminoácidos, interacción hidrofóbica, interacción electrostática,puente disulfuro, enlace éster.

Cuaternario Los mismos que para el nivel terciario más las fuerzas de Van der Walls

Terciario

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La complejidad estructural de las proteínas se manifiesta desde el punto de vista funcional enuna gran diversidad de funciones biológicas. A pesar de ello y llevado hasta las últimasinstancias, las funciones biológicas de estas macromoléculas pueden comprenderse basadasen una sola propiedad inherente a estos compuestos, la de poseer característicasinformacionales.

En las macromoléculas informacionales la estructura del compuesto lleva implícita la pre-sencia de una codificación con sentido biológico. Esta información contenida en la estructu-ra puede ser de dos grandes tipos: la información secuencial y la conformacional.

La información secuencial depende exclusivamente del modo en que se organizan las dife-rentes unidades monoméricas que componen a la macromolécula; en otras palabras, dependedel orden en que se ubican los aminoácidos dentro de la cadena proteica. En tanto que lainformación conformacional residirá en la estructura tridimensional de la molécula. Lógica-mente la información conformacional dependerá de la secuencial y el cambio de tan sólo unaminoácido por otro en la estructura de las proteínas puede implicar por tanto una modifica-ción de su estructura tridimensional y por ende una alteración de la información conformacional

Como resultado de la existencia de la información conformacional, en las proteínas apareceuna característica fundamental para su funcionamiento que es el reconocimiento molecular.El reconocimiento molecular es la propiedad que tienen las proteínas de poder unirseselectivamente con otras moléculas gracias a la existencia de una complementaridad eléctri-ca y estérica que le permiten interactuar con dichas moléculas. Esta propiedad citada, porconsiguiente, depende fundamentalmente de las cadenas laterales de los aminoácidos quecomo ya ha sido mencionado representan la parte variable de la estructura de los aminoácidos,y de ahí el hecho de la gran variabilidad de funciones de las proteínas y su posibilidad real dereconocer un número prácticamente infinito de compuestos.

Por supuesto que para que se produzca el reconocimiento molecular la estructura tridimensionalde la proteína tiene que estar intacta y deben existir en el medio circundante condiciones depH que le confieran a esta macromolécula un estado iónico compatible con la molécula areconocer.

De lo anteriormente expuesto se deduce que el estado iónico de la proteína experimentarámodificaciones en dependencia del pH del medio. Esto se debe a la presencia de los grupos alfaaminos, alfa carboxilos y a la existencia en la cadena lateral de los aminoácidos de diferentesgrupos ionizables, cuya forma iónica variará de acuerdo a las condiciones del medio.

Como podrá apreciar existe una forma en cada uno de los aminoácidos que al sumar elnúmero total de cargas positivas y negativas el resultado será igual a 0, y por consiguiente sise colocara bajo la influencia de un campo eléctrico no migraría hacia ninguno de los polos.A este valor del pH en el que un aminoácido en solución colocado bajo la influencia de uncampo eléctrico no migra ni hacia el ánodo ni hacia el cátodo porque sus cargas eléctricasestán compensadas se le denomina PUNTO ISOELÉCTRICO (pI). Cuando el aminoácido

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se encuentra en un pH por debajo de su punto isoeléctrico su carga será positiva, en tanto quesi el valor del pH del medio es superior al punto isoeléctrico su carga neta será negativa ymigrará hacia el ánodo.

En las proteínas también se reconoce la existencia del pI el cual se define como el valor delpH en el cual una proteína en solución colocada bajo la influencia de un campo eléctrico nomigra ni hacia el ánodo ni hacia el cátodo porque sus cargas eléctricas están compensadas.

Para el caso de las proteínas los grupos α amino y α carboxilo de los aminoácidos consti-tuyentes no tienen prácticamente ninguna influencia en la determinación del pI puesto quelos mismos se encuentran comprometidos en el establecimiento de los enlaces peptídicos.

Lo determinante en la aparición del estado iónico de las proteínas serán, por tanto, funda-mentalmente las cadenas laterales de los aminoácidos ionizables constituyentes y de ahí quese haya mencionado con anterioridad que la función de reconocimiento molecular de lasproteínas dependiera de ellos en gran medida, puesto que serían los que estarían establecien-do la compatibilidad o incompatibilidad eléctrica con la sustancia a reconocer.

El otro aspecto a considerar en relación con el reconocimiento molecular, como ya se men-cionó, es la complementaridad estérica que dependerá de la integridad de la estructuratridimensional de las proteínas. Si se produjera la desnaturalización de las mismas, por con-siguiente se estaría no sólo cambiando las propiedades físicas y químicas de las proteínas,sino que también se perdería su función biológica.

Se entiende por desnaturalización el cambio de la conformación proteica como resultado dela acción de agentes físicos o químicos y trae como consecuencia la modificación de laspropiedades físicas, químicas y biológicas de las proteínas.

En la presente práctica nos proponemos estudiar un método de reconocimiento o identifica-ción de las proteínas, así como determinar el pI de una proteína y verificar que ladesnaturalización modifica las propiedades físico-químicas de las mismas.

Para dar cumplimiento al primer propósito utilizaremos la reacción del biuret; mientras quepara los otros dos emplearemos las características de solubilidad de las proteínas.

REACCIÓN DEL BIURET.

El biuret es un compuesto químico resultante del calentamiento de la urea, según se muestraen la reacción siguiente.Insertar biuret1

FORMACIÓN DEL BIURET A PARTIR DE UREALa reacción del biuret también dará positiva con todos aquellos compuestos que como los

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que se muestran a continuación posean grupos carbamidas (-CONH2) consecutivos o separa-dos por un átomo de nitrógeno o de carbono.

COMPUESTOS SIMILARES AL BIURET

Insertar biuret1b

Las proteínas, al tener los enlaces peptídicos separados por el carbono α tienen una estructu-ra similar a la de la malonamida y por tanto darán positivo con este reactivo. Cabe destacarque en el reactivo del biuret no se encuentra presente la sustancia que le da el nombre a lareacción, sino que este nombre deriva del hecho de haber sido esta sustancia la que se descu-brió históricamente como la primera que desarrolló color al ponerla en contacto con los ionescúpricos. Posteriormente se comprobó que otros compuestos, como la malonamida y laexamida, de estructura química similar también daban positiva la reacción.

El reactivo del biuret consiste, en esencia, en una solución de sulfato cúprico a la que se leadicionan otros compuestos que evitan que los iones cúpricos puedan reducirse, ya que sefundamenta en la formación de un complejo órgano metálico con el ion cúprico, que enmedio alcalino toma una coloración violeta. Este complejo se muestra en el dibujo siguiente,donde se ve como el ion cúprico forma un complejo de coordinación con el agua y con losnitrógenos de enlaces peptídicos consecutivos.

COMPLEJO DE COORDINACIÓN ORGANO-METÁLICO RESUL-TANTE DE LA REACCIÓN DEL BIURET.

Insertar biuret2

La reacción del biuret tiene también importancia cuantitativa, pues el color resultante de laformación del complejo de coordinación sigue las leyes de Lambert y Beer y por lo tantoresulta de utilidad práctica para conocer el contenido de proteínas en una solución, siempre ycuando la concentración de la misma sea relativamente elevada, pues la sensibilidad delmétodo no permite discriminar pequeñas variaciones del contenido proteico. Esta técnica esmuy empleada en la práctica médica para la cuantificación de proteínas en diferentes líqui-dos biológicos como son la sangre y el líquido cefalorraquídeo.

SOLUBILIDAD DE LAS PROTEÍNAS.

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En términos generales las proteínas son solubles en agua y en soluciones diluidas de ácidos,bases y sales; sin embargo esto es muy variable pues dependerá de la composiciónaminoacídica de la misma. Mientras mayor sea el número de aminoácidos polares más solu-ble será la proteína en soluciones acuosas; pero a medida que se incremente el contenido deaminoácidos apolares esta solubilidad irá disminuyendo y se irán haciendo cada vez mássolubles en solventes orgánicos.

La solubilidad en agua de las proteínas depende en primera instancia de la interacción queejercen los grupos polares de las cadenas laterales de los aminoácidos constituyentes con elagua, de manera que mientras más polar es la proteína mayor será su interacción con el aguadel medio y logrará crearse una capa de moléculas de agua que recubren a la macromolécula,a la que se denomina agua de solvatación; por consiguiente cualquier efecto o agente queexcluya el agua de solvatación provocará la precipitación de las proteínas.

De esta manera si se modifica el pH del medio hasta alcanzar el valor del pI de la proteína,aunque no se eliminan las cargas de la proteína, ésta sí estará en un estado eléctricamenteneutro y la interacción agua-proteína será más débil y por lo tanto las mismas precipitarán. Aeste procedimiento se le denomina precipitación isoeléctrica de las proteínas y además de per-mitir estimar el pI de una proteína, con él también se podrá efectuar la purificación parcial delas mismas. Está metodología será utilizada en esta práctica con el fin de determinar el pI de lacaseína.

La adición de sales neutras a una solución de proteínas tendrá un efecto diferente de acuerdocon la concentración en que se adicione la sal. Si la concentración de la sal es baja, la mismaconstituirá un puente entre la proteína y el agua de solvatación que permitirá que la solubilidadde la macromolécula se incremente; sin embargo si se añade sal en exceso la misma provoca-rá la sustracción del agua de solvatación de la proteína y estas últimas precipitarán. A esteprocedimiento de disminuir la solubilidad en agua de las proteínas se le denomina «saltingout» o precipitación salina.

La desnaturalización de las proteínas también traerán como consecuencia la disminución dela solubilidad de las mismas, siempre que esta desnaturalización se haga irreversible graciasa la acción de un agente desnaturalizante muy enérgico como serían las altas temperaturas olos ácidos y las bases fuertes. Este efecto será el resultado de la liberación de los gruposapolares de las proteínas que normalmente se encuentran localizados en el interior de lasproteínas globulares; pero que al distorsionarse su estructura tridimensional quedarían ex-puestos al medio, además, en estas condiciones las proteínas se encuentran con más gruposreactivos disponibles, e interactuarán unos con otros provocando la formación de agregadosproteínicos (coágulos) que no podrán mantenerse en solución.

Combinando la acción de la desnaturalización proteica y la precipitación salina, en esta prác-tica demostraremos la posibilidad de extraer todas las proteínas de una solución, conservan-do los otros componentes. Este proceder es extraordinariamente importante en la prácticamédica en la determinación de compuestos diferentes a las proteínas en los líquidos biológi-cos, ya que las proteínas en muchas ocasiones interfieren con el desarrollo de la técnica quese debe emplear y por lo tanto deben ser eliminadas. También se emplea cotidianamente en laesterilización del instrumental quirúrgico y es la base de algunas maniobras de asepsia yantisepsia del área quirúrgica y de las manos del personal que participa en la cirugía.

OBJETIVOS

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En la presente práctica nos hemos propuesto los objetivos siguientes:

1.- Demostrar la utilidad de la reacción del biuret en la detección cualitativa de las proteínas.

2.- Determinar el pI de la caseína mediante el estudio de su solubilidad a diferentes valoresde pH.

3.- Realizar un filtrado libre de proteínas utilizando el método de Nelson.

4.- Demostrar que al realizar el filtrado libre de proteínas no se pierden las otras sustanciaspresentes en la solución.

DESARROLLO.

EXPERIMENTO # 1. REACCIÓN DEL BIURET.


Espere 10 minutos y observe los resultados. Dibuje en el espacio siguiente los resultadosobtenidos:Insertar tubos3

¿Cuáles fueron las soluciones que dieron positivo con la reacción?

Considera Ud. que los aminoácidos interfirieron con el desarrollo del color de la reacción.

EXPERIMENTO # 2. OBTENCIÓN DE UN FILTRADO LIBRE DE PROTEÍNAS.

1 2 3Tubo #Reactivo

Caseína 1 ml - -Aminoácidos - 1 ml -Caseína+aminoácidos - - 1 ml

Reactivo del Biuret 4 ml 4 ml 4 ml

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Prepare tres tubos de ensayo siguiendo las orientaciones del cuadro siguiente:

Para que los resultados sean confiables, Ud. debe agitar cada uno de los tubos de ensayovigorosamente después de añadir cada uno de los reactivos.

Describa qué ha sucedido en cada uno de los tubos de ensayo.

Proceda ahora a filtrar cada uno de los tubos de ensayo anteriores y describa en el siguienteespacio cómo es el aspecto de cada uno de estos tubos. Guarde los filtrados libres de proteí-nas (FLP) para utilizarlos en el próximo experimento.

EXPERIMENTO # 3. CARACTERIZACIÓN DE LOS FILTRADOS LIBRES DE PRO-TEÍNAS.

Prepare 6 tubos de ensayo según se describe en el siguiente cuadro:

Lleve los tubos del 4 al 6 al baño de agua en ebullición y manténgalos ahí durante 5 minutos

1 2 3Tubo #Reactivo

Caseína 1 ml - -Aminoácidos - 1 ml -Caseína + aminoácidos - - 1 mlHidróxido de Bario 4,5 % 4,5 ml 4,5 ml 4,5 mlSulfato de Zinc 5 % 4,5 ml 4,5 ml 4,5 ml

1 2 3 4 5 6Tubo #Reactivo

FLP caseína - - 1 ml 1 ml - -FLP aminoácidos. - 1 ml - - 1 ml -FLP caseína+aminoácidos 1 ml - - - - 1 mlReactivo de Biuret 4 ml 4 ml 4 ml - - -Ninhidrina - - - 1 ml 1 ml 1 ml

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Observe los resultados obtenidos y dibújelos en el espacio siguiente.Insertar tubos6

¿Qué ha sucedido con la reacción del biuret?

¿Qué ha sucedido con la reacción de la ninhidrina?

¿Interfirió la obtención del FLP con la detección de los aminoácidos? ¿Por qué?

EXPERIMENTO # 4. DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE LACASEÍNA

En el cuadro que se le muestra a continuación se describe la forma en que Ud. debe prepararlos 9 tubos de ensayo necesarios para este experimento.

Debe tener cuidado de agitar cada uno de los tubos de ensayo cada vez que añade un reactivo.1 2 3 4 5 6 7 8 9Tubo #

ReactivoAgua 8,4 ml 7,7 ml 8,8 ml 8,5 ml 8,0 ml 7,0 ml 5,0 ml 1,0 ml 7,4 mlAc. acético 0,01 N 0,6 ml 1,3 ml - - - - - - -Ac. acético 0,1 N - - 0,2 ml 0,5 ml 1.0 ml 2,0 ml 4,0 ml 8,0 ml -Ac. acético 1,0 N - - - - - - - - 1,6 ml

Caseína 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 mlpH resultante 5,9 5,6 5,3 5,0 4,7 4,4 4,1 3,8 3,5

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La aparición de turbidez estará manifestando la insolubilidad de las proteínas, luego dondemayor turbidez exista menor solubilidad tendrá la proteína.

Describa los resultados de la experiencia anterior inmediatamente después de terminada.

Espere 5 minutos y vuelva a describir los resultados observados.

Escriba el valor del punto isoeléctrico de la caseína y explique por qué llegó a esa conclu-sión.

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PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LAS PROTEÍ-NAS

EQUIPO #_____________DÍA_______________HORA_____________.

INTEGRANTES:1.- _____________________________________________________________________2.- _____________________________________________________________________3.- _____________________________________________________________________4.- _____________________________________________________________________5.- _____________________________________________________________________

1.- ¿Cuáles de las soluciones ensayadas dio positiva con la reacción del biuret? ¿Por qué?

2.- ¿Por qué cambia el aspecto de las soluciones que tienen proteínas cuando se adiciona elreactivo de Nelson?

3.-¿Por qué cambia nuevamente su aspecto después que se filtran?.

4.- Describa el procedimiento que se usó para determinar el pI de la caseína. Explique por qué

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PRÁCTICA # 4CINÉTICA ENZIMÁTICA

INTRODUCCIÓN

Las enzimas son catalizadores biológicos de naturaleza proteica, gran eficiencia catalítica,elevada especificidad y susceptibles de ser regulados en su acción.

Como proteínas que son, su funcionamiento transcurre mediante el reconocimiento molecular.De esta manera, las enzimas poseen un lugar de la proteína enzimática que se une íntima-mente con el sustrato y al que se le denomina SITIO ACTIVO o CENTRO ACTIVO. Todaslas propiedades de la enzima dependerán entonces de la estructura del sitio activo.

Para el estudio de la estructura del sitio activo, éste se ha dividido artificialmente en diferen-tes componentes:

1.- El esqueleto covalente.

2.- Los grupos de fijación del sustrato.

3.- Los grupos catalíticos

4.- Los grupos ambientadores.

El esqueleto covalente del sitio activo estará formado por aquellos sectores de la cadenapeptídica, no necesariamente consecutivos, que le dan forma y que frecuentemente se en-cuentran formando un dominio de la molécula proteica. Por supuesto que de la conformacióndel sitio activo dependerá en gran parte el reconocimiento molecular pues es el que estarádeterminando la posibilidad de la complementaridad estérica entre la enzima y el sustrato.

Los grupos de fijación del sustrato son los otros elementos que participan en el reconoci-miento molecular, ya que son cadenas laterales de aminoácidos presentes en el centro activoy que se interrrelacionarán con el sustrato por medio de atracciones electrostáticas, puentesde hidrógeno u otras interacciones, incluso enlaces covalentes, que garanticen la más íntimaunión con el sustrato y que éste quede colocado con la orientación óptima para el funciona-miento de los grupos catalíticos. En lo anteriormente expuesto queda implícito que del esta-do de ionización de las cadenas laterales de estos aminoácidos que constituyen los grupos defijación del sustrato dependerá la complementaridad eléctrica entre la enzima y el sustrato.Por supuesto que los grupos catalíticos también serán cadenas laterales de los aminoácidosubicados en el centro activo y a ellos corresponde la actividad catalítica de la enzima.

Los grupos ambientadores del sitio activo son por regla general cadenas laterales deaminoácidos hidrofóbicos que están garantizando la exclusión del agua del espacio internodel sitio activo de manera que ésta no interfiera con la reacción y que sólo pueda entrar a esteespacio cuando se necesite como sustrato y por lo tanto exista algún grupo fijador para ella.

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De las características del centro activo dependerán todas las funciones de la proteínaenzimática, en otras palabras: su acción, su eficiencia y su especificidad.

Entre las propiedades más importantes de las enzimas encontramos a la especificidad, enten-diéndose como tal a la característica que tienen estos compuestos de actuar sobre un sustratoo sobre un grupo estructuralmente parecido de sustratos, catalizando una y sólo una de lasposibles transformaciones que pueda experimentar dicho sustrato.

CINÉTICA ENZIMÁTICA.

La cinética química es la rama de la química que se ocupa de estudiar la velocidad y losmecanismos de las reacciones. Al aplicar esta rama general a la acción de las enzimas sehabla entonces de la cinética enzimática.

Se considera a la velocidad de la reacción como una expresión de la rapidez conque transcu-rre la misma y se puede calcular, bien como la cantidad de sustancias reaccionantes quedesaparecen en la unidad de tiempo o como la cantidad de productos que se forman en launidad de tiempo. Para los efectos de la presente práctica se va a utilizar para expresarla ladesaparición del producto.

Entre los diferentes factores que modifican la velocidad de la reacción enzimática tenemos:

1.- Concentración de la enzima.

2.- Concentración del sustrato.

3.- Concentración de coenzimas.

4.- pH

5.- Temperatura.

6.- Inhibición enzimática.

De todos ellos el 1,2 y 6 tendrán gran repercusión en la regulación del metabolismo celularen tanto que los otros estarán directamente vinculados con el proceso de salud y enfermedad.

En el momento de estudiar cada uno de estos factores debe tenerse en cuenta un aspectoimportante que es el de mantener constantes todos los otros factores que modifican a lavelocidad de la reacción enzimática, pues de otra forma las variaciones que se encontraranserían imposibles de explicar. Evidentemente resulta fácil o relativamente fácil controlarfactores como pH y temperatura; sin embargo, el hecho de que la reacción implica necesaria-mente una modificación permanente de la concentración del sustrato, este último factor re-sulta imposible de mantener constante y por lo tanto tiene que utilizarse un artificio quegarantice al menos que su variación de concentración pueda considerarse despreciable paralos efectos prácticos. Esto se realiza midiendo la llamada velocidad inicial (V0) que se definecomo la velocidad que alcanza la reacción cuando no se ha consumido más del 10 % delsustrato inicialmente añadido; por supuesto que trabajando con sustrato en exceso, esta va-riación es despreciable y da margen de tiempo para hacer las mediciones necesarias

41

Otro aspecto importante para realizar con calidad el trabajo a desarrollar con las enzimas esel de garantizar su pureza, es decir, que no exista en el medio ninguna otra enzima quepudiera actuar simultáneamente con la que se desea investigar. Este trabajo de purificaciónenzimática constituye, sin lugar a dudas, una de las tareas más difíciles que puede enfrentarun investigador ya que conlleva diferentes pasos que requieren de mucho cuidado. En primerlugar se debe seleccionar adecuadamente el organismo y tejido en el que la enzima se en-cuentre en elevada concentración, posteriormente tiene que producirse la ruptura de la célulaevitando que se pierda, mediante desnaturalización, la actividad de la enzima y una vezlogrado esto comenzar a eliminar por diversos procedimientos el resto de las proteínas exis-tentes en el material de trabajo. Dentro de los métodos de purificación más utilizados seencuentran: la precipitación isoeléctrica y salina, la electroforesis, la cromatografía y laultracentrifugación preparativa.

Para evitarnos todos estos trabajos en la presente práctica se ha seleccionado a la enzimaα-amilasa salival, antiguamente denominada ptialina, como el objeto de estudio, ya que estaenzima es de fácil adquisición, pues se encuentra directamente suspendida en una soluciónde muy fácil obtención y es prácticamente la única enzima existente en la saliva. Por otraparte el sustrato natural de esta enzima, el almidón, también se consigue fácilmente y resultarelativamente económico y muy estable.

Otro de los cuidados que se deben mantener al trabajar la cinética enzimática o al manipularcualquier muestra de enzimas es el de garantizar que durante todo el tiempo en que se estétrabajando no se vaya a producir la inactivación de estas proteínas. Existen múltiples facto-res que pueden inactivar a una enzima mediante su desnaturalización que incluyen desde unmaterial de laboratorio sucio y por consiguiente contaminado con sustancias que puedan seragentes desnaturalizantes o inhibidores de la enzima hasta el poco control de la temperaturay el pH. Otra gran ventaja en la utilización de la α-amilasa salival es que la misma es relati-vamente termoestable y no se desnaturaliza sino a temperaturas elevadas.

INHIBICIÓN ENZIMÁTICA

La inhibición enzimática es el mecanismo mediante el cual algunas sustancias químicas de-nominadas inhibidores producen una supresión de la actividad enzimática o al menos unadisminución de su velocidad de reacción, al afectar la eficiencia catalítica de la enzima, suafinidad por el sustrato o ambos parámetros cinéticos simultáneamente.

Resulta importante el estudio de la inhibición enzimática porque la de tipo no competitiva esla responsable de gran parte de las intoxicaciones que sufre el ser humano y la competitiva,además de poseer el efecto anterior, también constituye un mecanismo importante que parti-cipa de la regulación metabólica.

FUNDAMENTACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA ααααα-AMILASASALIVAL

Como se mencionó anteriormente en esta práctica se utilizará la α-amilasa salival comoenzima demostrativa, por lo tanto a continuación se procederá a explicar someramente elefecto catalítico de esta enzima.

42

La α-amilasa salival es una enzima del grupo de las hidrolasas y específicamente de lasendohidrolasas, es decir que va a catalizar la hidrólisis de un enlace que se encuentra situadointeriormente en una macromolécula y no afecta en absoluto a los enlaces que se encuentranen los extremos del sustrato. Más específicamente esta enzima se cataloga como unaα-endoglicosidasa porque cataliza la hidrólisis de los enlaces glicosídicos.

El sustrato natural de esta enzima lo constituye el almidón, aunque también puede actuarsobre algunos otros polisacáridos que como en el caso del glucógeno posean los mismosenlaces y estructura parecida.Insertar glucosaEl almidón es un polisacárido derivado de la unión de múltiples unidades de α-D-glucosa.

En la figura que se representa a continuación aparece la estructura de la glucosa, así como lanumeración de sus átomos :

En el almidón las unidades de α-D-glucosa que lo componen, se unen entre sí mediante elestablecimiento de enlaces α-1-4-O-glicosídicos y como es un compuesto que presenta ra-mificaciones, el establecimiento de estas ramificaciones se hace por intermedio de enlacesα-1-6-O-glicosídicos. La estructura de ambos tipos de enlaces se representa a continuación.Insertar glicosídico

En el almidón existen dos tipos de cadenas diferentes, una que no se encuentra ramificadallamada amilosa y otra que se encuentra muy ramificada y que se denomina amilopectina.

43

IAmbas moléculas se imbrican entre sí paradar lugar a la aparición del gránulo de al-midón que constituye la reserva de com-bustible biológico en los vegetales.

Existen dos elementos que posibilitan laimbricación del gránulo de almidón: unoes la propia estructura de la amilopectina,que como se aprecia a continuación per-mite que entre sus múltiples ramificacio-nes se entrelacen las distintas moléculas,

y la otra es la característica que tiene la molécula de amilosa de presentar una conformaciónhelicoidal con seis unidades de glucosa por cada vuelta de la espira, que le permite interactuarcon otras moléculas de su mismo tipo y con las ramificaciones de la amilopectina.

La glucosa que forma el almidón tiene la propiedad de ser un monosacárido reductor debidoa la presencia en su estructura del denominado carbono anomérico; sin embargo el almidónpierde esta característica de ser un agente reductor porque en su estructura todos los carbo-nos anoméricos de sus glucosas constituyentes se encuentran comprometidos en la forma-ción de los enlaces glicosídicos, excepto unos pocos que forman los escasos extremosreductores de la molécula; sin embargo la mayor parte de los extremos de esta molécula sonno reductores.

La propia estructura de la amilosa permitió diseñar una reacción para la identificación delalmidón que se puede hacer fácil y rápidamente en el laboratorio mediante la adición de iodo,el cual formaría con la hélice del polisacárido un complejo de inclusión de color azul, talcomo se muestra en el siguiente esquema:I n - s e r t a r

Lugol

El proceso de digestión del almidón transcurre mediante reacciones sucesivas de fragmenta-ción de sus moléculas constituyentes, tal como se muestra en la figura de la página siguiente.

DIGESTIÓN ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN POR LA ααααα-AMILASAInsertar amilasa 1Como se aprecia en esa figura, la fragmentación sucesiva del almidón determina que vayanapareciendo compuestos que presentan diferente coloración con el reactivo de lugol, lo cualconstituye un excelente indicador que permite seguir el curso de la reacción. Cabe destacarque los productos finales obtenidos en este proceso son los disacáridos maltosa e isomaltosay el trisacarido isomaltotriosa, sin que pueda alcanzarse la formación de la glucosa, pues elenlace glicosídico existente en estos disacáridos es un enlace externo y la enzima no esespecífica para él.

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OBJETIVOS

Los objetivos de la presente práctica son:

1.- Demostrar que en la saliva existe actividad de la enzima α-amilasa.

2.- Comprobar el efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de la reacción.

3.- Determinar el pH óptimo de la enzima α-amilasa salival.

4.- Comprobar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.

5.- Identificar un inhibidor de la enzima α-amilasa salival.

DESARROLLO

RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA DE SALIVA Y PREPARACIÓN DE LA SOLU-CIÓN DE ENZIMA.

Lo primero que se debe hacer es recolectar la muestra de saliva para obtener una solución deenzima. Para ello enjuáguese la boca varias veces con agua corriente y proceda a recoger enun beaker de 50 ml limpio aproximadamente 2 ml de saliva. Adiciónele a la saliva recogida10 ml de agua destilada y mézclela bien. Filtre esta solución de saliva y rotule a este tubo deensayo como solución de enzima.

EXPERIMENTO # 1. DEMOSTRACIÓN DE LA ACTIVIDAD ααααα-AMILÁSICA ENLA SALIVA.

Prepare 5 tubos de ensayo con 0,5 ml de ácido tricloroacético (TCA) cada uno y rotúlelos del0 al 4. Prepare además un tubo de ensayo según se muestra en el cuadro siguiente. A estetubo de ensayo le llamaremos tubo de reacción:

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Reactivos CantidadAlmidón 1,0 mlAgua destilada 4,9 mlCloruro de Potasio 1,0 mlBuffer fosfato pH 6,9 0,1 ml

Agite bien este tubo de ensayo y proceda a adicionarle 1 ml de solución de enzima e inmedia-tamente, sin perder tiempo proceda a agitar y a extraer 1 ml de este tubo y adicionarlorápidamente al tubo rotulado 0 y al mismo tiempo comience a medir el tiempo. Cada minutosubsiguiente Ud. debe repetir el paso anterior, es decir extraer una porción alícuota de 1mldel tubo de reacción e irla adicionando a los tubos que contienen el TCA hasta alcanzar eltubo marcado 4 minutos. RECUERDE AGITAR EL TUBO DE ENSAYO CADA VEZQUE AÑADA LA PORCIÓN ALÍCUOTA.

De inmediato adiciónele a cada uno de los tubos de ensayo 2 gotas del reactivo de lugol.

A continuación dibuje en el espacio correspondiente los resultados obtenidos con cada unode los tubos de ensayo después de haber añadido el lugol.Insertar tubos5

¿Qué función desempeña el TCA?

Explique los resultados obtenidos.

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EXPERIMENTO # 2. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA SO-BRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN

Prepare 4 tubos de ensayo de la forma siguiente:

Recuerde que el tiempo de reacción es necesario controlarlo cuidadosamente de maneraque la enzima actúe en todos los tubos de ensayo de igual manera; para ello no adicione laenzima hasta no haber preparado todos los tubos de ensayo y haberlos agitado. Comien-ce el trabajo añadiéndole al tubo # 1 la solución de enzima y agite nuevamente, mida eltiempo en ese momento, transcurridos 30 segundos añada la enzima al tubo # 2, al cabode otros 30 segundos se le adiciona al tubo # 3 y al tubo # 4 se le adicionará la enzimadespués de otros 30 segundos. Recuerde que siempre debe agitar los tubos de ensayo.

Para detener la reacción añada 0,2 ml de TCA a cada tubo de ensayo después de habertranscurrido 4 minutos de reacción. Es decir se procederá en la misma forma secuencialconque se añadió la enzima, de esta manera a los 4 minutos de haber adicionado la enzima altubo # 1 será que se debe agregar el TCA a ese tubo y a los restantes se les adicionará el ácidoen intervalos de 30 segundos.

Después de haber detenido la reacción en todos los tubos de ensayo, proceda a agregarle atodos los tubos 2 gotas del reactivo de lugol y observe los resultados obtenidos reflejándolosen el dibujo que debe pintar a continuación.Insertar tubos4

Explique los resultados obtenidos.


Buffer pH 6,9 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 mlKCl 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 mlAlmidón 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml

Agua destilada 1,2 ml 1,1 ml 1,0 ml 0,9 ml

Enzima 0,1 ml 0,2 ml 0,3 ml 0,4 ml

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EXPERIMENTO # 3. DETERMINACIÓN DEL pH ÓPTIMO DE LA ααααα-AMILASASALIVAL.

Prepare 5 tubos de ensayo de acuerdo a las indicaciones siguientes:

Para agregar la enzima tiene que tener los mismos cuidados que con la reacción anterior en elcontrol del tiempo, es decir irla adicionando secuencialmente cada 30 segundos y de igualforma se debe agregar el TCA para detener la reacción a los 4 minutos exactos de haberañadido la enzima.

Una vez concluido todos los pasos anteriores adicione 2 gotas de lugol a cada uno de lostubos de ensayo y dibuje los resultados en el espacio siguiente.Insertar tubos5

Escriba el valor del pH óptimo de la enzima y explique cómo llega Ud. a esa conclusión.


Buffer pH 4,9 0,1 ml - - - -Buffer pH 6,3 - 0,1 ml - - -Buffer pH 6,9 - - 0,1 ml - -Buffer pH 7,5 - - - 0,1 ml -Buffer pH 8,9 - - - - 0,1 mlKCl 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml

Almidón 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 mlAgua destilada 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 mlEnzima 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml

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EXPERIMENTO # 4. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDADDE LA REACCIÓN ENZIMÁTICA.

Prepare tres tubos de ensayo de acuerdo con las indicaciones siguientes:

Después de preparados los tubos de ensayo; PERO ANTES DE ADICIONAR LA ENZI-MA, coloque el tubo # 1 durante 5 minutos en el baño de hielo y el tubo # 3 en el baño deagua en ebullición. Transcurridos estos 5 minutos y sin sacar los tubos de sus respectivosbaños de incubación, añada la solución de enzima y controle que el tiempo de reacción sea de4 minutos, adicionando el TCA en el momento apropiado.

Agréguele a cada tubo de ensayo 2 gotas de lugol, observe los resultados y dibújelo en elespacio siguiente.Insertar tubos3

¿Qué explicación le da Ud. a los hallazgos encontrados.

1 2 3Tubo #Reactivo

Agua destilada 1,0 ml 1,0 ml 1,0 mlBuffer pH 6,9 0,1 ml 0,1 ml 0,1 mlKCl 0,2 ml 0,2 ml 0,2 mlAlmidón 1,0 ml 1,0 ml 1,0 mlEnzima 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml

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EXPERIMENTO # 5. IDENTIFICACIÓN DEL COFACTOR Y DE UN INHIBIDORDE LA ENZIMA ααααα-AMILASA SALIVAL.

La enzima α-amilasa salival requiere como cofactor de la presencia de los iones cloruros; sinembargo los iones fluoruros constituyen un inhibidor de la enzima y los bromuros no afectanla velocidad de la reacción. Sobre esta base se han preparado tres soluciones en las que encada una de ellas se encuentra uno de los iones mencionados, en forma de su sal de potasio.Siguiendo las instrucciones que se brindan en el cuadro siguiente prepare 3 tubos de ensayo.

Recuerde adicionar la enzima de forma secuencial para controlar el tiempo y detener la reac-ción con el TCA a los 4 minutos exactos de haberse iniciado la misma.

Añada a cada tubo de ensayo 2 gotas de lugol y observe los resultados. Expréselos medianteun dibujo en el espacio siguiente:Insertar tubos3

¿Cuál es la solución que se comportó como inhibidora?

¿Cuál es la solución que se comportó como activadora?

¿Cuál es la solución que se comportó como inerte?

¿Cómo pudo Ud. diferenciarlas?

1 2 3Tubo #Reactivo

Solución KCl 0,2 ml - -Solución KBr - 0,2 ml -Solución KF - - 0,2 mlBuffer pH 6,9 0,1 ml 0,1 ml 0,1 mlAlmidón 0,5 ml 0,5 ml 0,5 mlAgua destilada 1,0 ml 1,0 ml 1,0 mlEnzima 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml

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CINÉTICA ENZIMÁTICA

EQUIPO #_____________DÍA_______________HORA_____________.

INTEGRANTES:1.- _____________________________________________________________________2.- _____________________________________________________________________3.- _____________________________________________________________________4.- _____________________________________________________________________5.- _____________________________________________________________________

1.- ¿Por qué se utiliza la saliva como material biológico en esta práctica?

2.- ¿Cómo detectó Ud. la actividad enzimática de la saliva?.

3.- ¿Qué factores estudiados afectaron la velocidad de la reacción enzimática ?. ¿Por qué?

4.- ¿Cuál es el pH óptimo de la enzima?. ¿Cómo Ud. lo determinó?

5.- ¿Cuál fue la sustancia activadora y cuál la inhibidora?. ¿Cómo Ud. lo determinó?

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PRÁCTICA # 5REACCIONES COLOREADAS DE MONO Y

DISACÁRIDOS

INTRODUCCIÓN

Los glúcidos constituyen un importante grupo de compuestos que garantizan la realizaciónde diversas funciones de la célula.

Conceptualmente se conocen como glúcidos a los compuestos químicos que respondan a lascaracterísticas de ser aldehidos o cetonas polihidroxilados, sus productos de oxidación, re-ducción, sustitución, acetalización y polimerización.

De acuerdo con el número de sus unidades constituyentes los glúcidos pueden ser clasifica-dos en tres grandes grupos:

1.- Monosacáridos.2.- Oligosacáridos3.- Polisacáridos.

Los monosacáridos son las unidades más sencillas de los glúcidos y representan a su vez alos monómeros que constituirán a los otros grupos clasificatorios.

Desde el punto de vista estructural los monosacáridos con más de 4 átomos de carbonoexperimentarán una reacción de hemiacetalización interna que les confiere característicascíclicas. Las aldopentosas y las cetohexosas adoptarán una forma furanósica en tanto que lasaldohexosas y las cetoheptosas se presentarán en forma piranósica.

Como resultado de la hemiacetalización de los monosacáridos aparece en su estructura eldenominado carbono anomérico. Este carbono tiene características especiales que determi-nan entre otras cosas la aparición de un tipo de isómeros (los anómeros) y le confiere a estasmoléculas la propiedad de polimerizarse y así constituir los oligosacáridos y los polisacáridos.

Cuando se produce la unión de dos monosacáridos a través de un enlace glicosídico se obtie-nen los denominados disacáridos, de gran importancia en el metabolismo de los glúcidos yparticularmente en su proceso de digestión, por lo que resulta necesario conocer a los princi-pales representantes de este grupo de compuestos.Insertar disacáridos

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Al observar estas estructuras se aprecia que al menos uno de los carbonos anoméricos haquedado comprometido en la formación del enlace glicosídico, en tanto que es común queotro de estos carbonos quede libre y permita que la molécula vaya creciendo hasta alcanzardimensiones que permitan considerarla como un polisacárido. En todo este proceso los enla-ces glicosídicos que van apareciendo irán comprometiendo a los carbonos anoméricos demanera que sólo uno, el de uno de los extremos permanecerá libre. Debido a las característi-cas reductoras que posee el carbono anomérico a ese extremo se le denominará extremoreductor, en tanto que al otro extremo de la molécula, al no presentar dicho carbono anoméricose le denomina extremo no reductor. Esta nomenclatura será de gran utilidad cuando se pasea estudiar el metabolismo de los polisacáridos y en particular el del glucógeno.

De lo anteriormente expuesto se deduce que algunos de los glúcidos presentarán la propie-dad de reducir a algunas sustancias y de ahí que los glúcidos serán también clasificadoscomo reductores o no reductores; para lograr comprender esta nueva clasificación debe pasara estudiarse las propiedades químicas de los monosacáridos.

PROPIEDADES QUÍMICAS DE LOS MONOSACÁRIDOS.

Los monosacáridos, como aldehídos o cetonas polihidroxilados, presentarán todas las pro-piedades químicas propias de los grupos carbonilos primarios o secundarios así como de losalcoholes. Comoquiera que éstas son muy extensas, limitaremos su estudio a las que tienenrelación directa con las reacciones que desarrollaremos en la presente práctica, es decir lasreacciones de reducción y las furfurálicas.

REACCIONES DE REDUCCIÓN.

Los monosacáridos como es sabido presentan un equilibrio entre las formas α, β y su estruc-tura lineal y por lo tanto como todos los compuestos que presentan carbonos carbonílicosexperimentan una reacción de tautomerización cuando se encuentran en solución, lo quedetermina la aparición de otro equilibrio de su forma lineal en que aparecen tres estructurasdiferentes: la aldehídica, la enólica y la cetónica, tal y como se muestra en la figura siguiente:Insertar cetoenol

La forma enólica resultante de este equilibrio tiene la propiedad de poder oxidarse fácilmen-te y por lo tanto manifiesta poder reductor. Existen múltiples sustancias que pueden ser redu-cidas por este grupo, entre las que se encuentran las sales de plata, el hidróxido de bismuto ylas sales cúpricas. Todos estos compuestos han sido utilizados para la identificación de losmonosacáridos basados en sus propiedades reductoras; sin embargo gracias a la estabilidaddel reactivo y a la facilidad de su realización se ha impuesto la utilización de las sales cúpricasy especialmente el reactivo de Benedict.

ALDEHIDO CETONAENOLTAUTOMERISMO CETO-ENÓLICO

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El reactivo de Benedict está compuesto por una solución de sulfato cúprico y de citrato ycarbonato de sodio, que le confieren a la solución un pH alcalino y evitan que los ionescúpricos se reduzcan espontáneamente en presencia del oxígeno ambiental. El medio alcalinohace que la reacción transcurra con mayor facilidad y por lo tanto todas aquellas sustanciasque posean poder reductor darán positivo con este reactivo, y entre ellas por supuesto todoslos monosacáridos y algunos disacáridos. La reacción se muestra en la siguiente figura:Insertar Benedict

En ella se aprecia que los iones cúpricos son reducidos a óxido cuproso que es una sustanciainsoluble de color rojo ladrillo característica de la positividad de esta reacción. La transfor-mación de los monosacáridos no se representa puesto que el mecanismo íntimo de la reac-ción es extraordinariamente complejo y a partir del glúcido se ha podido comprobar que seobtienen más de 93 compuestos diferentes como resultados de enolizaciones, epimerizacionesy polimerizaciones que se producen posteriores a la oxidación del compuesto.

Si se cambia el pH de la solución de manera que resulte ácido, se logrará también que lassustancias reductoras más potentes mantengan la positividad; pero aquellas que sólo tienenun débil poder reductor no lograrán reducir al cobre. Esta propiedad posibilitó desarrollaruna reacción de diferenciación de los monosacáridos y los disacáridos. Un científico llamadoBarfoed utilizó un reactivo compuesto por acetato cúprico y ácido acético, con lo que sólolos monosacáridos eran capaces de reducir al cobre, en tanto que los disacáridos que tienenmenor poder reductor al tener comprometido uno de sus carbonos anoméricos en el estable-cimiento del enlace glicosídico, no reaccionan y por lo tanto dan un resultado negativo. Porsupuesto que al tener la solución un pH ácido resulta necesario controlar rigurosamente eltiempo de la reacción, pues si éste se prolongara se produciría la hidrólisis ácida del enlaceglicosídico con la consiguiente liberación del carbono anomérico y la aparición de nuevosgrupos reductores que falsearían el resultado.

REACCIONES FURFURÁLICAS.

Los otros tipos de reacciones que analizaremos son las que se derivan de la propiedad quetienen los ácidos orgánicos fuertes de deshidratar a la molécula de los monosacáridos demanera que se obtiene un aldehído cíclico denominado furfural, el cual a su vez es capaz decondensarse con algunos compuestos aromáticos y rendir complejos coloreados que permi-ten visualizar la reacción. La reacción de deshidratación se muestra en la figura siguiente:

Insertar FURFUEn ella se ha modificado la estruc-tura lineal de los monosacáridos deforma que se puedan apreciar losgrupos que originan las tres molé-culas de agua; de igual forma sólose han representado las reaccionesque tendrían lugar con las aldosas;en el caso de las cetosas la reacciónsería igual, pero el grupo aldehídoque se ha representado debe sersustituído por una cetona. De esta

REACCIONES DE ÓXIDO-REDUCCIÓN

MONOSACÁRIDOS

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manera se puede concluir que para que se produzca la formación del furfural se requiere quelas aldosas tengan al menos 5 átomos de carbono, en tanto que con las cetosas sólo reaccio-narán aquellas que tengan 6 o más átomos de carbono.

De acuerdo con el tipo de ácido que se use como deshidratante y del compuesto aromáticoque se emplee para la reacción de condensación se describen las diferentes reaccionesfurfurálicas. En la presente práctica realizaremos tres de ellas que se describen a continua-ción:

Reacción de Molisch.

Esta reacción se considera como una reacción general de los monosacáridos puesto que uti-liza al ácido sulfúrico como agente deshidratante y este ácido es un deshidratante muy enér-gico y por lo tanto todos los monosacáridos que tengan suficiente número de átomos decarbono como para formar el furfural darán positivo con la reacción. Además, la fortalezadel ácido sulfúrico determina que los enlaces glicosídicos presentes en los di y polisacáridosque existan en la solución se hidrolicen y se descompongan en sus monosacáridos constitu-yentes, por lo que también darán positivos con este reactivo.

El agente condensante que posibilita la aparición del color es el α-naftol, el cual además, enpresencia del ácido sulfúrico se sulfona dos veces y aparece un complejo coloreado de viole-ta. Esta reacción se representa a continuación.Insertar Molisch

Reacción de Sellivanoff:

Esta reacción es típica de las cetosas, puesto que se aprovecha la característica que tiene elácido clorhídrico de ser un mejor agente deshidratante de éstas que de las aldosas, por lo quesi se controla rigurosamente el tiempo el furfural se obtendrá solamente a partir de losmonosacáridos que presenten grupos carbonilos secundarios en su estructura.

El agente condensante empleado en la reacción es el resorcinol y la representación del com-

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plejo obtenido se muestra a continuación.Insertar Sellivanoff

Otra precaución que hay que tomar al realizar este ensayo es el de la concentración utilizadade los monosacáridos, puesto que concentraciones superiores al 2 % también harán que lareacción dé positiva con las aldosas.

Reacción de Bial.

En esta reacción también se usa como agente deshidratante al ácido clorhídrico; pero enpresencia de cloruro férrico, de manera que en estas condiciones se deshidratan primero laspentosas que las hexosas y por lo tanto constituye una reacción de identificación de lasprimeras. El agente condensante es el orcinol, que al reaccionar con el furfural rinde uncomplejo coloreado de verde que se puede apreciar en la siguiente figura:Insertar Bial

De esta manera, en la presente práctica realizaremos 5 reacciones coloreadas de mono yoligosacáridos que nos permitirán, si no identificar a los monosacáridos, al menos conocerlas características generales de estos que nos permitan realizar su clasificación. De esta ma-

REACCIÓN DE BIAL.

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nera los objetivos que nos trazamos en esta práctica se enuncian a continuación:OBJETIVOS

1.- Identificar la presencia de glúcidos en una solución mediante la aplicación de la reacciónde Molisch.

2.- Comprobar la especificidad para las cetosas de la reacción de Sellivanoff.

3.- Ratificar que la reacción de Bial es característica de las aldopentosas.

4.- Verificar el poder reductor de los monosacáridos mediante la reacción de Benedict.

5.- Reconocer la presencia de monosacáridos en solución usando la reacción de Barfoed.

DESARROLLO

EXPERIMENTO # 1. REACCIÓN DE MOLISCH.

Prepare 5 tubos de ensayo de acuerdo con el siguiente cuadro:

Al preparar los tubos de ensayo debe tomar la precaución de añadir cada uno los reactivosexcepto el sulfúrico. Una vez que haya vertido todos los reactivos en el tubo de ensayoproceda a agitarlo y entonces y sólo entonces, añada el sulfúrico muy lentamente y por lasparedes y no vuelva a agitar el tubo de ensayo. La positividad aparecerá como la presencia deun anillo de color violeta en la interfase formada.

Recuerde que el sulfúrico es altamente cáustico y que si se le derrama produce quema-duras. de igual forma la reacción de deshidratación es altamente exotérmica y si seañade el sulfúrico rápidamente ebullirá y puede producirse la expulsión del líquido queproducirá quemaduras. ¡Tenga mucho cuidado !.

Deje reposar los tubos durante 5 minutos y proceda a dibujar los resultados obtenidos:


Glucosa 2 ml - - - -Sacarosa - 2 ml - - -Ribosa - - 2 ml - -Almidón - - - 2 ml -Albúmina de huevo - - - - 2 mlMolisch 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotasÁcido sulfúrico 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

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Insertar tubos5¿Qué puede concluir sobre los resultados obtenidos ?

¿Por qué la albúmina de huevo que es una proteína da un resultado positivo ?

EXPERIMENTO # 2. REACCIÓN DE SELLIVANOFF.

Para la realización de esta experiencia se deben de preparar 4 tubos de ensayo siguiendo lasinstrucciones que aparecen a continuación.

Lleve los tubos a un baño de agua hirviente durante 10 minutos exactos, al cabo de los cualesproceda rápidamente a enfriar los tubos de ensayo bajo el flujo de agua corriente.

¿Por qué hay que controlar el tiempo y por qué se deben enfriar los tubos de ensayo ?

Dibuje los resultados obtenidos:Insertar tubos4

¿Por qué la sacarosa resultó positiva en la reacción ?


Glucosa 1 ml - - -Fructosa - 1 ml - -Galactosa - - 1 ml -

Sacarosa - - - 1 ml

Sellivanoff 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml

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EXPERIMENTO # 3. REACCIÓN DE BIAL.

Para realizar esta experiencia se requiere de la preparación de 3 tubos de ensayo de acuerdocon las siguientes instrucciones:

Mantenga todos estos tubos en baño de agua en ebullición durante 10 minutos y proceda aleer los resultados y a dibujarlos a continuación.Insertar tubos3

¿A qué conclusión puede Ud. llegar con respecto a la arabinosa ?

¿Por qué a estos dos últimos experimentos hubo que darles calor ?

EXPERIMENTO # 4. REACCIÓN DE BENEDICT.

Prepare 5 tubos de ensayo de acuerdo con lo descrito en el próximo cuadro:

1 2 3Tubo #Reactivo

Glucosa 1 ml - -Ribosa - 1 ml -Arabinosa - - 1 mlBial 1 ml 1 ml 1 ml


Glucosa 1 ml - - - -Fructosa - 1 ml - - -Sacarosa - - 1 ml - -Maltosa - - - 1 ml -Lactosa - - - - 1 mlBenedict 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

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Mantenga los tubos de ensayo durante 5 minutos en el baño de agua hirviente y luego proce-da a ver los resultados y dibujarlos a continuación.Insertar tubos5

¿Por qué la sacarosa dio negativo con esta reacción ?

¿Qué diferencia observó entre los resultados de los monosacáridos y los disacáridos ?

EXPERIMENTO # 5. REACCIÓN DE BARFOED.

Prepare 5 tubos de ensayo de acuerdo con lo descrito en el próximo cuadro:

Mantenga los tubos de ensayo durante 5 minutos en el baño de agua hirviente. Recuerde


Glucosa 1 ml - - - -Fructosa - 1 ml - - -Sacarosa - - 1 ml - -Maltosa - - - 1 ml -Lactosa - - - - 1 mlBarfoed 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml

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tener sumo cuidado con el control del tiempo que debe ser muy exacto.Pasado este tiempo proceda a observar los resultados y dibujarlos a continuación.Insertar tubos5

¿A qué conclusiones generales puede Ud. arribar en este experimento ?

¿Qué diferencia observó entre los resultados de los monosacáridos y los disacáridos ?

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REACCIONES COLOREADAS DE MONO YDISACÁRIDOS

EQUIPO #_____________DÍA_______________HORA_____________.

INTEGRANTES:1.- _____________________________________________________________________2.- _____________________________________________________________________3.- _____________________________________________________________________4.- _____________________________________________________________________5.- _____________________________________________________________________

1.- Escriba en el siguiente cuadro las especificidades de cada una de las reacciones que sele mencionan:

Reacción EspecificidadMolischSellivanoff

Bial

Benedict

Barfoed

2.- De acuerdo con los resultados obtenidos en la práctica. ¿Qué puede Ud. afirmar enrelación con las características estructurales de?:

Sustancia Características estructuralesGlucosa

Fructosa

Galactosa

Ribosa

Arabinosa

Sacarosa

Maltosa

Lactosa

Almidón

Albúmina de huevo

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PRÁCTICA # 6EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LÍPIDOS

INTRODUCCIÓN

Los lípidos constituyen un importante y variado grupo de compuestos químicos. Debidoprecisamente a su gran variabilidad estructural resulta imposible establecer un concepto quí-mico de estas sustancias y por ello se precisa definirlas operacionalmente, así se entiende porlípido a todo material biológico que sea extraíble por medio de la utilización de solventes nopolares

Sin embargo, para su clasificación sí resulta útil la agrupación de estos compuestos de acuer-do con sus características estructurales, y de esa forma los mismos se clasifican en:

1.- Ácidos Grasos.2.- Grasas neutras.3.- Ceras.4.- Fosfátidos de glicerina.5.- Esfingolípidos.6.- Lípidos isoprenoides.

Igual que diversa resulta la estructura de los lípidos, consecuentemente sus funciones bioló-gicas también serán muy variadas, de ahí que a pesar de poder generalizar señalando que lasprincipales funciones que cumplen estos compuestos en el organismo son las de: servir comocombustible biológico, constituir la principal reserva de energía del organismo, ser compo-nentes estructurales importantes de la célula y el organismo y poseer muchos de ellos activi-dad biológica propia; deba señalarse que cada grupo clasificatorio además cumple con fun-ciones específicas.

Consecuentemente con su definición, la obtención de los lípidos tendrá que realizarse utili-zando como fuente algún tejido vivo y como material de extracción a alguno de los solventesno polares u orgánicos. A pesar de que en general todos los lípidos son solubles en estos tiposde solventes resulta que, de acuerdo con las características estructurales que presentan, seránmás o menos solubles en los diferentes tipos de solventes orgánicos: así el cloroformo seráun buen diluente para casi todos ellos, en tanto que el etanol y la acetona serán más específi-cos. La acetona resulta un buen disolvente de los esteroides, en tanto que el etanol lo serápara los ácidos grasos de cadena corta. De esta manera utilizando diferentes combinacionesde solventes no sólo se logra la extracción de los lípidos a partir de la materia orgánica, sinoque también se podrán diseñar métodos que permitan la obtención selectiva de algunos deellos.

En la presente práctica utilizaremos la propiedad de solubilidad para aislar a partir del cere-bro de conejo los lípidos presentes utilizando el equipo de Soxhlet

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Flujo del refrigeranteFlujo del solvente gaseosoFlujo del solvente líquido

Como se aprecia en el esquema del equipo de Soxhlet: el cloroformo se ubica en el matraz, elcual a su vez está inmerso en una manta de calefacción eléctrica regulada a una temperaturade 65°C para lograr la ebullición del solvente. Los vapores del solvente ascienden por larama lateral del equipo y alcanzan el condensador, refrigerado por agua corriente, y luego devolver al estado líquido cae en el vaso central del equipo. En este vaso central se encuentra eldedal de extracción de Soxhlet que contiene al tejido objeto de estudio. El solvente se vaacumulando y elevando su nivel hasta alcanzar la parte superior del sifón, que se muestra enla parte derecha de la figura, y entonces se vacía en el matraz. Con esto se logra un circuitocerrado de circulación del solvente que permite que en múltiples ocasiones éste se ponga encontacto con el material biológico y así vaya extrayendo sus lípidos constituyentes.

Insertar Soxhlet.

El tejido nervioso tiene un alto contenido lipídico y porlo tanto constituye una fuente ideal de este material.Aprovechando esta característica se procederá a extraerlos lípidos presentes en el encéfalo utilizando al cloro-formo como solvente. Con este procedimiento se logra-rá disolver a la mayor parte de los lípidos existentes queserán colectados en el matraz del equipo y luego porevaporación del solvente se obtendrán los mismos.

En la presente práctica además de realizar algunos expe-rimentos de carácter general, emplearemos este extractopara la identificación de las propiedades físico químicasde los lípidos obtenidos a partir del tejido nervioso.

PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LOS LÍPIDOS:

La primera y tal vez más importante propiedad físico-química de los lípido es su solubilidad.Esta propiedad ha sido utilizada incluso para la propia definición de estos compuestos; sinembargo a pesar de ser cierto que la mayoría de los lípidos son solubles en solventes apolares,también es cierto que su solubilidad no es igual para todos ellos. Por ejemplo, existen lípidoscon cierto grado de polaridad y otros que son totalmente apolares; por consiguiente unosserán más solubles que otros ante determinado solvente orgánico. Es el caso de algunaslecitinas que incluso precipitan en presencia de la acetona fría y el de los ácidos grasos al serpuestos en presencia del etanol.

SOLUBILIDAD DE LOS ÁCIDOS GRASOS EN ETANOL

El etanol es un solvente que no es totalmente apolar y algo similar ocurre con los ácidosgrasos que poseen en su estructura un grupo carboxilo polar y una cadena lateralhidrocarbonada de longitud variable. De acuerdo con la longitud de esta cadena lateral y dela presencia o no de dobles enlaces en la misma variará la solubilidad de los lípidos en eletanol.En sentido general se puede afirmar que mientras más corta sea la cadena lateral de los

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ácidos grasos más solubles serán en el etanol y que a igual número de átomos de carbono lamayor solubilidad en este alcohol se verá en aquellos ácidos grasos que posean mayor núme-ro de dobles enlaces. Esta propiedad la podremos demostrar en la presente práctica.

EMULSIFICACIÓN Y DETERGENCIA.

Como es de esperar resulta imposible mantener unido un sistema disperso integrado por unamezcla de agua y grasa. Estos sistemas dispersos son coloides llamados emulsiones y quedanconstituidos por el agua que representa a la fase dispersante y la grasa que se comporta comola fase dispersa fragmentándose en partículas denominadas micelas. Las dos fases se logranmantener unidas sólo si se continúa la agitación, pues tan pronto como regresan al reposo deinmediato se separan.

En los seres vivos que son organismo absolutamente dependientes del agua se necesita con-servar estables a estas emulsiones para lograr tanto el transporte como el metabolismo de lasgrasas. Esto se consigue a través de un mecanismo llamado la detergencia.

La detergencia es el mecanismo a través del cual la adición de una sustancia llamada deter-gente garantiza la estabilidad de una emulsión.

En la figura que se muestra a continuación se aprecia que al agitar el agua y la grasa se lograla obtención de una emulsión; pero cuando se permite el reposo del sistema ambas fases seseparan en un proceso denominado coalescencia; sin embargo al adicionar un detergente laemulsión se estabiliza al impedir que las micelas coalezcan.Insertar Emulsión

Los detergentes logran realizar esta actividad gracias a su estructura química. Independiente-mente de su naturaleza química, todo detergente tendrá una parte apolar y otra polar ionizable,de manera que son sustancias anfipáticas con afinidad tanto por el agua como por las sustan-cias apolares.

En la siguiente figura se muestra una de las sales biliares, la del ácido glicocólico, y en ella

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se aprecia que el anillo del esterano resulta apolar en tanto que el residuo de glicina es alta-mente polar e incluso iónico. Las sales biliares son los principales detergentes biológicosInsertar Sal biliar

Como resultado de su carácteranfipático las moléculas de deter-gente mantendrán su parte apolarincorporada en el interior de lamicela mientras que su porción po-lar quedará en la superficie de lamisma y en íntimo contacto con elagua por lo que constituirá un me-

dio de unión entre la grasa y el agua; además si dos micelas de estas se aproximaran laigualdad de las cargas que mantienen en su superficie haría que ambas se repelieran y así selogra evitar la coalescencia y por consiguiente estabilizar la emulsión.

En la siguiente figura se aprecia la interacción entre cuatro micelas que se han formado conel glicocolato de sodio. Se puede distinguir en el interior de cada una de estas micelas lapresencia de los anillos de esterano mientras que la porción polar ha quedado en el exterior ypor lo tanto le confiere una carga negativa a toda esta superficie de la partícula. Debe señalar-se que esta figura es sólo una representación esquemática del proceso y que el número demoléculas de sales biliares que se mantienen unidas a cada micela es muy superior al que seha representado en la figura y por consiguiente la carga negativa externa es de magnitudsuficiente como para neutralizar la tendencia natural que tiene la grasa de volver a unirse.Insertar y editar Miscela

REACCIONES DE HALOGENACIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS:

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