UNIVERSIDAD DEL CAUCA

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES, EXACTAS Y DE LA EDUCACIÓN

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS PARA BIOLOGIA CELULAR

GERARDO ANDRES TORRES RODRÍGUEZ

Magíster

Popayán, Noviembre de 2002

UNIVERSIDAD DEL CAUCA

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES, EXACTAS Y DE LA EDUCACIÓN

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS PARA BIOLOGÍA CELULAR

GERARDO ANDRÉS TORRES RODRÍGUEZ

Magister

Popayán, Noviembre de 2002

INDICE

Pág.

INTRODUCCION

CAPITULO I. MICROSCOPIA OPTICA Y ELECTRONICA 3 Practica 1. Conceptos Básicos de Microscopía Optica 6 Practica 2. Practica Demostrativa en Procesamiento de Muestra 12

y Conceptos Básicos de Microscopía Electrónica Practica 3. Recuento de Leucocitos 16 Practica 4. Observación Microscópica de la Actina y Miosina del Músculo 22

CAPITULO II. CULTIVO DE MICROORGANISMOS 24 Practica 5. Cultivos de Microorganismos en Medios Sólidos y Líquidos 25

CAPITULO III. MEMBRANAS CELULARES 30 Practica 6. Osmosis 31 Practica 7. Solubilidad de los Lípidos de la Membrana 33

CAPITULO IV. FRACCIONAMIENTO CELULAR 36 Practica 8. Separación de Células por Baja Velocidad 37 Practica 9. Aislamiento de la Mitocondria 39 Practica 10. Respiración de la Mitocondria 41

CAPITULO V. ESPECTROFOTOMETRIA 45 Practica 11. Preparación de una Curva Patrón 47 Practica 12. Determinación Espectrofotometrica de Proteínas en

Materiales Biológicos 50 Practica 13. Efectos de la Temperatura y el pH en la Actividad de las Enzimas 53

CAPITULO VI. ACIDOS NUCLEICOS Y DIVISION CELULAR 56 Practica 14. Aislamiento de DNA 56 Practica 15. Modelamiento de Moléculas Biológicas 60 Practica 16. Mitosis

BIBLIOGRAFIA

INTRODUCCIÓN

La célula, como unidad fundamental de la vida, es la gran empresa en la cual se han interesado, muchos investigadores científicos, en especial, los que se han dedicado al estudio de las Ciencias Naturales. Debido a tales ingentes esfuerzos, se han producido grandes avances y descubrimientos que han permitido el estudio de las estructuras, funciones y mecanismos interactuantes en la unidad vital celular. Entre estos, se destacan los estudios de los tipos celulares, la bioquímica y el metabolismo celular y la estructura de las organelas. Debido a la gran avenida del conocimiento que se abrió en febrero del año 2000, cuando Craig Venter y Francis Collins de Celera Genomics y del HGP, mostraron a la comunidad científica y a toda la sociedad humana, el primer borrador del genoma humano con el 99.99% de su contenido secuenciado, los investigadores de todo el mundo, se afanan por conocer todas las relaciones existentes entre estas secuencias, y toda la expresión de las proteínas, que conllevarán al conocimiento mas preciso del metabolismo celular. Todo lo anterior, se propone como gran final de esta notable empresa, y por supuesto a la corrección de los errores que puedan existir en algunas muestras biológicas humanas que producen enfermedades y patologías, todo esto, como un gran presupuesto de conocimiento que será usado para entender a otros modelos de sistemas vivientes, como son los vegetales, animales, y los microorganismos. Por esto, la Biología Celular y la Biología Molecular, son actualmente los bastiones de las nuevas ciencias emergidas de estos nuevos descubrimientos: La Genómica y la Proteómica. En el presente Manual, los autores, se han preocupado por diseñan unas practicas que permitirán a los estudiantes en formación profesional del Programa de Biología, el conocimiento de los aspectos básicos generales de la célula, la destreza en algunos de los análisis bioquímicos (enzimáticos), físico-químicos (espectrofotometría) que permiten conocer el funcionamiento celular, y los análisis básicos moleculares (aislamiento de ADN). Por todo lo anterior, este Manual se ha organizado por Capítulos, en los cuales, se condensan diferentes Laboratorios para Microscopía Óptica, Cultivo de células procariotas, Membranas Celulares, Espectrofotometría, Fraccionamiento Celular y ADN y la División Celular, que serán de gran utilidad para el conocimiento, la motivación, la adquisición de destrezas en este apasionante campo de la Biología Celular.

4

CAPITULO I

MICROSCOPIA ÓPTICA Y ELECTRÓNICA

El microscopio es una herramienta de investigación que se usa como elemento para obtener conocimientos en diversa áreas científicas, tal es el caso de la histología, embriología, microbiología, micología, citología, parasitología, etc. Algunas de ellas requieren del microscopio solo de manera secundaria mientras que otras lo precisan como utensilio indispensable. Aunque prácticamente cualquier biólogo maneja un microscopio, son muy pocos los que en verdad lo saben hacer, su mal uso resta calidad a la imagen y por lo tanto la información que se obtiene. Los estudiantes y maestros debemos pugnar por quitar viejos vicios en el uso del microscopio (limpieza inadecuada, iluminación deficiente, mala combinación de objetivos y oculares) para de este modo lograr un aprovechamiento integral del viejo y siempre novedoso instrumento. Viejo instrumento porque hace más de 300 años fue usado por primera vez, la iluminación según Kohler data de la última década del siglo XIX los sistemas de iluminación tangencial, campo oscuro, microscopía de fluorescencia y polarización son todos de principio del siglo XX. Pero estos viejos microscopio se han actualizado y modificado para dar lugar a nuevas generaciones de sistemas ópticos, contraste de fase, microscopios de interferencia de Dyson, Jamin-Lebedef y Nomarski, los microscopios electrónicos de transmisión y de barrido. En los últimos 20 años la evolución del microscopio se observa de manera vertiginosa en la microscopía de fluorescencia, microscopía confocal con la utilización de rayos láser y los sistemas de análisis da imágenes. En el año de 1931 Ernest Ruska y sus colaboradores construyeron el primer Microscopio Electrónico de transmisión este es similar en sus principios físicos al microscopio de luz. A través de este Poderoso instrumento se pudo determinar le ultrestructura de la célula Su poder radica en haber utilizado una fuente de iluminación con un haz de electrones que permitió aumentar el poder de resolución hasta 10.000 veces con relación al microscopio óptico.

5

Figura No 1. Microscopio Óptico de Alta Resolución

PRACTICA 1

6

CONCEPTOS BÁSICOS DE MICROSCOPIA OPTICA

INTRODUCCIÓN

El microscopio además de aumentar la imagen de los objetos y mostrar que muchas veces algunas cosas que son visibles a simple vista son diferentes a como las observamos, sirve para hacer mediciones, estimar el tamaño de una población de microorganismos, estudiar estructuras celulares y en general para hacer estudios morfológicos y fisiológicos de células y tejidos.

OBJETIVOS Con esta práctica se pretende que el estudiante. 1 Entienda algunos conceptos básicos de microscopía tales como poder de

resolución, poder de aumento y campo visual con relación a las lentes utilizadas.

2 Adquiera destreza para calcular mediciones aproximadas de células y otras

estructuras. 3 Conozca las unidades de medida de mayor uso en micrometría y las utilice

resolviendo algunos problemas comunes en este campo.

MATERIALES

Microscopios Compuestos

Lámparas de bombillas u otras fuentes de luz

Portaobjetos

Cubreobjetos

Papel limpia lentes

7

PROCEDIMIENTO

1. ANÁLISIS DE ALGUNOS CONCEPTOS BÁSICOS DE MICROSCOPÍA

Iluminación Kohler La mejor forma de ajustar el microscopio para una iluminación correcta según los principios de Kholer, que establece para realizar una buena iluminación la necesidad de que esté equipado el microscopio con diafragma de campo o diafragma de lámpara y un condensador de la lámpara, esta lente también recibe el nombre de colector además el condensador del microscopio debe ser centrable y deslizable a lo largo del eje del microscopio. 1 Encender el microscopio, se ilumina a 6 vol. Por medio del control de

luminosidad. 2 Abrir el diafragma de campo y de apertura. 3 Subir el condensador. 4 Seleccionar objetivo de 10X. 5 Enfocar la muestra con los mandos macro y micrométrico. 6 Ajustar la distancia interpupilar (distancia entre los ojos) 7 Ajustar dioptrías (agudeza visual) con cada ocular hasta que la muestra se vea

nítida 8 Cerrar un poco el diafragma de campo luminoso 9 Descender ligeramente el condensador, hasta ver nítido el borde del diafragma

de campo. 10 De ser necesario, centrar el condensador con la ayuda de sus dos tornillos

laterales. Una vez centrado el condensador abrir el diafragma de campo hasta que apenas desaparezca del campo visual

11 Contrastar la imagen con el diafragma de apertura del condensador. 12 A cada cambio de objetivo:

a. Enfocar con el micrométrico b. Contrastar con el diafragma de apertura.

Poder de Resolución Es la capacidad que posee un instrumento óptico para diferenciar dos puntos que a simple vista parecen uno solo debido a la pequeña distancia entre ellos. Es característico de cada instrumento óptico y depende en gran parte de la calidad de las lentes utilizadas. Es así como el poder de resolución máximo aproximado del ojo humano es 100µ, el del microscopio compuesto es de 0.2µ y el del microscopio electrónico es de 0.001µ. Lo anterior significa que para que el ojo humano pueda

8

diferenciar claramente dos puntos, éstos deben estar separados entre sí por una distancia igual o mayor a 100µ. ¿Podría Usted por lo tanto observar separadamente con el microscopio compuesto, dos puntos que están a 10µ entre sí? ¿Y dos puntos que están a 0.1µ?. Para entender en la práctica lo que es el poder de resolución, tome un papel delgado impreso con letras, observe una de ellas y esquematícela. Luego, usando dicho papel, prepare un montaje en fresco y enfoque la misma letra en 10X y en 43X. Haga los esquemas correspondientes y compare los resultados. ¿A qué se deben las diferencias observadas en los tres casos?. Conserve esta preparación para un análisis posterior.

Poder de aumento

Es la capacidad que posee un instrumento óptico para dar una imagen aumentada de un objeto y depende, entre otros factores, del tipo y calidad de las lentes utilizadas en tal instrumento. Lógicamente que una lente dada puede dar una imagen mayor o menor dependiendo de la distancia a la cual se encuentra del objeto. No obstante, hay una distancia óptima entre objeto y lente que proporciona una imagen lo más nítida posible. Para nuestros propósitos consideraremos siempre el aumento obtenido cuando se cumple la condición anterior. Así por ejemplo, si un objeto tiene un tamaño de 1 mm y una lente dada origina una imagen de 10 mm, se dice que el aumento es de 10 veces, es decir, el poder de aumento de esa lente es de 10. Nótese que el poder de aumento es en este caso la relación entre el tamaño de la imagen y el tamaño del objeto. Por otra parte, una imagen a su vez también puede ser aumentada por una lente. Si en el caso anterior se toma la imagen obtenida de 10 mm, y por medio de otra lente, obtenemos una nueva imagen de 50 mm, tenemos que el aumento total es de 5 veces en relación con el tamaño de la primera imagen o de 50 veces en relación con el tamaño del objeto.. Se puede deducir por tanto que el aumento total producido por dos lentes es igual al aumento producido por la primera lente multiplicado por el aumento producido por la segunda lente. En este caso, el aumento total (AT) equivale a 10 x 5 = 50 veces. El microscopio que usted utiliza consta de dos lentes, ocular y objetivo, cada una de ellas con su respectivo poder de aumento. Es decir, cuando se observa un objeto a través de él, su aumento total está dado por el producto del poder de

9

aumento de cada una de las lentes, o sea, aumento del objetivo (Aob) multiplicado por el aumento del ocular (Aoc).At = Aob x Aoc Siendo X el tamaño del objeto, veamos algunos ejemplos:

Poder de aumento del

objetivo

Poder de aumento

del ocular Aumento total

10X

97X

6X

10X

60X

970X

Según lo anterior, ¿cuántas veces se aumento el tamaño de la imagen de la letra cuando usted utilizó el objetivo de 10X y el de 43X, si el ocular de su microscopio era de 10X?

Campo visual del microscopio

Es el área circular que se observa al mirar a través del microscopio y varía según las lentes utilizadas. Observe nuevamente la placa que contiene las letras impresas. ¿Con cuál de los dos objetivos, 10X o 43X, observa mayor área de una de las letras? ¿El campo visual de un microscopio es entonces mayor o menor según se observe con mayor o menor aumento?.

2. UNIDADES UTILIZADAS EN MEDICIONES MICROSCÓPICAS La mayoría de organismos o estructuras que se estudian al microscopio son de tamaños muy pequeños. Por lo tanto, para medirlos es necesario utilizar unidades reducidas tales como el ángstrom (A°), el nanómetro (nm), la micra (µ), y en algunos casos el milímetro (mm). Las relaciones que existen entre ellas son: 1 mm = 1000 µ 1 µ = 1000 nm 1 nm = 10A° Teniendo en cuenta los datos anteriores, resuelva los ejercicios siguientes:

10

1. ¿A cuántas nm equivale un mm? ¿Y a cuántas nm equivale 1 A°? Si una célula tiene un diámetro de 1.2µ. ¿Cuál será su diámetro en A° y en mm?

2. Si el microorganismo A mide 120µ y el microorganismo B mide 1200 A°, ¿Cuál de los dos tiene mayor tamaño?.

3. CALIBRACIÓN DEL MICROSCOPIO OPTICO

Para medir los campos presentes en el campo microscópico es necesario disponer de una escala apropiada en el ocular del microscopio. Ahora bien, antes de utilizar esa escala habrá que calibrarla. Los micrómetros oculares son discos planos de vidrio que llevan grabada una escala lineal dividida en 50 ó 100 pequeñas divisiones. Estas divisiones tienen diferentes valores de medición con arreglo al poder de resolución del objetivo utilizado. El valor de medición se calcula utilizando un micrómetro de platina provisto de una escala calibrada en divisiones de 0.1 mm y subdivisiones de 0.01 mm. Para calibrar el micrómetro ocular se procede del modo siguiente: 1. Retirar el ocular (de 10X o de otra graduación) del microscopio y desenroscar la

lente superior o inferior, según el modelo de que se trate. Colocar la escala sobre el diafragma situado en el lado grabado contra la superficie inferior del retículo. Volver a enroscar la lente y reinsertar el ocular en el microscopio.

2. Colocar el micrómetro de platina sobre la platina del microscopio y enfocar el objetivo de menor aumento en algún segmento de la escala con el ocular de 10X.

3. Ajustar el micrómetro de platina desplazando ésta de manera que la línea cero del micrómetro ocular quede exactamente sobre la línea cero del micrómetro de la platina.

4. Sin mover el micrómetro de la platina, encontrará otro punto en el extremo derecho en el que coincidan con exactitud otras dos líneas. Este segundo par de líneas superpuestas debe estar lo más alejado posible de la línea cero. La distancia dependerá del objetivo utilizado. Con los mayores aumentos, las líneas pueden aparecer tan gruesas que sea necesario buscar la superposición del borde derecho o izquierdo de cada una de ellas.

5. Contar en el micrómetro ocular el número de divisiones entre la línea cero y el punto de donde se superpone el segundo par de líneas. En la figura adjunta, por ejemplo, este número, indicado por la línea de puntos, equivale a 33 unidades del ocular.

6. Contar luego el número de líneas de divisiones de 0.1 mm entre la línea cero y el segundo par de líneas superpuestas en el micrómetro de la platina; en la figura, este número, indicado por la flecha, equivale a 0.22 mm.

7. Calcular la longitud representada por unidad ocular: 8. 33 unidades del ocular = 0.22 mm.

11

9. 1 unidad del ocular = 33

22.0 mm = 0.0066 mm = 6.6 m

10. Así pues, 1 unidad del ocular = 6.6m para este objetivo. Cada objetivo del microscopio debe calibrarse por separado.

11. Una vez calibrados todos los objetivos, preparar una sencilla gráfica que indique el factor de calibración correspondiente a cada uno de ellos

12

PRACTICA 2

PRACTICA DEMOSTRATIVA EN PROCESAMIENTO DE MUESTRA Y

CONCEPTOS BÁSICOS DE MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

INTRODUCCION La presente practica pretende mostrar a los estudiantes las características y particularidades que tiene el procesamiento de muestras Biológicas en esta técnica, de igual forma los equipos y principios básicos de funcionamiento Igualmente se pretende mostrar a la comunidad Universitaria los potenciales y aplicaciones que tiene la microscopía Electrónica en General como la capacidad de la Unidad de Microscopía de la Universidad y su labor apoyando diversas actividades académicas y de investigación

OBJETIVOS

1. Ofrecer al estudiante el conocimiento básico en el procesamiento de muestras

Biológicas para microscopía electrónica. 2. Mostrar al estudiante las diferentes aplicaciones de la microscopía electrónica

en investigación en ciencias biológicas. 3. Mediante esta práctica el estudiante estará en capacidad de conocer y

diferenciar el Poder de resolución del Microscopio Óptico versus el electrónico y su aplicación en los estudios de la Ultraestructura.

PROCEDIMIENTO La practica se desarrollara de manera que el técnico de laboratorio realizara un montaje en los diferentes equipos lo que permita hacer una observación en los siguientes aspectos

1. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

13

Realizar según figura No 2

Figura No 2 Diagrama que muestra las diferentes etapas en el proceso de

muestras Biológicas para microscopía Electrónica de Transmisión

2. DESCRIPCIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS Y FUNCIONAMIENTO DEL

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN.

El microscopio electrónico consta principalmente de una alta columna cilíndrica hueca donde se confina el rayo de electrones y de una consola con un panel de botones giratorios que controlan electrónicamente las operaciones efectuadas dentro de la columna la parte superior de la columna contiene el cátodo, un filamento de tungsteno que cuando se calienta actúa como fuente de electrones.

14

Los electrones se desprenden del filamento y se aceleran para formar un delgado haz mediante la aplicación de un voltaje entre el cátodo y el ánodo. Antes de la operación se extrae el aire de la columna para producir un vacío donde se desplazarán los electrones, si no se extrae el aire los electrones pueden dispersarse prematuramente por colisión con las moléculas de gas. Puesto que los electrones son partículas con carga eléctrica se pueden desviar de su trayectoria y poner en foco mediante un campo magnético. Las lentes de un microscopio electrónico son electroimanes potentes localizados en la pared de la columna que rodea el centro de la columna al vacío. La fuerza de los imanes está controlada por la corriente suministrada que a su vez es determinada por la posición de los diferentes botones de la consola. Entre la fuente de electrones y la muestra se colocan lentes condensadores que se encargan de enfocar el rayo de electrones sobre la muestra, la propia muestra se sostiene sobre una pequeña rejilla de metal delgado 3 mm de diámetro que se introduce con pinzas en un soporte para la rejilla, el cual se introduce en la parte media de la columna del microscopio de modo que la rejilla se mantenga perpendicular al haz de electrones. La imagen suministrada por la lente objetivo se amplifica unas 100 veces, pero a diferencia del microscopio de luz los detalles presentes en esta imagen son suficientes para amplificarlo unas 10000 veces más lo que permite apreciar con la vista la información contenida. Modificando la corriente aplicada a las diferentes lentes del microscopio se puede variar la amplificación desde casi 1000 hasta 250000 veces, el margen que el observador ve es resultado de los electrones que pasan a través de la muestra enfocados sobre una pantalla localizada en la parte inferior de la columna. Los electrones que golpean la pantalla excitan un recubrimiento de cristales fluorescentes que emiten su propia luz visible percibida por el ojo como una imagen de la muestra. Puesto que el material insoluble de las células consta de átomos de número atómico relativamente bajo como carbono, oxigeno e hidrogeno el material biológico posee muy poca capacidad intrínseca para dispersar electrones para lograr un buen contraste se confiere densidad atómica a la muestra fijando y tiñendo el tejido con soluciones de metales pesados. Estos metales penetran en las estructuras de las células y forman complejos selectivamente con diferentes partes de los organelos, las partes de células con mayor concentración de átomos metálicos permiten el paso de menor número de electrones que participara’n en la formación de la imagen bajo la acción de las lentes, cuanto menor sea el número de electrones enfocados sobre un punto determinado de la pantalla por unidad de tiempo más oscura será la pantalla en dicho punto en tanto que cuanto mayor sea el número de electrones más brillante será el punto. La imagen se puede fotografiar desplazando la pantalla hacia fuera de la trayectoria de los electrones y permitiendo que estos incidan sobre una placa fotográfica colocada en posición

15

debajo de la pantalla. Puesto que la emulsión fotográfica es directamente sensible a los electrones casi igual que a la luz se puede registrar sobre la película una imagen de la muestra. Figura 3.

Figura No 3 Microscopio Electrónico de Transmisión

3. OBSERVACIÓN Y COMPARACIÓN DE MUESTRAS BIOLÓGICAS EN

MICROSCOPIA ÓPTICA DE ALTA RESOLUCIÓN Y MICROSCOPIA

ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN

Se realizara el montaje de placas y rejillas con muestras Biológicas y se procederá a realizar un análisis de la Morfología y Ultraestructura en tejido vegetal y animal a) Observación de Muestras de tejido Animal Consistentes en Biopsias Renales

Humanas, Tejidos Hepático y Cerebro de Ratas. En ellas se podrá Observar las Diferentes Organelas y los detalles de la Ultraestructura celular.

16

b) Observación de Muestras de tejido Vegetal de plantas vasculares. Se observaran los cloroplastos, las Membranas tilacoidales y detalles de la Ultraestructura celular

17

PRACTICA 3

RECUENTO DE LEUCOCITOS

INTRODUCCIÓN El recuento de leucocitos es un procedimiento de conteo directo de células que se realiza con el Hemocitómetro o cámara de NEUBAUER. Este es un instrumento que permite estimar la concentración de células su principal aplicación en la estimación de poblaciones celulares en un cultivo por ejemplo, así mismo la cuantificación de partículas en un volumen determinado. La siguiente practica tiene una utilidad clínica como es la determinación de las proporciones relativas de los distintos tipos de leucocitos llamada recuento diferencial de leucocitos proporciona información que puede tener importancia diagnostica. Sin embargo para llegar a un diagnostico es importante saber si él numero total de leucocitos es normal Los valores para individuos normales se expresan en la tabla

CIFRA NORMAL l

Al momento de nacimiento 18000 x mm3 promedio

12 horas 22800 x mm3 promedio

24 horas 18900 x mm3 promedio

1 mes 10800 x mm3 promedio

1 año 11400 x mm3 promedio

12 años 8000 x mm3 promedio

21 años 7500 x mm3 promedio

OBJETIVOS 1. Conocer un método de conteo de células a través de la Cámara de Neubauer 2. Adquirir destreza en el manejo instrumental y estar en capacidad cuantificar

células en un volumen determinado

MATERIALES

Pipeta para recuento de glóbulos blancos

Microscopio Óptico

18

Cámara de recuento globular: Se emplea la cámara con cuadriculado

perfeccionado de Neubauer. El área del cuadriculado mide 9 mm2. El cuadro

central se emplea para contar los hematíes y las plaquetas, y los cuadros de los ángulos, que miden cada uno 1 mm

2 para contar los leucocitos.

REACTIVOS

Se utiliza el diluyente de turk que disuelve ó lisa los eritrocitos para que no interfieran en el recuento de leucocitos.

Ácido acético glacial (3%) 2.0 mL

Azul de metileno o violeta de genciana en solución acuosa 1.0 mL

Agua destilada c.s.p. 100 mL

PROCEDIMIENTO - La Pipeta para recuento de glóbulos blancos: Tienen una porción capilar

dividida en 10 partes que miden el volumen de la muestra de sangre. La graduación quinta y décima están marcadas como 0.5 y 1 respectivamente. A demás tiene un bulbo que se extiende desde la marca 1 hasta la marca11. La ampolla de mezclar tiene una bolita blanca que ayuda a la homogenización de la dilución; el volumen de la ampolla es de 20 veces el del tubo hasta la marca 0.5 y 10 veces hasta la marca 1.

Se aspira con cuidado sangre hasta la marca 0.5 EXACTAMENTE. Limpiar la sangre adherida a la parte externa de la pipeta para no contaminar el diluyente.

- Aspirar líquido diluyente hasta la marca 11 EXACTAMENTE, evitando la formación de burbujas.

- Sujetando la pipeta entre los dedos pulgar y medio se agita hasta llegar al

agitador de pipetas donde se someten a vibración por 3 minutos. Elimine las tres primeras gotas (contenido del capilar) ya que se va a contar las células de la dilución del bulbo.

- Llene las dos cámaras del hemocitómetro. Enfoque con lente de 10X condensador bajo. Se cuentan los leucocitos de cada uno de los cuadrados secundarios de los cuatro más grandes de las esquinas, (cada cuadrado grande tiene 16 cuadritos pequeños), teniendo cuidado de no repetir ninguna célula. Esta ultima recomendación puede seguirse sí se utiliza la metodología

de contar en LL cada cuadrito sin olvidar que no se puede contar dos veces ninguna células pero que tampoco puede dejarse de contar ninguna. Por lo

19

tanto sólo se cuentan las células que toquen las líneas divididas de la izquierda y arriba, excepto en la primera fila.

- La suma de los leucocitos encontrados da el número de ellos por 1mm

2. Por lo

tanto es necesario multiplicar por 10 para obtener el dato para 1mm3, de sangre

diluida. Luego se multiplica por la dilución para hallar el número de células en 1mm

3 de sangre sin diluir. La formula es la siguiente:

Número de leucocitos/mm3 =

contados grandes cuadros de Número

10 x dilución x contadas células de Número

Lo anterior, rutinariamente se simplifica multiplicando por cincuenta si se ha contado una sola cámara (cuatro cuadros grandes = 64 cuadritos pequeños) ó multiplicando por 25 si se ha contado de corrido las dos cámara, es decir 8 cuadros grandes. Ejemplo: Se han contado 120 células en una sola retícula, es decir, cuatro cuadros grandes, luego:

60004

1020120

xx Leucocitos x mm

3

se han contado 240 células en las dos retículas, es decir, ocho cuadros grandes, luego:

60008

1020120

xx Leucocitos x mm

3

En general se recomienda hacer los recuentos en cuadros grandes, es decir, montar ambas retículas e da la cámara, contar por separado, realizar el cálculo por separado y luego promediar los resultados. El promedio solo se acepta si la diferencia no excede de 300 células; si los datos son muy diferentes, se debe repetir.

Si el recuento de leucocitos es inferior a 2500mm3 se debe repetir el recuento

llenando con sangre la pipeta hasta 1 y luego diluimos en el reactivo hasta la marca 11, la dilución queda 1/10 lo que debe tenerse en cuenta para hacer el cálculo del recuento. (Se multiplica por 250 ó 125n según se halla contado 4 u 8 cuadros grandes.

20

El líquido diluyente para contar glóbulos blancos produce hemólisis en todos los glóbulos rojos no nucleados. Los normoblastos no son destruidos y no podrían distinguirse de los leucocitos en la cámara; si el número de células rojas con núcleo es elevado, como sucede en algunas anemias, se debe restar del número total del recuento leucocitario. Esto se hace contando el número de eritrocitos que existen en 100 leucocitos vistos en un extendido coloreado (recuento diferencial de leucocitos) y luego se extraen con una simple regla de tres del número total de leucocitos.

Ejemplo:

El recuento de leucocitos es de 7500 células /mm3 de sangre. Mientras se realizó

un diferencial se observaron 7 normoblastos (esto se informa: 7 por 100 células blancas observadas. Se debe anotar al pie de donde se anota el diferencial, luego:

Si en 100 leucocitos hay 7 normoblastos

¿En 7500 cuantos normoblastos hay?

Quiere decir que debo restar 525 células del recuento de leucocitos y por eso se informa: recuento de leucocitos: 6975 x mm

3.

El reactivo debe filtrarse inmediatamente antes de usarlo. Los recuentos leucocitarios pueden hacerse con sangre capilar o con sangre anticuagulada pero fresca.

21

CAMARA DE NEUBAUER

10X

22

Cuadros grandes primarios que se dividen en cuadros secundarios. (glóbulos y

plaquetas).

En el presente cuadrante, hay 34 leucocitos. Este es uno de solo de los cuatro cuadrantes graduados de la cámara de Neubauer.

23

PRACTICA 4

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LA ACTINA Y MIOSONA DEL MÚSCULO

INTRODUCCIÓN

El Tejido muscular esta constituido por células muy especializadas que se caracterizan por su contractilidad y en menor grado por su conductividad. Son esenciales para el movimiento del cuerpo tanto el esqueleto como de los órganos Ultraestructuralmente se caracterizan por presentar Miofilamentos ; es decir junto a los filamentos delgados de actina se encuentras los filamentos de miosina La contracción muscular es un fenómeno que involucra estas estructuras conformando una unidad funcional llamada sarcomera. En esta practica se pretende visualizar el fenómeno de la contracción y la participación de esas estructuras.

OBJETIVOS 1. El estudiante estará en condiciones de reconocer las características del

músculo estriado y de las células Musculares. 2. Observar el fenómeno de la contracción Muscular y la participación de la

sarcomera en la función muscular

MATERIALES

Fibras de músculo de conejo glicerinadas

ATP 5 mM en Buffer 0.01 M Tris-HCl, pH 7.6 más KCl 0.05 M

CaCl 0.001 M

Placas preparadas de músculos estriados (secciones longitudinales)

Microscopio de contraste de fase

Portaobjetos y cubreobjetos

PROCEDIMIENTO Obtenga una placa preparada de células de músculo estriado. Dibuje la estructura de una célula individual y presta atención particular a las estriaciones Mida la distancia entre las bandas sucesivas del músculo e indique esto en el dibujo.

24

Compare la imagen vista en el microscópico de Luz. Tome una fibra pequeña del músculo de conejo glicerinada y colóquela en una placa, Ponga un cubreobjetos suavemente encima de la fibra del músculo y examine con un microscopio de contraste de fase. Mida la distancia entre las bandas y compare la distancia encontrada en la placa preparada. Suavemente retire el cubreobjetos (use una segunda fibra) y agrega una gota de ATP y una gota de CaCl. Inmediatamente observe las células a través del microscopio. Una vez más mida la distancia entre las bandas. Optativo Para observar la contracción muscular, cuidadosamente agregue el ATP y Ca++ al borde de la placa, que se difunda de bajo del cubreobjetos. Usted también puede cronometrar el proceso de la contracción con un cronómetro. Finalmente, las variaciones en la concentración del ion así como pueden agregarse iones alternativos a otras fibras del músculo para probar los efectos de iones en la contracción del músculo.

CAPITULO II

CULTIVO DE MICROORGANISMOS

En la naturaleza, los microorganismos se encuentran formando parte de poblaciones mixtas de una gran variedad de tipos diferentes. Sin embargo, el

desarrollo de la Microbiología se ha conseguido mediante el estudio de especies aisladas, crecidas en medios desprovistos de cualquier otra forma de vida contaminante. Al igual que los demás seres vivos, los microbianos necesitan nutrientes apropiados así como condiciones ambientales favorables. Se han

desarrollado los medios de cultivo estos debe contener aquellos nutrientes esenciales para el crecimiento de una determinado especie microbiana Esencialmente todos los medios de cultivo se encuentran en una de estas formas:

caldo ó medio de cultivo y medio sólido. Ya que cualquier medio inmediatamente después de su preparación contiene microorganismos procedentes de los ingredientes, de la superficie de los utensilios y de los materiales de vidrio, debe esterilizarse –es decir, tratarse por el calor u otros métodos– hasta destruir todas las células presentes. De lo contrario, tendríamos una mezcla de microorganismos. Antes de su esterilización, un tubo conteniendo medio de cultivo es tapado generalmente con algodón, o cubierto holgadamente con capuchón de metal o plástico. Así se evita la entrada de nuevos contaminantes, a la vez que se permite el libre intercambio de aire o gases. Las siguientes series de ejercidos pretenden familiarizase con las formas más comunes de los medios de cultivo –caldo común y agar nutritivo– y su uso en el cultivo de las bacterias. Al mismo tiempo aprenderá a resembrar asépticamente los cultivos microbianos, así como los métodos de aislar cultivos puros y de contar poblaciones microbianas.

25

PRACTICA 5

CULTIVO DE MICROORGANISMOS EN MEDIOS SÓLIDOS Y LIQUIDOS

INTRODUCCIÓN Las Técnicas de cultivo son procedimientos mediante el cual se promueve el crecimiento de Microorganismos al proporcionarles las condiciones apropiadas respecto a Nutrientes pH temperatura, luz, presión Osmótica , Oxigeno y otros factores: Los microorganismos son una herramienta indispensable en los estudios de Biología Celular a través de ellos se ha descifrado gran parte del metabolismo de los seres vivos, por ésta razón el manejo, uso y cuidada de los cultivos significa un valioso aporte en la formación de los Biólogos.

OBJETIVOS 1. Se creara destrezas en el estudiante en el cultivo y manejo de cepas

bacterianas y diferentes cultivos in vitro. 2. el estudiante aprenderá a reconocer los diferentes patrones de crecimiento de

los microorganismos

MATERIALES

Cajas de Petri

Tubos de ensayo

Agar Nutritivo

Caldo Nutritivo

Azas Bacteriológicas

Mechero

PROCEDIMIENTO Para sembrar un cultivo bacteriano en un medio estéril, un cierto número de

células –el inóculo– se transfieren (se inoculan)al medio con precauciones especiales para conservar la pureza del cultivo. Como se transfiere un gran número de microorganismos, no es necesario sacudir el asa de cultivo.

26

En el procedimiento de la inoculación el asa de cultivo o aguja de siembra, debe calentarse al rojo sobre la llama inmediatamente antes y después de hacer la transferencia. Este flameado destruye cualquier forma de vida sobre la superficie de la aguja o el asa. Se mantiene la aguja hacia abajo sobre la llama, para calentar la totalidad de la aguja y parte inferior del mango. Durante la siembra, se mantiene el tubo en la mano izquierda y se sostiene el tapón o capuchón entre los dedos de la mano derecha. Precaución: no debe depositarse nunca un tapón. Mantener el tubo los más cerca posible de la horizontal durante la siembra. Las bocas de los tubos de donde tomamos los cultivos y las de aquellos donde van a ser transferidos, deben también flamearse antes y después de que la aguja sea introducida y sacada. Además de destruir cualquier organismo del borde del tubo, el flameado tiene a crear corrientes de convección hacia fuera, decreciendo así el riesgo de contaminación. Ya que la mayor parte del trabajo del bacteriólogo se efectúa con cultivos puros, debemos subrayar la importancia de las técnicas utilizadas para la inoculación y dominarlas desde el comienzo del curso. Después de inoculado, un cultivo bacteriano es conservado o inoculado en un lugar apropiado para el crecimiento. En nuestro caso, «crecimiento» significa el desarrollo de una población de células a partir de una o pocas células. La masa de las células hijas llega a ser visible a simple vista, bien como una capacidad –

enturbiamiento– en medio líquido o como una población aislada –una colonia– en medio sólido. El aspecto del crecimiento ofrece un medio para diferenciar especies microbianas.

1. CULTIVO EN MEDIO LIQUIDO Una manera sencilla de obtener bacterias es hacerlas crecer en medio líquido, en un tubo de ensayo. Existe una gran variedad de fórmulas según la bacteria que se desee hacer crecer. Sin embargo, todos los medios líquidos deben proporcionar las condiciones ambientales físicas y químicas adecuadas y los nutrientes en solución acuosa. El crecimiento en medio líquido puede manifestarse de diferentes formas:

a) Enturbiamiento: una opacidad más o menos densa.

b) Formación de velo: una pequeña masa de células que flotan en la parte superior del cultivo.

c) Sedimento: un deposito de células que permanece en la parte inferior del cultivo, pero que se pone nuevamente en suspensión si el tubo se sacude suavemente.

27

METODO Tome cuatro tubos de caldo común. 1. Rotule un tubo «control» y déjele sin inocular. Este tubo no debe destaparse. 2. Destape un tubo y añada una pequeña cantidad de polvo u otro material

extraño. Tape el tubo nuevamente. 3. Después de flamear el asa y el tercer tubo de caldo, se inoculan con un cultivo

puro de Escherichia coli. Repita la técnica inoculando el cuarto tubo con cultivo puro de Sarcina lutea.

4. Inocule los cuatro tubos a 30ºC hasta el periodo de laboratorio.

OBSERVACIÓN

Se examinaran los cultivos líquidos para determinar el crecimiento. No agitar los tubos antes de hacer las primeras observaciones para determinar si ha habido formación de velo o de sedimento. La mayoría de las bacterias crecen abundantemente en medio líquido en veinticuatro a cuarenta y ocho horas.

Nota: Algunas células pesadas como las levaduras se sedimentan por completo dejando la parte superior del caldo estéril o casi estéril. Como una precaución de rutina durante las siembras es preciso asegurarse de que el inoculo esta en suspensión. En cuanto se aprenda la técnica correcta para resembrar cultivos debe practicarse hasta efectuarla rápidamente ya que la lentitud en el cerrado de los tubos aumenta grandemente los riesgos de contaminación.

PREGUNTAS 1. ¿Cuándo es necesario utilizar técnicas asépticas para inocular un tubo de

medio líquido?. 2. ¿Por qué el crecimiento de algunos microorganismos origina la formación de un

velo o película? ¿Qué factores ambientales pueden alterar la formación de velo?.

2. CULTIVO EN MEDIO SÓLIDO El agar inclinado es simplemente un tubo de ensayo conteniendo un medio con agar que durante su enfriamiento se colocó inclinado. El contenido de un tubo así tratado se solidifica con una superficie inclinado que se puede inocular fácilmente con una aguja o asa. El agar inclinado constituye un medio adecuado para el

28

cultivo de microorganismos, especialmente de aquellos aeróbios o anaerobios facultativos. Algunas características de los cultivos, como la formación de pigmentos, se observan más fácilmente sobre cultivos inclinados. El método de agar inclinado y otro método para el cultivo de microorganismos

sobre medio sólido, el agar para siembra por picadura, se utilizan corrientemente

para la conservación de stocks de cultivo (ver el apartado titulado «Conservación de cultivos de laboratorio», que se encuentra al final de esta sección del manual). El último método es preferible cuando se necesitan condiciones más anaerobias.

METODO

1. Funda tres tubos de agar nutritivo poniéndolos en agua hirviendo. Déjelos

enfriar en posición inclinada. 2. Cuando el medio esté frío y sólido, inocule la superficie de uno de ellos con

Escherichia coli, utilizando una aguja. Se mueve la aguja suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento serpenteante, desde el fondo hasta la parte superior, teniendo cuidado de no dañar el agar. Inócule un segundo tubo con Sarcina lutea. Utilice un tercer tubo sin inocular, como control.

3. Incube los tubos a 30ºC hasta el próximo periodo de laboratorio.

OBSERVACIÓN Se examinara el crecimiento que se desarrolla en superficie. Debe observarse la manera completamente diferente en que crece E. Coli sobre medio sólido, comparado con el crecimiento del mismo en medio liquido, Visualmente examine las colonias individuales de bacterias y descríbalos según las características siguientes: Tamaño. pequeña, media, o grande, basado en las diferencias relativas entre las colonias vistas más grandes y más pequeñas. Forma y Márgenes. Redondo, regular o irregular. Elevación. Aplastada, convexa o redondeada, umbonate (plano en las márgenes y levantado en el centro - como un huevo frito), craterlike (con centro deprimido). Consistencia. Suave o áspera.

29

Color. Describa el color , con la precisión mejor posible y distinga entre los tipos diferentes de gris o blanco, amarillo, y rojo. Si el pigmento parece difundirse en el medio circundante, en lugar de colorear toda la colonia, es un pigmento agua-soluble. Determine y anote la identidad de sus colonias.

PREGUNTAS 1. ¿Por qué es importante evitar que la aguja se introduzca bajo la superficie del

agar?. 2. ¿Por qué no crecen las bacterias (especialmente las formas móviles) por todo

el medio de agar que contiene 97 por 100 de agua?. 3. Cuando se utilizan cultivos inclinados para estudiar las características del

cultivo, es mejor inocular con una aguja que con una asa. ¿Por qué?.

CAPITULO III

MEMBRANAS CELULARES

Puesto que el contenido de una célula esta rodeado en toda su extensión por la membrana plasmática, toda comunicación entre la célula y el medio extracelular debe ser a través de esta estructura, por un lado debe retener los materiales disueltos dentro de la célula y por otro debe permitir el intercambio necesario de materiales hacia dentro y fuera de las mismas. Un electrolito debe satisfacer dos condiciones para difundir al interior de una célula a través de la membrana plasmática. La sustancia debe estar presente en concentración más elevada fuera de la célula y la membrana debe ser permeable a la sustancia. Una membrana puede ser permeable un soluto determinado: 1) porque el soluto pasa a través de la bicapa de lípidos, 2) porque dicho soluto es capaz de a través un poro acuoso situado en el espesor de la membrana que impide el contacto del soluto con las moléculas lípidas de la bicapa. Consideraremos primero la ruta en la cual una sustancia se disuelve en la bicapa de lípidos para atravesar la membrana. El análisis de esta ruta obliga a considerar la polaridad de un soluto. Una medida de la polaridad (o no polaridad) de una sustancia es su

COEFICIENTE DE PARTICIÓN, o sea la proporción entre su solubilidad en aceite y su solubilidad en agua. Las practicas correspondientes a este capitulo abarcaran los conceptos relacionados con la difusión del agua a través de las membranas, coeficientes de penetración y de partición y su relación con la capacidad movilización de una sustancia a través de un compuesto

31

PRACTICA 6

OSMOSIS

INTRODUCCIÓN Las moléculas de agua se desplazan con mucha mayor rapidez a través de una membrana celular que los iones y pequeños solutos El agua se mueve rápidamente a través de una membrana semipermeable desde una región de baja concentración hasta otra de alta concentración de soluto este

proceso se denomina OSMOSIS y puede demostrarse fácilmente colocando la célula en una solución con una concentración de soluto diferente de la presente en el interior de la propia célula

OBJETIVOS 1. Observar los fenómenos de Osmosis y difusión del agua a través de las

Membranas. de las células vegetales y el fenómeno de turgencia 2. Desarrollar de forma practica los conceptos de Hipotónico Isotónico e

Hipertónico. 3. Observación del os cambios de la presión osmótica intracelular y su efecto en

la apertura delos estomas en las hojas

MATERIALES

Hojas de Tradescantia sp

Hojas de Elodea

Muestra de sangre 3 mililitros

Soluciones de sacarosa que van desde 0.05 M a 0.50 M

Soluciones de cloruro de sodio, cloruro de potasio y nitrato de calcio que van desde 0.05 M a 0.50 M

cuchillas

Placas con depresión

Microscopio

32

PROCEDIMIENTO 1. Ponga 0.5 ml NaCl 0.050 M en el centro de una placa con depresión y

agregue un pedazo pequeño de una hoja de Tradescantia sp. despoje de la hoja la capa epidermal y observe la presencia de los Estomas y sus celulas oclusoras las cuales hacen que se cierren y se abran los estomas

2. .Repita el paso anterior haciendo diferentes montajes con las soluciones de

Sacarosa KCl y NaCl suministradas en las diferentes concentraciones. Observe los cambios presentados en las células oclusoras, Determine cual de las soluciones permite la apertura de los estomas y de explicación del fenómeno .

3. Coloque una hoja de Elodea en una lamina porta objeto y móntela con agua del medio natural observe las paredes celulares los cloroplastos y las vacuolas

4. Repita el paso anterior haciendo diferentes montajes pero con las soluciones de NaCl y KCl suministradas en las diferentes concentraciones . Observe el fenómeno de turgencia y plasmolisis y de explicación de él.

5. Coloque en un portaobjeto una gota de sangre cubra la muestra con una lamina cubre objeto observe los eritrocitos y su forma característica

6. Repita el paso anterior pero adicione una gota de la solución de cloruro de sodio Y KCl en las concentraciones suministradas . Observe los cambios de forma de los eritrocitos y de termine que solución es HIPOTÓNICA ISOTÓNICA e HIPERTONICA explique el fenómeno observado

33

PRACTICA 7

SOLUBILIDAD DE LOS LIPIDOS DE LA MEMBRANA

INTRODUCCIÓN El coeficiente de partición para un compuesto se mide disolviendo la sustancia en aceite y agua por separado mezclando luego los dos solventes inmiscibles con la sustancia disuelta. Y agitándolos, lo que permite que se separen en dos fases y se mida la concentración del soluto en cada fase. El coeficiente de partición es la concentración en aceite divida entre la concentración en agua. La importancia de la liposolubilidad para la permeabilidad se muestra en el cuadro 1 donde se compara la penetración de una serie de alcoholes con coeficiente de partición decreciente a través de la membrana del eritrocito. Otro factor que determina la velocidad de penetración de un compuesto a través de una membrana es su tamaño. Si dos moléculas tienen coeficiente de partición aproximadamente iguales, las moléculas de menor tamaño tienden a penetrar en la bicapa de lípidos de una membrana con mayor rapidez en comparación con la molécula más grande. Moléculas sin carga y muy pequeñas penetran rápidamente a través de las membranas celulares. Por consiguiente las membranas son permeables a moléculas inorgánicas pequeñas como O2, CO2, No y H2O, que parecen deslizarse entre fosfolípidos adyacentes. En contraste moléculas polares más grandes, como azucares, aminoácidos e intermedios fosforilados, muestran poca penetrabilidad en la membrana. Por consiguiente, la bicapa de lípidos de la membrana plasmática suministra una eficaz barrera que evita la difusión de estos metabolitos esenciales hacia el exterior de la célula. Puesto que algunas de estas moléculas (P. e., azucares y aminoácidos) deben entrar las células procedentes del torrente sanguíneo, al parecer no lo hacen por simple difusión. En vez de eso deben disponer de mecanismos especiales para penetrar atraves de la membrana plasmática. Estos mecanismos permiten a una célula controlar el movimiento de sustancias a través de la barrera situada en su superficie.

34

Coeficiente de Participación (x10) Tasa relativa

Alcohol metílico 0.78 0.99

Guicerol etil éter 0.74 0.077

Propilenglicol 0.57 0.087

Glicerol metil éter 0.26 0.043

Etilenglicol 0.049 0.043

Glicerol 0.007 0.00074

Eritritol 0.003 0.000046

Cuadro No 1. Relación entre coeficiente de participación y tasa de penetración de

una sustancia.

OBJETIVOS 1. Deducir a través de la observación los conceptos de Coeficiente de penetración

y coeficiente de partición. 2. Realizar una interpretación de la arquitectura molecular de la membrana y la

reilación con el transporte de sustancias.

MATERIALES Y REACTIVOS

Cuchillas

Placas de dispersión

Cronómetro

Remolacha fresca

Alcoholes: Metanol 22M Etanol 8.5M n-Propanol 3M n-Butanol 1.1M

Amylalcohol 0.38M

PROCEDIMIENTO Las células de la remolacha contienen una concentración alta de anthocianina (pigmento rojo). Cuando se ponen en contacto con un compuesto que disuelve la

35

membrana de la célula, las anthocianinas gotean fuera de esta y producen un color rojo. Corte rodajas delgadas de remolacha y colóquelas en una placa con depresión, observe en el microscopio por el objetivo de menor aumento(4X). Mientras mira el borde del corte de remolacha agregue aproximadamente 1 ml. de cada uno de los alcoholes o mezclas de estos que estén disponibles, hasta que el corte de la remolacha se sumerja; tenga cuidado de que el alcohol no se rebose de la placa ( El alcohol isoamílico tiene un olor fuerte, molesto y los vapores irritan un poco, se requiere una adecuada ventilación para manipularlo) Inmediatamente empiece a cronometrar la disolución de las membranas de las células de remolacha, marque el tiempo en que el color rojo se observa en el alcohol circundante. Repita el anterior procedimiento utilizando diluciones de los alcoholes en agua en las siguientes proporciones: alcohol-agua (1:1) y alcohol-agua (1:4) . Para la dilución de cada alcohol, calcule un coeficiente de penetración, dividiendo el tiempo de aparición del pigmento por la concentración molar del alcohol. Realice un gráfico del coeficiente de penetración contra la miscibilidad relativa del alcohol (conocida como el COEFICIENTE DE DISTRIBUCIÓN O DE PARTICIÓN)

Alcohol Formula Peso Molecular Coeficiente de Partición

Metanol CH3OH 32.04 0.01

Etanol C2H5OH 46.07 0.03

n-Propanol C3H7OH 60.09 0.13

n-Butanol C4H9OH 74.12 0.58

n-Amil-alcohol C5H11OH 88.15 2.00

CAPITULO IV

FRACCIONAMIENTO CELULAR

La mayor parte de las células contienen gran variedad de diferentes tipos de organelos, cuando se pretende estudiar una función particular de las mitocondrias o aislar una enzima particular del complejo de golgi es de suma utilidad poder aislar el organelo relevante en estado puro. El aislamiento de un organelo particular en cantidad apreciable por lo general se logra mediante la técnica de centrifugación diferencial, que depende del principio siguiente: Si se colocan partículas materiales más densas que el medio que las rodea en un campo de centrifugación las de diferente tamaño y forma viajan hacia el fondo del tubo de la centrífuga a diferente velocidad. Primero las células se rompen mediante alguna técnica casi siempre de agitación mecánica en solución isotónica amortiguada, con frecuencia contiene sacarosa utilizando un homogenizador mecánico. A continuación se somete el homogenado a una serie de centrifugaciones secuenciales. La centrifugación a través de un gradiente distribuye el contenido de la fracción en varias capas según la densidad de los componentes. Los organelos celulares aislados mediante centrifugación diferencial retienen sus actividades normales a un nivel notablemente elevado, siempre y cuando no se expongan a condiciones desnaturalizantes durante el aislamiento. Se pueden usar organelos aislados con este procedimiento en sistemas libres de células para estudiar una gran variedad de actividades que ocurren dentro de la célula viviente incluyendo síntesis de proteínas enlazadas a las membranas, transporte de solutos u desarrollo de gradientes iónicos y fosforilación oxidativa.

37

PRACTICA 8

SEPARACION DE CELULAS POR BAJA VELOCIDAD

INTRODUCCIÓN La presente practica pretende involucrar a los estudiantes en el manejo de las técnicas de separación de fracciones celulares por métodos muy sencillos como la centrifugación, lo que les permitirá así mismo identificar las diferentes fracciones celulares en el microscopio de contraste de fase

OBJETIVO 1. Capacitar en el manejo del equipo y las técnicas de centrifugación como

herramienta de gran utilidad en el laboratorio.

MATERIALES Y REACTIVOS

1 pipeta Pasteur

2 tubos para centrifuga

Centrífuga con rotor de ángulo fijo

Microscopio de contraste de fase

Sangre Total

Buffer Fosfato Salino (PBS) + Suero Bovino 0.1% (w/v)

Albúmina (BSA)

PROCEDIMIENTO Coleccione por lo menos 5.0 ml de sangre en un tubo de centrifuga que contiene EDTA como anticoagulante. Mezcle suavemente por inversión. Centrifugue a 2,000 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente, con un rotor de ángulo fijo. Lentamente disminuya la velocidad de centrifugación (no use freno). Después de centrifugar la sangre total debe quedar una capa compacta debajo del menisco del tubo. Esta banda (MNC) de color opalescente contiene las células MONONUCLEARES (LINFOCITOS Y MONOCITOS)y las plaquetas, debajo de esta banda esta el plasma, mientras los eritrocitos y las células polimorfonucleares formarán una banda oscura al fondo del tubo.

38

Mantenga verticalmente el tubo, inserte una pipeta Pasteur en el tubo y recoja la banda MNC (células mononucleares). No coleccione más de 2.5 ml en la pipeta. Transfiera el volumen de la pipeta a un tubo de centrifuga cónico de 15 ml . Enjuague la pipeta con 2.5 ml de PBS y transfiera el lavado al tubo de centrífuga cónico. Lave las células mononucleares en el tubo cónico agregando 5 ml de PBS que contiene 0.1% BSA para un volumen total de 10 ml y mezcle por inversión. Centrifugue a 300 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente. Resuspenda las células mononucleares en 5.0 ml de PBS. Haga una sola cantidad de las células frescas suspendidas Examine la pureza de la separación utilizando un microscopio de contraste de fase.

39

PRACTICA 9

AISLAMIENTO DE LA MITOCONDRIA

INTRODUCCIÓN

La centrifugación como la ultracentrifugación son procesos de separación de fracciones celulares de acuerdo al tamaño de las partículas como al procesos llamados Velocidad de Sedimentación. . Los valores típicos de centrifugación para obtener diferentes fracciones celulares son Baja velocidad 1000 veces la gravedad por 10 minutos Velocidad media 20000 veces la gravedad por 20 minutos Velocidad alta 80000 veces la gravedad por 1 hora Muy alta velocidad 150000 veces la gravedad por 3 horas

OBJETIVOS 1. Capacitar al estudiante en el manejo de las técnicas de fraccionamiento celular

y las aplicaciones en el trabajo de laboratorio 2. Permitir al estudiante la obtención de una organela celular especifica con la

cual pueda desarrollar un análisis estructural y funcional de la misma.

MATERIALES

Hígado fresco de ratón

Sucrosa 0.25 M en 10 mm de Buffer HEPES

pH 7.5 (Buffer de Homogenización)

Sucrosa 0.25 M en 10 mm HEPES

pH 7.5 + 1 mm EDTA (Buffer de Suspensión)

Homogenizador de Teflón

Centrífuga refrigerada

Verde Janus B

Hemocytometro y microscopio

40

PROCEDIMIENTO Sacrifique un ratón que no se ha alimentado por lo menos 24 horas antes del laboratorio, Retire el hígado y péselo. Agregue el hígado en un beaker, por cada gramo de hígado, agregue 9.0 ml de sacarosa 0.25 M en 10 mm Buffer HEPES, pH 7.5. Esto producirá una mezcla al 10%. Agregue la mezcla en tubos de centrifuga y centrifugue a 4,500 xg durante 10 minutos a 4° C. Decante el sobrenadante en los tubos de centrífuga limpios y deseche el pellet (botón). Recentrifugue el sobrenadante a 16,000 xg durante 25 minutos a 4° C. Decante y deseche el sobrenadante. Resuspenda el pellet mitocondrial en 20 ml de sucrosa 0.25 M en 10 mm HEPES. Salte al punto 10. Optativo: si se desean mitocondrias más limpias, resuspenda en 20 ml de sucrosa 0.25 M en 10 mm HEPES + 1 mm EDTA y realice los pasos 8y9. Recentrifugue el pellet suspendido a 16,000 xg durante 25 minutos a 4° C. Decántese y deseche el sobrenadante. Resuspenda el pellet y lave en 20 ml de sucrosa fresca sin EDTA y ponga la suspensión en el baño de un hielo hasta que se requiera su uso extenso. La suspensión permanecerá activa durante aproximadamente 4-6 horas si se guarda en frió. Mezcle solución con unas gotas de Verde Janus con 0.1 ml de suspensión del mitocondrial. Ponga una gota de esta mezcla en un hemocitometro y determine el número de mitocondrias ml. Si hay demasiados mitocondria para contar, haga diluciones seriadas de 1/10 a 1/1000 y recuente. Deben contarse rápidamente las mitocondrias. Ellos no son estables y se descomponen en pocos minutos después de la dilución. Anote el número de mitocondrias/ml ___________

41

PRACTICA 10

RESPIRACION DE LA MITOCONDRIA

INTRODUCCIÓN La mitocondria es el organelo celular donde se desarrolla la respiración celular. Estos organelos pueden ser de diferentes formas pero su estructura básicamente consiste de una membrana interna plegada que contiene la matriz mitocondrial y una membrana externa separada de la membrana interna por el espacio intermembranal. Dentro de la mitocondria se realiza la oxidación de los ácidos grasos y el ciclo de Krebs entre otras vías metabólicas importantes. en su membrana Interna se encuentra los componentes de la cadena respiratoria en donde se lleva acabo reacciones de oxido reducción acopladas al sistema de ATPasas la cual genera la energía necesaria para el funcionamiento celular Esta practica permitirá comprender y observar en un sistema in vitro el funcionamiento de la mitocondria

OBJETIVO 1. Comprender las reacciones de oxido reducción que se llevan a cabo en la

respiración mitocondrial conducentes a la generación del ATP

MATERIALES

Respirómetro Gilson (o Warburg)a 37° C

Suspensión de Mitocondria del Ejercicio 8.4

Ringers Krebs Fosfato (KPR)

Glucosa 10% (w/v)

Acido de Sodio 0.39% (w/v)

Dinitrophenol (DNP) 18.4 mg %(w/v)

Malonato de Sodio 6.64% (w/v)

KOH 10% (w/v)

42

PROCEDIMIENTO

Cuando usted entra en el laboratorio, cheque que las cámaras de referencia del respirómetro Gilson están llenas con la solución apropiada (normalmente formaldehído). Enciende el instrumento y equilibre la temperatura. Utilice catorce tubos de reacción y asegúrese que estén limpios, que no estén partidos, con tapones y aberturas de ventilación. Use una micropipeta y agregue cuidadosamente 0.2 ml de KOH 10% en el centro de cada uno. Es sumamente importante que el KOH no chispee en el tubo de la reacción principal porque este destruye la Mitocndria. Ponga 2.0 ml de KPR en el vaso principal de frascos #1 y #2. Ponga 0.5 ml de KPR en el vaso principal de frascos #3 y #4. Ponga 0.2 ml de KPR en el vaso principal de frascos #5 hasta el #12. Ponga 0.1 ml de KPR en el vaso principal de frascos #13 y #14. Ponga 1.0 ml de suspensión del mitocondrias en los vasos principales de frascos #3 hasta el #14. Agregue 0.5 ml de glucosa al brazo lateral de frascos #3 hasta el #12. Finalmente, agregue lo siguiente a los vasos principales de los frascos indicados:

Tubos

#5 y #6 0.3 ml de glucosa #7 y #8 0.3 ml de ácido de sodio #9 y #10 0.3 ml de DNP #11 y #12 0.3 ml de malonateo de sodio

Corte catorce cuadros de 2 cm de papel del filtro y haga pequeños abanicos de cada uno. Ponga bien los pedazos en el centro. Haciendo esto aumentarán el área de la superficie disponible para la absorción de CO2 por el KOH.

43

Cuidadosamente coloque un retenedor de brazo lateral (o un tubo de abertura cerrada) a los frascos. Coloque los frascos al manómetro y asegure bien. Baje los frascos en el baño de agua. Deje todos los frascos de la reacción 5 minutos a la temperatura de equilibrio. Durante este tiempo, ponga todos los micrómetros a una lectura de 500. Adicione a los volúmenes del brazo lateral a los vasos principales, ensamble e el manómetro dentro del baño de agua e incline los frasco suavemente. TENGA cuidado para no DERRAMAR NINGÚN VOLUMEN POR FUERA DEL CENTRO. Ponga todos los frascos en el baño de agua y cierre todas las válvulas del respirómetro. Éste es el punto cero para sus datos - registre el tiempo. Encienda el motor y ajuste la velocidad para obtener un remolino suave de los volúmenes del frasco. Después de 10 minutos, ajuste el fluido del manómetro en la línea de arranque original volviéndose al micrómetro apropiado. Anote las lecturas del micrómetro para cada uno de los catorce frascos. Repita las lecturas del micrómetro a pequeños 10 intervalos hasta obtener una pendiente estable para el respirómetro. Esto generalmente estará dentro de 40-60 minutos del punto cero. Anote todas las lecturas. Para cada lectura, substraiga el valor original de 500. Promedie las lecturas obtenidas en los frascos #1 y #2 y substraiga este promedio de los promedios de #3/#4, #5/#6, #7/#8, #9/#10, #11/#12 y #13/#14. Grafique el cambio en volumen de gas (el consumo de oxígeno) para cada una de las condiciones de la replica.

Nota: Los tubos 1 y 2 son termobarómetros. Cualquier cambio en el volumen de gas dentro de estos tubos refleja cambios en la temperatura y/o la presión barométrica. Los tubos 3/4 y 5/6 representan todas las condiciones para la Fosforilación Oxidativa (respiración). Los tubos 7/8 son inhibidos por el ácido en el sistema de transporte del electrón. Los tubos 9/10 son inhibidos por la presencia de DNP que efectúa transporte de glucosa así como la entrada del substrato en el sistema de transporte del electrón. El malonato de sodio en los tubos 11/12 es un inhibidor competitivo de la succin deshidrogenasa en el ciclo de Krebs. ETS no detendrá las reacciones, y las reducirá sólo si la concentración de glucosa es más baja que el

44

malonato. Finalmente, los tubos 13/14 representan cualquier reacción endógena de la mitocondria en el aislamiento de sucrosa. Técnicamente, la glucosa no es metabolizada por la mitocondria. Debe ser alterada por enzimas del citoplasma para formar piruvato antes de entrar en la mitocondria. El procedimiento de aislamiento usado en la preparación de las mitocondria es importante. Si las mitocondrias son "purificadas" las medidas no trabajarán. Usando un homogenizador la sucrosa mantendrán bastantes enzimas para que ocurra la glicólisis . El experimento podría ser alterado usando ácido pirúvico en lugar de la glucosa. En el experimento tradicional se utiliza glucosa. Anote las catorce lecturas del manómetro cada 10 minutos durante por lo menos una hora. Promedie cada par de lecturas y substraiga la lectura para 13/14 de cada uno de los promedios para 3/4, 5/6, 7/8, 9/10 y 11/12. Promedie los valores corregidos contra el tiempo, usando para cada uno un promedio de la regresión lineal.

# Tubo/Tiempo 10 20 30 40 50

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

CAPITULO V

ESPECTROFOTOMETRIA La espectroscopía es el estudio de la interacción de la radiación electromagnética con la materia. Las técnicas espectroscópicas han sido ampliamente utilizadas en investigaciones sobre la naturaleza, estructura y reacciones de diversos compuestos. Entre las ventajas de estas técnicas se encuentran el que no degradan las moléculas bajo estudio, además de poder detectar y probar cantidades muy pequeñas de material, la espectrofotometría es una rama de espectroscopía y como técnica de experimentación es usada principalmente para medir la cantidad de luz visible o de luz ultravioleta de varias longitudes de onda absorbidas por una sustancia. En la investigación biológica la espectrofotometría es comúnmente usada para determinar la concentración de una sustancia en solución así como también para obtener su espectro de absorción.

Fotocolorimetría Cuando se hace pasar un haz de luz a través de un medio líquido, la luz que sale después de atravesarlo es menos intensa que la luz que incidió, ésta disminución en intensidad se encuentra directamente relacionada con el número de partículas en suspensión o solución dentro del sistema, por lo que es posible determinar indirectamente su concentración en una muestra. La luz blanca es una mezcla de diferentes colores longitudes de onda, cuando un haz de luz blanca incide sobre una muestra puede suceder: a. Que la muestra absorba de igual modo todas las longitudes de onda,

disminuyendo la intensidad de la luz sin afectar la distribución de color. b. Que la muestra colorida absorba solo ciertas longitudes de onda permitiendo el

paso de las otras, en este caso el resultado será una disminución de la intensidad luminosa y un cambio en la distribución del color.

En ambos casos los fundamentos del análisis del colorimétrico son los mismos ya que para cualquier muestra dada un cambio en la intensidad de la luz transmitida será directamente relacionada con un cambio en la concentración de las partículas en la solución o suspensión.

46

En medio líquido o solvente donde las partículas están dispersas también absorbe la luz de manera característica por lo que es necesario conocer este dato para hacer los ajustes pertinentes durante las mediciones. El grado de transmitancia (T) de una muestra se puede determinar midiendo la intensidad del haz luminoso antes (Io) y después de atravesarla (I) donde: I: Es la luz transmitida, y la luz incidente es Io T= I/Io Es conveniente expresar el valor de la tranmitancia en forma logarítmica y este valor recibe el nombre de absorbancia (A) o densidad óptica (DO) A= D.O= log 10 1/T En los reportes e A= D.O= log 10 1/T En los reportes experimentales es más común encontrar el término de absorbancia que el de densidad óptica.

47

PRACTICA 11

PREPARACIÓN DE UNA CURVA PATRON

INTRODUCCIÓN Para determinar fotométricamente la concentración de una sustancia de naturaleza química conocida es necesario contar con una curva patrón que es la representación gráfica de la relación que existe entre la absorbancia de diferentes diluciones en la misma sustancia a una longitud de onda determinada correspondiente a su máximo de absorción. La curva patrón se obtiene midiendo la absorbancia de una serie de alicuotas de concentración conocida de una determinada sustancia a una longitud de onda fija. Una vez que los datos se han graficado es posible determinar la concentración de una muestra de la misma sustancia midiendo solamente su absorbancia.

OBJETIVOS 1. Capacitar al estudiante en le Manejo del espectrofotometro y sus aplicaciones

en el trabajo de laboratorio. 2. Proporcionar a los estudiantes los conceptos físicos y químicos que permiten a

la espectrofotometria ser una herramienta de análisis en el laboratorio.

MATERIALES Solución madre KMnO4 Tubos de ensayo Gradillas

PROCEDIMIENTO Empiece preparando una solución Patrón de KMnO4 que tenga 100 ppm de manganeso así: 250 ml KMnO4 100 ppm (100mg/Lt) 100 mg/Lt 0,250 Lt = mg Mn =25 mg Mn 1g / 1000

48

A partir de esta solución madre de 100 ppm de Mn y utilizando agua destilada prepare cuatro soluciones de 2, 4, 8, 10 ppm en un volumen de 25 ml utilice balones aforados y mantenga las soluciones en la oscuridad. Que formula aplica para encontrar las concentraciones a preparar? Utilice la tabla siguiente

Concentración Vol. de la solución madre

Vol. Final Absorbancia

2

4

8

10

Muestra problema

Encienda el Espectrofotómetro y ponga una longitud de onda de 526 nm. Use el tubo #1 de las diluciones anteriores como un blanco y ajuste el Espectrofotómetro para 0 y 100% T. Lea la Absorbancia (o convierta y lea la trasmitancía) de cada uno de las soluciones de los tubos 2-8 y complete la tabla siguiente: Trace que un diagrama del valor de la absorbancia contra la concentración de KMno4 concentración conocida de KMnO4 debe ser el eje de x, mientras los absorbancia deben ser el eje de y. Trace la pendiente computada e intercepte la regresión lineal como una línea recta que recubre su gráfico. La ecuación para una línea recta es y = mx + b, donde m es la pendiente y b el intercepto.

Nota: La densidad óptica de Mn a 526 nm es directamente proporcional a la intensidad de formación de color en solución (La ley de Beer-Lambert).

49

PRACTICA 12

DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMETRICA DE PROTEINAS EN

MATERIALES BIOLÓGICOS

INTRODUCCIÓN

Se han reportado varios métodos para cuantificar proteínas por métodos espectrofotométricos: El Método de Biuret se basa en que los enlaces peptídicos en la proteína forman

con el Cu+2

en medio alcalino una coloración entre azul y púrpura. El método es bastante específico pero no es muy sensible, se requieren cantidades entre 1 mg a 10 mg de proteína, en la muestra para dar una lectura. Pero es conveniente por su sencillez para muestras cuya concentración protéica esté en el rango de sensibilidad del método. El Método de Lowry se basa como el anterior, en la formación de complejos

cúpricos pero la coloración es intensificada con el reactivo de Folín - ciocalteau que a demás reacciona con residuos de tirosina y triptófano presentes en la proteína. La coloración resultante es entonces más intensa por lo cual la sensibilidad del método es incrementada. La sensibilidad entre 10 mg y 200 mg de proteína. El método de Warburg – Christian está basado en la absorvancia relativa de proteínas y ácidos nucléicos a 280nm y 260nm. Los dos primeros métodos son los más usados.

OBJETIVO 1. Preparar una curva patrón de calibración para proteínas y determinar la

concentración de una muestra problema por el método de Biuret.

MATERIALES Y REACTIVOS

Tubos de ensayo

Gradillas

Espectrofotómetro

50

Patrón de proteínas. Seroalbúmina bovina 3.0mg/mL (fracción de sigma)

Reactivo de Biuret. (250mL).

Heparina

Muestra de Suero sanguíneo

Preparación de Albúmina Agregue 0.9g de albúmina (a 300mL de H2O. Agite suavemente y deje varias horas o toda la noche a 4ºC, luego mezcle suavemente por inversión y almacene a 4ºC (Solución 1).

Preparación de reactivo de Biuret Disuelva 6.0g. de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado en 500mL de H2O. Añada 1.5g. de CuSO4 5 H2O. Agregue lentamente con agitación 300mL de NaOH al 10% (libre de CO2) diluya a 1 litro con H2O. El reactivo es estable y puede guardarse para experimentos sucesivos. Descártelo cuando aparezca un precipitado rojo o negro.

Prepare l a solución 0.3 mg/mL de proteína a partir de la solución 1. Disponga 8 tubos de 18 x 150 mm como se muestra en la tabla siguiente.

REACTIVO TUBO NÚMERO

ML 1 2 3 4 5 6 7 8

Albúmina 3mg/mL (mls)

0.2 0.4 0.7 1.0 2.0 3.

H2O (mL) 3.0 2.8 2.6 2.3 2.0 1.0 0 2.0

Reactivo de

Biuret (mL) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0

Agite para conseguir un buen mezclado y Deje los tubos a temperatura ambiente por 30 minutos luego mida la absorbancia a 540 nm. Calibre el instrumento con agua. El color es estable por cerca de dos horas pero luego disminuye lentamente con el tiempo.

Corrija las absorbancias de los tubos 2 - 7 con la del blanco (tubo No 1).

51

Obtenga el Suero sanguíneo a partir de una muestra de sangre de uno de sus

compañeros previamente Heparinizada (Muestra Problema Tubo No 8) Realice diluciones de la muestra Problema y obtenga la concentración por extrapolación. 1. ¿Qué ventajas presenta cada método y cuales son las limitantes principales? 2. Anote los complejos formados entre los grupos peptídicos y el reactivo de

Biuret. 3. ¿Podría determinar la concentración de aminoácidos en una muestra por la

reacción de Biuret?. Explique. 4. ¿Qué importancia práctica tiene la determinación de proteínas en tejidos

biológicos?

52

PRACTICA 13

EFECTOS DE LA TEMPERATURA Y El pH EN LA ACTIVIDAD DE LAS

ENZIMAS

INTRODUCCIÓN Las enzimas son catalizadores notablemente eficaces. Los catalizadores empleados por los químicos en el laboratorio como calor han sido platino y magnesio metálico por lo general aceleran la reacción 100 a 1000 veces en relación con la velocidad no catalizada. Por lo contrario las enzimas incrementan típicamente la velocidad de una reacción 1 millón a 1 trillón de veces 10

12.

Todavía más notable es que esto se logra a temperaturas y pH sumamente bajos presentes en la célula, además a diferencia de los catalizadores inorgánicos empleados por los químicos la mayor parte de las enzimas son muy específicas en relación con los reactantes a los que pueden unirse y la reacción que catalizan. Existen factores que influyen fuertemente en la cinética enzimática son pH y temperatura del medio de incubación. Los cambios de temperatura modifican la actividad de las enzimas a temperaturas más bajas la velocidad de una reacción se eleva con los incrementos de temperatura debido al aumento de energía de los reactantes. a temperaturas más altas este aspecto positivo se contrarresta por la desnaturalización de la enzima.

OBJETIVOS 1. Promover en los estudiantes la destreza en el uso de los equipos y capacidad

de análisis en las practicas a realizar 2. Mostrar a los estudiantes el efecto de la temperatura y el pH en la cinética

enzimatica

MATERIALES

Extracto de la enzima

DOPA 8 mM a pH 6.6

Incubadoras o baño de Baño Maria ajustados a 10, 15, 20, 25, 30, 35 y 40° C

Espectrofotómetro con tubos

Cronómetro

Tubos de ensayo

53

DOPA 8 mm en buffer citrate ajustado a valores de pH de 3.6, 4.2, 4.8, 5.4, 6.0, 6.6, 7.2, 7.8.

1. EFECTOS DE LA TEMPERATURA EN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS

PROCEDIMIENTO Prepare una serie de tubos de ensayo, cada uno conteniendo 2.5 ml de Buffer DOPA 8 mM a pH = 6.6. coloque el tubo sobre hielo o ajuste el baño maría a las siguientes temperaturas: 10, 15, 20, 25, 30, 35 y 40° C, Agregue 0.5 ml de un extracto de la enzima apropiadamente diluida (para producir 10 micromoles de dopachrome en 3-5 minutos) a cada uno de una segunda serie de tubos. Ponga a cada uno en los baños a la temperatura correspondiente. Deje todos los tubos 5 minutos en las diferentes temperaturas. No mezcle los tubos. Ajuste el espectrofotómetro a 475 nm. Tome el tubo que contiene la enzima, vierta la enzima (0.5 ml a 10° C) en el tubo que contiene el DOPA ( 2.5 ml a 10° C) y empiece cronometrando la reacción, mezcle completamente. Anote el tiempo que la reacción alcanza el punto final equivalente a la conversión de 10 micromoles de substrato. Repita el paso 3 para cada uno de las temperaturas de la lista, complete la siguiente tabla y anote los datos.

Temperatura ° C tiempo (minutos) Micromoles de

dopachrome

velocidad

(micromoles/minuto)

10 10

15 10

20 10

25 10

30 10

35 10

40 10

54

2. EFECTOS DEL PH EN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES

PROCEDIMIENTO Prepare una serie de tubos de ensayo cada uno conteniendo 2.5 ml de DOPA 8 mm, ajustados a los valores de pH siguientes: 3.6, 4.2, 4.8, 5.4, 6.0, 6.6, 7.2, y 7.8 Empiece con el tubo que contiene DOPA @ pH 3.6, agregue 0.5 ml del extracto de la enzima diluido como el que convertirá 10 micromoles de DOPA en 3-5 minutos como en el Ejercicio 5.3. Comience cronometrando la reacción, mezcle por inversión y mida en el spectrophotometro. Anote el tiempo para la conversión de 10 micromoles de DOPA. Repita Paso 2 para cada uno de los valores del pH indicados. Complete la tabla siguiente:

pH Tiempo(Minutos) Micromoles de

Dopacrome

Velocidad

(Micromoles /min)

3.6

4.2

4.8

5.4

6.0

6.6

7.2

7.8

Grafique pH (Eje X ) versus Velocidad (Eje Y)

CAPITULO VI

ACIDOS NUCLEICOS Y DIVISIÓN CELULAR

PRACTICA 13

AISLAMIENTO DE DNA

INTRODUCCION Durante las practicas de la Biología Celular, es interesante, conocer una de las fascinantes moléculas biológicas, en la cual esta escrita toda la historia, el origen y el mecanismo de acción del material genético de cualquier organismo viviente: El ADN. Esta llamada, la molécula de la vida tiene encriptada una gran cantidad de información que de manera jerárquica, direcciona todo el ambiente celular. El ADN, tiene entonces la responsabilidad de ¨dirigir¨ la replicación, la transcripción, la traducción, la recombinación y la posibilidad de la variabilidad genética. Así mismo, tiene la información para que la célula se divida, interactue con otras células de su entorno, y hasta para su desaparición, ya que también lleva encriptado un mecanismo de apoptosis (muerte celular programada). En la presente practica, se pretende que el estudiante aprenda mediante un protocolo sencillo, el aislamiento de esta molecula, y conozca algunas propiedades quimicas de la misma.

OBJETIVOS 1. Se reforzara en el estudiante los conocimientos acerca de la molecula de la

vida: el ADN. 2. Se entrenara al estudiante al aislamiento del ADN 3. Se crearan destrezas en el estudiante para la manipulacion del ADN, de los

reactivos y equipos utilizados en el procedimiento de aislamiento

57

MATERIALES Y REACTIVOS

Agua desionizada

MgCl2 (5 mM)

Tris-HCl (pH 7.5, 10 mM)

Sucrosa

Triton X-100

Na-EDTA (1M)

NaCl (6M)

NaOH

Perclorato de sodio

SDS (20%)

Isopropanol

Buffer TE (pH 7.5)

Material Fungible:

Tips adaptables

Tubos eppendorff nuevos y estériles de 1.5 mls.

Pipetas pasteur

Jeringas esteriles

Tubos para toma de muestra de sangre con EDTA (Becton Dickson/Tapa morada) de 10 mls

Tubos para centrifuga Corning de 15 mls nuevos y estériles

Para la preparación de los Buffer I y II:

Frascos estériles de vidrio de capacidad de 100 ml y 500, ml.

Pipetas de vidrio de 10 ml, 5 y 1 ml.

Probetas de vidrio de 1000 ml, 500 ml, 100 ml

Equipos:

Microcentrifuga

Centrifuga (Hasta 4000 RPM a temperatura ambiente)

Vortex

Incubadora a 37° C

58

PROCEDIMIENTO

Lea primero cuidadosamente la guia, y elabore un diagrama de flujo, el cual deberá entregar al final del Laboratorio. Se tomaran muestras de sangre con las jeringas estériles de los estudiantes para que por grupos aíslen una muestra de ADN. El estudiante procederá al aislamiento del ADN, siguiendo los siguientes pasos: a) Tomar 0.5 ml (500 ul) de sangre y se deposita en un tubo eppendorff nuevo. b) Nota: Si la sangre no se va a aislar inmediatamente, es mejor gurdarla en los

tubos con EDTA de tapa morada. c) Se adiciona a este tubo, 1000 ul de Buffer de Lisis I, y se mezcla suavemente

el tubo dando pequeños golpes con el dedo. d) Se centrifuga a 3.500 RPM a temperatura ambiente en una microcentrifuga por

6 minutos. e) Descartar el sobrenadante, por inversion rapida del tubo. f) Resuspender en 60 ul de Buffer de Lisis II, 30 ul de perclorato de sodio y 2 ul

de SDS (20%). Mezclar suavemente con micropipeta. g) Dar un pulso de vortex durante 10 segundos. h) Adicionar 30 ul de NaCl (6M) i) Repita el pulso de vortex durante 15 segundos. j) Centrifugar a 2800 RPM durante 6 minutos. k) Traspasar el sobrenadante a otro tubo eppenforff limpio y nuevo. Adicionar a

este, 100 ul de isopropanol. l) Mezclar por inversion, suave. Observe lo que pasa. Debe observarse un hilo de

apariencia gruesa y viscosa. m) Recoja el ADN con una punta nueva. Lave un poco el ADN con etanol. Para

este proceso, adicione 1 ml de etanol con mucho cuidado. n) Guárdelo en 200 ul de Buffer TE (pH 7.5) precalentado a 70° C. o) Diluir y guardar a 4° C.

BUFFER DE LISIS I: Adicione a 800 ml de agua desionizada, contenida en una probeta de 1000 ml (tambien puede adicionarse agua miliqure o grado molecular), 5 ml de MgCl2 (5 mM), 10 ml de Tris-HCl (pH 7.5, 10 mM), 102,59 gr de sucrosa y mezcle cuidadosamente todos estos reactivos por resuspension con pipeta. Adicione 10 ml de Triton X-100 al 1% y posteriormente, se lleva hasta a 1 Litro.

59

Alicuote en volúmenes pequeños Rotule cada frasco con el nombre de la persona que preparo la solución, la fecha de preparación, enumere cada frasco (esto con el fin de saber la cantidad disponible para cada grupo de trabajo) Almacenar en frasco oscuro y a 4° C.

BUFFER DE LISIS II: Adicione 800 ml de agua desionizada, contenida en una probeta de 1000 ml (tambien puede adicionarse agua miliqure o grado molecular), 24 ml de Na-EDTA (1M) y 12.4 ml de NaCl (6M). Calibrar la solución a un pH de 8.0 con NaOH. Para este procedimiento, caliente la solución a 50oC. Lleve el volumen hasta 1 Litro. Alicuote en volúmenes pequeños. Rotule cada frasco con el nombre de la persona que preparo la solución, la fecha de preparación, enumere cada frasco (esto con el fin de saber la cantidad disponible para cada grupo de trabajo) Almacenar a temperatura ambiente

60

PRACTICA 15

MODELAMIENTO DE MOLECULAS BIOLÓGICAS

INTRODUCCION Durante las ultimas décadas, los investigadores de todo el mundo, se han dedicado a la tarea ardua del entendimiento de los mecanismos biológicos que determinan todas las actividades de los seres vivientes. En este proceso, se han dilucidado interesantes interrogantes acerca de la Replicación, la transcripción, la traducción, y la regulación de los genes, entre todos los muchos procesos, además de las estructuras de los genes eucariotes y procariotes. Para el abordaje del entendimiento de estos mecanismos, se han usado diversas estrategias tales como el cultivo In vitro, la tecnología del DNA-recombinante, la PCR (amplificación de gene), la secuencia y la clonación genética, entre otros. Para su entendimiento, se han realizado además diferentes tipos de modelamientos, desde los de figuras tridimensionales hasta los virtuales hechos en computadores. Todos ellos han propiciado un mayor entendimiento de las propiedades que subyacen en las moléculas de DNA, y sus interacciones con proteínas, cofactores, iones y otras sustancias interactuantes. Esto también ha permitido el entendimiento de los procesos anormales que suceden cuando el DNA es alterado y conlleva a estados patológicos o enfermedades.

OBJETIVOS 1. Reforzar en el estudiante la estructura del DNA y los procesos biológicos

funcionales encriptados en ella. 2. Motivar al estudiante al modelamiento de los mecanismos moleculares y

estructurales del DNA 3. Estimular al estudiante la creatividad para elaborar modelos biológicos. 4. Estimular el pensamiento espacial del estudiante y la visión tridimensional de

las estructuras y los procesos biológicos.

61

MATERIALES El estudiante podrá usar cualquier tipo de material que le permita el modelo estructural y funcional que le corresponda. Podrá usar materiales como:

Alambre

Madera

Plástico

Icopor

Maquinarias eléctricas pequeñas

Cables

Cordeles

Bisturí

Pegantes

Colores o colorantes, etc.

PROCEDIMIENTO El estudiante elegirá uno de los 5 temas propuestos:

a) Replicación del DNA b) Transcripción del DNA c) Traducción del DNA d) Gen Procariota e) Gen Eucariota

El estudiante conformara un grupo de 5 personas para elaborar su modelo Los estudiantes presentaran un informe escrito detallado de la elaboración de su modelo: Materiales usados, modo de identificación de los componentes de las estructuras, Los estudiantes presentaran una sustentación de su modelo para su evaluación ante el profesor de la materia.

62

PRACTICA 16

MITOSIS

INTRODUCCION

El ciclo celular es uno de los fascinantes procesos que llevan a la división celular y a la generación de dos nuevas células, nuevos organismos genéticamente idénticos a su progenitor. Se produce en cualquier tipo de célula eucariote, ya sea diploide o haploide Algunas células no realizan mitosis y permanecen en un estado interfásico pero otras la realizan frecuentemente (células embrionarias, células de zona de crecimiento y células de tejido sujetas a desgaste). Estas, que integran la mayor parte de los tejidos de un organismo sufren un proceso de renovación debido a la continua multiplicación y muerte celular. La división celular se observa en un proceso llamado MITOSIS, durante el cual, la célula madre se divide en dos. Este proceso consiste en la duplicación de los cromosomas y la distribución equitativo de este material genético en las células hijas. Este proceso de división celular se lleva a cabo mediante mecanismos precisos, los cuales ocurren dentro de una fases llamadas fase G1, S, G2 y M (Mitosis). En cada fase suceden de manera general los siguientes acontecimientos: Fase G1: En esta fase, se sensan los factores nutricionales y ambientales para seguir el curso del ciclo celular. Fase S: La célula duplica su DNA Fase G2: En esta fase se sensa nuevamente el ciclo celular, en esta se sensa si los cromosomas tienen el tamaño adecuado, si el huso mitótico esta listo, y si los factores nutricionales y ambientales siguen favorables para continuar con la siguiente etapa del ciclo celular. Fase de Mitosis: En esta fase la célula pasan por diferentes etapas: Profase, Metafase, Anafase, Telofase, en donde los cromosomas se condensan con sus homólogos, se alinean en el plano ecuatorial, se separan y se dirigen hacia los polos celulares para formar dos nuevos núcleos y luego dividir el citoplasma en una etapa final muy brve llamada citocinesis.

63

Profase: En esta, la cromatina se condensa para formar los cromosomas y los dos centriolos migran a polos opuestos organizando un sistema de microtubulos (Aparato Mitotico), para permitir la migración de los cromosomas. El Aparato Mitotico esta constituido por:

Centriolos: Están rodeados por el centrosoma. A medida que cada centriolo migra produce otro y cuando llega al polo se ven dos.

Asteres: Conjunto de microtubulos cortos que se extienden desde cada centriolo.

Huso Acromatico: Tiene forma ovoide y formado por muchos microtubulos sin ramificaciones.

Cada cromosoma esta constituido por dos cromatidas unidas por el centromero. L a envoltura nuclear se desorganiza y sus fragmentos no se distinguen del retículo endoplasmatico. Desaparece el nucleolo.

Prometafase: Los cromosomas Los cromosomas condensados migran hacia la placa ecuatorial del huso acromatico.

Metafase: Los cromosomas se alinean en el plano ecuatorial, y cada uno esta unido por su centromero a una fibra del huso acromatico.

Anafase: Las dos cromatidas de cada cromosoma se separan por fisión del centromero y se dirigen hacia polos opuestos. El movimiento de los cromosomas hijos hacia los polos se debe a un acortamiento de las fibras cromosomicas y se alargan las fibras interzonales.

Telofase: El huso mitotico y los asteres se desorganizan. Alrededor de cada grupo cromosomico se organiza una envoltura nuclear a partir del retículo endoplasmatico y de la envoltura original. Los cromosomas se dispersan y retoman el aspecto de cromatina que tenían antes de inciciarse la división. Los nucleolos reaparecen a partir de sus organizadores nucleolares.

OBJETIVOS 1. Enfatizar en el estudiante los conceptos de los mecanismos de la división

celular. 2. Distinguir las diferentes etapas de la fase M del ciclo celular. 3. Adquirir destreza en el montaje de tejidos vegetales meristematicos que se

encuentran en división celular.

64

MATERIALES

Microscopio

Cuchillas

Papel absorbente

Palillos de madera

Porta y cubre objetos

Mechero de alcohol

Crisol

Bulbo de cebolla (Allium cepa)

Colorante acetorceina (orceina acetica) al 20%

PROCEDIMIENTO Coloque a un bulbo de cebolla fresco a germinar en un recipiente plástico, de manera tal que la parte radical quede inmersa en el agua para permitir que se formen nuevas raíces. Deje durante tres días en un sitio fresco. Observe el montaje del grafico. Corte con una cuchilla, varias raíces que hayan germinado y tengan una longitud de tres milímetros desde el ápice (zona que incluye el meristemo), y se colocan en un vidrio de reloj que contiene el colorante acetorceina al 20%.

65

Con unas pinzas espatuladas se toma el vidrio de reloj que contiene la orceina y las raíces sumergidos, y se somete a calentamiento usando un mechero de alcohol hasta que se produce la salida de vapores. Se deja enfriar un poco (durante 1 minuto aproximadamente). Se repite dos veces más el calentamiento y enfriamiento anterior. Se extrae cada raíz colocándola con unas pinzas en un portaobjetos, se coloca en un porta y se le pone una gota de orceina. Se cubre con un cubreobjetos. Mediante la punta de un palillo de dientes, se presiona suavemente sobre el cubreobjetos en la zona donde se encuentra el meristemo y mediante golpes repetidos se va extendiendo el material radical.

66

Después del barrido hecho, se monta la muestra al microscopio y se observa con un aumento de 40X las diferentes fases mitóticas. Los análisis de los resultados se realizaran de acuerdo a los siguientes: A. Realice el conteo de 10 campos y use el siguiente cuadro para cada uno de sus

análisis:

Fases / Campos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Interfase

Profase

Metafase

Anafase

Telofase

TOTAL

B. Determine para cada campo. Grafique

1. totales células #

diviíón en células #

2. totales células #

fase cada en células #

4. división células #

fase cada en células #

C. Determine para todo el análisis hecho (todos los campos):

campos) los (todos células de total#

división en células de total#

67

68

BIBLIOGRAFIA

Smith y Wood. Biología Molecular y Biotecnología. Editorial Addison-Wesley Iberoamericana, 1988. Maniatis L. et al. Molecular Cloning I & II, Academic Press. 1999. Lewin, B. Genes VI, Oxford University Press. Oxford, New York, 1997 Kendrew, J, The Encyplopedia of Molecular Biology. Blackwell Science, Oxford, 1995 Watson, J.D. La Doble Helice. Biblioteca Cientifica. Salvat, Barcelona, 1987 Ridley, M. 2001. Genoma. Punto de Lectura. Grupo Santillana de Ediciones S.A., 2001 Geneser, Finn. Histologia. Editorial Panamericana. Buenos Aires 1997. 101-122. Junqueira, L.C. y Carneiro, J. Histologia Basica. Salvat Editores. 1998 Gerald, Karp. Biologia Celular. Editorial Sinclair. 1997 Rincón Sánchez, Ana Rosa, Reyes Ortiz, Norberto. Manual de Microscopía Optica. Editada por la Asociación de Químicos del INNSZ. Marquez Guzmán, Judith. Biología Celular. Manual de Practicas. UNAM Lodish.H, Berk,A.,Zipursky S. L., Matsudaria P., Baltimore D.,Darnell J. 2003 Biologia Celular y Molecular . Editorial Panamericana