Lineas Celulares
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Transcript of Lineas Celulares
UNIVERSIDAD NACIONAL DE HUANCAVELICA
E.A.P. DE ZOOTECNIA
UNIV
ERSI
DAD
NAC
IONA
L DE H
UANCAVELICA - FACULTAD DE CIENCIAS D E IN
GENIERIA
ESTABLECIMIENTO DE LINEAS CELULARES SOMATICAS Y FETALES EN ALPACAS Vicugna pacos
Ing. LEANDRA LANDEO JURADO
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA REPRODUCTIVA
INTRODUCCIÓN
Permiten estudiar y caracterizar los procesos de desarrollo celular.
Criopreservar material genético de especies en peligro de extinciónproducción de embriones transgénicos.
producción de células donantes para Transferencia Nuclear.
LIMITANTES DE LA TRANSFERENCIA NUCLEAR
•Uso células en cultivo primario
•Uso de células inestables
•Desconocimiento del comportamiento celular /pasaje
•Desconocimiento del tipo celular
ESTABLECIMIENTO DE LINEAS CELULARES
MATERIALES Y EQUIPOS UTILIZADOS EN EL LA OBTENCION DE CULTIVOS PRIMARIOS
MATERIALES UTILIZADOS EN EL LA OBTENCION DE LINEAS CELULARES
ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS PRIMARIOS DE CÉLULAS FETALES
Feto de 130 días de gestación Obtención de muestras Obtención de explante
Transferir los explantes Cultivo celularEstufa de cultivo celular5 % CO2
ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS PRIMARIOS DE CÉLULAS SOMATICAS
OBTENCIÓN DE MUESTRA TRANSPORTE DE MUESTRA
CULTIVO POR EXPLANTE OBTENCION DE FIBROBLASTOS5% DE CO2
Evaluación de confluencia celular
Tripsinizacion de células confluentes
ESTABLECIMIENTO DE LINEAS CELULARES SOMATICAS Y FETALES DE ALPACAS
células confluentesPrimer pasaje celular
Evaluación de confluencia celular
Cultivo celular por 74 horas5% CO2
DP=Log (n/no) x 3.33
MEDIO DE CRIOPRESERVACIÓN
10% Dimetil sulfóxido (DMSO)
10% Suero Fetal Bovino (FCS)
10% Sultafo de Gentamicina
70% DMEM
18h a -20° C
DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD POST-DESCONGELACIÓN
% células viables = células viables (sin colorear) X 100 células viables+ células muertas (coloreadas)
50 ul de solución celular
50 ul de trypan azul
Baño Maria 37 ° C10-15 Minutos
%CV= 70 X 100 70+ 40CV=63.6
En el presente trabajo de investigación se evaluaron el % de confluencia, “Doubling de la población” (DP) y la Viabilidad de células post descongelación.
DISTRIBUCIÓN DEL EXPERIMENTO
Yij = μ + Ti + eij
Los componentes del modelo son:
Yij = observaciones (% viabilidad post-descongelación).μ = media general.Ti = efecto del los tratamientos (células somáticas y fetales)eij = error asociado a cada observación.
Las diferencias estadísticas de los experimentos de viabilidad post-descongelación fueron comparados utilizando análisis de varianza (ANVA) después de la transformación arcsen de los datos. Se utilizaron la prueba de Duncan para contrastar la diferencia entre promedios.
ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS PRIMARIOS A PARTIR DE CÉLULAS FETALES
- Feto macho de alpaca
-Cultivo celular a los 4 días de haber establecido el cultivo.
-70 % de adherencia celular.
-Células confluentes a los 7 días de haber establecido el cultivo celular.
-100% de confluencia celular
RESULTADOS:
OBTENCION DE LINEAS CELULARES A PARTIR DE CÉLULAS FETALES
Confluencia a los 3 días de haber establecido el cultivo celular.
CURVA DE CRECIMIENTO CELULAR
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21
N° Pasajes
Célu
las/
ml
Serie1
Figura 3a: Curva de crecimiento de líneas celulares fetales de alpacas.
COMPORTAMIENTO DEL CRECIMIENTO CELULAR
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21
N° Pasajes
Célu
las/
ml
Serie1
Figura 3b: Barras comparativas de división celular en cada pasaje celular de células fetales de alpacas
ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS PRIMARIOS A PARTIR DE CÉLULAS SOMATICAS DE ALPACA ADULTA
-Alpaca macho de 2 años de edad.
-Cultivo celular a los 7 días de haber establecido el cultivo.
-100 % de adherencia celular.
- Células confluentes a los 14 días de haber establecido el cultivo celular.
- 100% de confluencia celular
OBTENCION DE LINEAS CELULARES
CURVA DE CRECIMIENTO CELULAR DE CELULAS SOMATICAS
0100000200000300000400000500000600000700000800000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
N° Pasajes
N° C
élul
as/m
l
Serie1
Figura 5a: Comportamiento de la curva de crecimiento de líneas celulares somáticas.
COMPORTAMIENTO DEL CRECIMIENTO CELULAR EN CELULAS SOMATICAS
0100000200000300000400000500000600000700000800000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
N° pasajes
N° C
élul
as/m
l
Serie1
Figura 5b: Barras comparativas de división celular en cada pasaje celular de células somáticas
DETERMINACION DEL PORCENTAJE DE CONFLUENCIA CELULAR DE CELULAS ADULTAS Y FETALES
Cuadro 2. Porcentaje de confluencia de células somáticas y fetales
TIPO DE TEJIDO
Confluencia% Días
Células Fetales 100 7
Células somáticas 100 14
Líneas fetales 100 3
Líneas somáticas 100 3
COMPORTAMIENTO DE CONFLUENCIA (100%)
02468
10121416
CP. CélulasFetales
CP. Célulassomáticas
Líneas fetales Líneassomáticas
TIPO CELULARTI
EMPO
(DIA
S)
Días
Figura 6. Comportamiento de confluencia en cultivos primarios y líneas celulares de células somáticas y fetales.
DETERMINACION DEL “DOUBLING” DE LA POBLACION (PD)
Cuadro 3 “Doubling” de la población celular de líneas celulares procedentes de células fetales y somáticas
TIPO DE TEJIDO DP (Promedio) N° pasaje Celular
Líneas Fetales 0.41 9
Líneas somáticas 0.16 5
VIABILIDAD POST DESCONGELACION DE LINEAS CELULARES PROCEDENTES DE FETO Y CELULAS ADULTAS
Cuadro 4. Promedio y desviación estándar el porcentaje de viabilidad post descongelación
TIPO DE TEJIDO Viabilidad (promedio) % Desviación estándar
Líneas Fetales 95.1 ±3.47
Líneas somáticas 96.5 ± 3.32
CONCLUSIONES
1.Fue posible establecer líneas celulares de alpacas como base para ensayo de Transferencia Nuclear y Transgénesis.
2.Se obtuvo cultivos primarios de células somáticas y fetales en alpacas a partir de muestras de piel.
3.El % de confluencia de células somáticas fue de 100% a los 14 días de haber establecido el cultivo primario, de igual manera se determinó que las células fetales de alpacas logran 100% de confluencia a los 7 días de establecido el cultivo primario.
4.Se determinó la tasa de división de la población de líneas de fibroblastos procedentes de células adultas con un promedio de 0.16 DP y 0.41 DP para las líneas de fibroblastos fetales.
5.Se evaluó el % de viabilidad post descongelación de líneas de fibroblastos procedentes de células adultas con un promedio de 96.5 y 95.1 de viabilidad post-descongelación para las líneas de fibroblastos fetales. No encontrando diferencias significativas entre las líneas de fibroblastos fetales y somáticas.