Biotecnología Ambiental

Obtención de liposomas

Por M en C. Javier Araiza Arvilla.

RESUMEN

Los liposomas al ser estructural y funcionalmente semejantes a las membranas celulares, han sido ampliamente usados en la industria farmacéutica como acarreadores de fármacos de liberación prolongada; y más recientemente se ha tratado de implementar el uso de éstos en la remediación ambiental. En el presente ensayo se obtuvieron liposomas a partir de lecitina de soya, encontrándose una gran variabilidad de tamaños entre las vesículas de cada una de las repeticiones realizadas y entre los observados inmediatamente después de la metodología y los almacenados 5 días después del procedimiento. En dichos liposomas se puede insertar enzima lacasa para la degradación de colorantes textiles en aguas contaminadas por la industria de ese rubro.

INTRODUCCION

Los liposomas fueron descubiertos en 1961 por Alec D. Bangham mientras estudiaba un tipo de biomoléculas (los fosfolípidos) y su relación con la coagulación sanguínea. Desde entonces, se han convertido en herramientas versátiles en Biología, Bioquímica y Medicina. Bangham descubrió que los fosfolipidos en agua forman de manera inmediata esferas cuyas paredes se encuentran organizadas en bicapas debido a que cada molécula tiene un terminal hidrosoluble en tanto el otro es hidrofóbico, es decir se trata de moléculas anfifílicas (Lanio, et al. 2010).

Para comprender las propiedades de las membranas biológicas se han estudiado ampliamente sistemas de membrana artificial. Existen diversas técnicas que utilizan fosfolípidos sintéticos y lípidos extraídos de membranas naturales para preparar liposomas. Según el procedimiento pueden prepararse vesículas unilamelares o multilamelares (vesículas dentro de vesículas) de diversos tamaños. Tanto el entorno externo como el interno del liposoma, puede ser manipulado lo que permite llevar a cabo estudios sobre una serie de propiedades de estas membranas sintéticas entre ellas su capacidad de excluir moléculas, su interacción con las sustancias así como la estabilidad en diversas condiciones. Con los liposomas es más fácil evaluar los diversos parámetros de los sistemas de membrana lo que permite estudiar las diferentes actividades libres de posibles interferencias provocadas por reacciones presentes en las membranas celulares (Devlin, 2004).

Los liposomas han sido estudiados por casi dos décadas con el objetivo de incrementar la especificidad de acción de los fármacos hacia dianas específicas para facilitar la biodisponibilidad de los fármacos a través de membranas biológicas o para proteger al fármaco contra la inactivación de la enzima (Garg, et al. 2010).

La mayoría de los resultados han indican que los liposomas utilizados como vehículo del fármaco ofrecen la posibilidad de una administración selectiva y controlada así como una biodisponibilidad mejorada. Sin embrago su utilidad se ve opacada por una vida propia corta limitada capacidad de carga de fármaco y por la dificultad de esterilización de las preparaciones de los fármacos (Garg, et al. 2010).

El uso de los liposomas como acarreadores de fármacos se ha dirigido a reducir los efectos tóxicos colaterales de las drogas en órganos sensibles, tales como corazón y riñones, y a lograr una direccionalización a tejidos específicos tales como los tumorales. Por otra parte, la inclusión de lípidos catiónicos en la composición liposomal ha potenciado su capacidad para mediar la transfección en la terapia génica. La racionalidad que existe en el empleo de los liposomas en inmunizaciones y en el diseño de vacunas se basa en su capacidad para liberar la molécula antigénica en células específicas del sistema inmunológico y estimular una respuesta inmune (Lanio, et al. 2010).

OBJETIVO

Conocer el mecanismo de obtención de liposomas y explorar la posibilidad de su utilización con enzimas para tratar agua contaminada proveniente de la industria textil.

MATERIAL Y MÉTODOS

Los liposomas como acarreadores de enzimas han sido obtenidos por León et al. (2009), intentando en el presente trabajo la obtención de liposomas portadores de enzima lacasa. Para lograr esto, se realizó por triplicado la preparación de la solución, en la cual; se utilizó como componente de la base de la matriz lipídica, L- α- fosfatidilcolina de cápsulas de lecitina de soya, y colesterol (CH); rehidratando manualmente con cloroformo, se eliminó la fase orgánica por rotaevaporación (Rotavapor Yamato, Water Bath BM 400) a 65°C y se secó a temperatura ambiente durante 24 horas. Se obtuvo un film delgado de fosfolípidos que se hidrató con buffer fosfato pH 7 a 40°C para obtener una suspensión de liposomas. Se llevó a cabo la reducción de tamaño por medio de ultrasonido (sonicador VWR ™ Modelo 150T) durante 20 minutos, en tanto la distribución de tamaño se determinó mediante la observación de la solución lipídica al microscopio óptico (Leika); y después se contrastó con la observación de la mezcla lipídica teñida con Sudán III y observada en las mismas condiciones.

RESULTADOS

Sin teñir

La observación se llevó a cabo a 400 aumentos totales, encontrando aproximadamente 200 vesículas lipídicas por campo.

Muestra 1.

Figura. . Liposomas de la muestra 1 observados al microscopio óptico. Existe una variabilidad en el tamaño de las vesículas lipídicas.

Muestra 2.

Figura. 2. Muestra 2 observada al microscopio óptico; se notan varias capas de la preparación, las vesículas más claras son las del plano y las más de difusas son de las capas inferiores de la preparación.

Muestra 3.

Figura. 3. Liposomas de la muestra 3, observados al mismo aumento que las anteriores (40X), nótese que los de ésta muestra presentan un mayor tamaño y son más abundantes que los de la muestra 1 y 2.

Teñido.

Asimismo, las muestras teñidas fueron observadas a 400 aumentos totales. Encontrándose lo siguiente:

Muestra 1.

Figura 4. Liposomas de la mezcla 1 con colorante (Sudán III) en su interior, el tamaño se encuentra más definido en cada una de las capas de la preparación.

Muestra 2.

Figura. 5. Liposomas observados después de teñir con Sudan III la muestra 2.

Muestra 3.

Figura. 6. Vesículas liposomales de la tercera muestra teñidas con Sudán III.

DISCUSION

Los liposomas, son en esencia protocélulas o células sin organelos, pues están formados al igual que las membranas celulares en mayor porcentaje por fosfolípidos, y dentro de ellos, la fosfatidilcolina al presentar características de gran biodegradabilidad, es uno de los mejores para sintetizar liposomas; por ello, la lecitina de soya fue elegida como la base lipídica para el desarrollo de las vesículas lipídicas en el presente trabajo.

Los liposomas al ser estructuras micro o nanoscópicas consistentes de una o varias capas esferas concéntricas de bicapas fosfolipidicas o lamelares que encierran compartimentos acuosos y poseer el carácter anfifilico de los lípidos que los componen; tienen atributos únicos que los convierten en vehículos adecuados de fármacos tanto hidrofílicos como lipofílicos (Navarro et al., 2008). Además de poder acarrear y conservar en ellos colorantes, enzimas y otras sustancias. Como es el caso de la enzima lacasa utilizada en el tratamiento de aguas contaminadas por colorantes textiles; o el colorante usado para contrastar las vesículas al microscopio.

Para el análisis cualitativo, los liposomas fueron observados a través del microscopio óptico encontrándose una completa heterogeneidad en el tamaño de éstas; en lo relacionado a su forma, las

vesículas son esféricas y elipsoidales. Y un tamaño más o menos homogéneo en cada una de las capas de la preparación observada (Figura 1-6). Lo anterior debido a que la cantidad de colesterol añadido a las tres mezclas fue la misma; pues si hubiese cambiado, la medida hubiera incrementado; porque el porcentaje de colesterol en los liposomas, aumenta el diámetro de las vesículas, debido a la ubicación de colesterol en la porción interna de la capa fosfolipídica provocando una separación entre las moléculas de fosfolípido, aumentando por consiguiente el diámetro de la vesícula (Beltrán et al., 1999).

Además, las vesículas teñidas con Sudán III (Figuras 4- 6), fueron almacenadas por varios días; y muestran un mayor tamaño; lo que puede deberse a que las vesículas se aproximan unas a otras fusionándose, y además de formas esféricas también se observarán vesículas alargadas en las cuales es posible diferenciar los liposomas esféricos que se están fusionando (Beltrán et al., 1999).

CONCLUSION

La heterogeneidad en el tamaño de los liposomas obtenidos fue alta, de acuerdo al análisis cualitativo, las vesículas de la muestra 3 presentaron el mayor volumen de las tres repeticiones; además los liposomas de las mismas muestras mostraron un tamaño más grande en la observación realizada después de un tiempo definido y de ser teñidas con colorante específico para grasas (Sudán III).

BIBLIOGRAFÍA

Beltrán O. C. Escobar M. J. Jiménez F. Barbosa H. Martínez F. 1999. Caracterización de vesículas liposomales. Efecto de la composición fosfolipídica sobre el tamaño de la vesícula. Rev. Colomb. Cienc. Quím. Farm. Vol. 38. Colombia. Pp. 117- 122.

Devlin T. 2004. Bioquímica Aplicaciones Clínicas. Reverté. USA. Pp. 504

Garg, Sheppard, Donnenfeld, Friedlaender. 2010. Tratamientos Antibiótico y Antiinflamatorio en Oftalmología. Panamericana. Argentina. Pp. 68 – 69.

Lanio. M, Luzardo. M, Laborde. R, Sánchez. O, Cruz-Leal. Y, Pazos. F, Tejuca. M,Valle. A, Alonso. M, Fernández. L, Alvarez. C. 2009. Las vesículas liposomales: obtención, propiedades y aplicaciones potenciales en la biomedicina. Revista Cubana de Física. Vol. 26, No. 1, Pp 23 – 30.

León- Joublanc E. Vázquez- Gutierréz B. Ramírez- Esquivel G. Martínez- Hernández J. Iliná A. 2009. Enzimas micolíticas encapsuladas en liposomas como agentes de biocontrol contra Fusarium oxysporum. Congreso Nacional de Biotecnología y Bioingeniería. México. <http://www.smbb.com.mx/congresos%20smbb/acapulco09/TRABAJOS/AREA_II/CII-58.pdf>.

Navarro G. Cabral P. Malanga A. Savio E. 2008. Diseño de liposomas para el transporte de diclofecac sódico. Rev. Colomb. Cienc. Quím. Farm. Vol. 37. Colombia. Pp 212- 223.