UNiVERSIDAD COMPLUTENSEDE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUíMICA Y BIOLOGíA MOLECULAR 1

liiiMIII fl~ U DliiiMII I~ U* 5309838805*

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE

REGULACION A CORTO PLAZO DE LA CARN?UI’TNAPALMITOILTRANSFERASA 1 DE THGADO DE RATA

TESIS DOCTORAL

por

GUILLERMO VELASCO DIEZ

Director: Dr. ManuelGuzmánPastor

Madrid, 1997

ABREVIATURAS

ACBP:ACC:AICAR:AMPK:Ca2~/CMPKII:

eAMP:CAT:COT:CPT-I:CPT-II:db-cAMP:FABP:FAS:HDL:IDPN:L-FABP:MFABP:PICA:PKC:PMA:OA:VLDL:

y calmodulina

Proteínaligantedeésteresde coenzimaAAcetil-CoA carboxilasa5-aminoimidazol-4-carboxiamidaribonucleásidoProteínaquinasaactivadapor 5’-AMPProteínaquinasadependientede Ca2~detipo ItAMP cíclicoCarnitinaacetiltransferasaCarnitinaoctanoiltransferasaCarnitinapalmitoiltransferasa1Carnitinapalmitoiltransterasa11Dibutiril-AMP cíclicoProteínaligante de ácidosgrasosAcido grasosintasaLipoproteinasde altadensidad3,3’-iminodipropionitriloProteínaligantedeácidosgrasos(isoformahepática)Proteínade membranaligante de ácidosgrasosProteínaquinasadependientedeAMP cíclicoProteínaquinasaC4 ~-forbol 12 ~-miristato13 6-acetato(=TPA)Acido okadaicoLipoproteinasde muybajadensidad

ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN

1.1. ASPECTOSGENERALES DEL METABOLISMO HEPÁTICO

1.2. REGULACIÓN DEL METABOLISMO HEPÁTICO DE ÁCIDOS GRASOS

CapturaTráfico intracelularActivaciónSíntesisdenovoEsterificaciónOxidación

Transportede ácidosgrasosa lamitocondria/3-OxidaciónCetogénesisCiclo de losácidostricarboxílicosOxidaciónde ácidosgrasosenperoxisomas

1.3. CARNITINA PALMITOILTRANSFERASA 1

Estructura e isoforniasEstructuraprimaria de la CPT-LfEstructuraprimaria de la CPT-I

HígadoMúsculoesquelético

CorrelaciónestructurafunciónTovologíaenla membranaSitiosdeunióndel sustratoy el malonil-CoA

Regulacióna corto plazoRegulaciónpor malonil-CoA

HígadoMúsculo esqueléticoy corazónCélulas 13

Sensibilidada malonil-CoACambiosconformacionalesy malonil-CoA

Regulaciónindependientede malonil-CoARegulacióna largo plazoCPTs extramitocondriales

1.4. OBJETIVOS Y CONTENIDO

2. RESULTADOSY DISCUSIÓN

2.1. EFECTOS DEL AlT EXTRACELULAR Y DE LOS CAMBIOS EN EL VOLUMENCELULAR SOBRE LA ACTIVIDAD CPT-I

Introducción2.1.1Arecytoskeletal componenLs involvedin thecontrolofhepaticcarnitine

pabnitoyltransferase1.(Biochem.Biphys.Res. Commun.224, 754-759)

2.1.2 Inhibition ofcarnitinepalmitoyltransftraselby hepatocyteswelling(FEBSLett. 344, 239-241)

Discusión

2.2. MECANISMO DE REGULACIÓN A CORTO PLAZO (INDEPENDIENTE DEMALONIL-CoA) DE LA CPT-I

Introducción2.2.1Are cytoskeletalcomponentsinvolvedin the controlofhepaticcarnitine

palmitoyltransferase(Biochem.Biophys.Res. Cominun.224, 754-759

2.2.2 InvolvementofCat/calmodulin-dependentproteinkinaseJI in theactivation ofcarnitinepalmytoiltransferase1 by okadaicacidin rathepacytes.

(Biocliem. J. 321, 211-216)2.2.3Malonyi-CoA-independentacutecontrolofhepaticcarnitine

palmitoyltransferase1 activity. RoleofCa2*/Calmodulindependen1proteinkinaseII andcytoskeIetoncomponents

(J. Biol. Chem.,enrevisión)Discusión

2.3. POSIBLEPAPEL FISIOLÓGICO DE LA REGULACIÓNA CORTOPLAZO(INDEPENDIENTE DE MALONIL-CoA) DE LA CPT-I

Introducción2.3.1 LossofresponseofcarnitinepaImitoyltransferase.1 lo okadaicacid in

transformedhepaticcelis.(Biochem.Pliarmacol.,enrevisión)

2.3.2Control ofhepaticfattyacidoxidationby 5>-AMP-activatedproteinkinaseinvolvesa malonyl-CoA-dependentand a malonyl-CoAindependentmechanism.

(Arcli. Biochem.Biophys. 337, 169-175)

2.3.3Studieson Ihe intracellularlocalizationofacetyl-CoAcarboxilase(Biochem.Biophys.Res. Commun.233,253-257)

Discusión

3. DISCUSIÓNGENERALY CONCLUSIONES

Regulacióna corto plazo de la CPT-IPrincipales proteína quinasas implicadas en el control a corto plazode la CPT-I

z) Ct/CMPKIJu) AMPK

Efectos de otros mediadores

L Introducción

Canindo 1 Introducción

ASPECTOS GENERALES DELMETABOLISMO HEPÁTICO

El hígadojuegaun papelesencialen los me-canismoshomeostáticosy en la distribución desustratosa los distintostejidosdel organismo.Así,el hígado contiene las enzimas necesariasparallevar a cabotanto la biosíntesiscomo la degrada-ción de los lípidos y los hidratosde carbono,es elórganoque lleva acabomayoritariamenteel proce-so de gluconeogénesisy, en muchasespecies,entrelas que se encuentrael hombre, es un órganolipo-génico de extraordinariaimportancia. Desdeelpunto de vista anatómico,el hígado se encuentrasituadoen unaposiciónprivilegiadaparacontrolarla homeostasisde la concentraciónde glucosaen lasangre debido a que la venaporta, antesde bañarel hígado,abarcala mayorpartede la superficiedeabsorcióndel intestino delgado.De estaforma elhígado recibe rápida información acerca de lacantidadde glucosaque se ha obtenidoa partirdela ingesta,con lo que la maquinariametabólicahepáticaretiraráglucosade la sangreo la liberaráal torrente circulatorio paramantenerconstantelaglucemia, procesocrucial para el correctofuncio-namientodel sistemanerviosocentral.Sin embar-go, aunquese conocen las principalesrutas impli-cadasen el metabolismolos hidratosde carbonoy

Hígado

Tejido Adiposo

los lípidos,el destinoexactode la glucosaabsorbi-da es aún tema de debate.Así, durantemuchosaños se mantuvo la ideade que la glucosapasaríadirectamentedesdeel intestinoa la venaporta, dedonde el hígado la capturaría, siendo entoncesfosforilada y utilizada como precursordirecto enlos procesosde biosíntesisde glucógenoy lípidos.Sin embargo,durantelaúltimadécadasehavenidoacumulandounaabundanteevidenciaexperimentalque apoyala existenciade unaruta indirecta, quesupone la transformaciónde la glucosa en frag-mentos C3 (especialmentelactato) antes de serconvertidaen glucógenoy lípidos. La deteccióndeestarutaindirecta,aparentementeineficientey muycostosadesdeel puntode vistaenergético,ha dadoorigen al conceptode la paradoja de la glucosa.La contribuciónrelativade las rutasdirectae indi-rectaen los procesosde biosíntesisde glucógenoylípidos en el hígado está aún por establecer(McGany el aL, 1987; Watford, 1988; Cune ySchulman,1991;Schulmany Landau,1992).

Durante periodosde ayuno,en los cualeselcocienteinsulina/glucagónen la sangrese encuen-tra disminuido, se movilizan las reservastanto deglucógenodel hígadocomo de triacilglicerolesdeltejido adiposo.Estasúltimas dan lugar a glicerol,que sirve como sustratopara la gluconeogénesis,ya ácidosgrasos,que,transportadosvía circulatoria

Glc

Lac ~

AG—

Figura 1. Ciclo de la glucosay los ácidosgrasosy su relación con el ciclo de Cori. Las flechasdiscontinuas indican lasinteraccionesmetabólicasentrelos lípidosy los hidratosde carbono,mientrasquelas flechasgniesasmuestranel ciclo de Cori.Ábrcviauras: Ac-CoA, acetil-CoA; AG, ácidos grasos;CC, cuerposcetónicos; (Mc, glucosa; Pir, piruvato; Lac, lactato; TO,triglicéridos

Mi

Hc S.4---

Pir

‘e9

9

Músculo

Canítulo1 Introducción

en forma de complejoscon la albúmina,son oxi-dados por el hígado y los tejidos extrahepáticos(Sugdenet al., 1989;Eeylot, 1996).En situacionescomoésta, en las que laoxidaciónde ácidosgrasosse encuentraestimulada,parecenunaseriede me-canismosadaptativosqueconducena la supresiónde la utilización y oxidaciónde la glucosa(el cicloglucosa/ácidosgrasos), por lo que los requeri-mientosgluconeogénicosparael mantenimientodela glucemiadisminuyen(Fig 1). Así, la oxidaciónde ácidosgrasosinhibe la fosforilación de la glu-cosa,el flujo glicolítico a nivel de la 6-fosfofructo-1-quinasa,la enzimareguladorade la primerafasede la glicolisis y la oxidación de piruvato por elcomplejode la piruvato deshidrogenasa(Hueel al,1988). Este último efecto permite que se reciclenlos esqueletosde carbono entre la glicolisis y lagluconeogénesis(ciclo de Cori, Fig. 1). La oxida-ción de ácidosgrasosestimulaademásla gluco-neogénesishepática (Sugdenel aL, 1989). Ensuma,la oxidación de las reservaslipídicasjuegaun papel reguladorde granimportanciatanto en la

conservacióncomoen la biosíntesisde la glucosa.En situacionesde ingestacorrecta,unaparte

de los ácidosgrasoshepáticosse desvíahacia larutade esterificaciónen lugardeseroxidados(Fig.2). El control del equilibrio esterifica-ción/oxidaciónde los acil-CoA de cadenalargaesejercidopor factorestalescomoel cocienteinsuli-na/glucagónen el plasmay la disponibillidad rela-tiva de lípidos e hidratos de carbono (Zammit,1984) (Fig.2). Durante los periodosde alimenta-ción correcta,la bajaactividadde la camitina pal-mitoiltransferasa1 (CPT-l) impide que la oxidaciónmitocondrialde ácidosgrasosse verifique a velo-cidades elevadas. Sin embargo, esta restriccióndesapareceen el estadode ayuno,de maneraquese desvíahacia la ~3-oxidaciónunamayorpropor-ción de acil-CoA de cadenalarga(Zammit, 1994).Las demandasenergéticasdel hígado,son así cu-biertas mayoritariamentepor la j3-oxidación, con-tribuyendo de forma minoritaria la glicolisis y laoxidaciónde piruvato. Los ácidosgrasosoxidadospor el hígado son convertidosprincipalmenteen

CC AG-Ab TOHidratosde

Figura2. Interrelacionesentrela síntesisy la oxidaci6ndeácidosgrasosenel hígado.Las flechasdiscontinuasindicanla inhibición que diversosintermediariosdel metabolismodeácidosgrasosejercensobrela ACC y la CPT-l. Las flechaspunteadasindican los lugaresdondeel cocienteinsulina/glucagónejercesusefectos.Abreviaturas:Ac-CoA, acetil-CoA;ACC, acetil-CoA carboxilasa; AO-Ab, complejos ácido graso-albúmina;CC, cuerpos cetónicos; CPT-l, camitinapalmitoiltransferasa1; Gluc, glucagón;ms, insulina;Mal-CoA, malonil-CoA;Pir, piruvato;TG, triglicéridos.

CC t Ins/Gluc (cadenalarga)

carbono

Ins/GIuc

Acetil-.CoA

Pir

1

2

Capitulo 1 Introducción

cuerposcetónicos,quepuedenserutilizadoscomosustratosalternativosa la glucosapor el hígadoylos tejidos periféricos, incluido el cerebro(Zammit, 1984; 1994).

En contrastecon su elevadahomogeneidadmorfológica, una de las característicasmás sor-prendentesde las célulasqueconstituyenel parén-quima hepático(los hepatocitos)es su alta hetero-geneidaden lo que a ultraestructura,característicasmetabólicasy equipamientoenzimáticose refiere(Gumucio, 1989;Jungermann,1992; JungemannyKietzmann, 1996). Dentro de lo que se consideracomo la unidadestructuraly funcional del hígado,esto es, el acino hepático,los hepatocitospuedenser subdivididosen dos subpoblacionescelulares,los hepatocitosperiportales(situadosalrededordelas ramificacionesterminalesde la venapoz-ta, es

Pv

PP

ya que la sangreentraa cadaacino siguiendo elsentidoporta —* cava,de forma que la composi-ción de la sangreva siendo modificadaa medidaque atraviesael acino desdela “entrada” (zonaperiportal)hastala “salida” de éste(zonaperiveno-sa) (Lamers el al., 1989ab; Jungermann,1992).Cadauna de las dossubpoblacionesde hepatocitosposee asimismo una inervación particular(Moorman el aL, 1989; Gardemannel aL, 1992).Además, tanto los hepatocitosperiportales comolos perivenososposeencaracterísticasfenotípicaspropias,ya queaún aisladospor separadoa partirdel hígadoconservansus peculiaridadesmetabóli-casy enzimáticas(Cheny Katz, 1988;Tosh el al,1988; Jungermann, 1992; Jungermann yKietzmann,1996).Así, los hepatocitosperivenososparecenestarmejor capacitadospara llevar a cabo

Figura3. Zonaciónmetabólicadel hígado.Abreviaturas:Ac-CoA, acetil-CoA;CC,cuernoscet\nicos;Glc,glucosa;(Mc6P, glucosa6 fosfato; Gíno,glucógeno;LP, lipoproteinas;PP. zonaperiportal;PV, zonaperivenosa.

decir en la zonaaferentedel hígado)y los hepato-citosperivenosos(situadosalrededorde las ramifi-cacionesterminalesde la venahepática,es decirenla zonaeferentedel higado) (Gumucio, 1989; La-mers et al, 1989ab; Jungermann,1992; Junger-mann y Kietzmann,1996).

Unaprimeraconsecuenciaque surgedel con-cepto de heterogeneidadzonal del hígado es quelas distintas regionesdel hígado poseenuna dife-rente disponibilidad de nutrientes,02 y hormonas,

la capturade aminoácidos(Burger el aL, 1989) yde 2-oxoglutarato(Stoll y Háussinger,1989), labiosíntesisde glutamina (Lindros el al., 1989) yquizá la glicolisis (Cheny Katz, 1988;Wals el al,1988;Moorman el al, 1991;Jungermann,1992)yla lipogénesis(Guzmán y Castro, 1989; Evanselal, 1989, 1990), mientras que los hepatocitosperiportales verifican con mayor eficiencia losprocesosde síntesisde glucógeno(Chen y Katz,1988; Agius el al, 1990), colesterol (Li el al,

Cava

Gle

Ole GP ~

G1no~~7-

C374

r

Ole6PA

LP

CC

CC

LP

Ole

3

Can/tu/o ¡ Introducción

1988) y salesbiliares (Verhoveny Jansen,1989;Ugele el aL, 1991), así como la gluconeogénesis(Chen y Katz, 1988; Tosh el aL, 1988; Jun-gernmann,1992), la oxidación de ácidos grasos(Tosh el aL, 1988; Guzmány Castro, 1989a)y lasíntesisde urea (Háussinger,1990; Takei, 1990)(Fig. 3). Desdeel puntode visía de la paradojadelaglucosa, estaheterogeneidadzonaldel metabo-lismo de hidratos de carbonoha sido explicadadeformaque los hepatocitosperivenososcapturaríany fosforilaríanla glucosa,pasandoseguidamenteala ruta glicolítica hasta generar fragmentosC3,sobretodolactato.A continuación,éstepasarlaa lacirculación sistémica hastaser capturadopor loshepatocitosperiportales,que utilizarían el lactatocomo precursorpara la síntesisde glucosa,glucó-geno y lípidos (McGarry el aL, 1987; Watford,1988). Sin embargo,los datosde los que se dispo-ne en la actualidadsólo apoyan parcialmenteestahipótesis (Watford, 1988; Youn, 1989; Cline ySchulman,1991).

Otra cuestiónimportantees el papelque po-dnajugar en el control del metabolismohepáticoel hinchamientocelular. Aunque los mecanismosbioquímicos a través de los cualeseste controlseríaejercidono se conocencon precisión,exceptoen el casode la enzimaglucógenosintasa(Meijertel aL, 1992), el hinchamientocelular comienza aserconsideradocomo un elementoimportanteen laregulaciónmetabólicade diferentestejidosy espe-cialmentedel hígado(Agius el al., 1991;Háussín-ger el al., 1994; Háussinger,1996), dondedife-rentesrutaspodríanverseafectadaspor esteproce-so.

REGULACIÓN DEL METABOLISMOHEPÁTICO DE ÁCIDOS GRASOS

El hígado utiliza ácidosgrasosde proceden-cia tanto exógena,mayoritariamentede los com-plejos ácido grasoalbúmina presentesen el pías-ma) cono endógena(sintetizadosde novo a partirde acetil-CoA u obtenidosa partir de los depósitosintracelulares de triacilgliceroles). Estos ácidosgrasos podrán entonces ser, bien oxidados(completamentea CO2 o parcialmentea cuerposcetónicos) bien esterificadosa lípidos complejos(principalmentetriacilgliceroles,fosfatidilcolinasyfosfatidiletanolaminas),bien secretadosen formaesterificadacomo glicerolipidosunidosa proteínasde muy bajadensidad(VLDL) o a lipoproteinasdealtadensidad(l-IDL). Todasestasrutassonregula-das de maneracoordinadapor diferentesfactores,de formaquela mayoro menoractividadde algunade ellas repercuteen la actividadde otras.A conti-nuación se repasaránlos puntos de control másimportantesdel metabolismode ácidosgrasos.

Captura

Los ácidosgrasosson capturadosmuy efi-cazmentepor el hígado. Tradicionalmentese haasumidoque los ácidosgrasosatraviesanla mem-branaplasmáticasiguiendoun procesono saturablede difusiónsimple (Spectorel aL, 1965;De Grelley Light, 1980). Estavisión clásica de captura deácidosgrasosestáasimismoapoyadapor experi-mentosmás recientes(Cooperel aL, 1989; Ferra-resi-Filhoel al., 1992). Alternativamente,durantelos últimos altos se ha ido acumulandounaciertaevidenciaque apoya la existenciade un sistemasaturablede transportefacilitado de ácidosgrasos(Stremmel,1989; Stremmelel aL, 1992; Trotter yVoelker, 1994; Glatz y van der Vusse, 1996).Enconcreto,el grupo de Stremmelha identificadounaproteínade membranaligante de ácidosgrasosde40 KDa (MFABP). Aunqueestaproteínase propu-so que pudiera funcionar como intercambiadorNa~/ácidosgrasosde cadenalarga(Stremel,1989;Diedeel aL, 1992;Trottery Voelker, 1994) pareceque su funcionamientopodría sermás bien depen-dientede la existenciade un gradientede protonesque podríagenerarel propio transportede ácidosgrasos al interior del hepatocito(Elsing el al,1996). Se han aislado ademásotras proteínassi-milares a partir de otros tejidos que capturanáci-dosgrasoscongranactividad, talescomo el tejidoadiposo (Schwietermanel al., 1988; Abumrad elaL, 1994; Schaffer y Lodish, 1994), la mucosaintestinal (Stremmel, 1988) y el corazón(Sorrentinoel al., 1988). Estasproteínaspodríanconstituirun primer puntode control de la entradade ácidosgrasosal interior de la célula.La funciónde las diversasproteínasligantes de ácidosgrasosen la membranaplasmáticapodríaser la de actuarcomotransportadoreso quizás,simplementecomoaceptoresde ácidosgrasosquefacilitasenla poste-rior difusión a travésde la membrana(van Nieu-wenhovenel aL, 1996).

Otro puntoimportantede control lo constitui-ría la lipasa sensiblea hormonas(HSL) del tejidoadiposo: los depósitosde triglicéridos del tejidoadipososon, cuantitativamente,los más importan-tes reservoriosde energíadel organismoy, de estamanera, los niveles de ácidos grasos libres enplasmavienenprincipalmentedeterminadospor laactividad de estaenzima, cuya eficacia catalíticaestá sometida a regulación por fosforilación-desfosforilación.

Tráfico intracelular

El tráfico intracelularde ácidosgrasosde ca-denalarga estámediado por proteínasligantes deácidos grasos(FABP). Hastael momento se hanidentificado 9 isoformas distintas en diferentestejidos (van Nieuwenhovenel aL, 1996), entre

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Canilulo 1 Introducción

ellas la isoforma hepática (conocida comoFAEP), cuya expresiónaumentaen presenciadediferentesácidosgrasos(Meunier-Durmontel al.,1996). Por otra partetambién se ha descubiertolaexistenciade unas proteínasligantes de acil-CoA(ACEP) (Gossettel aL, 1996) que podríanestarimplicadas en la regulación de las enzimasqueutilizan acil-CoA, como sustratoo como modula-dor, a travésde la mayoro menor disponibilidadde acil-CoA libre (Faergemany Knudsen,1997).

Activación

La activaciónde ácidosgrasosa sustioéste-res de CoA es un requisito previo a su utilizaciónpor la célula. Esta reacciónes catalizadapor unafamilia de acil-CoA sintetasasque difieren en suespecificidadpor la longitud de cadenadel ácidograso y en su localización subcelular (Zammit,1984;Schulz,1991; Waku, 1992).De estamanerael hígado contieneacil-CoA sintetasasespecíficaspara acil-CoA de cadenacorta, cadenamedia,cadenalarga y de cadenamuy larga. Aunque laacil-CoA sintetasade cadenalargaes inducibleporla dieta (Suzuki el al., 1990; Schoojansel al.,1993), y las acil-CoA sintetasasde cadenacortaymedia son reguladas in vitro por el cocienteATP/ADP (Zammit, 1994).

Síntesisdenovo

La síntesisde novo de ácidosgrasosse en-cuentrareguladaen primer lugarpor la disponibi-lidad de sustrato.Así, el flujo a travésde la glicoli-sis, el suministro de lactato y la conversióndepiruvato en acetil-CoApor el complejode la piru-vato deshidrogenasason factoresde gran impor-tanciaque intervienenen el control de la velocidadde síntesisde ácidosgrasos(Geelen el aL, 1980;Wakil el aL, 1983; Hillgartnereta!, 1995). Ade-más, las dosenzimasimplicadasen la ruta debio-síntesisdenovo de ácidosgrasos,estoes,la acetil-CoA-carboxilasa(ACC) y la ácido grasosintasa(FAS), se encuentransometidasa un estrechocon-trol por diferentestipos de mecanismos(Wakil elal, 1983; Hardie, 1992; Hardie y Carling, 1997).Esto es especialmentecierto para la ACC, enzimaque cataliza la etapalimitante del procesobiosin-tético de los ácidos grasos(Bijíeveld y Geelen,1987; Hardie, 1992). La ACC está sometida adiferentes mecanismosde regulación: alostérica,con el precursorbiosintéticocitrato como principalactivador (Thampy y Wakil, 1988) y el productomalonil-CoA como retroinhibidor (Geelenel al?,1980;Powell el aL, 1985); los acil-CoA de cadenalargasonasimismopotentesinhibidoresalostéricosde la ACC (Wakil el aL, 1983). La ACC se regulaademáspor cambiosen su estadode agregación(Geelenel al., 1980) y por mecanismosde fosfori-

lación-desfosforilación.En generalla activación dela ACC resultade su desfosforilación(SwensonyPorter,1985; Bijíeveld y Geelen,1987;ThampyyWakil, 1988). La proteínaquinasadependientedeAMP (AMPK) pareceser la responsableprincipaldel control de la actividad de la enzimahepática(Carling el al?, 1989; Moore el aL, 1991;Hardie yCarling, 1997). Se han descritodos especiesdeACC en hígado (Thampy, .1989; Bianchi el al.,1990). Se ha sugeridoque la especiede 280 KDaestá probablemente implicada en la sintesis demalonil-CoApara el control de la actividadCPT-l(Bianchiel aL, 1990;Ha el aL, 1996),aunqueesteaspectono estáaúnclarificado(Winz el aL, 1994;Guzmánel aL, 1995). La isoenzimade 265 KDaparecetenerdos isoformasdiferentesque difierenes sucapacidadparaser fosforiladaspor la proteí-na quinasadependientedecAMP (PKA) (Kong elaL, 1990; Winz el aL, 1994). El hígado contieneprincipalmente la isoenzima no fosforilablepor¡‘KA (Kongel aL,1990),lo que escoherentecon laideade que la fosforilación de la ACC hepáticainvivo es llevada a cabo principalmentepor laAMPK (Hardiey Carling, 1997).

Esterificación

La esterificaciónde ácidosgrasosse encuen-tra reguladaen el hígadode forma coordinadaconsu oxidación(Zammit, 1994). Así, las variacionesen el estado nutricional y hormonal del animalpuedenestimular en el hígado la esterificaciónydisminuir la oxidaciónde los ácidosgrasos(comoson los casosde la realimentacióntras el ayuno oel hipotiroidismo) o viceversa(comoocurre en elayuno, la diabeteso el hipertiroidismo).La esteri-ficación de ácidos grasos a triacilgliceroles seencuentrareguladaa niVel de distintas etapasen-zimáticas, destacandola glicerol 3-fosfato-aciltransferasa (regulada por fosforilación-desfosforilación), la fosfatidato fosfohidrolasa(reguladapor fosforilación - desfosforilación,portraslocación citoplasma-retículoendoplásmico ypor ácidosgrasos)y la diacilglicerol acil transfera-sa (posiblemente regulada por fosforilación-desfosforilación)(Tijburg el al, 1989).

Oxidación

En el hígado,los ácidosgrasosde proceden-cia exógenao endógenason convertidosen suscorrespondientesésteresde CoA por las distintasacil-CoAsintetasas(Zammit, 1984; 1994).En casode no ser esterificadosa lípidos complejos, losacil-CoA puedenseroxidadosen las mitocondrias,aunquetambiénpuedenhacerloen los peroxisomas(Osmundsenel al., 1991). Sin embargo,la mem-branamitocondrial interna es impermeablea losacil-CoA de cadena larga, por lo que existe un

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Capítulo 1 Introducción

sistemade transportedependientede camitinaquetranslocalos acil-CoA a la matriz mitocondrial ycuyo papel,crucial en la regulacióndel procesodeoxidaciónde ácidosgrasos,seestudiaen detalle enun apanadoposterior.

Una vez en el interior de la mítocondria,losacil-CoA son escindidosen fragmentosde acetil-CoA a travésde la ruta de la 13-oxidación. Estosrestos C2 pueden ser completamenteoxidados aCO2 y 1-hO a travésde la acción subsecuentedelciclo de los ácidostricarboxílicosy la cadenares-piratoria transportadorade electroneso bien serconvertidosen cuernos cetónicos.En general sepuedeconsiderarque la capacidaddeoxidación deácidosgrasospor el hígado(u otros tejidos) en unasituación fisiopatológica determinadaestácondi-cionada por dos factoresprincipales(Edstrom yGrimby, 1986;Zammit, 1994): la disponibilidaddesustratoy la capacidaddel tejido en cuestiónparaoxidar ácidosgrasos.En lo que al primerfactor serefiere, la velocidadde oxidaciónde ácidosgrasospor el hígadoaumentade forma casi lineal con laconcentraciónde ácidos grasos en el medio, almenos en el rango fisiológico de concentracionesde estossustratos.Así, sueleconsiderarseque lasconcentracionesde ácidosgrasosque se consiguenin vivo no son suficientesparasaturarel sistemaoxidativo de ácidosgrasos(Zammit, 1984). Por loque respectaa la capacidadde oxidaciónde ácidosgrasospodemosconsiderarcuatro procesosen laoxidación de un acil-CoA; el transporteal interiordel orgánulo, la 13-oxidación, la cetogénesis,y elciclo de los ácidos tricarboxilicos. El transporteyla 3-oxidacióntienenlugar tanto en los peroxiso-mas como en las mitocondrias, mientras que lacetogénesisy el ciclo de los ácidos tricarboxílicosse llevan a caboexclusivamenteen el interior delas mitocondrias.

Transporte

Los ácidosgrasosde cadenacorta o mediapuedenpenetrarlibrementeen la mitocondria in-dependientementede carnitinay serposteriormenteactivadosa ésteresde CoA en la matriz mitocon-drial por la acciónde acil-CoA sintetasasespecifi-casde ácidosgrasosde cadenacortay mediadon-de, finalmente,sufrirán el procesode 13-oxidación(Bieber, 1988). Sin embargo,los acil-CoA de ca-dena largason capacesde atravesarsolo la mem-branamitocondrialexterna;parapoderatravesarlamembranamitocondrial internadebenesterificarsecon camitinapara formar un complejoacilcamití-na. Esta reacciónde síntesisdel complejo acilcar-nitina la lleva a cabouna familia de enzimasde-nominadasen su conjunto carnitinaaciltransfera-sas. El hígadode los mamíferoscontienetresacti-vidades carnitina aciltransferasaatendiendoa lalongitud de cadenadel acíl-CoA sustrato(Bieber,

1988): unaactividadcarnitinaaciltransferasaespe-cífica de acil-CoA de cadenacorta (actividadcar-nitinaacetiltransferasa,CAl), unaactividadcami-tina aciltransferasaespecíficade acil-CoA de ca-denaintermedia(actividadcamitina octanoiltrans-ferasa,COT) y una actividadcarnitinaaciltransfe-rasa específica de acil-CoA de cadena larga(carnitina palmitolitransferasa,CPT). Estas tresactividadesenzimáticasse encuentranlocalizadasen las mitocondriasy en los peroxisomasy en elretículo endoplásmico.Sin embargo, existe unaciertaevidenciahoy en día de que las actividadesCOT y CPT sonen realidaddosactividadesde unamismaenzima,que recibeen generalel nombredeCPT y que se estudiaen detalle en un próximoapartado.

/3-oxidación

El conocimientode la 13-oxidaciónde ácidosgrasosha aumentadoen granmedidadurante losúltimos añosdebidoa la caracterizaciónde distin-tas enzimasimplicadasen estaruta y a la descrip-ción de unaserie de defectoshereditariosasocia-dosa ella (Schulz, 1991; Bennet,1994;Middleton,1994; Vockley, 1994; Eaton et aL, 1996).La rutacomprendedos etapasoxidativas (las reaccionescatalizadaspor la acil-CoA deshidrogenasay la L-3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa),por lo que unposiblefactorreguladorpodríaser la relaciónentrelas concentraciones intramitocondriales deNADHINAD (Grunnety Kondrup, 1986; Latipá~el aL, 1986; Eaton el aL, 1994). Aunque existenotra seriede efectoresque puedenactuara distin-tos niveles en la ruta 13-oxidativa (Wang el a!,1991;He el aL, 1992; Bennet, 1994;Eaton el a!,1996), no existen evidenciasdirectas de que lasenzimasde la 13-oxidaciónesténsometidasa regu-lación alostéricao a modificación covalente invivo.

Celogénesis

La formaciónde cuernoscetónicosconstituyeel destino metabólico principal del acetil-CoAproducidopor la 13-oxidaciónde ácidosgrasosenel hígado.Así la contribucióndel ciclo de los áci-dos tricarboxilicos a la utilización de este acetil-CoA es bastantereducida (menos del 10%) ensituacionesen las cualesla disponibilidad de glu-cosaes la adecuaday prácticamentenula en esta-doscatabólicostalescomo el ayuno y la diabetes,en los que los ácidosgrasosoxidadospor el hígadose desvíanprácticamenteen su totalidadhacia lasíntesisde cuerpos cetónicos(McGarry y Foster,1980;Zammit, 1984; Sugdenet aL, 1989). Algu-nosestudioshansugeridola hipótesisde la canali-zación de sustratosentrelas enzimasde la ruta 3-oxidativa y la cetogénica,así como entre la oxida-

6

Capítulo 1 Introducción

ción de piruvato y el ciclo de los ácidostricarboxí-licos. Así, el acetil-CoA producido en la 13-oxidación de ácidosgrasoses desviadode manerapreferencialhacia la ruta cetogénica,mientrasqueel formadopor la piruvato deshidrogenasaes prin-cipalmente utilizado por el ciclo de los ácidostricarboxílicos(Baranyai y Blum, 1989;NorstenyCronholm, 1990; Des Rosiers el aL, 1991). Ac-tualmenteestábien establecidoque la cetogénesishepáticaestácontroladatantoa cortocomo a largoplazo por el estado nutricional y hormonal delanimal (McGarryy Foster, 1980;Zarnmit, 1994).

El primer paso de la formación de cuernoscetónicoses la condensaciónde dos moléculasdeacetil-CoA para generaracetoacetil-CoA,en reac-ción catalizadapor la acetil-CoA acetiltransferasa.La formaciónde acetoacetil-CoAcatalizadapor laacetiltransferasaes inhibida por uno de sus pro-ductos, la CoA libre, que disminuyela afinidaddela enzimapor su sustrato,el acetil-CoA (Zamniit,1994). Éstepodríaconstituirun mecanismopara laregulaciónde la cetogénesisa travésde cambiosenla relación intramitocondrial de [acetil-CoA]/[CoAJ (Wang el aL, 1991).

El acetoacetil-CoAes un importantemetabo-lito implicado en el control del metabolismomito-condrial de ácidosgrasosen hígado.Se ha obser-vado que el acetoacetil-CoAinhibe iii viíro a laacil-CoA deshidrogenasa,la primeraenzimaimpli-cada en la 13-oxidación de ácidosgrasos, y quee¡erceinhibiciónpor productosobrela acetil-CoAacetíltransferasay por sustratosobre la 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) sintasa(Lowe yTubbs, 1985). La HMG-CoA sintasamitocondrialcatalizala síntesisde HMG-CoA para la formaciónde cuerposcetónicosy parecerepresentarla prin-cipal etapa limitante del flujo en la cetogénesisapartir de acetil-CoA(Quantel a!, 1990; 1993). Laactividad de la l-IMG-CoA sintasa mitocondrialestácontroladapor dosmecanismosqueoperandemanera coordinada: (i) modificaciones a cortoplazo de las moléculasde enzimapreexistentesatravés de un proceso de modificación covalente(succinilación ¡ desuccinilación) (Quant el a!,1990; Zammit, 1994); (u) cambiosa largo píazoque afectana los niveles de mRNA que codificapara la enzimay tambiéna la cantidadde proteínainmunorreactiva(Casalsel a!, 1992;Rodríguezela!, 1994).

Ciclo de ¡os ácidosIricarboxiícos

La oxidacióncompletade acetil-CoA.a CO2tiene lugar en la matriz mitocondrialpor las enzi-mas del ciclo de los ácidostricarboxilicos. Comoya se ha mencionadoen el apanadoanterior, lacontribucióndel ciclo de los ácidostricarboxílícosa la utilización del acetil-CoA producidopor la 13-oxidación hepática de ácidos grasoses práctica-

mentenula comparadacon la utilización de dichoacetil-CoA para la síntesisde cuerposcetónicos.Los mecanismosde control del ciclo son muyvariadose incluyen modulaciónalostérica,controlpor cargaenergéticay potencialredox, regulaciónpor iones Ca

2~y control por volumen mitocondrial.El lector interesadopuedeconsultaruna serie derevisiones publicadas en los últimos años(Halestrap, 1989; McCormack y Denton, 1990;McCormacketa!, 1990; Brown, 1992; Halestrap,1994).

Oxidaci¿nde ácidosgrasosenperoxisomas

Los peroxisomas poseenun equipamientoenzimáticoparticular para13-oxidarácidosgrasos,ácidosdicarboxílicos, prostaglandinas,ácidos 513-colestanóícoshidroxilados y diversos análogosdeácidos grasos(Osmundsenel al?, 1991; Osumi,1993; Reddy y Mannaerts, 1994; Singh, 1997).Comparadacon la 13-oxidaciónmitocondrial, la ¡3-oxidaciónen peroxisomasposeeuna especificidadde sustratomásamplia, siendoespecialmenteacti-va con ácidos grasos de cadena muy larga(Osmundsenel a!, 1991; Reddy y Mannaerts,1994). De estamanera,los peroxisomasacortaríanla cadenahidrocarbonadadelos ácidosgrasosque,debidoa su longitud, dificilmente podríanseroxi-dadosen la mitocondria(Osmundsenel a!, 1991;Pourfarzamy Barlett, 1992). Los productos de laoxidación en los peroxisomasson transferidosalcitoplasmay posteriormentea la matriz mitocon-drial, dondecontinúansu metabolización(Bieber,1988; Osmundsenel a!, 1991; Mannaertsy vanVeldhoven, 1993). La contribución de la ¡3-oxidaciónen peroxisomasa la oxidación total deácidosgrasosde cadenalarga en hepatocitosde-pendetanto de la concentracióncomo de la longi-tud de cadenade los ácidos grasos utilizados(Skorin el aL, 1992). En ratasalimentadasoscilaen un rangodesdeel 20 al 35%si se utiliza palmi-tato u oleatocomo sustrato(Rongstad,1991;Guz-mán y Geelen, 1992; Skorin el a!, 1992). La ¡3-

oxidación en peroxisomaspuede ser fácilmenteinducida por la dieta, así como por la administra-ción a largoplazode una seriede agenteshipolipí-démícosy xenobióticos(osmundsenel a!, 1991;Moodyela!, 1992;Reddyy Mannaerts,1994).

CARNITINA PALMITOILTRANSFERASA..I

Como se ha mencionadoanteriormente,losácidosgrasosde cadenalargano puedenatravesarla membranamitocondrial interna. Para poderhacerlo,losacil-CoA procedentesdedichosácidosgrasos debenser transformadosen acilcarnitinasque, finalmente,son transportadasal interior de lamitocondria.Las CPT catalizande forma reversi-

7

Capitulo 1 Introducción

ble la síntesisde complejosacilcarnitinaa partirdeuna moléculade acil-CoA de longitud de cadenaintermediao largay una moléculade camitina.Enlas mitocondriasexisten dosactividadesCPT, quesuelendenominarseCPT-1 y CPT-11, con distintalocalización en la barrera mitocondrial (Murthy yPande, 1987). Así, hoy en día se admite el si-guientemodelode traslocaciónde ácidosgrasosdecadena larga al interior de la mitocondria(McGarryy Brown, 1997): la acil-CoA sintetasadela caracitoplásmicade la membranamitocondrialexternaactivaría un ácido grasode cadenalarga asu respectivoésterde CoA. En estrechocontactocon la acil-CoA sintetasaestaría la CPT-l quemediaría la síntesis de acilcarnitina a partir delacil-CoA y la carnitina. El complejo acilcarnitinadifundiríaa travésdel espaciointermembranahasta

Acil-CoA

dora es la CPT-I (McGany y Brown, 1997). LaCPT-1 es la enzimaque se consideraclave en elproceso de oxidación de ácidosgrasosde cadenalargatanto en hígado(Zammit, 1986)como en lostejidos extrahepáticos(Saggerson,1986), puestoque catalizala principal etapareguladoradel flujoa través de dicha ruta (Drynan el al?, 1996;Spurwayel aL, 1997) A continuaciónabordaremosel estudiode las propiedadesestructuralesy regu-ladorasque presentanlas CPT,haciendo especialincapiéen la CPT-1.

Estructurae Isoformas

Durante bastantetiempo el estudio de laspropiedadescinéticasy reguladorasde la CPT-ltuvo que enfrentarsea tres grandesdificultades:(i)

Acil-CoA

Figurn 4. Traslocaciónde ácidos grasosa la matriz mitocondrial. Abreviaturas:ACS, acil-CoA sintetasa;;AG, ácidograso; Carn, carnitina; MME, membranamitocondrial externa; MMI, membranamitocondrial interna;T, trauslocasadecamitina:acilcarnitina

llegar a la cara externade la membranamitocon-drial interna, o alcanzaríaestaa travésde los pun-tos de contactoentre las dosmembranasmitocon-driales (Kerner y Bieber, 1990) y allí la acciónsucesivade la translocasade carnitina:acilcarnitinay de la CPT-ll permitiría la entradadel resto deacil-CoA en la matriz mitocondrial(Fig. 4) A nivelfisiológico, la CPT de mayor importanciaregula-

La caracterizaciónmolecularde la enzima,princi-palinentedebidoa la creenciaerrónea(pero clási-camenteaceptada)de que la enzimase encontrabalocalizada en la membranamitocondrial interna(Murthy y Pande,1987).(u) La presenciade pero-xisomas en las preparacionesconvencionalesdemitocondrias y la consiguiente contaminacióncruzada con la CPT de peroxisomas,fácilmente

AG

Cam Acil-Cam

Matriz

Cam AciI-Cam¡

CoA-SH

Carn

8

Capitulo 1 introducción

solubilízable(Healy el a!, 1988; Ramsay, 1988).(iii) La solubilizaciónde la proteínaa partir de lasmembranasmitocondriales con la consiguientepérdidade de actividadenzimáticay/o de sensibi-lidad a la inhibición por malonil-CoA (Murthy yPande,1987; Woeltjeel a!, 1987; McGarryel a!,1991). Así, al comienzode la presentedécadahabíauna serie de cuestionesplanteadasy no re-sueltasen torno a la CPT-l talescomo: (i) Si laCPT-l y la CPT-ll eran la mismao diferentespro-teínas.(u) Si existían diferentesisoformasde am-bas enzimasen los distintos tejidos. (iii) Cómo seproducíala interacciónde los inhibidores reversi-bles (comoel malonil-CoA) o irreversibles(comoel tetradecilglicidil-CoA o el etomoxir -CoA) conla CPT-l. Clásicamenteha habidodosescuelasqueproponíanrespuestasdiferentesa estascuestiones.Una de ellas sosteníaque la CPT-l y la CPT-lleran la misma proteína (al menos en un tejidodado),pero que la primeratenía asociadauna su-bunidadreguladoraconla que interaccionaríanlosdiferentesinhibidores que, de estamanera,supri-mirían la actividad del componentecatalítico(Zammit el a!, 1989;Kemer y Bieber, 1990;Oha-niminejay Saggerson,1990ab;Woldegiorgisel a!,1992).Unavisión alternativaproponíaque la CPT-

1 y la CPT-ll eran proteínasdiferentesy que laprimeraposeería,dentro de la misma cadenapoli-peptidica, tanto el centro activo como el sitio re-gulador de la enzima(Woeltje el a!, 1987; De-clercq el al., 1987; Woeltje el a!, 1990ab;Murthyy Pande,1990; McGarry el al, 1991). Finalmentela aplicación de las técnicasde la biología mole-cular ha permitido clarificar este escenariome-diantela determinaciónde las estructurasprimariasde ambasenzimas.

Estructuraprimaria dela CPT-11

Primeramente se caracterizó la estructuraprimariade la CPT-Il. Graciasa que estaproteínapuedesersolubilizadaen forma activamedianteelempleo de detergentesfue posible purificar unaactividad CPT insensiblea malonil-CoA (Woeltjeel a!, 1990a)y finalmentellevar a cabo la clona-ción del cDNA de la CPT-ll de hígado de rata(Woeltje el a!, 1990b) y humano(Finocchiaroel

al., 1991) que, en amboscasos,permitió predecirun tamañode 658 aminoácidosy un peso molecu-lar de 71 KDa parala CPT-l1. Diferentesestudiosmostraronque el mRNA de la CPT-ll era idénticoen tamaño(Woeltjeel a!, 1990a; McGarry el al,1991) e inmunológicamente indistinguible(Kolodziej el a!, 1992) en toda una seriede teji-dos, indicando que en todos ellos se expresabalamismaproteína.

El gen de la CPT-l1 (el único de los genesque codifican para las CPTsquehasido analizadoen profundidadhastael momento)(Verderioel al.,

1995), estácompuestode 5 exones,uno de loscuales es excepcionalmentelargo. En estudiosrealizadoscon los geneshumanoy murino de laCPT-II (Gelb, 1993;Verderioel a!, 1995) se hanlocalizadopotencialeselementosreguladoresen laregión promotoraque podrían incluir: un sitio Sp-1, unasecuenciaconsensoparala uniónde factoresderespuestaa insulinay, finalmente,unasecuenciaque podría ser un sitio de unión de receptoresdehormonasesteroideas/tiroideas.

Esírucluraprimar¡ci de la CPT-i

HígadoLa caracterizaciónde la CPT-l fue bastante

másdificil debidoa dos propiedadesde la enzimaque ya habían sido previamenteobservadas:suestrechaasociacióna la membranamitocondrialexterna y la pérdida de actividad catalítica queexperimentacuandoes separadade su entornonativo (McGarryelal., 1989; Zammiteta!, 1989).La estrategiaque finalmentese empleó fue la detratar mitocondrias de hígado de rata conetomoxir-CoA (que como ya se había señaladoanteriormentees un inhibidor irreversibley especí-fico de la CPT-1) para marcar covalentementedichaenzima.Posteriormentese trataronlas mem-branasmitocondrialescon una mezcla de protea-sas. Así, se pudo obteneru fragmentode CPT-ltodavíamarcadoy que pudo serpurificado a partirde gelesde electroforesisen cantidadessuficientescomo parallevar a cabosu secuenciación(EsserelaL, 1993a).Con estainfonnación,sesecuenciaronoligonucícótidoscon los que se realizóla búsquedadel gen de la CPT-l en una genotecade cDNA dehígadoderata.Finalmente,el clon aisladopermitiópredecir una proteína de 773 aminoácidos(88KDa) que, una vez expresadaen células COS,produjo una inducción de entre 10 y 20 vecesdeuna actividad CPT inhibible por malonil-CoA ysensibleal tratamientocon detergentes(Esserela!, 1993b).La expresiónde estaproteínaen leva-duras (que carecende actividad CPT endógena)confirmó plenamente los resultados anteriores(Brown el a!, 1994; De Vries el al., 1997). Estosexperimentosestablecieronclaramenteque: (i) laCPT-l estáconstituidapor un único polipéptidoenel que residentanto el dominio catalítico como elinhibidor y, (u) que la CPT-[ y la CPT-ll sonpro-teínasdiferentes.A diferenciade lo que ocurreconla CPT-Il, que presentaunasecuenciaseñal en elamino terminal parapoderser transportadaal inte-rior de la mitocondria, la CPT-I al igual que otrasproteínas de la membranamitocondrial externa,carecede esasecuencia(Brown elal., 1994).

A partir del cONA de la CPT-I de hígadoderata fueposibleaislar su equivalenteen unageno-teca de cDNA de hígado humano(Brition el a!,1995).Al igual que ocurríaen el casode la CPT-1l

9

Can¡tu/o 1 introducción

Caractenstica

PesoMolecular1C50parael Malonil-CoA

K,,, parala Carnitina

Cromosomahumano

Expresiónen tejidosHígadoMúsculo esqueléticoCorazónRifiónPulmónBazoIntestinoPáncreasAdiposo(pardo)Adiposo(blanco)OvarioTestículosFibroblastoshumanos

Deficienciahumanadescrita

L-CPT 1 M-CPT 1 CPT II

88 KDa~25 ¡.tM

~30kM1 1q13

(+)+

(+)+

(+)

Sí

88 KDa0.03 ~.tM500 ~iM

22q13.3

(+)(+)

(+)

No

70 KDa

120 MIp32

+

+

+

+

+

++

++

+++

Sí

Tabla 1. CaracterísticasdelasCPTmitocondriales.Los nivelesrelativosdeexpresiónen cadaórganoestánbasadosenanálisispor nor¡hern bicí (y en algunoscasospormarcajecon [H

3] etomoxir-CoA).(+) Solo trazasen comparaciónconla isolbrmaalternativa. (-) Indetectable.Los datosde expresiónen tejidosse refieren a rata exceptoen el caso de lostibroblastos. La Km para la carnitina de la CPT-ll fue determinadatras solubilización de las mitocondriasenoctilglucásidoy portantono debeser comparadadirectamentecon los valoresde CPT-I.

tanto la secuenciaobtenidaa partir del cDNA deCPT-l humanacomo la estructuraprimaria (773aminoácidos)presentaronuna granhomología(82y 88% de identidad,respectivamente)conrespectoa la enzimade rata.

Músculo esqueléticoQue la CPT-l de hígado (L) y músculo(M)

son proteínasdiferentesse sospechabadesdehacíaya tiempo ya que presentabanuna sensibilidadamalonil-CoA muy diferente(lC

50~ 2.7 gM y 003

en hígado y músculoesquelético,respectiva-mente) y valores muy diferentes de Km para lacarnitina (30 pM y 500 pM, respectivamente)(McGarryel al, 1983). Y además,tras su marcajecon inhibidores específicosde la CPT-l ambasproteínasmigrabancon pesosmolecularesaparen-tes distintos(88 KDa (L) y 82 KDa (M) (Woeltjeel al., 1990a;Weis el al., 1994a). La donacióndelgen de CPT-l de músculoesquelético(Yamazakiela!, 1995; Esser el a!, 1996) confirmó que dichotejido presenta,en efecto, una isoforma diferente

de CPT-1 y cuyo pesomolecularera sorprenden-tementede 88 KDa. El hechode que la isoformahepáticay musculartenganmovilidadeselectroforéticas tan diferentes,a pesarde poseer un pesomolecular casi idéntico, se ha sugerido que sedebe,mása la estructuraprimaria de la M-CPT 1que a posibles modificacionespostraduccionalesde lamisma(McGarryy Brown, 1997).Ambas

isoformaspresentanunaamplia distribuciónen diferentes tejidos (McGarry y Brown, 1997)(Tabla 1). La isoforma L-CPT 1 es la principal(oúnica) en hígado,riflón, pulmón, bazo, intestino,ovario y pancreas(tanto en los islotescomo en losacinos),mientrasque la formaM-CPT 1 predominaen músculoesqueléticoy testículos.Especialmenteinteresantees el casodel corazón,dondela isofor-mademúsculose expresamayoritariamenteperodondetambiénhay unapresenciasignificativade la isoforma hepática(Weis et a!, 1994) quepodría dar cuenta de las propiedadescinéticasintermediasque presentanlas preparacionesde

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Canítulo 1 Introducción

corazón(en términos de 1C50 parael malonil-CoAy Km parala camitina)con respectoa las observa-das en hígadoy en músculoesquelético(McGarryeta!, 1983).

Correlaciónestructurafunción

Aunque todavía no se ha determinadolaestructurade ningunade las CPT deforma inequí-voca, sí existen datos aportadospor estudiosdeexpresión en levaduras,por comparaciónde se-cuenciaso por utilización de anticuerposespecífi-cos frente a distintosdominios de estasproteínasque permitenconocer algunosdatos acercade latopologíade estasenzimas.

Tonologlaenla membranaLa CPT-1l se encuentradébilmenteasociada

a la cara interna de la membranamitocondrialinterna y puedeser solubilizada fácilmente en suforma activa(Woeltjeel aL, 1987).En concordan-cia con estaobservación,la CPT-1l no presentaningunasecuenciade aminoácidosindicativa de lapresencia de fragmentos transmembranares(Woeltjeela!, 1990b).

La formade asociacióna la membranaexter-na mitocondrial de la CPT-l parececonsiderable-mente diferente. El hechode que la enzima nopuedasolubilizarseen su forma activamediantelautilización de detergentessuavesya es indicativo

de una fuerte asociacióna la membrana.La se-cuenciadeducidatanto para la isoforma L comoparala M de la CPT-1 dé rata contienedos domi-nios hidrofóbicosentre los aminoácidos53 y 75(HI) y 103 y 122 (H2). Aunquese ha cuestionadoque Hl pudieraserun fragmentotransmembranardebido a la presenciade dosprolinas en las posi-ciones56 y 59 de la secuenciade aminoácidosdela proteína(aminoácidospoco habitualesen estetipo de dominios),diferentesdatosparecenindicarque realmenteadoptaestaestructura.La presenciade 5 aminoácidoscon carga positiva altamenteconservadosen el extremoamino terminal de lasecuenciaHI, junto a la conservaciónde distribu-cionesde cargade un affiinoácido positivo y unonegativoen el extremocarboxiloterminal de dichodominio, soncaracterísticasde proteínasde mem-branaque presentanel amino terminal hacia la caracitoplásmica(Kolodziej y Zammit, 1993). Así, seha propuestoque la CPT-1 tendríados fragmentostransmembranares(Hl y H2) de tal forma quetanto el extremoaminocomo el carboxiloterminalse situaríanhacia la cara citoplásmicade la mem-branamitocondrialexternay queel corto buclede27 aminoácidosqueune Hl y H2, estaríasituadohacia el espacio intermembrana(Fraser el a!,1997) (Fig 5). Dc acuerdocon estahipótesis,unaserie de estudios realizadoscon malonil-CoA yoctanoil-CoAasociadosa agarosa(para imposibi-litar que pudiesenatravesarla membranamitocon-

Figura 5 Topologíade la CPT-I en la memebranamitocondrial externa.En la figura se exponenlas principalescaracterísticasde latopologíade la CPT-l: (i) La proteínatienedos fragmentostransmembranares(Hl y H2); tanto elextremoN comoC terminalde la proteínaestánexpuestosenla caracitosólicade la membranamitocondrialexterna.LasletrasC, A’ yL, indican la localizaciónde los fragmentosfrentealos cualessehandesarrolladoanticuerposespecí-ticos.

-ooc

citoplasma

espaciointermenibrana

L

11

Cadhulo1 Introducción

drial externa) mostrabaque ambos compuestospodianseguir actuandocomo inhibidor y sustratode la CPT-1 respectivamente,indicando que lalocalizaciónde los dominios reguladory catalíticode la CPT-l escitosólica(Fraser,eta!, 1996).

Sitiosde unión del sustratoy del malonilCoAen laCPT-l

Si bien inicialmentese consideróque la inhi-bición de la actividadCPT-l queproduceel malo-nil-CoA podríasercompetitiva, diferentesanálisismostraron que, en gran parte, esa inhibición esalostérica (Cook el a!, 1994). El tratamientodemitocondriasde higadode ratacon diferentespro-teasasproduceunapérdidade sensibilidada malo-nil-CoA de la CPT-l sin que la actividadcatalíticase veaafectada(Frasee/aL,1996;Kashfi y Cook,1992), indicando que existen dos dominios dife-rentes,uno catalítico y otro alostérico,en la enzi-ma. Además,la presenciaen el medio de malonil-CoA duranteel tratamientoconproteasasprevienetanto la desensibilizacióncomo la inactivacióndela enzima(Kashfi y Cook, 1991).Se ha propuesto(ver apartadosiguiente)que la presenciade malo-nil-CoA en el medio puede inducir un cambio deconformación en la CPT-l que favorezcala uniónposteriordel propio malonil-CoAy quequizáhagaa la enzimamenos suceptiblea la acción de lasproteasas(Zammit, 1996).

La diferencia de tamaño existenteentre laCPT-l y la CPT-ll se debefundamentalmentea lapresenciade un extremo amino terminal muchomás largo en la primera. Así, las dos proteínaspresentanunaalta homologíade secuenciaexceptoen los primeros 170 aminoácidosde la CPT-l, enlos que se localizarían los dos fragmentostrans-membranaresque la CPT-ll no posee.Puestoquela diferenciamásdestacableentreambasproteínasestribaen la capacidadde serinhibida por malonil-CoA de la CPT-l pero no de la CPT-1I, esposibleespecularque el dominio de unión para malonil-CoA pudieraresidiren eseextremoamino terminalde la CPT-1, mientrasqueel centroactivo se en-contraríaen el extremocarboxiloterminal comúncon la CPT-ll. Diferentesdatos apoyanestahipó-tesis.Así, la expresiónen levadurasde unaL-CPT1 truncadaa la que faltaban los primeros82 ami-noácidosy que presentauna notabledisminuciónen la sensibilidada malonil-CoA (lC50~80 pM parala proteínatruncaday 5 ¡iM para la nativa)(Browneta!, 1994) indica que el extremoamino terminalpodría estar implicado de alguna manera en laformación del dominio de unión a malonil-CoA.De acuerdocon esto,el tratamientocon proteinasaK de mitocondriasde hígado escindeel extremoamino terminal de la CPT-1 produciendouna pér-dida de sensibilidada malonil-CoA. Sin embargo,cuandola proteinasaK tiene accesotambién a lacara internade la membranamitocondrialexterna,

la pérdida de sensibilidada malonil-CoA de laCPT-I es bastantemásrápida, indicandoqueotrasinteraccionesentre los dominios amino terminal ycarboxiloterminal,entreel dominio Hl y la mem-brana, y/o entre los dominios Hl y H2 podríanestarimplicadasen determinarla sensibilidadde laCPT-1 a malonil-CoA (Fraser el a!, 1997). Elhechode que ambosdominios sean importantesala horade determinarla función de la enzimaseapoyatambiénen la observaciónde que,aunqueeldominio catalíticode la CPT-l pareceresidir en elgran extremocarboxilo terminal de la enzima, larotura del extremo amino terminal por proteinasaK también induce una fuerte disminución de laactividadcatalítica(Fraserel a!, 1997)

Regulacióna cortoplazo

Regulaciónpor malonil-CoA

HipadoEl descubrimientode la inhibición de la

CPT-I por malonil-CoA (McGarry el a!, 1977;Mcúarry el a!, 1978; McGarry y Foster, 1980)atrajo unaenormeatenciónhacia el estudiode laregulaciónde estaenzima. Como se mencionaenel apartadode síntesisde novo de ácidosgrasos,elmalonil-CoA es precisamenteel producto de lareaccióncatalizadapor la ACC, que constituyelaetapa limitante de la síntesis de ácidos grasos(Geelenel a!, 1980; Wakil el aL, 1983). De estamanera,se consigueun control coordinadode lasíntesisy la oxidaciónde ácidosgrasosen el híga-do (McGarry y Foster, 1980; Zammit, 1984).Puestoque los nivelesde malonil-CoA en la célulason dependientesde la actividad ACC, se venafectadosnotablementepor los cambios a cortoplazo que diferentesmecanismosproducensobredicha actividad enzimática(Zammit, 1994). Así,los niveles de malonil-CoA hepáticosse ven afec-tados por alteracionesen el estado hormonal ynutricional del animal (McGarry y Foster, 1980;Zammit, 1984). Especialmentedeterminanteen laactividadACC y en los nivelesde malonil-CoA, ypor tanto en la actividad CPT-l, es el cocienteinsulina/glucagón.Cuandoestecocientees alto, losniveles de malonil-CoA también los son y la acti-vidad CPT-1 está inhibida, y viceversa(Zammit,1994).

Músculo esQueléticoy corazónEl descubrimientode que diferentestejidos

no lipogénicos, como el corazón y el músculoesquelético,tambiéncontienenmalonil-CoA, y quesus niveles oscilan en función del estadonutricio-nal del organismo indicabanque este metabolitotambién podríaestardesempeñandoun importantepapelreguladorenotros tejidos(Saggerson,1986).De hecho, la isoformade CPT-I mayoritariamente

12

Capitulo 1 Introducción

presenteen músculocardiacoy esquelético(M-CPT 1), es mucho mássensiblea la presenciademalonil-CoA que la isoformahepática(Saggerson,1986). La ideade que el malonil-CoA y la CPT-1constituyen un importante punto regulador delmetabolismoenergéticoen músculoesqueléticoyen corazónfue confirmado por el descubrimientode que ambostejidoscontienenACC. La isoformade músculo esqueléticoy corazón es la de 280KDa (ó ACC2) distinta de la de 265 (ó ACCI)mayoritaria en hígado (Thampy, ¡989; Bianchi elal., 1990).Diversosexperimentoshan llevado a laconclusiónde que los niveles de malonil-CoA encorazóndependenprincipalmentede la disponibi-lidad de acetil-CoA citosólico, de forma que elpapel del malonil-CoA seríael de reguladorde laCPT-l más que el de precursorpara la síntesisdeácidosgrasos(Awan y Saggerson,1993; Saddikelal?, 1993; Lopaschukel a!, 1994; Kudo el a!,1995; Ha el a!, 1996; Stanley el a!, 1996). Lasituációnen músculoesqueléticoes menosclarayaún existen datos contradictorioscon respectoalposible papel que el malonil-CoA pudiera estardesempeñandoen estetejido (McGarry y Brown,1997).

Célula 5Un tercertipo celularextrahepáticoen el que

la regulación de la CPT-l mediadapor malonil-CoA parecetenerun papel fisiológico importantees la célula 13 del pancreas.Se ha propuestoquetras un incrementode la concentraciónde glucosaen sangre,este azúcares metabolizadopor la cé-lula 13 a travésde la ruta glicolítica, de tal formaque partedel piruvatoseríadesviadohacia lasínte-sis de malonil-CoA. Este malonil-CoA inhibiría ala CPT-l, lo que provocaríauna acumulacióndeacil-CoAs de cadenalargaen el citoplasmade lacélula ¡3. Se ha propuestoque estosacil-CoA ac-túan estimulandola exocitosisde los gránulosdeinsulina acumuladosen estascélulas(NewgardyMcGarry, 1995;McGarryy Brown, 1997). De estaforma,el malonil-CoA y la CPT-1 podríantambiéndesempeñaruna función esencialen el mecanismoimplicado en la secreciónde insulina.

Sensibilidada malonil-CoA

El malonil-CoA,por si mismo,no solo inhibela actividadCPT-l, sinoque tambiénpodríadeter-minar la sensibilidadde la CI’T-l a la inhibiciónpor malonil-CoA. De estamanera,tanto la prein-cubaciónde hepatocitosintactos con agentesqueincrementanlos niveles intracelularesde malonil-CoA (Guzmány Castro, 1989b) como la exposi-ción de mitocondrias aisladasde hepatocitosaconcentraciones fisiológicas de malonil-CoA(Zammit, 1983) hacenque la CPT-l seamássensi-ble al malonil-CoA en el posteriorensayo.Es más,

se ha observadouna fuerte correlación entre lasensibilidadde la CPT-1 hepáticaa la inhibiciónpor malonil-CoA y la concentraciónde malonil-CoA a la que la enzimaestáexpuestahz vivo antesdel aislamientode las mitocondriasparael ensayoenzimático (Robinson y Zammit, 1982). Estasobservacionessugierenque este fenómenopodríatambiénconstituir la basede un importantemeca-nismo reguladora travésdel cual la respuestade laCPT-l a pequeñoscambiosen la concentracióndemalonil-CoA hepático pudiera verse amplificada(Zammit, 1994).

En cualquiercaso, la importanciafisiológicade este mecanismoestá ampliamenteadmitida, yaque en diferentessituacionesfisiopatológicas lasensibilidadde la CPT-l a malonil-CoA se ve mo-dificada.Así, los cambiosinducidospor la dietayel estadohormonal en el flujo a travésde la rutaoxidativa de los ácidosgrasosestánnormalmenteacompañadospor variacionesparalelasen la acti-vidadespecíficay la sensibilidada malonil-CoA dela CPT-1 de hígadode rata.Porejemploen estadoscetóticos tales como el ayuno (Bremer, 1981),diabetes(Cook y Gamble, 1987; Grantham yZammit, 1988) e hipertiroidismo (Stakkestad yBremer, 1983), la actividadespecíficade la CPT-laumenta,mientrasque la sensibilidadde la enzimaa inhibición por malonil-CoA disminuye. Por elcontrario,en estadoslipogénicostalescomo hipoti-roidismo (Saggersony Carpenter, 1986), reali-mentacióntras el ayuno (Grantham y Zammit,1986)o alimentacióncrónicacon etanol(Guzmánela!, 1987)ocurrelo contrario. La importanciadela sensibilidada malonil-CoA de la CPT-l en elcontrol dela oxidaciónde ácidosgrasosde cadenalargaha sido inequivocamentedemostradaen he-patocitosaislados(Prip-Buusel a!, 1990).

Cambiosconformacionalesy malonil-CoALa posibilidad de que puedanexistir dife-

rentesconformacionesen la CPT-l relacionadascon la unión de malonil-CoA ha venido sugeridapor una serie de observaciones,por ejemplo, lasensibilizacióna malonil-CoA de la CPT-1 induci-da por la preincubaciónen presenciade concentra-ciones fisiológicas de malonil-CoA se mantienecuandolas mitocondriasse incubana 40C (aún enausenciade malonil-CoA) mientasque la incuba-ción de la enzimaduranteunosminutos a 370Creviertecompletamenteestasensibilizacióna ma-lonil-CoA (Zammit, 1983; Zamndt el a!, 1984).Además, la unión de malonil-CoA a la enzimaparece inducir un fuerte cambio conformacionalpuestoque su presenciaprotegea la enzimade laaccióndeproteasas(Kashfiy Cook, 1992).

Se ha propuestoque la CPT-l podríaadoptardiferentesconformacionesen un comportamientoqueha sido sugeridoparaotrasenzimasmonomé-ricas(Ricard el a!, 1974). De estaforma la unión

13

Canítulo1 Introduccián

del malonil-CoA produciríaun cambio conforma-cional que ademásfacilitaría la unión posteriordeotra molécula de malonil-CoA (Fig. 6). El pH(Fafournouxe al., 1987) o la composiciónlipídicade la membrana(Zammit, 1994)podríancontribuirasimismoa determinarla conformaciónde la en-zima en la membranamitocondrial externay portanto, su sensibilidada malonil-CoA.

Regulaciónindependientede malonil-CoA

Durantebastantetiempose consideróque elúnicomecanismode regulacióna corto plazode laactividad CPT-l seria aquel dependientede los

37o~

t

©

agonistas.Por ejemplo, la insulina y el ésterdeforbol 4¡3-forbol 1213-miristato l3ct-acetato(PMA)inhiben la actividadCPT-l, mientrasque el yana-dato, el ácido okadaico y los agentesque incre-mentan los niveles de cAMP tienen el efectoopuesto(Guzmány Geelen,1988;Guzmány Cas-tro, 1990;Guzmány Geelen,1992). En todosestosestudiosse observóuna relación cualitativa entrelos cambiosen la actividadCPT-I y los cambiosenla velocidadde oxidaciónmitocondrial de palmi-tato, confirmando que la CPT-l es una enzimaclaveen el control de la oxidaciónde ácidosgrasosde cadenalargapor mitocondriashepáticas(Tabla2). Es importante resaltarqueel ensayode la acti-

Mal-CoA

40C

M-CoA

Mal-CoA

Figura6. La CPT-l podríasufrir cambios conformacionalesen funciónde la existenciao no demalonil-CoA en elmedio.La CPT-í podríaadoptaral menosdosconformacionesdiferentesen funciónde la presenciademalonil-CoAenelmedio. Abreviaturas: M-CoA, malonil-CoA; It conformaciónrelajada(más activa); T, conformaci\n tensa(menosactiva).

niveles de malonil-CoA que como hemos vistoanteriormentedeterminantanto la actividad catalí-tica de la enzimacomo su sensibilidadal propiomalonil-CoA. Ésto podríaser debidoal hechodeque la modulación a corto plazo de la CPT-l seperdieradurante el proceso de rotura celular yposterior aislamiento de las mitocondrias parallevara cabo el correspondienteensayoenzimátí-co. Sin embargo,la puestaa puntode métodosdedeterminaciónde la actividadCPT lii situ mediantela utilizaciónde célulaspermeabilizadas(Stephensy Harris, 1987; Guzmány Geelen, 1988) (Fig. 7)permitió demostrarque la CPT-I hepáticase hallacontroladaa corto plazo por diferentes tipos de

vidad CPT-I en células permeabilizadasimplicaunanotoria dilución del,contenidodel citoplasmacelularen el medio de ensayoy con ello del malo-nil-CoA presenteen el mismo,por lo quelos cam-bios observadosen la actividadCPT-l no se debe-rían a modificacionesen los niveles de malonil-CoA, sino a otro(s)posible(s)mecanismo(s)impli-cado(s)en la regulacióna corto plazode la CPT-1.Dado quediversosagonistascapacesde modificara corto píazo la actividad CPT-I, como por ejem-plo el glucagón(que incrementalos niveles intra-celularesde cAMP, induciendoasí la activacióndela PKA) mediansu accióna travésde la activaciónde proteínasquinasas,se especulócon la posibili-

M-CoA

Activa

M CeA

14

Introducción

c

1\Permeabilización

e 1\ Homogeneización

1

Permeabilización yensayo

) Ensayo

P-CoA~N. ~ Carnitina

P-CoA

2) Aislamiento de

niitocondrias

Carnitina

~PCoA

3

Ensayo

Figura 7. Esquema de los diferentestipos deensayodeactividadCPT-l. Cuandola actividadCPT-l esdeterminadatrasel aislamientode mitocondrias,(métodoC), las modificacionesque diferentesagonistaspuedeninducir endicha actividadenzimáticase pierden. Por el contrario, la utilización de los métodosde penneabilizacióncon digitonina, directo (A) oindirecto(B), permitenestablecerlos cambiosqueestoscompuestosinducena cortopíazoen la actividadCPT-l.

dad de que la CPT-l pudieraserdirectamentefos-forilada por acción de algunasde estasquinasas(Haranoel al., 1985). Además,el ácido okadaico,un compuestoque inhibe las proteínasfosfatasas1y 2A, produciendoasí un fuerte aumentoen elgrado de fosforilación de numerosasproteínascelulares,induce asimismo una notableestimula-ción de la actividad CPT-l (Guzmán y Castro,1991; Guzmány Geelen, 1992). Sin embargo,diversos experimentosdemostraronque la CPT-lno es directamentefosforilada ni por acciónde la¡‘KA ni de la AMPK (Guzmánel a!, 1994), indi-candoque las modificacionesa corto píazo de laactividad CPT-l debenestarmediadasa travésdeotro(s) mecanismo(s). La clarificación de esosposiblesmecanismoses el principal objetivo de lapresentememoria.

Regulacióna largo plazo

El estudio de la regulaciónde la expresiónde los genesde las CPT aún no se ha llevado acabo en profundidady hastael momento se harestringido al estudio de cómo diversos factores

nutricionales y hormonalespueden afectar a laexpresiónde las CPT de hígado de rata. Se sabequediferentessituacionesqueestimulanla cetogé-nesisenhígado,talescornoel ayuno,la diabetes,elhipertiroidismo o el tratamientocon agentesproli-feradoresde peroxisomas,inducentanto un au-mento en los niveles de proteína inmunorreactivacomo de mRNA de CPT-l y CPT-Il (Kolodziej el

a!, 1992; Park el aL, 1995; McGarry y Brown,1997). Otra situación fisiológica que afecta demaneraselectivaa la expresiónde los genesdeCPT-l y CPT-I1 se produce durante el periodoperinatalen la rata. En el hígado fetal, tanto losniveles de mRNA como la actividad CPT-1 sonmuy bajos en el periodoanterioral nacimiento.Sinembargo,ambosaumentanbruscamenteduranteelprimer día de vida extrauterinay permanecenele-vados durante todo el periodo de lactancia(Saggersony Carpenter, 1982; Thumelin el al.,1994;Asins el a!, 1995). Trasel destete,la trans-cripción del gen de la CPT-I se ve fuertementeatenuadosi se suministraa la críaunadieta rica enhidratosde carbono,mientrasque si la dieta es ricaen grasaslos nivelesde mRNA de CPT-1 se man-

Capitulo ¡

A B

.5 ¿

y

15

Introducción

Preincubación Actividad CPT-I (%) Oxidación de palmitato (%)

Sin adiciones 100 100

Glucagón10 nMDibutiril cAMP 50 iiMForskolina50 kM

127±7al3l±3b

Insulina 85 nMEGF 100 nM

84±8a86±4a

ss±ía86±3a

Vasopresina100 nM¡‘MA 1 ¡.tM

82±7a 88±3

Vanadato2mM l4S±l6b 1142±11

Etanol20 mMAcetaldehido

73±11”81±6a

66±8”b71±11

Acido okadaico0.5 pM 154±15” 149±12”

Tabla2. Efecto de diferentes agonistassobre la actividad CPT-I la oxidación de palínitato. Despuésde un periodode incubaciónde 10-30mm. en ausenciao presenciade las adicionesindicadas,se tomaronalícuotasde las suspensio-nesde bepatocitosparadeterminarla actividad CPT-l enhepatocitosperineabilizadoscon digitoninay la velocidaddeoxidaciónde palmitatoen hepatocitosintactos.Significativamentediferentede las incubacionessin adiciones:‘P-<O 05

tienen elevados(Ihumelin el a!, 1994). Por elcontrario, durante todo el periodo prenatal-lactancia-destetelos niveles de mRNA y la activi-dad CPT-ll permanecenelevadosindependiente-mente del contenido de la dieta suministrada(Thumelin et a!, 1994; Asins el a!, 1995). Así,durante el periodo de transición fetal-neonatal,tanto la actividad CPT-1 como los niveles demRNA se encuentranaumentados.Además, lasensibilidada malonil-CoA de la enzimatambiénse encuentradisminuida (Decaux el al., 1988).Todo ello favorece que la oxidación de ácidosgrasosy la cetogénesisse produzcande maneramásefectiva, lo que se correspondecon el mayorporcentajeen grasasde la alimentaciónduranteelperiodode lactancia.

En cuanto a los posibles mecanismosquepodrían estarmediandoeste aumentode la expre-sión de la CPT-l, recientementese ha determinadoen hepatocitosfetalesen cultivo que tanto el dibu-tiril-cAMP como los ácidosgrasosde cadenalargainducenun aumentoen los niveles de mRNA deCPT-l mientrasqueno modifican los de la CI’T-II(Chatelain el a!, 1996). Se ha sugerido que ladisminuciónen los niveles de insulina en sangreduranteel periodode lactancia,lo quese relaciona

con un aumentode la concentraciónde cAME yácidosgrasosde cadenalarga en el hígado podríamediar el incrementoen los niveles de mRNA deCPT-1 (Chatelainel a!, 1996; McGarry y Brown,1997).Sin embargo,los agentesproliferadoresdeperoxisomasestimulan la transcripcióntanto delgen de la CPT-I como del de la CPT-ll, indicandoque los ácidos grasos de cadenalarga y dichoscompuestospodrían actuara través de diferentesreceptoresactivadospor ácidosgrasos(Chatelainera!, 1996;McGarry y Brown, 1997).

CPTs extramitocondriales

Se sabe desdehace tiempo que no solo lasmitocondrias,sinotambién otros orgánulossubce-lularescomo el retículoendoplásmicoy los peroxi-somas,contienenenzimascon actividad CPT. Enlos microsomasdehígadoderata sehanlocalizadodosproteínasdistintascon actividadCPT. Una deellas se halla asociadaa membranay otra es solu-ble y estálocalizadaen el lumendel retículoendo-plásmico.La primerapresentapropiedadesregula-dorassemejantesa las de la CPT-1, puestoque seinhibe reversiblementepor malonil-CoA e irrever-

Capitulo ¡

16

Capitulo 1 Introducción

siblementepor etomoxir-CoA.La formasolublenopresentaestetipo de regulación,a semejanzade loque ocurrecon la CPT-ll (Lilly er a!, 1990;Mur-thy y Pande, 1994a; Broadway Saggerson,1995).A pesarde su aparentesimilitud funcional con laCPT-l (88 KDa), la enzimaunida a membranaesuna proteínadiferente(47 KDa), al igual que ocu-rre con la forma soluble (54 KDa), que difiere dela CPT-ll (71 KDa). Además,la forma asociadaamembranaparece ser idéntica a una proteínadeestrés(GRP5S) cuyo cONA había sido previa-mentedonado(Murthy y Pande,1994b).

En cuanto al posiblepapel que las CPT mi-crosomalespudierandesempeñarse ha propuestoque pudieraninterveniren la acilaciónde proteínasdestinadasa la secrecióny/o al ensamblajedelasVLDL (Broadwayy Saggerson,1995).Puestoqueeste procesopodríaocurrir, al menosen parte,enel interior del retículo endoplásmico,el aportedeacil-CoA al lumende dicho orgánulopodríareque-rir de una CPT implicada en el procesode trans-portede los acil-CoA a travésde la membranadelretículoendoplasmico.

En los peroxisomastambién parecenexistirdos actividadesCPT. Al igual que ocurre en elcasode los microsomas,existeunaactividadCPTinsensible a malonil-CoA (Derrick y Ramsay,1989) que, dada su preferenciapor acil-CoA decadenaintermediacomo sustratosha sido denomi-nada camitina octanoiltransferasa(COT). Estaproteína, puedeser solubilizada en forma activacon cierta facilidad, perodifiere en su pesomole-cular (~63 KDa) estructuraprimaria y reconoci-mientopor anticuerposde las otrasdosCPTinsen-sibles a malonil-CoA (la CPT-ll y la CPT solublede micrósomas) (Ramsay, 1988;Pande et aL,1992).Tambiénsehadeterminadola existenciadeunaCPT sensiblea malonil-CoA que estaríafuer-temente unida a la membranadel peroxisoma(Singh eta!, 1996).Actualmentese aceptaque losperoxisomasno requierende camitinaparallevaracabo la oxidación de acil-CoAs, por lo que se hapropuestoque la CPT de estos orgánulos podríaestarimplicadamásbien en la exportaciónde acil-CoAs de cadenaintermedia,que sonlos principa-les productosde la oxidaciónde ácidosgrasosenperoxisomas(Kunauet a!, 1995).Es en cualquiercasocurioso que las mitocondrias,el retículo en-doplásmicoy los peroxisomascompartanun siste-ma similar de transportede ácidosgrasosa pesarde que las proteínasque constituyendichos siste-mas seantan diferentes.

OBJETIVOSY CONTENIDO

metabolismode ácidosgrasosse refiere,el hígadopuedellevara cabola síntesisy oxidaciónde estasmoléculas,así como su exportacióna otros tejidosdel organismo.De estamanera,la coordinacióndetodos esosprocesosdependede la acciónde unaserie de efectorescelulares,que son liberadosenrespuestaa diferentessituacionesfisiopatológicas.

La principal etapa reguladoradel flujo atravésde la ruta de oxidaciónde ácidosgrasosesla catalizadapor la camitinapalmitolitransferasa1.Desdeque en 1977 se descubrierala inhibiciónmediadapor malonil-CoA de la CPT-I este meca-nismo quepermiteexplicar la regulacióncoordina-da de la síntesisy oxidación de ácidosgrasos,hasido consideradocomo el principal procesoimpli-cado en la regulacióna corto plazo de la CPT-í.Sin embargo,estudiosllevados a cabo en nuestrolaboratorioa mediadosde la décadade los 80 conhepatocitospermeabilizadosen los que es posibledeterminarla actividadCPT-1 in situ sin necesidadde recurrir al aislamientode mitocondrias,pusie-ron de manifiesto que diversos factores puedenmodificar la actividadde la CPT-l de maneraesta-ble e independientede malonil-CoA. Puestoquedichos experimentosno permitieron dilucidar elmecanismoimplicado en la regulación indepen-dientede malonil-CoA de la CPT-1, en la presenteTesis Doctoral se ha llevado a cabo un estudiodetalladosobre las posib!esbasesbioquímicasdela regulación a corto plazo e independientedemalonil-CoA de la CPT-1.

En el primer bloque de resultadosde estetrabajo (Capítulo2.1), se describenlos efectosdelATP extracelular y los cambios en el volumencelular sobrela actividadCPT-1 y la oxidacióndeácidosgrasosque,en amboscasosparecenutilizarestavía de regulación“independientede malonil-CoA”. Unavezque la existenciade estaregulaciónde la CPT-l pareció confirmarse,en un segundobloque de resultados(Capitulo 2.2), estudiamosquémecanismosintracelularespodríandeterminarestasmodificacionesde la actividadde la enzima.Paraello utilizamos el ácido okadaico como he-rramienta que permitiera establecersi en dicharegulaciónde la CPT-l estabaninterviniendopro-cesosde fosforilación desfosforilación.Por últimoen un tercerbloque (Capítulo 2.3) se apuntanlasposibles implicacionesfisiológicas de estemeca-nismo, tanto a nivel de su potencialimplicaciónenprocesosde . malignización celular como de sucoordinación con el mecanismodependientedemalonil-CoA ya previamenteestablecido.Final-mente, la presentememoriaincluye una discusióngeneral de los resultadosobtenidos,en la que seexponenlas conclusionesfinalesdel trabajo reali-zado(Capitulo3).

El hígado desempeñauna función funda-mentalen la distribuciónde sustratosa los distintostejidos del organismo(Capítulo 1). En lo que al

17

Canítulo ¡ Introducción

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20

2. ResultadosyDíseuSión

2.1. EfectosdeJATPextracelulary deloscambiosen elvolumencelular sobrela actividadCPT-I

Capítulo 2 Resultadosy Discusión

INTRODUCCION

Como ya se ha señaladoanteriormenteen el apartadode IntroducciónGeneral, las diferentes situaciones fisiopatológicas en las que se puedeencontrarel organismo, conducena la liberación de una gran variedad demediadoresextracelularesqueejercensu efectosobreel metabolismohepático.En lo queala regulaciónde la oxidacióndeácidosgrasosserefiere, la insulinay los factoresde crecimientoinhibenmientrasqueel glucagónactivaa la CPT-1 la enzimalimitante del flujo a travésde estaruta (Guzmány Geelen,1993).En elpresentecapítulo,seestudianlos efectosque otros mediadores(talescomolos agentesque movilizan Cafl, o situacionesfisiológicas (cambios en elvolumencelular),pudieranejercensobrela actividadCPT-I.

El ATP extracelular,quepuedeser liberado en respuestaa diferentesestímulospor diversostejidos (El-Moatassimet al., 1992), puedeejercer susefectosa travésde toda una serie de receptores(Windscheif, 1996). A nivelhepático, el ATP extracelular actúa sobre el receptor P2~, estimulandolahidrólisis de fosfoinosítidos(Windscheif, 1996) y mediandoasí un incrementoen la concentracióncitosólica de Ca

2~ y de diacilglicerol. Por ello, se utilizóestecompuestocornomodelo paraestudiarlos efectosqueestetipo de agentespudieranejercersobrela actividadCPT-I.

Los cambiosen el volumencelular,tambiénconstituyenun importantemecanismoregulador del metabolismohepático (Háussinger,1996), de talmaneraqueel hinchamientode los hepatocitosse encuentrarelacionadocon laactivaciónde rutasanabólicas,mientrasquesu deshinchainientolo estácon lade miascatabólicas(Háussinger,1996).Los posiblesefectosde los cambiosenel volumen celular sobre la actividad CPT-1 no son aún conocidos. Losresultadosque se exponena continuaciónconfirman que la actividad CPT-1tambiénpuedeversecontroladaa corto plazopor agonistasquemovilizan Ca2~y por cambiosenel volumencelular.

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adenosine5’-triphosphate;fatty acid metabolism; proteinkinaseC; hepatocyte

TItE BINnINO OF MANY hormonesaudgrowth factors totheir plasmamembranereceptoraja coupledthroughphospholipaaeC activation to the formation of twosecondmesaengera,diacylglycerol,whichactivateapro-tein kinase O (Pl(O) (1, 21), and inositol 1,4,5-trisphosphate,which releasesCa2~ from intracellularstores, thereby transiently raising cytosolic free Ca2~concentration([Ca2~]

1) (1). In hepatocytea,receptor-mediatedphosphoinositidebreakdownoccura in re-aponseto anumberof Ca

2~-mobilizingeffectorssuchasvasopresain,angiotensin,a

1-adrenergicagenta, amiextracellularATP (6). ATPis releasedto theextracella-lar mediumfrom severalcelí types,includingneurona,platelets,andebromaifincelia of the adrenalmedulla(8, 9); it interactawith speciflc receptors(P2-purinergicreceptora)on the surfaceof many different celís, inwhich it regulatesmany physiologicalproceasea(8, 9).In isolatedhepatocyteaor perfusedliver, similar tootherCa

2~-mobilizingeffeetors,extracellularATPnota-

bly atimulatesglycogenolysis,gluconeogenesis,tricar-boxylic acidcycleactivity, andureagenesis(8,9).

In contrastto this knowledgeon the effectsof extra-cellular ATP on hepatic carbohydrateand nitrogenmetabolism,asfa asweknow theeffeetsof extracelín-lar ATP on hepatiefatty acid metabolismhavenot yetbeenatudied.Thusin thepresentstudyweexamineindetall theeffectsof extracellularATP on the differentfatty acid-metabolizingpathwaysin rathepatocytea.Inaddition, it hasbeensuggestedthat the regulationofsornehepaticenzymesby Ca2~-mohilizingagentamaybesolelymediatedby thediacylglycerollimb (27)or theinositol 1,4,5-trisphosphatelimb (8, 18, 23, 24) ofmembranephosphoinositidehydrolysis. Thus we alsoatudiedthe contribution of these two componentaofphospholipidbreakdownte the effectsof extracellularATP on hepatiefattyacidmetabolism.

MATE1UALS AND METHODS

Isolationand incubationof hepatocytes.Male Wiatarrats(250—300g) with free acceaste foed andwaterwere usedthroughout tIria atudy. Ml the animal protocoladeseribedbelow followed the guidelinesof the SpaniahMinistry ofHealth. Hepatocyteswere isolatedby thecollagenaseperfu-sion method describedby Beynen et al. (2). ‘Ib minimizeglycogenolyais,glucosa(20mM) waaaddedto aJ.1thebuiferaemployedin the isolationprocedure(5). Becauselipogenesiais markedlydepresaedjust añerhepatocyteisolation, celiawere incubatedfor 15 mm at 37’C iii a gyratory metabolicahalierandsubaequentlyifiteredthroughnylonmeshbeforeuse(S).Celíviability, asdeterminedby trypanblueexelusion,alwaysexceeded90%in thefinal hepatocyteauspension.

Exceptfor [Ca2i1 detenninationa(seabelow),hepatocytea

were incubatediii Krebs-Henseleitbicarbonatobuifer(Ca2~

concn2.5 mM) supplementedwith 10 mM glucoseand 1%(wtivol) defattedanddialyzedbovinaserumalbumin.Incuba-tiona (4—6mgofcelularprotein/ml)wereperformedin a totalvolumeof2 ml at 3700,withconatantshaldng(85oscillationa!mm) andunderanatmosphereof O~-CO~of 19:1.

Catmt-depletedhepatocyteawereusedlii sorneexperirnenta(seaTable 2). For thia purpose.afler isolation, hepatocyteswere waahedtwice in Ca2~-freeKrebs-Henseleitbicarbonatebuifer supplementedwith 0.5 mM ethylene glycol-bia$-a,ninoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetieacid and furtherincubatedin tWa medium for 20 mm undertheaforemen-tionedconditionabeforeuse(22).

Rutesof fatty acid synthesis,esterifrcation,and oxidation.Forthedeterminationofratasoffatty acidsynthesisdenovo,reactionawere atañedby the additionte ccli incuhationaofeither[1-’4C]acetate(0.1 Ci/mol, 3 mM final concn)or 3H

20(0.4 CM in the final incubation). Total fatty acida wereextractedaccordingto themethodofTijburg etal. (25).

For thedetenninationof ratesof fatty acidesterificationinto triacylglycerolaandphoapholipids,reactionawereatañedby theadditionte ccli incubationaof either[U-’

40]palmitate(0.05 Ci/mol, 0.4 mM final concn) bound to albumin or

G7010193-1857/96$500 Copyright n 1996theAmericanPhyaiologicalSociety

0702 EFEECTSOF EXTRACELLULAR ATP Di HEPATOCYTES

[U-14C]glycerol(0.2 Ci/mol, 0.5 mM final concn). Cellulartriacylglycerolsamiphospholipidswereisolatedby thin-layerchro¡natographyand quantified as describedby TijburgstaL (25).

For ita determinationof ratasof fatty acid oxidation,reactionawere atañedby the addition to ceil incubationaof[1-’4C]fatty acid (either palmitateor octanoate,0.05CiImol,0.4 mM final concn)boundte albumin. Oxidation producta(both acid-solubleproducta ami CO

2) were extractadamiquantiñedexactly as describedbefore (10). Ketone bodiesroutinelyrepreaent80—90%oftotal acid-solubleproducta(10).

Finzymaticassays.Acetyl-CoAcarboxylase(ACC) activitywas determinadja digitonin-penneabiitadhepatocytesasthe incorporationof radiolabeledacatyl-CoAinto fatty acidsla a raactionconpledto the fatty acidsynthase(FAS) reac-tion. This methodavoidsthenumberof interferencesinher-ant to ita classicbicarbonate-fixationaasayof ACC activity(5). Te measureenzynieactivity, 100pl of hepatocytesuspen-sienwasaddedto 100pl of prewarmeddigitonin-containiflgaasaymediumexactlyasdescribadby Bijleveld andGeelen(5).

FAS activity was monitored in digitonin-permeabilizedhepatocytasasdescribedpreviously(5).

Carnitine O-palmitoyltransferase1 (CPT-I) activity wasdeterminadin digitonin-parmeabilitedhepatecytasaB thetetradecyiglyeidate(TDGA)-sensitiveincorporationof radiola-beled L-carmtine into palxnitoylcarnitine. In brief, hepato-cyteawerepreincubatedfor 20 mm in theabsenceorpresenteof5 wM TIJGA, apotentandspeciflcinhibitor ofCPT-I (7, 12).Aliquota ware removed from both sets of incuhationatomonitorCFT-1 activity. For thatpurpose,100pl of hapatocytesuspansienwas addedto 100 pl of prewarmaddigitonin-containingassaymediumexactly as describedby GuzmánandGealen(12). PeroxisomalCFI? activity wasdeterminadliithesanieincubationaasthaTDGA-insensitive,malonyl-CoA-sensitivahepatoceHularCFI? activity (12).

Lactatedehydrogeaaseactivity wasdeterminadby astan-dardspectrophotometricmethed(29).

Determinationof [Ca2~.l~.Hepatocytes(2—3 mg of cellular

protainlml)were incubatedwitb 6 pM indo 1-acetoxymethylester(indo 1-AM) in bicarbonate-freeKrebs-Henseleitme-diumsuppiemeatedwith 10 mMN~2.hydroxyethylpiPeraZin5N’~2-ethanesulfoniCacid-NaOH(pH 7.4).10 mM glucosa,and1%(wt/vol) defattedanddialyzedbovinasaruinalbumin.Itaincubationwasperformadat 370C for 45 mm with constantshalci.ng(85 oscillations/min).

Thefluorescenceof indo 1-loadadcallawasexcitadby a5-Wlasertunadto 345—365sun,andtheamittedfluorescancewassimultaneouslymeasuradat 895 t 12.5nm (for Ca2t~boundindo 1) and488 ± 5 nm (for Ca2t-freeindo 1) in a FACStarPlus(BectonDickinson)Iiow cytometer

Oth-eranalyticalproeedures.Intracellularlavelaof malonyl-CoA ware detarminedin neutralizadperchloric acid celíextractaby aradieenzymaticmnethedasdescribadby Baynanet al. (2). Proteinwasdeterminadby themerhodof Lewry atal. (19).with bovinesarumalbuminasstandard.

Materíais. [1-’4C]acatyl-CoA(54CiImol), [1-’4C]acetate(56CiImol), 3H

20 (5 CiImol), [1-’4C]palniitic acid (58 Ci/mol),

[1-’4C]octanoic acid(32Ci/moll. [U-’4Clglycerol (171CiImol),and L-(Me-’4C]carmtlfla (54 Cf/mal) werasuppliadby Anier-shaniInternational(Ainershani,Bucks,UK). Digitonia,colla-genase(type1),4~3-phorbol12r3-myristateiSa-acetata(PMA),andATP were purchasedfrom Sigma Chemical(St. Louis,MO). TIRiA was a gift from Dr. M. J. H. Geelan,UtrachtUniversity,TheNatherlands.Bisindolylmalaintide,thapsigar-gin, A-23187, ~,5~di.(t.butyl).1,4-banZOhytfrOqrnnOne(BHQ),andindo 1-AM warafrom Calbiocham(SanDiego,CA).

Statistical analysi-s. Unleesctharwiseindicated, resultaaremeana±SDof thenumberof aniinalsindicatedin everycase.Ceil incubationaand/orenzymeassayswere alwayscarriedout iii triplicate. Statiaticalanalysiswasperformedby Studant’st-tast.

RESULTS

Ita affeetaof extracallularATP enfatty acidsynthe-sis andoxidation were studied in isolatedrat hepato-cytea. In addition, digitonin-permeabilizadhapatocyteswere uaed for the study of tha effects exerted byextracallularATP enthe activity of ACO (akayregula-tory enzymeof fatty acidsyntheaisdenovo in theliver)andCPT-I (an importantregulatorysiteofhepaticfattyacid oxidation). Exposuraof hepatoeyteato the concen-tration of digitonin usedin our system(—40 pg/mg ofcellular protein) liberatea more than 95% of totallactate dehydroganase(a cytosolic markar enzyme)within 15 8(11, 12). Theintagrity of themitochondrialontarandinner membranasis prevedby the fact thatlasathan 1% of total monoamineoxidase(amitochon-drial outer membranamarker enzyme)and of totalglutamate dehydrogenase(a mitochondrial matrixma.rker enzyme)la raleasedfrom tha permeahilizedceliaafter 1 mm of exposureto digitonin (11, 12).

BecauseextracellularATP acta on hepatic matabo-lism in a vary rapid fashion (8, 9), and becauseit isactivelyhydrolyzadby plasmamembranaecto-adanosin-etriphoaphataaes(8, 9, 18), the incubationtimes usadin thepresantstudyweravaryahort.Itese incubationtimeaware observadto allow maximal effects en theparameteraexperimental1)’ determinad (resulta notshown). In the casaof maasurementsof ratasof fattyacid synthesia,esterification, and oxidation, incuba-tiona wera carried out for np te 5 mm to achieveadequateincorporationof the radiolabeledsubatratesinto producta.

Prolongadexposuraof rat hepatocyteste high deseaof ATP hasbeenahownte producecytotoxic affects(31).Howaver we did not observeanycytotoxic affectof thiacompeund in our short-term cali incubationa. Thuachallengeof hepatocyteate 200 pM ATP for 5 mm didnot induceany signiñcantvariation of calí viability, asdeterminadby both trypan bíne axcluaionandlactatedehydrogenaaeralease.

Sifects of extracellularA7’P on Upogenesis.Incuba-tion of hepatocyteawith ATP markadlydecreasedtherata of fatty acid synthesiadenovo when [‘4C]acetatewasusadasasubatrate(Tabla 1). Similarly, extracalín-lar ATP depresaedfatty acid synthesia da novo by39.3 t 6.4% (n = 3, P<0.01)when3H

20wasusadasasubatrate.Thia decreasacorralatadwell with theextra-cellularATP-mediatedinhibition ofACC activity (Tabla1). Likawiae,theintracellular concentrationof malonyl-CeA, the product of tha carboxylase-Catalyzadreactronand a phyaiological inhibitor of CPT-I (20), waa de-creasedin parallelby extracellularATP (Table 1). FASactivity wasnotaffectedby extracellularATP(Tabla1).

BecauseATP is a aubatratefor ACC and it is notremovedfromthamediunzbeforeasaaysareconducted,

EFFECTSOF EXTRACELLULAR ATP Di HEPATOCX’TES 0703

Tabla1. Effect of extracellularA=PPen hepatiefattyacid synthesis

Additions te the Incubationa

Parameter n None 100 pMATP

Rata of fatty acid synthesis 6 25.3±0.6 16.8 ±2.1*ACC aetivity 9 0.74±0.08 0.45±0.16*FAS activity 9 22:0.3 2.3±0.4Malenyl-CoAcencfl 4 0.089±0.011 0.055±0.006*

Hapatocytas were incubated in absenee nr in prasance nf 100 pMAlT for 1 mii,. Than, calle wera usad fer measnrement of acetyl-CoAcarboxylase (ACC) and fatty acid synthase (FAS) activitias, aB well somalonyl-CoA concentration. TEa rata of fatty acid synthasis de aovowas monitored ja paraba! cali incubationa. In this case, [‘

4C]acetate(3 mM final cenca) andATP (100pM final conca) ware siinultaneousiyadded to tEa incubationa, which were allewad to rin for 5 mii,.Enzyme activitias are axprassed aB nanomoles of preduct par minutepar milligTam celluJar pretain. Malenyl-CoA teveis are axpresaed asnanemoles par milligran caltular protain. Bates of fatty acid synthaala are expressed as nanomoles acetyl unita par Emir per milligramceildar protain. Signiflcantly ditTarent from incubationa with noadditions: *~ <0.01.

it might be arguedthat thaATP addadte cali incuba-tiona might havea direct effact enACC activity. How-ayer,hepatocyteaareincubatedwith or without 100 pMAl?, andte determineACC activity 100 pl of hapato-cyta auspansionwasaddadte 100 pl of assaymixturecontaiing 4.0 mM ATP subatrate(seaMATERIALS ANDMETHODSandRef. 5).Hence,ACC activity is assumedtebeunchangadwhen daterininedwith either2.0 or 2.05mM ATP assubstrate.

With regardte fatty acidaateriflcation,no aigniflcanteffaetof axtracallularATP wasdetectadenthaincorpe-ration of axoganeus(‘4C]palmitata into cellular triacyl-glycerolsandphospholipids.Thus therataof palmitateesterification (in nmol of [‘4C]paimítata inteproduct.h’-mg cellular protain’; n = 3) was 11.5 t1.3 (incubationa without ATP) or 10.7 t 1.4nnaol. . mg protein’ (incubationawith 100 pM Al?)in the caseof triacylglycerels,and29.3 ±2.6 (incuba-tions witheut ATP) or 28.6 t 4.1 nmol.h’•mg pro-tein’ (incubationawith 100 pM ATP) in the caseofphespholipids.Similarly, axtracellularATP hadno el-fact en the incorporationof [‘4C]glycerol into celluilarlipida. Thus therataofglycerol incorporationinte lipids(in ninol of (‘40]glyceroi into product-h1mg cellularprotein’, n = 3) waa 7.4 ± 1.1 (incubatienswithoutATP) or 7.0 t 0.9 nmol.lv’mg protein’ (incuhatienawith 100 pM ATP) in the caseof triacylglycarols, and17.8 t 3.5 (incubationawithout ATP) or 17.2 ± 1.6nxnol.h’.mgprotaii0’ (incubationswith 100pMATP)in thecaseof phospholipids.

ExtracallularATP might hayaan effactenfatty acidreleasefrom cellular lipids. Te tast that pessibility,hepatocytelipids were prelabeladby incubating thecells for 5 ruin in thaprasencaof 0.4mM [‘4C]palmitate.Hepatocytaswere subsequantlywaahedand furtharincubatedfor 5 mm in a radioisotope-freemadiuin inthaabsencaorprasancaof 100pMATE However,undertheseconditionsfatty acid raleasefrom hepatocellularlipids waa negligibla in both control andATP-contain-ing incubationa.

Effectsof extracellular I4IP enfatty acid oxidation.The rataof kategenasiafron palmitatewasdepresaedby tha addition of Al? te the hepatocytaincubationmedium(Fig. 1). However, axtracellularATP had nosigniflcantaffactentherataof keteganasisfrom octano-ata (Fig. 1). It is wall astablishedthat palmitate istransportad into mitechendriaby a carnitina-dapan-dant procesa,whareasectanoatamay entermitechen-dna indapandantlyof carnitine (4, 20, 30). marafora,this rasult suggeststhat tha target for extracallularATP actienmight be CPT-I; ether cemponantsof thefatty acid-transíecationsystam,namelylong-chainacyl-CeA synthatasa,carnitine:acylcarnitinetransíecase,andCPT-II, aregenerallynot consideradte play a sígmfl-cantragulatoryreíain thatranspoñof leng-chainfattyacidsinte the mitochondrial matrix (4, 13, 20, 30). Ascan be sean in Fig. 1, hepatic CPT-I activity wasdaereasedby extracallularATE Howayar,axtracellularATP did not exert any affact en parexiaemal CPTactivity (0.53 ± 0.09 and 0.52 t 0.06 nmolproduct. min’ mg cellular pretein’ in incubationswitheut additiensor with 100pMATP, raspactively).

lb test whetharATP might haya a direct effact enCPT-I,anzymaactivity waadeterminadin isolatedlivarmitochondriaincubatadin theprasencaofup to 0.5 mMATP. CPT-I activity wasalso determinadin thaparma-abilizad cali aasayaltar hapatocytepraincubationwithno additiensaxcept100 pM Al? addadtethadigitonin-contaiing assaymix. Howevar,weceuld notdatactanyeffaet of ATP en CPT-I activity in eithar of the tweassays.

In eur isolatedhepatocytesystam,acid-solubleprod-ucta reutinely reprasent85—90% of total oxidation

‘oo

‘-o

o‘o(‘3aoo,oo

sc

-[09 [AIP] CM)

Fig. 1. EfTaetof axtracellularATPenkatogeaesisfrompalmitataandoctaneata,anóentl,e activity of carnitineO-paimitoyttr&taferasa1(CPT-D. For daterminationof the rata of ketogeaasis,hepatocytaswaraincubatedfor 5 mii, with either0.4 aiiM [“C]palmitata (O) orO.4mM [‘4C]octanoata (e) in presencaof increaaingcoacentrationaofATP. Maxiinal(100%)vatuasofhepatickatoganasisfor [‘4C]pabnitateand I’4Cloetanoatewera 67.4 ± 3.8 and 141.7 16.1 amol fattyacid h’ -mg caflular protaiw’ into acid-setublaproducta,raspee-tively. For datarminationof Cli?-! activity (E), hepatocytesnraincubatadfor 1 mm in prasenceof increasingcoacentrationsofATP.100%ValueofCIi?-I aetivity wae1.86±0.24nmolpreduct.miir’ mgcellular proaaic’. Resultacorraspondto 4 different aniinals.Notaacaleony-ans.

lee

G704 EFFECTSOF EXTRACELLULAR ATP IN HEPATOCVTES

Tabla2. Lackofeffectofextracellular AJ’Ponfatty acid synthesisandoxidation inCa

2 <depletedhepatocytes

Paraneter

Additioris tú theIncubsticas

None 100pM ATP

ACc acíivityFatty acid synthesisCPI’-t aetivityKetogenesisfon palnitata

0.44 ±0.0817.2±4.61.39±0.24512±1.1

0.48±00616.8:5.81.38±0.0450.2±6.4

Ca~-deplatadhepatocyteswere jacubatedji, absencaor in pras-onceof 100pMATP for 1 mii,. Than,callswerausadfor measuremantofACC nadcarnitineO-palmitoyltransfarasa(CPT-I)activities.Batasof fatty acid synthesisda novo andketogenesisfrom palinitatawaremonitored ja parallal cal¡ incubationa.fa this case,either !‘4C]ac-atate (3 mM final conca)or L’4Clpahnitate (0.4 mM final conca),togetberwith ATP (100 pM final cencn),weresimultaneeuatyaddedto incubatione, which ware aflowad tú run for 5 mii,. Enzyneactivities are axpressedaB nanomolesof productpar minute paraxilligramncellularprotain.Batasof fatty acidsynthesisareexprassadaB nanomolasacety¡unite per heur par milligran callular protain.Ratasof ketoganasísara axpressadaB nanomoleaE14C]pahnitatejatoacid-solublaproductaparEcurparmilhigran callularprotoin. Resultacorresponilte4 differantanimals.

productswhan [‘4C]palmitate is usadas a subatrate.Neyarthelaas,waalsodeterminadtheaffactof axtracel-lular ATP enfatty acidoxidationte CO

2by hepatecytes.ExtracallularATP hadadualeffectenpalmitataoxida-tien, sincekatona bedy fermationwas reducad(seaaboye),wharaasCO2preductienwaanetablyenhanced.Thua CO2 production was 10.2 t 2.9 (incubatienawitheut ATP) or 16.2 ± 4.0 amol-h~mg cellularprotain’ (incubatienswith 100 pMATP) (n = 4, P <

0.01). la anycase,palmitataoxidationtetotalproductswassigniflcantly inhibitadby extracallularATE Valuaaebtainedin thia casewera 82.1 ± 9.2 nmol~h’•mgcellular protain’ for incubatiena witheut ATP and67.5 t 2.5 nmel•lv’•mg cellularpretein’ for incuba-tienawith 100 pMATP (n = 4,P <0.01).

Modulation of the effects of extracellular ATP bycompoundsthat change[Ca

2’]1 andPKCactivity. It has

bean suggestedthat tha regulation of soma hepatic

Fig. 2. Modulationof tEacifecta of ex-traceilularATP on acatyl-CoAcarboxyl-ase(ACC) actjvity by compeundathatchange cytosolic frea Ca

2~ concantra-tion tCa2~t> and protain kiaasa C(PKC>activity. Hepatocyteswareprain-cubatedfor 5 mii, with no additiens(—)or with Cia pM) 0.1thapaigargin(TSG),10 2,5-di-(t.butyt)-1,4-beazohydroqul-

<BHQ), 2 A-23187, 1 413.phorbol12a-myristataiSce-acatate(PMA), nr 2bisiadolylmaleimide (BlM). Hepato-cytas werefurtEer incubatedfor 1 mii,in absenca(open bara) or prasence(hatohedbare) of 100 pM ATP. TEen,ACC activity was determinad.ResultaareS’c ofactivity relativete ineubationewith no additions aad cerrespoadto3—4 difl’erent anisnala.Maxbnal(100%)value of ACO activity was 0.80 0.11amol product.min<-mg cel¡u¡ar pro-

loo -

‘5

ceoo

teic’. Signiflcaatlydifferantfrominca-bationa with no additions:*p < 0.01;**~ <0.05.

50-

o

anzymaaby Ca2’-mobilizing hormonesmay be selalymadiatadby thadiacylglycarollimb (27) ertha inesitel1,4,5-trispheaphatelimb (8, 18, 23, 24) of membranaphosphoinesitidahydrelysis.Hence, wa attemptedtedeterminathe centributienof thasatwo cemponantatethaaferamentienedeffactsof axtracallularATP enACCaadCPT-I. Fer this purposawe usadCa2-deplatedhapatocytes;depletienof intracellularCa2~ sterasun-derthesacenditienswasassassadby thalackof affectofthapaigarginandBHQ enACO activity (seabalow). Inadditien,we usada numberef compeundathat specifl-cally 1) increasa[Oa2~]~(tha intracallularCa2~ releas-era thapsigarginand BHQ, and tha Ca2~ ionophoreA-23187) (9) er 2) medulatePKC activity (a PiCOstimulatorsuchas tha phorbelasterPMA anda spacificenzymamhibitorsuchasbisindelylmalaimida)(1,21, 26).

Theinhibitien inducadby extracallularATP enACOactivity and fatty acid synthasisde nove waa netevidaatin Ca2tdaplatedhapatecytes(Tabla2), indicat-ing that Ca2’ should be involved in thasa effecta.Incubationof hepatecytaswith thapsigargin,BHQ, erA-23187 dacreasadACC activity beth alone and incombinationwith axtracallularATP (Fig. 2). PMA in-creasedACC actiyity, whereaabisindelylmalaimidedidnetaigniflcantlyaffectanzymeactivity (Fig. 2).Further-mora, the affaetof extracallularAl? enAOC activitywasalse evidantin tha prasanceof thePiCO inhibiter(Fig. 2).

Tha inhibition ofACO by agentathat increasa[Ca2~]~(Fig. 2) showadagoedrelatienwith thamagnitudaofthe elevatienof [Ca2’]

1 (Tabla 3). Thus extracallularATP, thapsigargin,andBHQ, cempeundathat triggerthe raleaseof Ca

2’ frem intracallularstoresaswall asthe capacitativeinflux of extracellularCa2~ (1, 6, 9),induceda mereremarkablealavationof [Ca2~]

1thantheienephoreA-23187(Tabla3).WhenthapsigarginorBHQ was addadte the incubation madiun tegetharwith extracalhilarAl?, themagnitudeof theelayationof [Ca

2~]1(Tabla 3) andtha inhibitien of ACO (Fig. 2>

wereslightly enhancedcomparadwith theactienofthethreacempoundssaparataly.Tha affact of A-23187 en

-A-

e

e

1e

TSO BHO A231B7 BlMPMA

G705EFFECTSOF EXTRACEI4LULARATP Di HEPATOCVTES

Tabla3. EffectofextracellularAIF, thapsigargin,RHQ,azulA-23187on[Ca

2ÉL in isolatedhepatocytes

Additionstú tlie IncuhationeFíoorescaoceIntensity,%

Nona 100100pMATP0.1 pM thapsigargin0.1 iM thapsigargin±100pMATPiO

4MBHQ1OpMBHQ+100pMATP2 gMA-231872jMA-23187+ 100 p.MATP

296304371297355230

383

Afta indo 1 ¡oadirxg, hapatocytaswera jncubatedwjth tha addi-tiona indicatadat37’C, aadthaintracallularindo 1-emjttadfluoras-canee light was detarminedby flow cvtúmatry. Data are % ofjncubatjonswith no additjons(% of control)andreprasentmarimuinvalueof fluorescencaintensjty at395 12.5 ma relativatú that at488 5 nm. ISaacpeakvaluaswareroutinalyobtajnad45—75aafteradditionoffha djffereatCa

2~-mebihzjngagente.flata correspoadtú arepresentativaexperjmentthat was rapeatad3 timeswith similarresulta.BHQ,2,5~di.(t-buty¡)-1,4-benzohYdrOqmnOaC.

both ACC activity (Fig. 2) arid [Ca2’]t (Tabla 3) wasmarkedlypotentiatedby extracellularATE

ExtracallularATPwasunablete deprasaCPT-I actiy-ity arid Rateganasisfrem palmitate in Ca2’-dapletadhapatocytas(Tabla 2).Although this may indicatethatCa2’ should be involvad in thasaaffects, hepatocytaincubationwith thapsigargin,BHQ, erA-23187hadnoeffect en CPT-I activity (Fig. 3). Qn the othar hand,PMA decreasedCPT-I activity in a nonadditive andquantitativalysimilarmarinarwith respactte axtracel-lular ATP (Fig. 3). Moreover,bisindolylnialaimidaabel-ishedtheextraeeilularAl?-ínediatedinhibition of CPT-Iactivity (Fig. 3). Bisindelylmaleimidealso antagenizadtha extracallularATP-depandentinhibition of CPT-Iwhan thapsiga.rgin,BHQ, or A-23187waa presantintheincubationmedium(resultanetshown).Thedepen-dencyof theantilcetogenieaffactofextracellularATPenCa2~(Tabla 2) may thusresidein a stepprior te PKCactivatien. Interestingly, tite PMA-inducedinhibitionof CPT-I activity waa not avidant in Ca2’-depletedhepatecytas(resultsnot shown). Moreovar, tite PMA-inducedinhibition of CPT-I activity observadin Ca2’-contaiinghepatocytas(Fig. 3) wasnot potentiatadbyBHQ, titapaigargin,erA-23187. Valuesof CPT-I activ-

-¡00

uce

o-o

90

80

70

ity (as a parcentagaof incubationswith no additiens,n = 3) were 73 ±4% (incubationswith 1 pM PMA?1,73 t 3% (incubationswith 1 pM PMA plus 10 pMBHQ), 72 5% (incubatienswith 1 pM PMA plus 0.1

1iM thapsigargin),and75 t 5%(incubatienswith 1 piMPMAplus2 pMA-23187).

DISCUSSION

In tha praaantatudywe showthat axtracellularATPmarkadly affecta hapaticfatty acid matabolism.Thaparallel inhibitien of ACC arid fatty acid syntheaiadenove by extracallularATP suppertstite generalviewthat ACC is a key regulatory point of tha fatty acid-synthasizingproceas(13). Malonyl-CeA, tite preductoftite reactiencatalyzadbyACC, isaphyaielogicalinhibi-ter of CPT-I andplayaan essentialreíain tite ceerdi-natacontrolof fatty acidsynthasisandexidatienin titelivar (4, 13, 20, 30). Tha extracellularATP-induceddapressienof itepatie ACC activity lad te a paralleldecreasein malonyl-CoAcentent.BacauseCPT-I actív-ity andpalmitataoxidationwereinhibitadby extracel-lular ATP, titis would indicate that tha intracallularcencentrationof malonyl-CoAis net thafactorraspen-sible for the ragulationof hapatieleng-chainfatty acidoxidation under theaa conditiona. It should also bepointad eut that te measureCPT-I activity we hayapermeabilizedtite plasma membrane,arad titis hascausadtite cytesol te leak out of tite calí, laachngte alargadilutien of cytoaoliccomponanta,including malo-nyl-CoA (11, 12). In titis respectit is netewortity thattite shoñ-term modulatien of CPT-I by extracailularATP (rasults not shown), hepatocytaawalling(15), ertite piteapitatasainhibiter ekadaic acid (14) la verystable,sincethaysurvive hepatocytepermeabihzation,extensivewaahingof thepermeabilizadcalla, aradsub-sequentincubation of tha parmeabilizadcelís at 37

0Cfor at leaat10 mm. Thus, althoughinhibition of CPT-Iby malenyl-CoA la a wall-describedproperty of titeanzyme(4, 13,20, 30),ethertypese!ragulaterymacha-nisma may be invelvad in tite shert-tertncontrol ofhapaticCPT-I by cellulareffactors(cf. Ref. 14).

Tha malonyl-CeA-indepandantinltbition of hapaticCPT-I activity by extracalluilarATP is accempaniadby adual effectenmitochondrialfatty acid oxidation,sinca

Fig. 3. Medulationofcifacteof extracal-lular ATP on CPT-I activity by con-pounds that changa[Ca2’]

1 and PKCactjvity. Hepatocytes were preenea-batodfer 5 mii, with no additiona(—brwith (ja pM) 0.1 TSG, 10 BHQ, 2A-23187, 1 PMA, or 2 BlM. Hepato-cyteswerafurther incubatedfor 1 mmja abseace(opea bara) or prasence(hatehadbara)of100pM ATP, andtenCPT-Iactivity wasdeterminad.Resultsare%of activity ra¡ativetú incubationawith no additions and correspondtú3—4 differant animala. 100%Value ofCPT-I actjvity ng 177 : 0.35 mno¡preduct.mia<-mg celular pretein’.Noteecaleeny-axis.Significantlydiffer-antfron jacubationawith no additions:5P< 0.01.o ~I~sc RHO AfllS7 PMA SIM

EFFECTSOF EXTRACELLULAR ATP Iii HEPATOGYTES0706

ketonebedyformatienis deprassedwhile CO2produc-tien ia enhanced.Thus axtracellularATP may reducetite antry of fatty acyl-CeA into hapatiemitecitendriaanddivartmitochondriailacetyl-CoAinte tite tncarbex-ylic acid cyclaat tite expenseof tite keteganicpathway.Tite atimulation of CO2 fermation itas alsebeenob-servadin thecaseof etiter Ca

2~-mobilizingagantasucitasvasopresainanda

1-adrenergicagents(e.g.,seaRe!s.6, 11, 22), witareas tha inhibition of itepatic CPT-Iactivity and ketogenasisby vasopreasin(11, 22) anda1-adrenergicagenists(results net sitewn) itas beendeseribadas well. Heweyar,otitara hayareportadtitata1-adrenargicagenta stimulataer haya no effect enitepatickatoganesis(cf Re!. 13).In anycase,eurrasultsarein agraamantwitit thenetiontitat apartfremCPT-Iotitar factors may exert control ovar tite fatty acid-exidativaprecassin the liver at tite intramiteehondriallayal (seaRafs.13 and30 for reviaw).

Tite effects of extracallularAl? and otiter Ca2t~

mebilizingeffecteraenlivar metabolismarebelievedtebedependantenreceptor-mediatedbreakdewnof mem-brana phespitatidylinoaitel4,5-bispitespitatete pro-duce diacylglycerel and inositol 1,4,5-trispitoapitata(1, 6). ExtracallularATP is also able te trigger titerecepter-mediatedhydrelysis of piteaphatidylcitelineandpitospitatidyletitalielamifleby membranaphospito-upases(8, 9). In somacali types,sucitas platalataandvarleussecretorycalís,tite diacylglycarolandtheineai-tel 1,4,5-trispitespitatelimbsof phosphelipidhydrelysisact aynargically(1). However, titis is not tite casewitititepatocytes.Thus it hasbeensitewntitat tite stimula-tion of glyceganbreakdown,gluconeoganesis,andtitetricarboxylic acid cycla inducad by Ca2~-mobi1izingagenta in rat liver solely dependsen the inesitel1,4,5-trispitespitatecempenantof membranaphospitoi-nositidaitydrelysis, i.a.,entite elevatienof [Ca2>]

1(6, 8,9). Howaver,tite effectaof extracellularATP enitepaticfatty acid metaboliam,as shewnin tite prasentpapar,saamte bemerecemplax(Fig.4). Titustite inhibition of

Fjg. 4. Diagramshowirgeffectaof ex-tracallularATP en hepatic fatty acidmetabolism. laesitel 1,4,5-triBpheB-phate[hab of phosphoinositidehydroly-sis (jo., tha Ca

2~ connactien)may berasponBiblafor inhibition ofACO (andhenceof fatty acid synthesisda novo)and admulatienof tricarbexy¡ic acidcycle. Thadiacytgtycerolcompoaeatofphosphelipidbreakdownmaymodutatethe inhihitjon of CPT-I (and hancaofketogenesisfrom long-chain fatty ac-ida). EffectofextraceltuiaxATPis shownaB +, activation;—, inhibitioa; oro,noeffact. KB. katúnaboches;LCFA, long-chau, fatty acids; PL, phospholipids;TG. triacylglycaro¡s.

Extrocellulor >

ATP

e-

ACC (and henceof fatty acid synthasisde nove) byextracellularAl? may beinadiatedby tite elavationof[Ca2<1t. Titis is in lina witit tite ebaervationathat titesermeresiduespitospiterylatedenACC upenhapato-cyte treatmentwith pitorbel estersde net corraspondwith sitesphoapiterylataden tite purifiad enzymebyPKC, and titat PRO-inducedphosphorylationof puri-fiad ACC doesnet correlatewith changasin enzymeactivity (16). In additien,andsimilar te axtracellularATP, a

1-adrenergicagentainhibit fatty acid synthesiaas wall as acetyl-CoAcarboxylasaactivity in hapato-cytas, and this effect may be mediated by Ca

2~/calmodulin-dependentpretainkinasa11(28). In con-trast, tite inhibitien of CPT-I (andhenceof ketogenaaisfrom long-chainfatty acids)by extracallularATP maybe selely dependenten tite diacylglycarol limb of titebifurcatedmacitanism.Thalattar effect would in turnraquireacertainlaval of Ca2’ in tite cytosel(assitewnby tite lackof PMAaffectin Ca2~-depletaditepatocytas),but it wou.ld netbe synergicte elavationain [Ca2>t (asshownby tite lack of petantiatienof tite PMA effectbyBHQ, titapsigargin,andA-23187).

BecausePMA inhibits CPT-I actiyity, it might bearguedthat inhibition of PKC by bisindelylmaleimidesitouldcausean activationof CPT-I.Hewaver,it sitouidbe pointed eut that tite basalactivity of itepatecellularPKC ja very low bacausemestof tite anzymeis presantin tite soluble fraction (a.g., sea Raf. 28). merafora,inhibition of this marginal aetivity of PiCO should nethaya any important affect en CPT-I activity. In con-trast, bisindelylmaieimidasitonid be expectedte abel-ish PiCO-mediatadaventawiten PiCO is fully activatadby itepatocyteincubationwitit pitorbol estara.Thuswehayaobservadtitat bisindelylmaleimidais ablate blecktite PMA-inducadinhibition of CPT-I activity (rasultsnetsitown),indicatingtitat titeinlhihitery affectof PMAenCPT-I ismadiatedby activationof PI-CC.

ExtracellularATP itasbeenaitownte triggerin vitreanuinberofbielogicalresponsesin differentceil limesof

<~ El-.. CYTOFLASM

TC,PL

LCrA

Acatyl—CoA —4 KB

Co,

0707EFFECTS OF EXTRACELLTJLAR AIF Di HEPATOCYTES

tite cardiovasculartract andtite nerveussystemtitatitavebeenextrapolatedte thepesaiblasituationin vivo(6, 9). In tite caseof liver tissue,itowavar, tite atudiesreportadte date itava baen restrictad te tite use ofisolatadhapatocyteser perfusadliver, se tha poasiblaroleof ATP invivo ramainste be fully elucidated(6, 9>.Ite prasentresults suggesta petential physiologicalreíafor extracellularATP in the modulationof itepaticmetabolism.Thus,in limewitit eurobservationa,sympa-thetic activationof tite liver, whicit may involve bothcatecitelanúnesandextracellularATP (8, 9), has beensitown te depresaketegenesis(3). In additien, stressmediaterssucit as vasopreasin,catecitelaminas,and(petentially)extracellularATP exertsimilar effectsenitapatiecarboitydrate(8, 9) and lipid metabolism(titepresamtpapar)by imcreasingglucoaa ouput from titeliver tetite bleodstraamandby inhibiting hepaticfattyacid utilization, thus increasimgtite supply of sub-stratasfer axtrahapatictiasuesin stresssituatiena.

In conclusien,our results show titat extracellularATPaxertsstriking effectsenitepatiefattyacidmatabe-lism by simultaneouslyinhibiting fatty acid syntitesis(andACO activity) and ketegemesisfrem long-chaimfatty acida (and CPT-I activity). Rasultsalso indicatethat tite inhibitien of ACO by extracallularATP ismediatedby am elevatienof cytesolicfree Ca2’ concen-tration, witeraasCPT-I maybeinhibitedby axtracallu-lar ATP titrough a PKC-depandentmechanism.Thisscenariomaybeevenmorecemplicatad,sinceextracel-luilar ATP itasbeenobservadte decreasethe velumeofliver calla, andtitis maycauseprefoundalteratiemsinhepaticmnetabolism(17).

We are indebtadto Dr. TeresaPortolés for kind halp ja thadetermjaatjonsof [Ca24]

1.This work was supportedby a grant <91/209) from tha Fondo de

InvastigacionesSanitariasdel Ministerio de Sanidady Consumo,Spain.Addrass for reprint requests: M. Guzmán, Dapt. of Bjochemjstry

and Molecular Biology 1, Faculty of Bjology, Complutense Univ,28040Madrid, Spain(E-mail: mgp@so¡ea.quim.ucm.es).

Racaivad 9 February 1995;acceptadin fi.na¡ feria 16 Saptember1995.

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ELSEVIERLE TTERS

FEESLetters 344 (t994) 239—241

FEBS 140¡9

Inhibition of carnitinepalmitoyltransferase1 by hepatocyteswelling

Manuel Guzmána*. Guillermo Velascoa,JoséCastroa,Victor A. Zammitb

~Departmentof Biochernistrr ond Molecular Biology L Facuitv of Chernistry, Complutense University. 28040-Madrid, SpainbHannah Research Institute, Ayr, KÁÓ SHL, Scotland. UK

Received8 April 1994

AbstractIncubationof hepatoc~tesunderconditionsknown te increasetheirvo¡ume.i.e. with aminoacids<g¡utamine.pro¡ine>ev in bypo-osmoticmedium.

decreasedcarnitinepa¡n,itoyi-transferase1 (CPT-l) activity. Tbis effectof hepatocvteswe¡¡ingwasantagonizedby okadaicacid anddibutyry¡-cAMP.Physio¡ogica¡concentrationsof g¡uramateinhibited CPT-l activity in digitonin-permeabi¡izedbepatocytesbut not in iso¡atedn,itochondria.Resu¡tssuggest that the amino acid-inducedinhibition of CPT-¡ sharesa common n,echanismwith the amino acid-inducedstimu¡ationof acety¡-CoAcarboxy¡aseand g¡ycogensynthasef(¡993) Eur. J. Biochen.2¡7. ¡083—¡089].

Key words: Carnitjne palmitoyltransferase1; l-lepatocyteswelling; Glutamine: Ketegenesis

1. Introduction 2. Experimental

Evidence is rapidly accumulatingthat changes inhepatocytevolumeplay an importantrole in the controlof hepatocellularmetabolic function [1,2]. Hepatocyteswellinginducedby severalamino acids,notably glutam-inc amd proline. or by hypotonicity havea number ofanabolicand anti-cataboliceffects. such as stimulationof glycogen[3,4], lipid [4] and protein synthesis[5], or¡nbibitionof glycogenolysis[6] audproteolysis[7]. Keto-~enesisis also inhibited by hepatocyteswelling [8]. Al-

thoughthemechanismresponsiblefor this effect hasnotbeendescribed.amino acid-inducedinhibition of hepaticketogenesiswas observedte be independentof changestn the concentrationof malonyl-CoA [8],a physiologicalinhibitor of the key regulatoryenzymein the transportof long-cbainfatty acidsinto the mitochondrial matrix,viz. carnitine palmitoyltransferase1 (CPT-l) [9—12].Changesin the kinetic characteristicsof CPT-I thatoccur in parallelwith, or independentlyof. intracellularmalonyl-CoA concentrationhavebeenshown te be in-volved in a numberof short- and long-tenalterationsof hepatic kctogenesis[9—12].Iherefore. the presentwork was undertakente test whether changesin theintrinsic propertiesof CPT-I are involved in the aminoacid-inducedinhibition of hepaticketogencsis.

‘Correspondingauthor.Fax: (341 (¡) 394 4¡59.

2.1. Hepatoevie isolation and incubationMa¡eWistarrats(220—250g)wereusedthroughoutthis study.Hepa-

toevíeswere isolated as describedin [13] and incubated in Krebs—Henseleitbicarbonatebuffersupplementedwith ¡ O mM glucoseand1%(w¡vi defattedanddialysedbovinaseruinalbumin. tncubatioos(4—6mgofce¡¡u¡arprotein/mí)werecarriedout in a tota¡vo¡umeof 2 ml at37

0Cunderan atmosphereof O,ICO, (191).The osmo¡arilyof the medium(305 mOsm under iso-esnioticconditions) was varied te 225 mosm(hvpo-osmoticn,edium)or to 385 mOsm(hyper-osmoticmediun,)bychangingNaCí concentration.

2.2. Rare of ketogenestsThe raeof ketogenesiswasn,onitoredin incubatienscontaining0.4

mM l¡.’4C]palmitate(0.¡ CiImo¡) beundte albumin. Reactionswerestoppedwith 0.5 ml of 2 M petch¡oricacid and ketone bodieswereextractadand quantified as describedbefore 114-¡5]- Ketone bodiesroutine¡y acconmedfor 85—90% of tota¡oxidationproducts.

2.3. CPT-I assoy

CPT-l acíivity was dererniinedaB tSe tetradecylg¡ycydate(TDGA)-senstisveincerporatienof radiolabelledL-carnitine into palmitoylcar-nitine by chree different methods<A. 5 and O). TDGA is a potent.specificandirreversibleinhibitoroICPT-I 1t4.¡61. In brief. hepatecyteswere incubated lii (he absenceor in tice presenceof 5 pM TDGA.A¡iquots wereremovedfren,both setsof incubationsin erdertú mon-itor CPT activity. In methodsA andB. CPTactivity wasmeasuredindisziíonin-permeabilizedhepatocytes.Both methodswere perforníedusiogthesamedetergentlce¡¡proteinratio (ca. 40pg digitonin/mgcel¡protein). ¡n meihodA (one-stepassay).¡OOp¡ of hepatoc~tesuspen-sien ‘vas addedte ¡00 p¡ of prewarn,eddigitonin-containingassaymediumexact¡y as describedin [¡5]. and so the cel¡ penneabilizationand enzymeassaywere perfornied at tSe same time. to meshodB(txvo-s(ep assay¼.hepatocyteswere permeabilized and thorougly~vashedprior to determination of cnzvrneactivity. Thus. 1.0 ml elhepatocytesuspensienwas added te ¡.0 m¡ of prewarmedn,ediumcontaining0.20 mg digitenin. 5 mM Tris-HC¡ (pH 7.4). ¡50 mM KG.5 mM EDTA and5 mM EGTA (CV mediuca).The resu¡tingmix wasgenih’shakenbr 5 s andrapidlydiluted by tranaferte tabescontaining40 m¡ of ice-co¡d CV mediun,. Permeabilizedcelísweresedimentadbycentrifugational 350 x g fer ¡5 s. andpe¡¡etswereresuspendedin ¡ .0ml of prewarmeddigitenin-irea CV medium. TSe permnaabilized-ca¡¡

Ah rights reservad.O0¡4-5793/94/$7.O0©¡994 Federationof EuropeanBiochemicalSecieties.lSD! 00 ¡ 4-5793<94)00405-K

ti Guzmán et al IFEBS Lerter, 344 (1994) 239—241240

snspansionswareincubatadat 37C for 5—¡5 minandthenCPTactivitYwasmonitored.Finatty,thethird melhod mathodO measuresenzymeactivity in mitochondria iso¡atedfrom bapatecytesuspensionsas da-scribed in (17]. When the direct efYect of g¡utamateen 0PTA activitywasstudied,iso-esmoticcontro¡swerealwaysrl.tfl in para¡le¡by rap¡-ac-ing potassiumglutamatebr idenúca¡concentratiensof KC¡.

3. Resultsand discuasion

Incubation of isolated hepatocytes in conditiomsknown te increasetiteir volume,le. wíth aminoacids(10mM glutamine or 10 mM proline) or in hypo-osmotic(225 mosm)medium.decreasedCPT-l activity, asmeas-uredin digitonin-perineabilizedcelis by methodA (TablaIt Ihis was accompaniedby an inhibition of hepaticIcetogemesisfrom palmitate in parallel celí incubationsjable 1). In contrast.a slight increasein CPT-I activityandin ketegenesisfrom palmitatewasobservedin bepa-tocytesincubatedin hyper-osmetic<385 mOsm)medium(Table 1).

Tite inhibition of CPT-[ and ketogenesisby hepato-cyteswellingcouldresult from an increasein theintracel-lular leveis of malonyl-CoA,a physiologicalinhibitor of

Table 1Inhibitionof 0PTAactivity andketegenesisby hapatocyteswa¡¡ingandfrs reversalby okadaicacid and dibutyryl-cAMP

Ce¡¡ incubadon Percantageof incubationswith no additions

CPT-l Rateofacrivitv katogenasis

Hvpo-osmoticmedium (n = 6)Hyper-osmoticmedium(n = 4)10 mM g¡utamine(n = 61¡OmM pre¡ine(n = 4)0.5 uM okadaicacid <o = 6)SO uM dibutyryl-cAMP (o = 6~Hypo-osmoticmedium+ 0.5 pM

okadaicacid <o = 6)Hypo-osmoticmedium+ 50 pM

dibutyry¡-cAMP <o = 4)lO mM glutamine+ 0.5 pM

okadaicacid (o= 6)¡O mM glutamine-1- 30 ,uM

dibutyry¡-cAMP(n 4)¡OmM pro¡ine+ 0.5 pM okadaic

acid (o= 4)10 mM pro¡ine+ SOpM

dibutyryt-cAMPn = 4>

78.5±54’ 8¡.9 ±7.0~¡18.¡ ~ 3.T ¡16.0±4.3’

74.7±6.~ 78.4±5.Y68.9±8.Y 74.7±8V

¡54.6±¡47a ¡48.6±12V

¡37.2±S.V ¡32.4±ST

¡49.6±¡0.2’ ¡40.7±54~

¡36.4±ST 133.9±3.2’

¡42.0±89 ¡43.4±93’

¡33.2±5.0’ ¡28.1 ~ 4.4’

145.9±6.9’ ¡39.5±¡0.4’

¡ 26.8 ±4.0’ 126.1 ±3.T

Hepaiocyteswereincubatadbr 30 mm in theprasenceof thaadditiensindicated.Than. partof theca¡¡swere usadfor measuramentof CPT-lacciv¡ty in digitonin-parmeabi¡izedhapatoc~tasby maihodA. Tharestof thaca¡¡swera usedfor deterniinationof the rataof ketogenasisfrom

J¡—’C]pa¡mitale.Resu¡tsrepresentthemeans±S.D. of the numberofcali preparationsindicated o everycase.100%va¡uesof CPT-I activiryand katogenesiswere 2¡6 ±0.43nmo¡ preductlminx mg ce¡¡ proteinand78.5 ±8.0 nmo¡pa¡mitateinto productlhx mg ccli protein. respec-tive¡y. As determinedby the Studentsr-test. Significant¡v diffarent(P < 0.011 from incubationswith no additions.

la

c

oao.o,E

oEe

ue,

o-E)

a6

4

y

*

2

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LI 1

4

4,

atCrutamateJ (mM]

Fig. ¡. Inhibition of CPT-I activity by g¡utamatein digitonin-permea-bilized hepatecytesand its raversal by hepatecytepretreatmentwitholcadaicacid. Hapatocyteswereincubated¡br 30 mm with no additiens(CI)or in thepresencaof cither ¡OmM g¡utamine(e), 0.5 MM okadaicacid (a).or tú mM glutamineplus 0.5pM okadaicacid(U). Then.celíswerepermeabihzed.washedin anexcessof CV mediun,.andincubatedat 3TC for 5—¡5 mm with increasingconcentrationsof glutamate.CPT-I acíivity was determinedlo thosepermeabi¡izedce¡ls by methodB. A¡ternatively. CPT-I activity wasdetam,inedby method O lo mito-chondriaisolatadfrom hepatocytasincubatedwith no additions<,j.Resu¡tsrepresentthemeans±S.D. of 4 cali praparations.

CPT-I [9—12].lzlowever, Baquetet al. hayashowm thatthe aminoacid-inducedinhibitien of hepaticketogenasiscan occur independentlyof increasesin malonyl-CeAcencantration[8]. In the presentstudy, the simultaneouspermeabilizatienof the plasmamembraneandassayofCPT-I activity (methodA) is assumadte havedilutedintracellular malonyl-CoA [14,15]. Censaquently,it ispessiblethat tite observadchangasin CPT-I activity aredue te stablepost-translatienalmedification of CPT-I,eltiterdirectly [14,15,18]er indirectly [19].Titerefore,watestadwhetherfactersthat increasecali preteinphospho-rylatiom (cg. dibutyryl-cAMP, ekadaicacid)could pre-vent tha observadeffects of swelling. Tabla 1 showsthatbethagentswereablete antagenizethe affects of swel-ling en CPT-l activity.

In anetiterset of experimants,hepatocyteswere incu-batadwith glutamineand/er okadaic acid, and CPT-1activity wasdeterminadin digitenin-permeabilizedhapa-tocytesby metitod H (Fig. 1). The changasinduced byIhasecellularettectorsenCPT-l activity survivadperme-abilizationel hepatocytes.extensivawashingof tite par-meabilizedcelís. and subsequentincubationof the per-

10 20 30

.14. Guzmán et al. IFEBS Letters 344 (1994) 239—241 241

meabilizadcalís at 370C fer 5—15 mm, again indicatingthat the medulationof enzymeactivity is stable.Ibera-fore, although tite inhibition of CPT-l by malonyl-CeA¡s a wall-describedpropertyof tha enzyma[9—12],ethertypesof regulatorymechanismsceuldbeinvolved la thecontrol of hepaticCPT-I by hapatocytaswelling. Sincetha changasobservadin CPT-I activity are stablaja spiteof the absenceof fluoride in tha medium, they are un-iikely te be duete changasin the phospheryiatioastateof CPT-I.

A macitanismlinkiag amino acid-inducadhapatocytaswelliag te stimulation of glycogeasyathasisand upe-genesishas bean recantlysuggested.Ihus, tha increasatn tite intracellularconcentrationof glutamateamd (te alesseraxteat)aspartatethat is observadla swollen hepa-tocytesafter incubationwith giutamineor proline seamte be rasponsible.at laast in part, for the stimulation ofpreteinphosphatase(s)involvad in tite activatienof gly-cogen syathase(and banca of glycogem synthesis)[20]and acetyl-CoAcarboxylase(and henceof lipegenesis)[21]. Titerefere,we wendaredwhathera similar mecha-nísm ceuld be respoasiblafor the inhibition of CPT-I(and hence of ketegenesisindependeatlyof malonyl-CoA coacantratien)by hepatocyteswelliag. Frem datapresentadin Fig. 1 it may be inferredthat (1) concentra-tions of glutamatafeuadla hepatecytasincubatadwithglutamina or prolina [20] inhibitad CPT-T whenenzyrneactivity was assayedby metitod H in digitonin-permea-bilized hepatocytes:(u) preincubatienof hepatocyteswith glutamine induceda cartain daseasitizatienof titeCl’T-I enzymatoward glutamate:(iii) preincubatienofhepatocytaswith ekadaicacid randaredCPT-I insensi-tive te tite inhibitory effact of glutamate.Titarefore, re-sults suggestthat tite amino acid-inducedinhibition ofhepaticCPT-I may result from a glutamata-depamdentmachanismrelatadte that invoived la tite activatienofg]ycogensynthase[20]andacatyl-CoAcarboxylase[21].

It has racantly bacashown that tite okadaic acid-in-ducedstimulationof CPT-I is retainedwheamitechea-dhaare still associatadwith ethercellularfractions,a.g.tn parmeabilizedcelí ghostsaadin crudacellularheme-genatas,butaot whenmitechondriaare isolatadfer da-terminationof emzymaactivity [19]. Likewise,the inhibi-tion of CPT-l by glutamataobservadin parmeabilizedhapatocytes(Tabla 1 and Fig. 1) was net evidentwiteaenzymaactivity wasassayedby methodC in mitochon-dha iselatadfrom hepatecytesuspeasiems(Fig. 1). Oka-daic acid is knewnte disruptthe cytoskeleton[22], andsoma eífacts of hepatocytaswe]ling are abelishedbyhepatocytapraincubatienwith colciticine. ¡e. they seamte dapendentite intagrity of thecytoskeleton[23]. Hew-ayer,whanwa preincubatedhepatecyteswith colchicina

or cytochalasinB, the effects of glutaminaamd okadaicacid en CPT-I activity were still evidemt (results notshown),suggestingtitat tha integrity of the cyteskeletonis notnecessaryfer the modulationof CPT-I activity bythesecellulareffactors.Our curreníresearchfocusesenthe characterizationof tite exíra-mitochondrialcali com-poaents,prasumablynen-diflusiblaamd possibly mcm-brameus.whicit seemte be requiredfer tite effects ofglutamina er okadaic acid en CPT-I activity te be ob-servad.

Ácknowledgernents~ This work was supportedby a grant(91/209)fremtheFondode InvestigaciónSanitariadel Ministerio desanidady Con-sumo, Spain.

Refarences

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ResultadosyDiscusiónCapitulo 2

DISCUSIÓN.

En el presentecapítulo,se describenlos efectosdel ATP extracelularyde lescambiosenelvolumencelular sobrela actividadCPT-I. En amboscasos,y al igual queocurría en el casode la insulina, el glucagóne los factoresdecrecimiento,dichos cambiosen la actividad CPT-I no parecen ser debidosúnicamentea cambiosenla concentraciónintracelularde malonil-CeA. En elcasodel ATP axtracalular,ésteinhibe simultaneamentatanto la síntesiscomola oxidación de ácidosgrasos,de tal maneraquea pesarde que los nivelesdemalonil-COA se encuentrandisminuidos, la actividad CPT-[ se encuentrainhibida. Las modificacionesque los cambiesen el volumen celular ejercensobre la actividadCPT-I tampocoparecendebersaa cambiosenlos nivelas demalonil-COA, puestoqueel metodoutilizado paradeterminarla actividadCPT-1 (hepatocitospenneabilizadoscondigitonina) implica la diluciónextremadelcontenidodel citoplasmaen el medio extracelular.De estamanera,diferentestipos de agonistasque ejercensusefectosa travésde muy diferentesvías detransducciónde señales,soncapacesde modificar la actividadCPT-I medianteunmecanismoindependientede losniveles demalenil-CeA.

El efecto inhibitorio del ATP extracelularsobre la actividad CPT-Ipodría estarmediadopor la activaciónde la PKC. Porotra parte, la inhibiciónde la CPT-I mediadapor hinchamientocelular, pareceverse mimetizadaporácidoglutámico,sugiriendoque,tal y como se ha propuestoparala glucógenosintasa y la acetil-CeA-carboxilasa(Baquet et aL, 1993), este aminoácidopodría activar unaproteínafosfatasa.La activaciónde estaproteínafesfatasaestaríaimplicadaen la estimulacióndeambasenzimas(Baquetet al., 1993)yquizátambiénen la inhibición de la CPT-I. Todasestasobservacionesapuntana que la modulaciónde la actividadde proteínasquinasasy fesfatasaspodríadesempeñaruna funciónimportanteen la regulaciónde la actividad CPT-I. Dehecho,la incubaciónde los hepatecitoscon ácidookadaicoun inhibidor de lasproteína fosfatasasde tipo 1 y 2A induce un fuerte incremento en dichaactividadenzimática(Guzmány Geelen,1992),aunqueesteaumentono parecedebersea unafosferilación directade la enzima(Guzmánet aL, 1994). Así,consideramosla posibilidad de que las diferentesvias de transducciónde laseñalpudiesenafectara la actividadCPT-I mediantecambiesen el grado defosforilación de potencialesproteínas reguladoras.En la búsquedade esasposiblesdianas,algunasobservacionespuedenresultarinteresantes:

i) Tanto los cambiosen cl volumencelular, en los queel propio ATPextracelularpodríaestarimplicado, ya que se ha propuestoquepodría actuarcomo unaseñalparacrinasecretadapor la célulaen respuestaal hinchamientocelular (Wang e! aL, 1996), como el tratamientode los hepatocitoscon ácidookadaico, inducen cambios importantes en la morfologíay organizaciónintracelulardela célula.

u) Los cambiesen la actividadCPT-I que inducentodos los efectorescelularesestudiadossepreservanencélulaspenneabilizadas,cuyaorganizacióntrídimensionalno se ve básicamentealterada(Fiskum e! aL, 1980), pero sepierdentras el aislamientode mitocondrias,indicandoquepuedesernecesariala presenciade elementosextramitocondrialesparaqueestetipo de regulacióndc la CPT-l severiftquc.

Bibliograria.

¡Baquet,X,Gaussin,y., BoI¡en,M., Sta¡mans,W.yllue,L. (1993)Eur. 3. Biochen,.215, ¡083-¡089Fiskum, O., Craig,5W., Daeker,G.L. y Lohninger,AL. (1980)Proc.Natl. Acad.Sci. USA 77, 3430-3434Guzmán,M. y Geelan,MilI. (1992)Biochení.3.287, 487492Guzmán,M., Ko¡odziaj,MP., C-a¡dwel¡,A., Corstorphine,CG. y Zsmníit, VA. (1994)Bjochem.3.300,693-699Wang, Y., ¡toman,R., Lidoñky, S.D.,Fjtz, 3.0. (1996)Proc.Natl. Acad.Scj. USA93, 12020-¡2025

2.2. Mecanismoderegulacióna cortoplazo (independíentedemalonil-CoA) delaCPT-I

Capitulo 2 ResultadosyDiscusión

INTRODUCCIÓN

Unavez puestode manifiestoquemuy diferentesagenistassoncapacesdemodificar la actividad CPT-l medianteun mecanismoindependientede malenil-CeA (Capítulo 2.1), intentamos determinar cuáles podrían ser las basesbioquímicasdedichomecanismo.Paraello, utilizamosel ácidookadaicecomo unaherramientaque nospermitieraprofundizaren el estudiodepotencialesdianascuyafosferilaciónfueseinducidaporestacompuestoy que asuvezpudiesenregulara laCPT-l. Dado que, tanto el ácido okadaico como el db-cAMP o el vanadate(compuestostodosalíes que inducenun incrementeen la actividad de la CPT-l)afectana la merfologlaacelulary a laorganizacióndel citoesqueleto,primeramentedecidimos estudiar el posible papel del mismo como factor extramitocendrialimplicadoen la regulaciónda la CPT-l.

El citoesqueleto está constituido por tres tipos de elementos, losmicrotúbulos,los microf¡lamentesy los filamentos intermedios(Tabla 1) que seencuentranestrechamenterelacionadosentre sí. Aunque hastahace tiempo seconsiderabaque el citoesqueleteúnicamenteposeíauna función estructural,cadavez son más Los datos que indicanque también desempeñaun importantepapelregulador(De Loof e! aL, 1996). Las proteínasde los diferenteselementesdelcitoesqualetopueden verse fosferiladaspor la acción de diferentes proteínaquinasas,entre las que la Ca2~/CMPKll es quizá la más importante(Toivola el aL,

Con,positida ¡>rog~,s

AIiuotál,alos o.l1—(ubt¡ma C.’¡chieinoMA¡”s Necoda2o¡

~lficrofilana¡das Ac¡ no Citoca¡asinaU

Citúqucratisiasdcsmno. ~i,ncntinoprotdnas¡ibri¡arcs

Tabla 1. Componentesde¡ citeesque¡ete.Abreviaturas: MAP’s, proteínasasociadasamicrotúbulos;¡DPN, 3,3’-iminodipropionitri¡o; ¡F, fi¡amentosintermedios

1997). Esesprocesosde fosforilación/desforilaciónafectannotablementeal gradode polimerización/organizacióndel citoesquelete, de tal manera que lasinteraccionesen las que éste pudieraestarimplicado también se vedanalteradas.Porelle tambiénprecedimosa estudiarsial tratamientocon ácidookadaicopodríainducir la activación de algunaproteína quinasay, dadassus características,laCa24/CMPKII es quizá el candidatomás probable, tanto por su capacidaddefosforilar a diferentes proteínasdel citeasqueletocomo por sus propiedadesreguladoras:En determinadascondicionasde activación, la Ca2t’CMPKII seautofosforila,alcanzandoasí un estadoautónomo(activado)que es independientede la presenciadaCa24y decalmedulina(Brauny Schulman,1995)(Fig. 1).

Los diferentesestudiosrealizadosy que se exponena continuación,nospermiten proponerun modelo de regulación a corto píazo (independientedemalonil-CeA)de la CPT-l.

Canitulo2 Resultadosy Discusión

0% 0%

Calmodulina

20 80

e

Ca¡modu¡ina

Estado autónomo

Figura ¡. Estadosde activación de la Ca’~/CMPK1I. La autofosfori¡aciónde la Ca2~/CMPKIIconducea un estadoautónomoque conservapartede ¡a actividadde ¡a quinasa,siendoestaactivación independiente de ¡a presenciadeCa2~y ca¡modulinaene¡ medio.

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100%

Oscilaciones (ca2+I

00/o

100%

-Ca2’

100%QO/o

BIOCHEMICAL AND B!OPHYSTCAL RESEARCHCOI’AWNICATIONS 224,754—759(1996)AncLE NO. 1095

Are Cytoskeletal Components Invoived in the Control of HepatioCarnitine PaIm¡toyltransferase 1 Activity?

Guillermo Velasco,*Cristina Sánchez,*Math 3. H. Geelen,t-1andManuelGuzmín*

*Dgp~rgy~~~ ofBiochem¿srry¿mdMolecular Biology 1, Facu.fryofBiology, ComplutenseUniversiry,

28040-Madrid,Spain;¿md tLaborarory of VererinaryBiochemisrry¿mdInsinue ofBiomembranesUrrechs Universiry, 35082V Urreclz 77w Nerherlands

Receivedluna7, 1996

The presentwork was underrakento test wheter cytoslcelera¡componenrsare involved in te controlof rat-livercarnirínepa]miraylnansferaseY (CFI-!) ac~ryby cellulareffectars.Ibanúcrotubulestabilizertaxa] abolishedte changes¡a CFI-! acrívity induced by te effectorsresred.Taxol a]soprevenredOA-inducedsbrinkageof heparocyresaswdll aste enhancedreleaseof lacraredebydrogenaseframdígitanin-

- permeabilized hepatocyres.On tebasis of frs reladve sensirivity tu tautomycinand QA, te modularíanof CFI-! activity seemedtu involve masdyproteinpliaspliarase1. flesedan suggest taL te sboit-tennconfrol of bepaticCFI-! by cellulareffecrorsmaylavolve modularíanof inreracdonsberweenCFI-Y andcyroskeletaicompanents. © 1996 AeadicPztss.Inc.

Carnitinepallmitoylu-ansferase1 (CPT-I), te mitochondrialoutermembranecarnitinepalmi-toyltransferase,catalyzeste pace-sett¡ngstepof long-chainfatty acid transiocañoninto temitochondrialmatrix (1-3). The phosphataseinhibitor okadaicacid (OA) is ableto stimulateby up to 50% hepañcCFI-! activity aswell aspaimitateoxidatian(4,5). Tbis observationledto te suggestionthai, apartfi-orn modulationof mt-livor CPT-I activity by malonyl-CoA, aphosphorylañon-dephosphorylationmechanismmight beinvolvedin te shart-termcontroloftbisenzyme(3). However,furtherresearchshowedtat te increaseof CPT-Iactivity observedlxi QA-treatedhepatocyteswas not dueto directphosphorylationof te CPT-I enzyme,batmayinvolve interactionsbetweente mitochondriaioutermembraneandextra-mitochondrialceil components(6).

A numberof reportshayo recentlydescribeddxc existenceof specific interactioxisbetweente mitochondrialoutermembraneandcytoskeletalelements(7-9). Lx te context of CFI’-!regulation,QA andvanadate,which activatehepatioCPT-I (5,10),havebeenshownto disnaptte cytoslceletonof heparocytes(11-13). Furthermore,CFI’-! activity is affectedby changeslix hepatocytevolumne (14), mrd severalresponsesof hepatocytesto changesin cd volumearedependenton micx-otubuiedynamics(15,16). Iherefore,dxc presentwork wasundertakenro restwhethercytoskeletaicompanentsmay be involved lix te control of hepaúcCFI’-!activity by OA mrd othershort-termeffectorsof celularmetabolisin.

MATERIALS AND METI-4ODSMala Wisrarras (250-300g) wbich liad ficeaccesata foadand wazerwere usad tzougbaurin rbissnzdy.Heparoc>ts

were ¡salmed and incubared as descúbedla (17). Ya sorne expeuiments,te osmalanry of te medíum (305 mOsm inte normal, iso-osmaricKrebs-Henselelrbicarbanare buifer) was increasadtu 385 mOsm(byper-osmadcmedium)bycbangingte NaO concentrarían. Ibis was achievedby adding 10 ~u1of 4.0 M NaO per ml of ceil incubarían.

ASter incubarían of dic beparocyteswirh te addidonsindicared ¡acadi case,CFI-! acdvfty wasrourinely dauminedin digfronin-permeabiiized beparocyres exacdyasdescribed befare (5).

‘lo wbam canespondencesbould be addressed.

7540006-291X/96518-00Cop>~~01996by Acade,cPress.Inc.MI ,í~u of re~odtaedoum anyfom resnvS.

Val. 224, No. 3, 19% BYOCHEMYCAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS

TABLE 1Taxol Pravents Sbart-Term Maduladon of CPT-I Acúvity

Taxol aher addiúons CPT-I activity (%)

— Nane (6) 100+ None(6) 98t5— 0.5f¿MOA(6) l5l~l?+ 0.5 pMOA (6) 97 ~ 8— 50 f¿M dibutyryl-cAivlP (4) 136 t

50~Mdibutyryl-cAMP(4) lO4~2— LomMvanadaze(4) 143 z l6~

l.OmMvanadate(4) 105~7— lomMgluramuna(6) S3~l0*+ lomMglutarnuna(6) l0l~6— 385 mOsm medium (6) ~+ 3gfmOsmmedium(6) 99z6

Hepa¡ocyteswere preuncubazed far 30 xnizi ¡a te absencaor ¡a tepresenceof 10 pM uní, fallowed by 15 (OA, dibutyryl-cAMP, vaña-date)ar 30 (glutamune, hyper-asmadcmcdium) addiríonal miii with thaadditians undicated. Subsequernly, CFI-Y activiry was determuned iiidigitonun-parmeabulized heparacytes.Values correspand ta te numberof heparacyteprepaxatiansundícated iii parentheses.100%valueof CFI-Y acdvity was 1.56 z 0.18 nmol/mun per mg of cellular prateun. Venusineubaríonswitb no addiríons: *p .< 0.01; ~P -c 0fl5.

Hepaxocytevalume was estimared fram te wet te dry cefi weight rafia as described ¡a (18). lactaredehydrogenaseacfivity was determinad iii permeabilized celia asdescribed befare (6).

Resultasliown represenr te mema ±SL. of te number af animais undicared iii eachcase.Ccli ineabationaamienzymeassayswert aiways cardadout ¡a triplicare. Stauisncal analysiswasperfarmad by Smdenúst reaL

Saurcesof chemicaisas iii (5) and(6).

RESULTS

Thepossibiility thatcytoskeletai camponents maybe invalvedlix te short-term modulationof CPT-! activity was tested by te useof taxoL This complexditerpenoidbinda to tubulinand stabilizes microtubules,preventingte disassemblyof niicrotubulesin a -very efficientfashion (cf ref. 19). Interestingly, stirnulaúon of bepade CFI’-! acúvity induced by QA,dibutyryl-cAMP or vanadatewere campletelyabolishedby pretreatrnentof bepatocyteswithtaxol (Table 1)- Lilcewise, changesin CFI?-! acúvity producedby hepatocyteswelling arshrinkagewere alsopreventedby taxol (Table 1). Hence,blocicadeof inicrombuledynamicspreventa short-tenn moduilationof CPT-I activity by a numberof celulareffectors-SinceQAproduced te most pronounced change of CPI’-I acúvity, a dose-responseof te cambinedeffectsof taxol mrd QA on CPT-I activity was determined(Kg. 1).

Thepossiblerelationshipbetweenhepatocytevolurne,¡nicrorubulestability mrd CPT-I activ-uy wasfurtherstudied.QA decreasedhepatocytevolumeby 7% (Table2), amagnitudesimilarto tal observedafter hepatacyteueatmentwith glucagonor dibutyryl-cAMP (20). Moreimportan,taxalpreveníedte QA-unducedshrunkageof hepatocytes(Table2). Whenbepato-cyteswereincubatedlix ahyper-osmotic(385mOsm)mediuxn,a12%decreaselii ccli valumewas observed.This shrinkagewasalsopreventedby taxol (Table2).

Oneofte alterationsobservedafterOA-induceddisruptionof te cytoskeleíanis enbancedccli fragility (6,11,21). ID mr attempt to quantify hepatocytefragiliry, we determinedtepercentageof lactatedehydrogenaseretainedin te permeabilizedcelis afterpenneabilizatianof te plasmamembranewith digitonin (cf ref. 6). As shown in Table2, treatmentof hepato-

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140

o

I-;4 1201—o-o

1 00

140

o

~ 1200

‘-4

o-o

100

log [OA] «¡M)

HG. 1. Taxol anuagamzeste OA-¡aducedsdmulañonof CPT-LPanelA: Hepatacyteswere preincubated far 30mm with vazyung concentraríonsof mxci, follawed by 15 additional mía ¡a ¡he absence(O) & ¡a ¡he presenceof 0.5~¿l.4OA (e). Panel E: Heparocyws were preuncubared for 30 miii ¡a te absence(O) or ¡a te presenceaf 10 sMmal (e), follawed by 15 addiflanai mía with varyung concentañonsof OX la bat paneis, CFI-Y acúvity vasderermuned ¡a digitanin-permeabilized heparocytesfoliawing ¡he uncubañansof ¡he celis ¡a ¡he presonceor absenceof te ¡adicared agonista. Ya bat casesvalues correspand to 3 separarebepatacyte preparatians.

cyteswit QA resultedun a decreasedretendonoflactatedehydrogenaselix dxc permeabilizedcells. Onceagain, taxol preventedthis effeaof QA (Table2).

Altough QA is a marepotent inhibitar of pratein plxasphatase2A tan of proteinphosphatase1, u te dosesemplayedin dxc presentstudy (0-5 gM) QA is supposcdtacompletely inbibit both proteunphosphatases(22,23). Ta study wbeterte stimulatory

-1 0

Iog [taxol] (gM)

-2 -1 0

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Vol. 224, No. 3, 1996 BIOafEMYCAL AND BIOPHYSYCAL RESEARCHCOMMUNICAflONs

TASIS 2laxal PreventsHeparocyteSbrinkageas WeII asReleaseof LacrareDehydrogenase

from PermeabilizedHeparocytes

Taxol OA385 mOsm

mediumWer weight:D¡y weight

Lactaredehydrogenasererainedin ceil ghasrs

3.93 t 0.07(100) 6.5 t 1.1

367 t 0.03*— -~- (93.4) 2.0 ± 0.3*

334 ±0.02(100.3) 6.7 z 1.4

3.92 ~ 0.04— .4- (99.7) 6.6 ~ 0.9

3.47 t 0.07w— — + . (88.3) o-d.

3.86 ~ 0.08+ — (98.2) n4.

Heparocytes were preincubared for 30 mía iii te absencear ¡a te presenceof 10 ¿M raxol, follawed by 15addiional m¡awxt ar withonr 0.5~¿MQA ar 30 addiúanalmía iii hyperosmaúcmediuzn.men,panof ¡hehepatacyteswasused ro determine ¡he wet ro dry cd weigbt rano. The percenhageas comparedra ¡acubañoaswi¡h no addiniansLs sbawn¡a parenteses.Ibe rest ofte celiswas permeabiluzedwit ca.40pg digitaninimg prarein and ¡he pereentageof lacrare debydrogenasererained by ¡he permeabilizedcelis was determuned. Values correspondra 4 separarebepara-eyre prepararians. ~Pc 0.01 versusíncubadonswit no additions. n.d.: nar determuned.

effect of QA on CPT-I activity was mostly dueto inhibiton of phosphatase1 ar 2A, wecamparedte effect of OA with that of tautomycin,wbich inhibits phosphatase1 moreefficiently tan pliospliatase2A (23). As shownin Fig- 2, tautomycinwas quite morepotentlix stimulatinghepaticCPT-I activity (50% of acúvationat 4 olA) titan OA (50%activationat 18 nM), indicatingtlxat proteinphosphatase1 is moreimportanttanpratein

160

oa

—

o6~

o-o

140

120

100-

3

HG.2. Tauromycinis moreportartan CA in srimulaúngCFI-Y. Heparocyreswere incubaredfar 15 miii ía tepresenceof varyungconeentaríonsof auromycin (O) orCA (O) Subsequently,CFI-Y acúvity vas determuned iii aceil-penneabilizedsysrem.Values correspondto 4 separare heparacyte ¡acubarlaus.

I4’

-a 0 1 2

Iog 1a904IÉtI <nM)

1 1 ¡

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Vol. 224. No. 3, 1996 . BIOCHEMICAL. ANt> BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNYCATYONS

phosphatase2A in dic control of CPT-! activity. !nterestingly,taxol also preventeddictautomycin-inducedactivationof CPT-I.

DISCUSSIONSevera!smdies ~erfonnedby aur group using digitonin-penneabilizedhepatocyteslcd to

te suggestionthat a mechanismof phosphorylaúon-dephosphorylationmiglxt be involúed inte short-tenncontrolofmí liver CPT-I acúviíy (reviewedun ref. 3). However,furíherresearcbshowedtaí te incitasein CPT-I acíiviíy observed¡ix QA-treatedhepatocyteswas not chicto direcí phosphorylaíionof te CFI’-! enzyme,buí may involve interacíionsbeíwecntemitochondrialouter membranemrd exíra-mitochondrial,non-diffusiblc ccli componenís(6).Dataon te effectsof tao! preseníedlix te prcsentreponindicatethatte extra-mitochondrialcd componentspoíentiailyinvolved lix tite short-termcontrolof CPT-I activity might reside¡ix tite cytoskeleíon.lix addition, te dataon te síinxulationof CPT-! by OA mrd tautornycinsuggestthaiproteinphospbatase1 is moreimporíanítan proteinpitospitatase2A lix dic sitorí-íermcontrol of CP’T-I. Titis is lix agreementwit tite observationthaipitospitatase1 seemstobe tite ¡nalnproicin pitospitataseinvolved ¡ix te regulationof tite phosphorylationstateof tecyíoskeleíon,mrd ¡ix mm in tite controlof cytoskeletalintegrity (21,24).

Thc namureof tite putativecyíoskeletalcomponení(s)tlxaí might be involved lix controllingCPT-I activity is still unknown.A firsm possibility couldbe thai tite control of CFI?-! activityby tosepotentialinteractionsbetweenmimochondriamrd te cytoskeletonmerely reflectedaphysicailpitenomenon,Le. CPT-I acmivity might bedependcnton mitochondrialshapc,stretcix-¡ng or cantractionof dxc ¡nimochondrialoutermembrane,etc. (cf ref. 7). A secondpossibilitycouild be thai moduladonof CPT-I activimy involved te specific inmeractionbetweenCPT-Isudregulatorycymoskeletalpromein(s).Titis notionis supportedby te obscn’ationthaite meredisruptionof microtubulesby 2-methoxy5-(2,3,4--¡rimethoxyphenyl)2,4,6-cycloheptatrien-1-one or coichicine or te meredisruption of actin microfilamenísby cytochalasinB doesnoí affect CPT-I activimy (unpublishedwork). QA mrd otiter pitospitataseinhibitors producehyperphosphorylationmrd consequentlydisruption of microtubules,actinmicrofilamcntsmrdinmennediamefilamentsin severalccli Unes, includ¡nghepamocytes(21,25,26)-Whetherdiesecymoskeletalchangesarerelatedto te cifecísof QA on hepaticCPT-I activity is as yet mropenquestion.

AOKNOWLEDGMENTSflese ¡avestigaúonswere supparred¡a panby te Nerherlands Faundarianfar Chemical Reseaxch(SON) with

financial aid ftamdic Netherlands Organizarion for Scienrific Researcb (NWO).

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ajochen. J. (1997)321. 211—216 (Printed in Greal Br(¡ain) 211

Involvement of Ca2~/caImoduIin-dependent pratein kinase hin theactivation of carnitine palm¡tayltransferase ¡ by okadaic acid in rathepatocytesGuillermo VELASOO*, Manue¡ GUZMÁN*, Victor A. ZAMMITt and Math J. H. GEELENt§tepartmenl of Bioehemistry and Moiecul& B¡o)ogy 1, Facu)ty of Bio)ogy, Complutense University, 28040-Madrid, Spain, tHannán Research lasfitute, Ayr KA6 SHL,Scot)and, U.K. aid Laboratory of Veterinary 8)ocremistry aid Instituís of Biomenibranes, U¡echt Univsrsity, 3508 TO Utrechí, lbs Netherlands

The present‘york was undertakento study the mechanismby~vhichokadaicacid(OA). aninhibitor of proteinphosphatases1and2A. stimulatescarnitine palmitoyltransferase1 (CPT-1) inisolatedrat hepatocytes[Guzmán. Kolodziej, Caldwell. Costor-phineand Zammit (¡994) Biochem..1. 300. 693—699]. TheOA-induced srimttlation of CPT-l was aholished bx’ the generalprotein kinaseinhibitor K-252a a; weli os by KN-62. a specificinhibitor of Ca24/calmodulin-dependentprotein kinase II(Ca2JCM-PKII).However,neithertheproteinkinaseC-specificinhibitor bisindolylmaleimidenor the protein kinaseA/proteinkinase C inhibitor 1-1-7 was able lo preventthe OA-inducedstimulacionofCPT-i. Hepatocyte-shrinkage-inducedstimulation

INTRODIJCTION

Garnitine pa¡mitoyltransferase1 (CPT-l) catalysesthe pace-setting step of ¡ong-chain fatty acid transiocation into themitochondrial matrix [1—3].It 1; weIl establishedthac long-taranchangasini ratliver CPT-lactivity occurin responseto alterationsini the nutritional and hormonal statusof the animal [1—3].Iniaddition. several studiesusing permeabilizedhepatocvteshaya.shown that various agentsexert short-termeffects on CPT-lactivity in parallel with changasini the rata of Iong-chainfattyacid oxidation measuredin thesamacali praparationis(reviewedin (3]). ¡ni particular. okadaicacid (OA). a potent inhibitor ofprotein phosphatases1 and2A [4]. is ableto stimuiateby up to5000hepaticCPT-I andpalmitateoxidation[56], indicatingthatinhibition of thephosphatasesmight haveresultadin increasedphosphoryiationof CPT-l, with consaquentincreasain enzymeacíivity [5.6].However,when hepatocytesweretreatedwith OAand then permeabilizedwith digitonin, addition of purifiedproteinphosphatases1 and 2A to the permeabilizedcali ghostsdid not reverse the OA-inducedstimulation of CPT-1 [71. Inaddition, although tha effects of OA couid be observad iniperaneabilizedhapatocytes,they were lost upon isolation ofmitochondriafrom the sama celis. This and otherobservationsshowedthat (1) the morcasein CPT-I activity observadin OA-treatedhepatocytesis not due to direct phosphorylationof theGPT-¡ enzyma. and (Ii) diffusible ccli component(s)iost onpermeabilization of the hepatoc~íeplasmo membranawithdigitonun and distinct from protein phosphatases1 and 2A areessenuialfor íhestimulatoryeffactof OA tobedamonstrated[7].

of CPT-l a; well as OA-induced hepatocyteshrinkage waspreventedby KN-62. KN-62 alsoantagonizedthe OA-enhancedreleaseof lactate dehydrogenasefrom digitonin-permeabilizedhepatocytes.Exposureof 32P-labelledhepatocytesto OA in-creasedthe degreeof phosphorylation of CaC+/CM~PK1I, -osimmunoprecipitatedby a monoclonalantibody raisedagainstthe ~-subunitof rat brain kinase. This effect of OA was alsoantagonizedby KN-62. The resuitsthus indicate that the OA-dependentstimulation of CPT-1 may be mediated(at least inipan) by increasedphosphor~iationanid subsequentactivationofCa2~/CM-PKli.

Thepresentstudywasthusconductedto identify intermediateproteins the phosphoryiation(= activation)of which could betriggerad by OA, resulting in subsequentactivation of CPT-I.OA may mnifluence the phosphorylationstate of a particularrargat protein either by the direct inhibition of the proteinphosphatasesinvolved in thedephosphorylationof suchproteinorby the indirectactivationof the proteinkiaasesinvolved in itsactivation. Regardingthe latter possibility, CaC+/calmoduiin~dapandentprotein kinaseII (CaJCM-PKII) is abie to becomeconstitutively activatedwhen autophosphoryiatedin key sermeor threonineresidueson tha autonomysite of theenzyme[8.9].Autophosphoryiationis sufficient to disrupt the autoinhibitorydomain of Ca2t/CM-PKII, ieading to a deinhibition of thekinase[8].1-lancepermanentactivationof Ca24/CM-PKIIshouldbe achievedby inhibition of the phosphatasesinvolved in thedaphosphoryiation(= deactivation)of Caa±/CM~PKII.la fact.sevaralresponsesof intacthepatocytesto OA, namelydisruptionof nhe cytoskeieton[10], inhibition of autophagy[10.11] andactivation of phenylaianinehydroxyiase [12], appear to bemediatedby the activation of Ca2~/CM-PKIl. Likewise, in thepresentreportwe prasentdataindicatingthat Ca2~/CM-PKII isinvolved in the activationof CPT-I by OA in rat hepatocytes.

EXPERIMENTAL

MaterlaisL-(rnetht’1-’4C]Carnitineanidcarrier-free[:¡aP]P~werefrom Amer-sham International(Amersham.Bucks., ¡3K.). Phosphate-free

Abbreviations used: Ca2~/CM-PKFI. Ca2tÍcaImodu)in~dependent protein kirtase II: 0PTA, carnitine palmitoyltransferase 1; LDH, lactatedehydroqenase: CA, okadaic acM.

$ To wbom correspondence shoutd be addressed.

212 0. Velasco and othsrs

Dulbaccosmodified Faglesmedium was from ICN Pharma-cauticals (Costa Mesa, CA, U.S.A.). Tatradecylglycidatewasdonatadby Dr. 3. M. Lowanstain (BrandeisUniversity. Wal-tham. MA. U.S.A.). OA. KN-62. K-252a. bisindoly¡maleimideandH-7 ‘vera from Calbiochem(SanDiego. CA. U.S.A.). Anti-Ca>/CM-PKII monoclonal anitibody (raisad against the ~-

subunirof tharatbrainenzyme)wasfrom Boahringer-Mannheim(Indianapolis, IN. U.S.A.).

Isolation and incubation of bepatocytes

Mala Wistar rats (250—300g) which hadfree accassto food andwatarwarausadthroughoutthastudy. Hepatocyteswereisolatedby thecollagenaseperfusionmathoddescribedini [¡3]. Theywareincubatedin Krebs—Hensaleitbicarbonatabullar,pH 7.4, suppla-mentadwith ¡OmM glucosaand¡ 0~ (w/v) dafattadaniddialysadBSA. Incubation;<4—6 mg of cellular proraini/ml) ware carriedoutar37 0C in ametaboliegyratoryshaker(85 oscillations¡min),underan atmosphereof 0

2/C02(19:1, y/y).In soma experimants.the osmolarityof iha madium (305

mOsm in Iba normal iso-osmotic Krebs—Hanseleitbicarbonatebuifer) was increasedto 385 mOsm(hyperosmoticmedium) bychanging iba concantrationof NaCí. This was achiavad byadding lOj,l of 4 M NaCí par ml of cali incubationmixture.

CPT-I assay

After incubationof the hepatocytaswith the additionsindicatadin eachcase,CPT-1activity wasroutinalydeterminadin digitonin-permeabilizadhapatocytasby a - ona-step assaya; the tatra-dac~Iglycidata-sensitivaincorporarion of radiolaballed L-car-nitmna into palmitoylcarnitineexactlyas describedpreviously(6].In sucha procedure.calI parmeabilizationandassayof anzymeactivity aresimultaneouslyparformed[6]. In somaaxperirnants,howaver. CPT-l activity was determinadby a more complaxprocadura.In this ~two-stap’ assay.celís areparmeobilizedwithdinitonin. then extensivelywashedand incubatedbr 5 mm at37

0C baforedetarminarmonof CPT-¡ activitv. Thiswas achievadaxacrly a; dascribadpraviously[7].

Immunopracipitation of 32P-Iabelled Ca2~/CM-PKII

Tha protocol for immunopracipiration of Ca-~~/CM-PKll isbasadon that designadfor immunopracipitationof acatyl-CoAcarboxyiasaa; pravious¡ydescribad[14].Altar isolation,hepato-cvtes~varawashedtwice in pho;phaíe-fraaDulbeccosmodifiadEagles medium supplamantadwith 1 (w/v) defattad auddialysadBSA. Hapatocytes(6—8 mgof calluiar protain in 1.5 mlof the aforamantionadmedium)warasubsequantlyincubatadat37 0C in a matabolicgyratoryshakar<85 oscillations/min),undarun atmosphereof 0

2/CO,(19:1. y/vI. Heparocyteswarelabelladwith ¡00 pCi of [

32P]P~br 1 h unid subsaquentlyexposadto theadditions indicated.Cali; wera then parmeabilizadby exposuralcr ¡Os to 200 pI of a solution containing ¡.5 mg of digitonini.¡OmM Tris/HCI. pH 7.4. 5 mM EDTA. 5 mM EGTA. 50 mMKF and ¡00 mM KCI. Tbe ccli ghostswcra rapidi~ sedimentad

1 ¡ 5 s ¿it 2000 g> and 500 pi of tha supernatanirwas treatedwith(y/y) Triton X-l00 for 1 mm Altar anothercenírifugation

step.200/4 of tha rasulring suparnataní‘vas takanbr immuno-precipitation altar mixinig with 50/4 of the following proteinaseinhibitor mixture: PMSF(0.5 mM). Tos-Pha-CH..C¡(¡5 pg/mfl.Tos-Lvs-CH,,CI (¡8 pg/mI). tos~¡-L-arginine mathyl aster

8 pg/mD. pepstatin(5 pg/mb. tr~psin inhibitor <50 pg/mb.¡cupaptin (5 pg/ml). banzamidine<0.8 mg/mí). aprorinin (0.4k¡ U/mb ¿md 2-mercaptoalbaniol (5 yl/mI) in TTBS bullar(20 mM Tris/HCI, pH 7.5, 0.5 M NaCí and 0.05 Twaan 20).

PreswoilanProteinA—Sapharosa(10 ji1) wasrotatadand-over-cod with 154 (15 j¿g) of anti-Ca~~/CM-PKIlmonioclonal anti-body (ramsedagainstthea-subunitof rat brain kinasa)and 25piof TTBS br at laast 2 h at room temperatura.The antibodybound to Protain A—Sapharosawas axtansivaly washedwithTTBS andthenrotatedend-ovar-andovarnightat 40C with the250 pI of calI extract supplemeníadwmth proteinasainhibitorcocktail (sea aboye).Tha immune complexaswera axtensivelywashadwmth a madium containing 50 mM Trms/HCI. pH 7.5,0.15 M NaCí, 0.5% (y/y) Nonidet P40. 0.5% (w/v) sodiumdaoxycholataand 0.1 % (w/v) SDS, andsubsequentlyextractadfrom tha Protain A—Sepharosegel; by boiling for 5 mm inLaemmli disintegratmon bullar. Samples wara subjacted toSDS/PAGEa; dascribadby Laemmli 1151 using 1.0 mm-thick12% poiyacrylamidagal;. Tha pH values of the stacking andresolving bufl’ers waraadjustadto 6.8 and8.8 raspactivalv.Afterfixing anid drying of the gels,aaP~labeiladbandswara visualizadby autoradiographyand the intensity of the bands in thaautoradiogramswasquantifiedby densitometry.

Olber methods

Hepatocytavoluma wasestimatadfroni thewat to drycalI waightratio essentiallyasdescribedin [16].Briefly, 150—175mgof frashhapatocytaswararapidly centrifugad(2000g, 20 s) in prawaighadtubasand tha wat weight of tha cali; a; wall a; tha dry weight(ovarnight at 105 0C) wa; measurad.Lactatadahydrogenase(LDH) activity wasdeterminadin pernocabilizadcalI;a;dascribadpreviously[7].Briafly, hapatocyteswerepernieabilizedwmth40 pgof digitoniin/mgof protain,andthaparcentageof LDH retainadby iba parmeabilizedcalI; wa; determinad.

Stalist¡cal analysís

Ra;ults shown rapraseníthe maans+S.D.for the numberofhapatocyrepraparation;indicatedin aachcase.Cali incubation;andenzymaassayswaraalwayscarriedoutin triplicate.Siatisticalanalysiswas performedby Student’s test.

RESULIS

Eftecl of K-252a ami KN-62 en ¡be OA-¡nduced sílmulation ofhepatlc GPT-I

ThealTeasof OA on cali matabolismareexartedby thamnhibitionof protain phosphatases¡ and 2A [4]. Naverthala;& increasadphosphorylarionof a particularproteinin cali; treatedwith OAcanresuit from inhibition of the protain phosphatase(s)anid/orby activationof thaproteinkinase(s)actingon theprotain.Tabla1 ;howsthaproteinkinase-dapandanteffectof QA on hepatocytaCPT-¡ activity. The OA-induced stimulation of CPT-1 wasantagonizedby K-252a,a generalproteinkinasainhibitor whichha; baen shown lo inhibit protein kinasa A, protain kinasa C.protain kinasaO. Ca4t/CM-PK1I,myosin Iight-chainkinaseandtha tyrosina kinase activity of narva growth factor receptor[17.18]. The affect of K-252awasdose-dapendentandevidentatmicromolar concentration;(Figure 1). Sinca this obsarvationindicatas thaI activarion of a protain kinasa may mediata thaeffact of OA on hepatocyteCPT-1 activity. Wc naxt set out todissect thaaliad of this generalprotain kinaseinhibitor K-252aus¡ngmore spaciticprotain kinaseinhibirors. Alternativaiy, OAmay inhibú dephosphorylationof [he unknowni Iarget protaindownstreamof Iba putative protein kinasa.

KN-62. a specific inhibitor of Ca2t/CM-PKII (19]. alsoantagonizadthaOA-inducadactivationof hepaticCPT-l (Tabla1). Tha atiact of KN-62 wasdose-dapandentanid was evidenturmicromolar concenitralion; (Figura 2). In contrast.naither tWa

Regu¡at¡on of carnitine pa¡mitoyllransferase 1 activily 213

Table 1 Effect al protejo kinase inhibitore no [heDA-induced stimutatlonof hepatio CPT-IHeoalocynss were prelocuhaled nr 15 mm ¡e <he oresence of [headditicns indicaled. fo<Ioweo

15 audilional mm wilh o; withau¡ 0.5 yM CA. C?1’-< acliviW was Ihen determined inz:o¡¡on(n-pernsabilizsd celis s¡<her hy <he siandaro cns-step assay Gr by [he¡wo-sle~ assay.¡1 ~GSccrresoand lo <he number cl hepa¡ocy¡e preocrationo indicaled and are eapressed Qn¿te casis cl letal cellular protein one-s¡ep assaví en ghcsl protein >two-slep assay). Ihece:cen¡ags elfecí as compared wi¡h incudabeos san no aíni¡(ons is sIeso ¡o íareítheses.

-e 0.01 compared sito ¡ecubaticos w¡th nc codition; of ¡he cor;espono.ng «pe cl assay.nnt determined.

:.jc¡<¡Qfl5

10aM K-252a

30 u¿M

M bisindolylmateimide

100 ¡‘M H-7

3

-n‘-4

o.ci

CPT-I (nmo¡/min per oig of protein)Píesence ol0.5 pM CA Ono-san assay iwn-step assay

— 1.47±0.21(n=11<<100<

<146<— 1.54±0.15<n=6<

(105<+ 1.50+0.13 (a=6(

(102>— 1.53-,-0.10(a=11)

(104<+ 1.50±0.08(n=11<

(102<1,44±0.16 (2= 4)(98<

+ 2.16±0.18’<2 = 4)<147<1,51+0.13(n=5><103>

+ 2.18”-O.33~ (a = 5)(148<

2.27 + 0.25 <2 = 4(100)3.543-0.43(2=4<(155>2.21 ±0.35(2= 3<

(97<2,34 +0.17 (nl = 3>((03<2.28+0.37(n~ 4>(100<2,41+0.26 (o = 4<(106)n.u.

0.0.

n.b.

n.u.

Figure 1 ¡hect of K-252a no DA-induced sflmulation of CPT-I

protein kinasaC-specific inhibitor bisindoiyimaleimida1201 norChe prolcin kinasaA/protcin kinaseC/proteinkinasaGinhibitorH- [21] were abla to preventIhe OA-induced srimulation ofCPT-I (Tabla 1). RencaactivationofCa2JCM-PKIIseemstobeinvolved in tha OA-inducedstimulationi ob heparicCPT-l.

Wc routinaly determinaCPT-¡ actiyity in digitonin-parme-abilized hapatocytasby a rapid one-;tapassay16]. In such aprocadura.cali parmeabilizationandassayofanzymcactivity ares¡multaneouslyparformad[6J.Tha vcrsatiiiíy of Ibis typa of assayhas beanrapearadlydemonstrated(reviawcd ini [31).Howevar.¡his assaymayalsoraflcct thadagreeof sansitizationof CFT-[ to‘naionyl-CoA mniduced by the different mnitraceliular conceni-tration; of maionyl-CoA at which the anzyma was exposedhefore cali permeabilization(sea raf. [7]). Hence. wa also de-termined CPT-¡ activity by a more complex procadurewhiciic¡rcumvantsthis potantial pitfali. in chis two-srepassay[7],cali;areparmeabilizedwith digilonin. followad by rapidandextensivawashingof permeabilizadcalI; and subscquantincubarionof Ihepermeabilizadcelis for 5 mm at 37 CC before daterminationof(YPT-l acrivity. This climinates any possíbla interfaranceofríialony¡-CoAsansiíizarioniin thaassavof enzymaactivity [7]. Asshownin Tabla 1. thc OA-iniduced srimulaíioni of CPT-¡ a; xvall¿rs Che antagonistieefl’ccí of K-252a¿md KN-62 cou¡d be readi¡v<lemonistratedb~ using tha two—scap ¿ossavas we¡l.

Efod of KN-62 no hepatocyte-shrinkage-¡nduced shlmulation ofCPT-l and DA-induced hepatocyte shrlnkage

[he possibielink batwacnchangas o hapatocytcvolumeandthcAlacosofOA and KN-62 on CPT-l acrivity was;tudied.Dataare

<A< Hepatncyles ¡¡ere preincuhated lcr 15 mil lo <he absence Oler presenne (0< ollo o.MK-262a, lo<fowed bv 15 addilional nio with varleus conceo¡rations of OA, (O> Hepalocytss serepreincuhated [nr1 5 nlo with Canoas nnncenfra¡<ons cl K-252a. lnllowed by 15 addil<ona< mio¡o <he absence <Olor presenne (Olol 0.5 oMIOA. CPT-í activ<ty was delermlned by ¡he oes-s<ep assay, (n <att cases values ccrrespond ¡o tires separale hepatocy¡e preparalion;,

shown in Tabla 2. Sri agrccment.with a prcvmousraporí [22],aslightbutsracisticallysignificantincreasainCPT-tactivity ansuedwhen hepatocytaswere incubatedin 385 mOsmmadium.ínter-cstingly, this stimulaíionof CPT-l inducedby hapaíocyteshrink-¿egawas prevantadby KN-62. Whanthe xvaí to dry cal! weighrratio was determinad.OA was observadce dacreasahepatoc~tevolume by 6.70<,, a magnitudesimilar te that observadafterhepatocytetreatmanicwith giucagonordibutyryl-cAMP [23].Inaddition. KN-62 preventedtheOA-inducedshrinkagaof hepato-cytas. A; expectad. whan hapatocyres‘vera incubatad in ahyparosmotic<385 mOsm)madium.a markad¡ 1.5 04, decreaseinccli volume was observad.Howaver. KN-62 wa; unabla toantaconizethe decreasein heparocytavoluma inducedby cx-posurate hvpcrosmoticmadium.

Elfect of KN-82 on DA-induced release of LDK Vram permeabilizedhepatacytes

Oneof iba mostremarkableeffectsclicited by OA inhepatocytes¿md oher cali lina; is hyparpbosphorviationand subsequentdisruption of the cyroskcleron.tharabyincreasingcali fragiliry[024.25]. Ca>/CM-PKIL is oneof rha.mostimportanit proteinkinases invoivad in tha control ob cytoskaletal integrity byphosphorylation18,26]. lo thaconrextof thepresentstudv.it has

5= 1.

u1-•¡2.ao-)

[cg (K-252a] (MM)

214 G. Velasco and others

160

140 -

13I-4

o-(-3

120 —

loo

160-

a5

H¡2.o-(-3

140

120 -

boj-Y

-2 -1 0

log (OA] (gM>

0 1lo~ [KN-621(pM)

Figure 2 Eftect of KN-02 00 DA-Induced stimula[ion al CPT-I

(A) Hepa¡ocyles ¡¡ere preincubaled br 15 nin lo <he absenne (O) or presence (@> al 30 ¡,MK14-62, to((nwed by 15 additional nin w¡th vaninus nnncsn¡ralicns ob DA. (B( Hepatonhies werepreincunaled br 15 mm ¡¡¡lb varinus nonnenlral)ons of KN-62, to((owed by 15 add(¡(onal mmO <05 absence (O) on presence e) ot0.5 ¡cM CA. CPT-l acl(v(¡y ¡¡as delernined by <he nne-

<len assav, Values cornespoad <o ¡bree separale heoatonyle prepanalians.

baensuggastadthat tha increasain CPT-l activitv observadinOA-treatadhapatocytesmay involve intaractiorisberween theouter niitochondrial membrana aud non-diffusible extra-mitochonidrialcali componants.probablylocalizad in thacyto-skaleton[7]. Thus. in anattampt to quantify hapatocytafragility,Wc determinadthaparcenragaof LDH ratainadin thecali ghostsafrer parmeabilizationof tba plasmomembranawirh digitonin(seareí 17])- As shown in Tabla2. treatmentof haparocytaswithOA rasultedin decreasedratantionof LDH in tha permeabilizedcelís. with a corrasponidinglygreater ¡os; of the c~toplasmicmarkerenzyma.Oniceagain.KN-62 prevantad<his affactof OA(Tabla 2).

Phospharylation of Caa*/CM~PKIl u aflecled by DA and KN-62

To gaiherindication;br a link betweanCa”/CM-PKI¡ and theOA-inducad stimulation of CPT-1. axparimantsfor measuringCa~/CM-PK11activitv waraparformed.it turnadout that hesameasuramentscouid noÉ be conductadon cruda cali extracts.Assayson partially purified preparationiscarry tha risk of post-homoganizingmodificationiof thaenzymeprotain.Thareforewadecidad to obtain mora direct avidancefor tha invo¡vementofCat/CM-PKII phosphorylationin the OA-inducedstimuiationof hepatocyte CPT-¡. For chis purpose. c-xpermments on

Table 2 Effect of KN-62, OA Md hyperosmotic medluoi on CPT-I act¡vlty,hepatacyte valunie and LDH release brom peroieabillzed hepatocytesHepa¡ncytes mere areincubated ter 15 mm la [heabsence nr presence nl 30 pM KN-62.(o((ovxeg by e¡ther 15 addilicnal mm ¡¡ah nr wilhnu¡ 0.5 pM CA or 30 addilinnal mm ¡ahypernsmotio nr (so-asmotin mediunn. Ihea cello mere ¿sed br <bree diblerení purposes:deterninallon cl CPT-l anliv4y by <he standard one-s¡ep assay. deterninatian el ¡he ws¡ ¡a dryce)) weight ratín and de¡erm)na¡ioa nl [CHre¡aiaed by hepalocytes afta permeabílizatian ¡¡¡lbdigitanin (sse [heFnperimenta( sentina). Values correspoad fo sic CPI>l ac¡iv)ly) o; four (we¡weigh¡/dry meigní. LCH aclivity) separate hepatocAe preparatiens. Ihe pernenfage eltení ascompared with incubatinas w)th no andíbinas lo ohoma la pareníheses. Pc 0.01 nr

2< 0.05 cnnoared ¡¡¡lb lbs correspnnding (naubabiono ¡¡¡lb no add(tinas (o iso-esnnotinmedian.

Presence Presence Píesenne nl 097-1 an¡iv)ty [OHrelamednf of 385 m0sm (oniní/min per 7451 weight/ ir ccii gbostsKN-62 DA mediun mg nl prole(o) dry weight 1%)

— — — <.34±0.25 3.82+0.14 6,3+1.4(100> >100>

— + — 2.00+0.4V 3.564008 2.3±1,0<149) <93.3)

+ — — 1.27+0.19 3.83+0.03 5.5+2.0951 >100.2>

— — 1.39+0.46 3.79±0.08 6.6+0.6(104). <99.3>

— + 1,59±0,11’ 3.38±0.l7~ 5.9+1.3>119) <68.5)

+ — + 1.35±0.15 3.49±0.20 5.7+0.9(<02<: (91.4)

98—64—so—

36—

a b c d

—

— -Y —

esc

Figure 3 lmmuoodetect¡an of hepatacyte Ca2/CM-PKII

<Hepa¡onytes ¡¡ere permeabilized ¡¡¡lb digibnnin and ¡be supernataní mas used br inmune-precipitableo wilh ¡he anti-Ca<’/CM-PKII aotibady as described ¡a ¡he Experimental seclienexcept [nr32P (abell¡ng. Tbe gel mas [¡vedaad subsequently síained ¡¡¡lb Oaonassie Bloc. A<2000 g supernalaní ab ral brainn mas used as a onabral. Malenu¡ar-mass narkers (lOa) areshema <a <he lefthaad and rigbl-hand lanes. lbs ameuní ab celí edrad (mg al prolein> incubatedbr imnunopnecipibabien mas 008 (<ana a. brain). 0.40 (lane b. brain). 0.16 <lanco, hepatanvlesíand 0.80 (lane 4. hepatocyles>.

Ca~/CM-PKI1immunopracipitationwere conducted.Firsí Wc

testadwheíher chaantibody raisadagainst<he z-subunitof ratbrain kinase was alMa to immunopracipitata Ca2~/CM-PK¡lfrom rat hapatocytas.A roL brain 12000gsuparnatantwas usada; a control. As axpactad.iba antibody ~vasabla to precipitateihe ~-subunitof Ca~~/CM-PK)l from rat brain. Gel; showadauniqueband of molecularrnass54 kDa (Figura 3). This agraeswith thasize praviously reportadfor thax-subunit(50-54 kDa){81. Altbough several tissue isoforms of Ca2>/CM-PKII hayabaendescribedto date [8]. Une molecularmas; reportadfor chasubunitsof rat liver kinasa(50-53 kDa) [27.281is similar (o (batof thao-isoform[8]. Thus a uniquabandof 54 kfla wasobservadin thageisaherimmunopracipitationofrathapatocyteCa2t/CM-PKII (Figure 3), indicating thai the immunopracipitationpro-ceduraamployadis valid for our hapatocytesystem.

Exparimanís ini which C-a~/CM-PK1I was immunopracipi-notadfrom 32P-iabelledhepatocytaswaresubsequantlyconducied.

- A

84

e

L.

¡ ¡

--o -1 2

Reguhation of carnitine palmitoyltranslerase activity 215

ab cd— — —

FIgure 4 Eblect of KN-02 an DA-Inducflphnsphorylallon of CaZt/CM.PkII

Hepatocytss mene labefled ¡¡¡lb02P [nr 1 b and Ihea ireaned [nr15 mm mi<fi ¡he bnllnming: nt

acditiens llane a). 0.5 yM OA ((ane 1>. 30 pM KN-62 «ane o) and 30 pM KN-62 pIas 0.5 ~CA ((ane di. <mmuoeprecipibatinn nl Ca2~/CM-PKl< mas peibormed as cescribed in ¡beExoermnenra) senflea. The arrew lodicates lbs 54 <Da baod.

As shownin Figura4. a uniqua~ bandappaaradin theautoradiograms.Une molecular massof which coincidadwmththai of immunoprecipitatedCa~/CM-PKI).i.e. 54 kDa (Figure-, .~ - OA produceda markadincrease o <he phosphorylationofCa</CM-PKII. KN-62 preventedthe OA-inducadphosphoryi-¿«ionof hepatocyteCa2>/CM-PK¡1(Figure 4). Densitomatryofthe 54 kDa bandin the autoradiogramscorraspondingto threediffarant hepatocytepraparation;gaye tha foiiowing relalivevaluas of intansiíy: no addiíions. 1.003-OB: 0.5 yM OA.3.61±0.59(P <0.08 comparadwith incubation;with no addi-tions):30¡rMKN-62 O 7~+20:30pM KN-62piusO.SpMOA.0.83+ 0.25.

DISCUSSIDN -

Severalstudiesparformadby our eroupusmngdiginonin-parma-abilizedhapatocytesled to thasuggastionthat phosphory¡ation—dephosphorylationmight be involved in theshorn-tarmcontrolof hepatocyteCPT-l activity (reviawedin [3]).Howevar, furtharresearchshowedthai tha increasein CPT-I activitv observadinOA-traatadhepatocyaswasnot dua co the direct phosphoryi-¿<Pon of the CPT-1 enzyma[7]. In addition. non-dillusibla calicomponant(s)<bat are ratainadwithin parmeabilizedcalis (e.g.cvtoskalatalalements)but which are Iost on preparationofmitochondrmaappearadto be essentialfor tba stimulatoryeffectof QA to bedemonstratad[7]. KN-62 hasbeenrepeatadlyusada; a spacificcali-permeableinhibitor of Ca~/CM-PKi1 auto-phosphoryladoni(sea refs. [8.29W Henca. un <he basis of <haantagonismexeried by KN-62 orn the ellects of OA. dMaprasannadin this report point <o tha inx’oivamentof Ca2~/CM-PKI¡ in ihe OA-inducadstimulationof hepatocytaCPT-1. Thusthe OA-dapandentstimulationof CPT-¡ musí ba depandentun<he parmanantactivationof Ca2~/CM-PK)tby autophosphoryl-ation. Le. OA must inhibit tina phosphatasasinvoived in thadaphosphorylanion(= deactivation) of au<ophosphorylatadCa</CM-PKiI. Likawise. activarionof Ca2>/CM-PKII appearsco be involvad in oíher affactsof OA on hepaíocvíes.niamalydisruption of tha cytoskelaton[¡0]. supprassionof autophagy[¡0.11] ¿md stimulationof phanyialaninehydroxylase(l2]. Tinaseobsarvations-also indicatethat protein phosphatasesof nypa land/or2A areinvolved in the daphosphorylaiionof C&>/CM-PKII in inac rat hapatocytes.in agreameníwith raports on ratbrain Ca>/CM-PKiI {30j. OA-insensitiveprotain phosphaíase2C has ¿,¡so beenshown <o daphosphorylataCa>/CM-PKIIpurified from rat brain [31]. ¡-lowever. <he possiblarole of tinisphosphatasein the dephosphor~lationof hepatic Ca’~/CM-PK¡l is a; vet unknown.

KN-62 was alMa to antagoniza(i) <ha stimulationof CPT-1induced by OA and hapatocytashrinkagaand (u) tha OA-induced hepatocyíashrinkaga.Theraforaa link may exist notoniy betweantha OA-triggeredphosphorylationof Ca2~/CM-PKII and<heOA-inducedstimuiationof CPT-I.but alsobatwaanthaeffectof QA andcali shrinkageon CPT-1activity. In lina wi<h<hasedata. Háussingarandco-workers[23,32]hayashownthatCa2~-mobiiizing agantssuch a; vasoprassinand extracallularATP decreasehepatocytavoluma. Navartheiess.wa ara awarethat thamagnitudaof theacrivationof CPT-1 inducedby 0.5 jaMOA is muchgreatar<han that elicited by hyperosmoticmedium,aithough the latter reduces hapatocytavoluma much moramarkediythan <ha formar (sea <ha Rasultssection). In addition,KN-62 ‘xas unabia to antagonizathe decreasein hapatocytevoluma inducedby incubalionof cali; in hyperosmoticmadium.Renca. although tina stimulation of CPT-1 by OA might beparniallydepandenton Ca2~/CM-PKIIandin turnon hapatocytashrinkaga. the possible connectionbatwaen thase paramatar;requirasfurther invastigationi.

Tha machanisanby which Ca2>/CM-PKII activateshepaticCPT-I is stili not known. Evidencehasbeenpresentadshowingthatthastimulationof heparocytaCPT-1 by OA doesnot invoiva<he direct phosphorylationof CPT-1 [7]. Wc haya recentlyobtaineddata indicating thaI cytoskaletalcomponantsmay beinvoived in the stimulationof hapatocytaCPT-l by agantssucha; protain phosphataseinhibilor; (inciuding QA), vanadataandcAMP analoguas[32a1.AII tinasa compoundsare potant dis-rupter;of thacytoskeiaroniof hapatocytesandstronginhibitor;of hepatocyta autophagy [10.11,33,34].lntarastingly, <hasedecísof protein phosphatasainhibitor; (vanadataand cAMPanaloguas)haya baen shown to be antagonizedby KN-62[10,; I.33.34]~ lo fact, Ca~t/CM~PKIl is one of the nnostimportantproreinkinasesinvolved in Una control of cytoskalatalintagrity by pinospinorylation[8]. ‘It biod; tu both microtubulasand inrarmadiatefilamenís wirh high affinity, phosphorylatingprotain; such a; vimentin, plactin. microtubula-associatadprotein-2and tau ¡8]. ThapossibiaconnactionbetweenactivationofCa’/CM-PKII. disruptionof thecytoskeletonandactivationof CPT-1 is currantly understudy ini our laboratories.

We are awarethat a discrepancyaxistsbatweentheaffectsofOA aodagantsthat increasecytosolicfraaCa2~concentrationunCPT-1 acrivity and Ca24/CM-PKII phosphorylation[35]. Foraxample.A-23187. lika OA. inducesa 3—4-fold increasein thaphosphorylation axtent of ral hepatocyta Ca24/CM-PKII(G. Velasco. M. Guzmán. V. A. Zammit and M. J. H. Gealen.unpublishadwork), but it hasno affact 00 CI’T-l activity [7.35].The reasonfor tina lack of stimuiatoryallactof compoundsthatIncreasacytosolic free Ca~ concentrationon hapaticCPT-l [35]is noÉ obvious.Mostof <ha praviouswork un <he mechanismofCa2JCM-PKII autophosphorylationhas baco parformedwithbrain kinasa. it 1; we¡l establishadIinat ¡neural Ca2~/CM-PKIl isfirst rapidly/transientlyactivatedby Ca2~/calmoduIin.and <han<ini; activarad form of <he enzyma undargoespermanantac-tivation by -auropinosphorylation[8].Howevcr. tinis machanismmaynol beexactlyidantical in axtranauralíissuas.Forexample.smooth-muscleCa~/CM-PK¡1 ;hows a dillerent pattarn ofCa>/calmodulin-depcnidentauíophosphorylationfrom tinat oftina brain enzyme,cg. <ha Iattar becomasautophosphoryiatedmuch mora rapidly <han <he formarand <ha aminoacid rasiduesaurophosphorylatedin <ha íwo enzymesarevary different [91.Asfar a; we know. no study has baenperformed<o date un <hamachanismof hepatic Ca2JCM-PKII autophosphorylation.itwouid <hus be inlarestingtu determinawinetherOA and A23 ¡87induce <he pinospinorylationiof dillarant amino acid rasiduasinheparocvtaC-a2~/CM-PK1l. anid wharherothar protemnis whose

216 G. Velascoand others

pho;phorylationis triggerad by OA (but not by A23187) arerequirad for tha stimuiation of CPT-¡.

13V. mas Ide recipiení cf a FEES sbudentship. Thess ¡nvest¡galions mere supportedo pan by Ide Nebherlands Faundation fo; Chemical Researod (SON) ¡¡lId linancial

aid treo Ide Nethsrlands Organization ter Scieníific Researod (NWO). as melí as by(he Soanish Comísión lníermioister¡aI de Ciencia y Tennologia (5AF93/0281).

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Rece:-;ed 11 June 1996/3 Septennber 1996: annep¡ed 12 Seplember 1996

THE JOURNAL OP WOLOGICAL CI4EM¡SIRY (en revisión)

Malonyl-CoA-independent Acute Control ofHepat¡c Carnitine Palmitoyltransferase 1 ActivityRole of Ca2~/ca1moduIin-dependentProtein K¡nase II audCytoskeletalComponent?

Guillermo Velascot, Math J.H. Geelen,and Manuel Guzmánt

Fromthe ‘~Departmentof Biochemistryand MolecularBiolo~r 1, Schoolof Bio)o~’, ComplutenseUniversity,28040-Madrid,Spain,and the‘ Laboratoryof Veíerina¡yBiochemistry,Schooiof VeterinaayMedicine,UtrechtUniversity,3508-TDUtrecht,TheNetheriands

Thiswork wassupportedby granrsfroan the SpanishComisiónInterministerialde Cienciay Tecnología(SAF9Ó/O113) aradFondode InvestigaciónSanitaria(FIS97/0039),aswell asfror» the NcthcrlandsFoundationfor ChemicalResearch(SON)and the NetheriandsOrganizationfor Sciantific Research(NWO)

-The mechanism of malonyl-CoA-independent acate

control of hepatie carn¡tine palmitoyltransferase 1 (CP’T-I)

acrivity was investigated. In a first series of experiments,

the possible involvement of the cytoskeleton in the control

of CI’T-1 activity was studied (1) Treatment of

pe¡-meabllized hepatocytes with tryps¡n ¡u very mild

conditions produced a ca. 50% stimulation of CPT-1. This

effect was not observed in celis that bad been pretreated

with okadaic acid (QA) and seemedto be due to tbe action

of tryps¡n 00 cdl component(s) distinct from CPT-I. (u)

Incubation of ¡ntact bepatocytes with 3,3’-

iminodipropionitrile (IDPN), a disruptor of intermediare

filaments, ¡nci-eased CPT-1 activity in a non-addit¡ve

manner with respect to OX Taxol, a stabiiizer of tbe

cytoskeleton, prevented the QA- and IDPN-induced

stimulatlon of CPT-l. (iii) CPT-I activity iii isolated

mitochondria ns depressed ¡o a dose-dependent fashion

by the addition of a total-cytoskeleton fraction and a

cytokeratin-enriched cytoskeletal fraction, tbe latrer be¡ng

3 times more potent than the former. lo a second series of

experiments, tbe poss¡ble link between Ca2~/calmodulin-

dependent protein kinase 11 (Ca2/CM-PKII) and the

cytoskeleton ii-as stud¡ed in the contefl of CFI’-1

regulation. <i) Purifled Ca~~/CM-PKll activated CPT-1 ¡u

permeabilized hepatocytes but not in ¡solated

¡nitochondria. (ji) Purifled Ca2JCM-PKII abrogated tbe

inhibition of CPT-l induced by a cytokeratin-enriched

fraction. (iii) The Ca2~/CM-PKlI inhibitor KN-62

prevented the OA-induced phosphorylation of cytokeratins

in intact hepatocytes. Resuits thus support a novel

mechanism of sbort-term control of hepatie CPT-l activity

wbich may rely on the cascade Ca2 JCM-PKIJ activation

-> Cytokeratin phosphorylation -> CPT-1 de-inhibition.

Mitochondrial fatty acid oxidation in livor provides a

major sourco of energy Lo this organ and supplios

extrahepatic tissuos with ketone bodios as a glucose-

replacing fuel (1,2). Carnitino palmitoyltransforase 1 (CFI’-

1), the outer-mitochondrial-menibrano carnitino

pa]mitoyltransforaso, catalyzos the pace-sotting stop of long-

chain fatty acid translocation hito dio mitochondrial matrix

(1-5). Moreovor, receut determination of flux control

coefficientsof the enzymesinvolved in hepaticiong-chainfatty acid oxidation showsthat CPT-I plays a pivotal role incontrolling tho flux through tbk patbway undor differentsubstrato concontrationsand patho-physiological ataros(6,7). CPT-I is subjectod Lo long-torm rogulation liiresponk to altorations in tho nutrirional aud hormonalstatus of tSe animal (1,2,5). Short-termcontrol of CPT-Iacdvity involves inhibition by malonyl-CoA, the product ofthe roaction catalyzedby acetyl-CoAcarboxylase(8). Sincetho lattor onzyme ja a koy regulatory site of fatty acidsynthosisdenovo (cf. 1-5), malonyl-CoAinhibition of CFI’-1 allows an elegantexpianationfor tho coordinatocontrolof tho partition of hepatic fatty acidsbetweonostorificationand oxidation. As a matror of fact, ovidonce hasaccumulatedduring tSe lasÉ two docadoshighlighting tSepbysiological importanco of malonyi-CoA inhibition ofCPT-I not only in livor bur also iii extra-hopatictissues(1,5).

During tho lasÉ years, howovor, a novel mochanism ofcontrol of hepatic CPT-I activity has beon pur forward.Srudios using permeabilizod hopatocytoshayo shown thatvarinusagontsoxort short-tormchangos¡u CP’I’-I activity iii

parallol with changos ¡u tho rato of long-chain fatty acidoxidation (3,9). Thososhorr-rermchangosira bopatioCPT-lactivity are asaumedto be mediatodby a malonyl-CoA-indopendent mochanism, since they survive cdpormabilization, extensivo washing of tSe permoabilizodcelis «o aliow complote reoñoval of malonyl-CoA) andsubsequontproincubationof tho coil ghostsat 3TCbeforedetorminationof CPT-I activity (to allow equalizationoftho conformationalatateof CPT-I) (10). Evidoncohasalsoboen prosontod showing thaÉ the stimu¡ationof hepaticCPT-I by tSe phosphataso inhibitor okadaic acid (OA),used as a modol compound to study tho shorr-tormrogulation of CPT-I, doca nor involvo tho directphosphoryiationof CPT-I (10). It hasbeenrocontlyshownthat tSeOA-inducodstimulation of CPT-I ¡a preventedbyKN-62, an inhibitor of Ca2~/cahnodulin-dependontprotoinkinase II (Ca2~/CM-PKII) (11), aud by taxol,a atabilizerofthecyroskeleton(12). Theseobsorvations suggostthat bothactivation of Ca2~/CM-PKII aud disruption of thocytoskoloton may be nocossary for the QA-inducedstimulationof CPT-I Lo be demonstrated.It os conceivable

1

diaL diesetwa processesmaybe relaLed,sizice Ca2JCM-PKII isonoof tho proteinkmasosmoreactive¡yinvolved indic control of the inLegrity of tho cytoskeleton byphospborylating cytoskeleralproteins (13). However, theavents undorlying this novelmechanismof control of CPT-Iactivity are as yot unknown.Tlio presentwork was thusundortakento study iii detall tho molecularbasis of themalonyl-CoA-independontsbort-torm control of hopaticCPT-Y activity.

EXPERIMENTAL PROCEDURES

Mateñais - L-[methy/-3H]carnitine, carrier-free [32P]P1,[1-

‘4Cfacetyl-CoA, the ECL detectionkit and the protain kinaseC

assaykit werefrom AmershamInternational(Amersham,Hucks,131K). Terradecyig)ycidatewas kindiy donated by Dr. .1KM.Lowenstein(BrandeisUniversity,Wa)tham,MA). The anti-CPT-Ianribody(raisedagainstpeptideresidues428-441 ofratliver CFI’-1) was kind)y given by Dr. Victor A. Zammit (HannahResearchInstituLe, Ayr, UniLed Kingdom). Coichicineand cytochalasinBwerekind)y gifted by Dr. .1KM. Andreu(CIB, Madrid,Spain).3,3’-iniinodipropionitrile (IDPN) was frono Acros Chinúca (Geel,Belgium).OA,KN-62, A23187andclassicalproteinkinaseCwerefrono Calbiochem(San Diego, CA). Ca2~/CM-PKII was fromBiomo) (Plymouth Meeting, PA). cAMP-dcpendentproteinkinase, írypsin and the monoclonal anti-cytokeratin antibody(done1(8.13) were frono Sigma(St. Locis, MO).

Iso/añonand incubañonofheparocytes- Mala Wistarrat; (200-250 g) which had free accessto food andwaterwere usedin aUexperiments. Hepatocyteswere iso)atad by ¡ha collaganaseperfusion method as describedbafore (9). Hapatocyteswereroutmely uncubatediii Krebs-Henseleitbicarbonatebuffer (pH7.4) supplementedwith 10 mM glucosaand 1% (w/v) dafattedand dialyzed bovina serum albumin. Incubation; (4-6 mg ofceUular protein/ml) were carried mit aL 37C iii a meíaboiicgyratoiyshaker(85 oscillationsparmiii), underan atmosphercof0

2/C02 (19:1).

Ass~vof CPT-Iacñviíyña isoé’atedmitochondña- Mitochondriawere isolated citber from hepatocytesand CPT-I activity wasmeasured as the malonyi-CoA-sensitive uncorporation ofradiolabelled L—cannitine bito paimitoylcarniíine exact¡y asdescribedbefore (10). WhenCPT-I activity was determunedinsuspensionaof mitochondria contauning cytoskeletal fraction;(Figs. 2 arad 3), CPT activity was also determunediii al) thecytoskeletalfractions employadand than substraaadfrom IheCPT-I acttvity experimentaUydetermined.An>way, CPT activitydetarmunedin Ihosacytoskeletalfractioraswasalway;marginalandon Lhe basisof proteuncontentnevaraccountedfor more[han5%of <he CPT-I activity measurad iii mitochondrial suspansiona.Preparations of mitochondria were practicalí>’ davoid ofparoxisomes,asjudgedfromthe ¡0w recovar>’ of catalaseactivity(<5%) in thosepreparations.

Assayof CPT-I acñvity in penneabilizedhepatocytes- Afteruncubationof thehepatocyteswith theadditionsindicatedini eachcase,CPT-I activity was determunedin digitonin-permaabilizedhepatocytesas the tetradecylglycidate-sensitiveincorporationofradiolabelled L-cannitunebito pa¡mitoylcannitine(9,10). in Ita“one-stepassay (Tabie II), cali permeabilizationand assayofenzyme activity are simu¡taneouslyperfonniad (9). Iii other

expariments,however,CFI’-! activity wasdeterminadby a morecomplexprocedure(Fig. 1). Iii this “two-srep assay

M, ceL arepermeabilizadwith digitonun,aradthenextansivel>’washedwith 40volumesof a mediuno containung10 mM Tris-HO, pH 7.4, 150mM KCI, 5 mM EDTA and5 mM EGTA. fle permeabilized-ceilpeleÉ was resuspendediii that medium with the additionsundicatedand CFI’-I activÉ>’ was subsequentlydeterminadafterpreincubationaL 37C for 5 miii. This was achieved exactlyasdascnbedpreviously (10).

Sincepermeabilizedhepatocyt¿saisoexpressCFI’ activÉ>’ fromperoxisomesarad microsomes,Ihe contributionof CFI”-! to totalhepatocellulartetradecylglycidate-sensitiveCFI? activity hasbeenquantitiad. Thus, hepatocyteswere uncubated with 10 ¡¿Mtetradecylglycidatefor 30 miii; purifiedmitochondria,peroxisomesandmicrosomeswereisolated(9), andCFI’ activity wasmeasurediii ¡hase fractioras. It turnad out that at ¡aast 85% of totaltetradecyiglycidate-sensitive CPT acrivity experimental)>’determinadcorrespondeto CFI’-I, whereasmicrosomalCFI” aradparoxisomalCFI’ togethermakeamunorcontribution(<15%)tothetetradecy)glycidate—sensitiveCFI’ pool undertheseconditioras(ref. 9 arad results noÉ shown). Therefore,we beliave thatdatermunationof CPT-I activity by this procedureis not pronatosubstantialerror.

Westembtor analysisof CPT-I - Mitochondrialfractionswere;ubjacted¡o SDS-PAGEusung1.0-mmthick 10%polyac¡ylamidegals.Stackungandresoivingbuffer pHvalueswereadjustedto 6.8arad 8.8, respective)>’.Proteunswere transfarredfrono SDS geisontonitroceilulosemembranas.Thehlotswerethenbiockedwith5% fat-frae dniadmilk lii PBSsupp)ementedwith 0.1%Tween20.Theywere subsequentí>’uncubaredwith Ihe anti-CFI’-I antibod>’(1:5,000) iii PBS/Tween20 fon 2 h at4C, andwashedthorougly.The blots were Unen uncubatedwith anti-shaep peroxidase-conjugated secondar>’ antibo@ (1:10,000) fon 1 h aL roomtemperatura,arad final>’ subjectedto luminographywith an ECLdetectionkit.

Isotation of cytoskeletatfractions - Two cytoskeietal fractionawerepreparadaccording Lo van Bergan en Henegouwenet al.(14). Briafly, isolatadhapatocyteswaresedimented(2 radaat 100x g) arad resuspended iii a cytoskeietonstabilizungbuffer (CSKbuffer) consistingof 10 mM Pipes,pH 6.8, 0.25M sucrose,3 mMMgCI

2, 150 mM KCI arad 1 mM EGTA. mis buffer wassupplemented with the folowung proteunase unhibitors:phenylmethanesulphonylfluonide (75 aNt), tosyl-L-phenylalaninechioronethyl ketone (2.5 ug/m)), íosyl-L-.lysine chloromethylketone (25 sg/mI), tosyi-L-argununamerhyl ester (2.5 sg/mI),pepstatun(0.8 sg/mI), taypsun unhibitor (7.5 sg/mI), laupeptun(0.8 sg/mI), banzamidine (115 sg/mI) and aprotunin (0.06kallicreun unhibitory units/ml), together with 10 mM 2-mercaptoathanol.Thafraction correspondingtototalcytoskeleton(Fraction 1) was obtainedby incubarionof hepatocytesiii CSKbuffer with 0.5% Triton X-100 at room temperaturefon 10 miiinad subsequantcentrifugationar20,000x g for 1 miii (14). Thefraction anniched iii intermedia¿efflaments (Fraction II) wasiselatedby uncubationof hepatocytesun CSK buffer with 0.5%Triton X-100 for 10 mun at 4C (which allows tubulindepolynierization)and ira thepresenceof 0.6 M Kl (which allowsactundepolymarization).Collactionof the untermediatefilament-annichedfraction wasperformadas in (14). Thetwo cytoskeletalfractioraswere fanal)>’ resuspendedun CSK buffer supplementedwith theafora-mantionedproteinaseinhibitors aradcharaccerizedfor their contentiii tubulun andcytokeratinsaxactí>’as un (14).

2

Immunop~rcipi¡añonof32P-¡abeiledcytokemñns-Aftar isolation,hepatocyteswerewashedtwice iii phosphate-freeDMEM madiumsupplementedwith 1% (w/v) defattedand dialyzedbovinaserumalbumin. Hapatocytes(6-8mg of cellular protein iii LS ml of Useaforemerationedmadium) wera subsequentlyiracubatediii thatmediumar 37C iii a metabolic~‘rato¡y shakar(85 oscillatioraspar miii), underan atmosphereof 0jC0

2 (19:1). Hapatocyteswera )abelledwith 0.2 mCi of [

32P]Pfor 1 Ii arad subsequantlyexposedto the additionsundicated.One mi of celis was rapidiysedimentad(5 sal 12,000 x g) arad resuspendediii 0.5 ml of 50mM Tris-HCI, pH 7.4, 0.15M NaCí, 1% (y/y) Igepal, 0.5% (w/v)sodiumdeoxycholateand0.1%(w/v) SDS,supplementadwith theafore-mentionedproteunaseunbibitors. Sampleswerecantrifuged(1 miii at 12,000x g) arad 500 pl of Lhe supannataníware treatedwith 1% (y/y) Triton X-100 br 1 mira. After anothercantnifugationstap,200 plof the resu¡tungsupamataratweratakenfor inomunoprecipitationby uncubatungwiíh a monoclonal anti-cytokaratunantibod>’ bound Lo proteun A-Sepharoseiii TTHSbuffar (20 mM Tris-HCI, pH 7.5, 0.5 Nt NaCí arad 0.05%Tween20). ‘Pie latter wasalso supplemaníedwith prolainaseinhibitors.Immunoprecipitationof cytokaratunswasperformadasdescribadbaforafor acetyl-CoAcarboxylase(15) andCa2~/CNt-PK1I(11).Sampleswaresubjectedto SDS-PAGEasdescribadaboye.Afterfoxung anddrying of Usegeis,32P-laballadbandswarevisualizadbyautoradiography.

Incubañonwida pmrein kino.ses- Permeabilizedheparocytesorisolatedmitochondria (1.5-2.0mg protein/ml),supplamantedornot wiíh cytoskeletalfractions(as undicatadiii eve¡ycase),wereuncubated at 30C for 10 miii iii ejíher of Ihe followungphosphorylationmedia, arad aliquota of the incubatioraswaresubsequentlytaken to determineCP’I’-I activity as describadaboye.(i) Ca’~/CNt-PKII phosphoryiationmediumcontaunad50mM Hapes/KOH,pH 7.4, 100 mM XCI, 1 mM CaCI

2, 10 mMNtgCI2, 0.1 mM ATP, 30 ng/pl cahniodulun,50 nM OA arad0.6ng/pl purífied Ca

2~/CM-PKII, esseníiallyas recomendadby thesuppiiar. (u) cAMP-depandantprotaun kunasephosphoeylationmediumwasaxactí>’as describedbefore(10). (iii) ProtaunkunaseC phosphorylationmadiumcontauned3 mU/sil purifaedproteunldnaseC arad the assaycomponentsaccordungto Lina supplier.

Detenninañonof matonyl-CoA concentrrnion - Intracellular¡avaisof malonyl-CoAwaredeterminadiii neutralizadpcrchloricacidextractaby a radioenzymaticmeritod (15).

Stañsñcalana¡ysis- Resultsshown rapraseníthe mearas±&D.of tina numberof hepatocytepraparatiorasindicatedin cadi case.Incubatiorasof inepatocytesor mitochondriaa; wdli as anzymeassayswerealwayscarniadout in triplicata.Síatisticalanaiysiswasperformadby Studant”st test.

RESULTS

Effect of mi/ti tzypsindigestion on CPT-factivity - In afarst set of experimentaaimed aL determining whethercyroskeletalconuponantsmay be unvolved in tino controlofCFI’-! activity (12),permeabilizadhepatocyteswereLreaLedwith trypsinin very mild condiLiona(low doses,40C, 2 mm)audCPT-I activitywassubsequentí>’determinad.As shownira Fig. 1, whenhepatocyteawerouncubatediii the proaoncoof no additionsand furthor permeabilized with digiLonin,trypsinwasablo to stimulateCPT-I by ca.50% iii theseccli

ghosrs. Preincubation of hepatocyteswith QA ¡cd to asimilar activation of CPT-I iii the permeabilized-ceilsystem(Fig. 1). However, trypsun was unabie to produce an>’furthorstimulaÉionof CPT-I iii ghostsproparodfrom OA-pretreatodhepatocytos(Fig. 1).Tho cytoskeletalstabilizertaxol has been shown Lo preventthe changosiii hepaticCPT-I activity inducod by a numberof cellular offoctorsincluding QA (12). Likewise, whon hepatocyresworepretreated wiLh QA iii combination with taxol, thestimulatoryeffect of t¡’ypsin wasevidont (Table 1).

TABLE 1

CPT-I aalvnv u, pemeabiltM /aeoatocnaami ¿,oúai mácehonáñate núM 0>72mw

He~aocvcn WCTC orcincubsed toe 45 aun¡o rite absen~ crin tite pmcaaot ¡0 .h4azoÉInonaooswcra conunuedloe 85 aádiñonuimis wid, oc witboa 0.5 uM OK

Cella were peninbdized with digitotun. a~ glnu <1.5-LO mg protein/mi) WC?!subseauendv nsaed vnah oc wirhout 125 »g tr,p.É/wl lot 2 mio U 4~C Añm n~nremoval os jo F¡g. 1. CPT-l actav,t wns detamined jo penneabil~d celh ce ¡onitocbondña ¡solaed fra,,, abose permeabWzedhepuoc>fl. Resano cosr~ so 4nfferes expenmeno.

mi —(amol/mio o mg prometí

Repazco-cepee ¡noubsñcza

Sto addiúons

Taxol

DA

Taxo¡ OA

Trvpsin

ÑoYesNoYesNoYe,NoYes

Permeubjl¡zed Isolated

:04±0113.01±0.13¡98±0.34287t0.I&360±04?3.82±0.5W2.11 ±0.302.98±0.4r

58±033-81±0.67s~±u3794±0.41srn±0i72712±010757±0.588.07±¡.05

5¡oniñandvdifferem¡P<O01) from incub.úonswieboo.¿Idhio,u.

To test whether trypaun ma>’ cleave CPT-I itself underÉhoaodigostionconditioras,mitochondriawere isolatodfromcontrol and trypain-treatedpermeabilizedhepatocytosandCPT-I wassubsequontí>’detectadby Westernblottung(Fig.1). As oxpectod(5), a unique baud of Mr=88 KDa wasdetectod iii tino blots. In addition, no difforonces wereobaervedbetweenLhe two preparationsof mitochondria(Fig. 1). Furtinormoro, CFI’-! activit>’ was dotorminediiimitochondriaisolatodfrom pormoabiizodhepatocytesthathad been treatedwith or without t¡ypsin. As ahown inTablo 1, no dilforences ira CFI’-! acrivity were evidentamongLhe different conditiona.

It is worth ¡uoting that treatmont of pormeabilizedheparocyrosivith trypauniii the conditionaempioyedharemhad noeffoct ontho rocover>’of total pormeabilized-coilortotal mirochondrial proteun. Tinus, when permeabilizedhepatocytasaL 1.6±0.2mg protein (n=4) were troatedornot with 17.5 pg trypsun fon 2 mira aL 40C andghostswerecollected aher stoppirag trypsin action as described iralegond to Fig. 1, 1.5±0.1and 1.5±0.2mg ghostproteunwere respectivel>’recovered.Likewiso, whenmitochondriawereisolaLedfrom thosegliosta,0.18±0.04aud0.19±0.06¡ng protemwere recovaredin ¡nitochondriapreparodfrommrypsin-trearedandtrypsin-untreatodghosts,respectively.

3

fliE JOURNAI. OF WOWG¡CM. CHEMISTRY <en revisión)

TABLE II

Eff ces ofdin,,xas of ¡he qeatkMona.CPUn* .~ i0m4 frtei

Hentccvteswere premoibetcd for 45 mira lo tite k — la ¡beptn of tite

nnowaaon of cvnkcleuá inujmny indialsd. ¡aaÉs~ we,t anaS ter 15adadonal — váab or “.,thout 0.5 »MOA. aaá din .Iiquoc .exemkn te delanune

¡ cfl”-i by tite one-etepsafasw.I¡ ma wuloa>4.CoA¡o.k Cw.4n~Span vanof CFI-! actnwv andmalouiyl-CaA aeennnozwere).29±ftflo,neI/mnnzmgpmtelfland 73±12pmoi/mg protein. respeaivciy. Rh. an~k <o <be ¡anta ofexnenmerns ¡racimaS Ira parenuhesn br Cf! amivfry Md <o 3 dMnnt aain~SLot maioovl-CeA coo~nnuOL

5 120’-

e

ab:r

6 12 18

[Trypsinl (inglmi>

HG. 1. FIlen of n.ild brypsin digestion en CPT-I actidby lapenneabilized hepatocytes. Hopatocytoswere preincutiated for 15 mm iradio absonce(o) or ira Iba presoraco (@)of0.5 gM OA. Ccli; ~cre ehenpormoabilized váth digitorain arad thorougJy washodwith 40 volumescfdigitonin-free modium as described ira Experimental Procedures.Permoabulized hopatocytes were subsequoratly resuspendod at 1.5-2.0 mgprotejo/ml and troated with vatying concentrations of tzypsin at 4C.Trypsinactionwasstoppcdaftor 2 mira ti>’ additioraof 10 mg/mlof bovinoserumalbuniin aradimmodiate washingwith 40 volumosof erypsin-froemedium. mora. CPT-T activity wasdetorminedira thoso penneabilizodhepatocytes. One-bundrod percoral CPT-i activity was 1.87±0.20ramol/min ir mg protoira. Resu¡ts corrospond te 4 d¡fferont calipreparation;.lnset: Mitochondria were isolatod from pormeabulizedhepatocytosthat liad becotroatodwiLbout (lanea) or váth (lario ti) 17.5gg/mI tzypsin,arad CPT-I wasdetectedti>’ Westorn blctting. ‘Dio arrowpoints te iba 88-KDa band.

Effectof disn¿ptorsof tite cytoskeletonoit CpT-i ac¡iviry -

OA and otber phosphataso inhibitors producehyperphosphorylarionand corasoquontlydisruption of thecytoskeletal network ira sevaral cail types, includinghopatocytes(e.g. 16,17). To test whether changasin Lhoorganizationof the cytoske¡etonmaybe relatedto parallelchangasira CPT-I activity, hepatocytcswere incubaLodwathcolchicune (a microtubule disrupLor), cytochalasinB (am¡crofilamont disrupror), and IDPN (ara intermediate-filament disruptor) (18,19).As shown in Table II, raeithorcoichicinenor cytochalasunB affectedCPT-I acrivity. A; acontrol to prova the biologica] activity of Lhese Nrocompoundsonhepatocytes,cellularlipid; werepre-labeiledwith [‘4C]palmitate,andvery-low-derasity-lipoproteinoutputanto the medium was monitorod (26). As previousiydescribed(20), disruption of microtubuleswirh colciiicineor disruptionof microfilamontswith cytochalasira8 led toa sLrong inhibition (>90%) of the output of very-low-donsity-lipoprotoinlipids into the mediumaradto a parallalaccumulaLionof intracellularlipids.

Heoa¡ccv,e

Drerncuoauon

No additions

Co¡ctucine (50 uMl

cvnochalasin 8<10acM)

1DPN <5 mM)

TaxoiIIOuMl NoYe;

Thxoi (10 oMí rDPN (5 mM) NoYes

No 160±t7Yes <54±1?<8)No 98±12<4)Yes 155±88’14)No 96±¡1<4>Ye; 51±18<<4)No 43±IP (6)Yes 166±8.? (6)

¡02±9<4>104±8<4)96±6<6)99±5(6)

160±867±996±145a 6’104±217±303±15

dar?¡01±8213±8<101±97~4a

Siniñcand,different íP<0O¡) from incjbauo.a wnb no aMibáoxn.

In contrasL to coichicuno and cytochalasin B, IDPNproduced a significant uncreasoira CPT-I activity (Table II).Iraterestungly, tho offocts of IDPN and QA wore basicallyraon-additive(Table II). Furthermore,srabilizationof libecytoskeletonwith taxol preventedthe srimulationof CFT-Iiraducedby IDPN and04 either alonoor iii combinafion(Tablo II). It shouldbe pointed out that neiliher taxol norIDPN changedby thomselvesma]onyl-CoA coracentrartoniii hepatocytos(TablaII). In addition,noirbor of thesetwocompunds affected the QA-induced docroase ofintracellularmalonyi-CoA levels (TableII).

Effect of cytoskeletalfractions oit CPT-I activity - Tofurthor support the notiora that cytoskeletal componontsma>’ inhibir CPT-I, Nro cytoskelatal fraction; were isolated(14) to sLudy thoir possible unhibitory effoct on CPT-I.Mitochondria woro liben uncubatedwith tho cyroskeletalfracrioras arad CPT-I activity was dororminod.As showniraFig. 2, Iba Nro cyliosko¡otal fraction; produceda dow-dependentunhibition of CPT-I activity. In agroemontwithtSe effect of IDPN doscribed aboye, dic fraction that wasmoro enriched in intormodiato-fiiamont componenlis(Fraction II) produced a more potent unhibition of CPT-I(Fig. 2). Fifty parcent unhibition of CFI’-! b>’ the Nrofraction; occurrod at total cytoskeletal protein:roralmirochondrialprotoin ratiosof 0.104±0.25andfl.032±0.O08for Fraction 1 arad FractionII, respectivol>’.

Effect of punfledprotein ¡<litases on CPT-I acrivity - Onthe basis of tho antagonisriceffect exertedby KN-62, aninhibitor of Ca24/CM-PKII (21), the OA-dependantstimularion of CPT-I has beon suggostedto rol>’ on thophosphoryiationarad subsequontactivation of Ca2~/CM-PKII (11). Hence,purified autophospborylatedCa2~/CM-PKII was directí>’ added Lo isolated mitochondria or

±0—

-4e—»

4

permeabilizod hepatocytos and CPT-I acliivity wasderermunod. Ca2~/CM-PKII was ablo to signuficantly(P-cO.O1)stimulalieCFI’-! in permeabilizedcells (140±8%stimulation,n= 4) but nat iii isolatedmitochondria(6±7%stimulation,n= 4). In contrasli,addiliion of purifiedcAMP-dependent proteun kinase or protoin kinaso C topermeabilizedhepaliocytesdid not producean>’ changeiiiCPT-I acriviliy in eirhor isolated mitochondria orparmeabilizedbepatocytes(dalia noli shown).

120

o-

ci

100F~

90 1-

¿0 h

40 f-

20

OF-

-n -3

<cg [Cvtoskeletalprvteínj4Mitoctwcndrialproteiril

HO. 2. FIlen of cytoske¡etal fraetiona oit CPT-l activity. ¡vlepaticmitochoradria (15-2.0 mg protoin/aul) woro incubated for 30 mm withvaryingamountsof cytoskeletalrracticns(e, Praction1; o, Faneticra ti)arad CPT-I activity was subsequentí>’ deternhletod as indicated iraExperimental Proceduros.Ono-hundrodporcont CFI’-! activity was865±1.11ramol/mira ir mg proteira. Results corrosporad¡o 4 difforontexporimoflts.

In arder lio define tite cali campononlis that are sufficionlifor rite malonyl-CoA-independentcontrol of CPT-I lio bedemonstrated,we raenattemptedtorecansLitulietite whole-cali experimental system in asimple mannerby incubatingisolatedmitochondriatogeliherwitit cytoskcletalFractionIIand purifaed Ca2JCM-PKII. As shown in Fig. 3, Liteunhibition of CP’I’-I producadby exposuraof isalatodmitochandrialio cytoskelotalFraction II was revertedbyadditianof exogenausCa2~/CM-PKII.

Fhosphorylation of cytokeratins in intact hepatocytes - Toobliain furtitor evidencofor titepossibleconnectionbetweenCa2~/CM-PK1Iaradintermediarefilaments,exparimentsofhepaticcyliokeraliin pitosphorylationwere performed.Titepitosphorylationpatternof purifaedcytokeratinsin vitro ma>’noÉ reflecli titeir phospitarylaliiora staLus in morephysiological,intact-coll systems(22-24).Titerefore, intacthepatacyteswere labelledwith 32P< and cytakeratinsworoammunoprecipilialied.As shown in Fig. 4, twa majarcyrokeratin bandswere phosphorylaLedupan itepatacytecitallerago to OX Thesetwa bandewere assignedLo cyto-

ti k-

o-

1~)

90 F-

~ractrcnII

Ca¡CM-PKII

FU].]. Effenof Ca2 /CM-PKII en CPT-I adivity. Hopatic mitochondria(1.5-2.0mg protein/mí)werepreincubatedfor 30 mira ira the absonce(-)

or ira tho presorace (-4-) cf cytoskelotal Faaction II (0.05-0.06 mgpro¡ein/mfl. Purifiod C.a2~/CM-PKllwassubscquontlyaddod(-4-)or not(-) te tÉ incubadoras, which v.ere run for 10 additioraa¡mm. Aliqacoeswero subsoqueratly takon te determine CPT-I activity. Resultscorresporadte 3 differont experimeratCSignificaratlydifforent (P-c0.01) frominaibatioraswitb no additions.

keratins8 and 18 on Lite basisof liheir Mr (54 and 45 KDa,rospecrivel>’) and higb abundanceiii rat liver (eg.22-24).Mareover, tite QA-unducedphospharylationof dieseNrobande was prevented by KN-62, Lite Ca2~/CM-PKIIinhibilior titar antagonizeslihe OA-inducedstimulationofCPT-I (11). Novertheless,libe Ca2~ ionophore A23187hadno effocli on cytokeratin phosphorylation iii intacthepatocytes(Fig. 4, lanese and O.

ab

94—

67-

43—

E: d ef

½

PTO. 4. Phospherylation of cytokeratins 1t intact hepatocytes.llepatocytos wero ¡ceded with 32P~ as indicatod ¡o ExporimenealProceduresand further incubatodfor 15 mira iii tho absonceor ira thepresencaof 30 pM KN-62. iracubatioraswerecoratinuedfor araadditional15-mira periodwhh or v.-ithout 0.5 PM OA or 10 pM A23187. Colisweresubsoquentlydisrupted ami cytolceratins wero immunoprecipitatod witba monoclonal aíiti-cytokoratin antibod>’. lmmuraoprocipitateswertsutijected te SDS-PACEaradautoradiography.[anoa: no additions;¡anoti: QA: ¡ano e: KN-62; ¡ano d: ICN-62 plus 0A4 ¡anoo: A23187; ¡ano f:KN-62plusA23187. Molecular-massmarlceex(ira KDa) areshownentiteIeft-haradsido of tite autoradiogram.‘Dio oxperimontwasrepoatedtitreotimesandsimilar resultswero otitainod.

+ - +

+ +

-2 —1

5

IMSCUSSION

The prosent work was undertaken to study libemecbanismby which Ca2~/CM-PKII (11) togetiter wilihcytoskaletalslirucliures (12) ma>’ be invalved ira libo acutocontrol of hopaliic CPT-I, libe enzymo Litat catalyzeslibepace-settmgstep of long-cbain fatty acid oxidation (1-5).Dalia presoraliedin tuis report support the notion titaritepaticCPT-I activity ma>’ be controladiii tSeshorli termnot oral>’ by intracelularmalorayl-CoAlevels (5,8) but alsoby amalonyl-CoA-undependentmecitanismthatma>’ invalvemodularion of tite inlieractioras berwoan CPT-I andcyroskelatalcomponants.As will be discussedbelow, lihisnovel mechanismof control of hapaticCFI’-! activiliy ma>’plausibí>’reí>’ ora libo cascadeCa2~/CM-PKII activation->

Cyliokerathn pitospitarylaLiofl -> CPT-I de-inhibition.

Involvementof cytoskeleta¿componentsitt tite control ofCPT-f activity - A number of reparts haya recaralil>’describadlibe existeracoof specificintaractiorasbaliweentitemitochondrialautermembraneand cytoskeleLaleleníenlis(25,26). Ira the context of CFI’-! regulation,OA activateshapatic CP’I’-I (9) and disrupts libe cytoskelalion ofhepaliocytes by causung lihe hyperpitospitarylation ofcvtoskeletalproLeiras(16). Faurobservationsira tite preseratreport provide additional evidencafar libe iravolvemararofcytaskalalial components (most likely cytakeratirainliermedialie filamenlis) in libe control of hepaliic CPT-Iacliiviliy. First,exporimentsof mild trypsira digasLionsuggoslilihat CFI’-! ma>’ becomeactivatad by cleavageof extra-mitachondrial celi component(s). Ira lina witb lihisobservation, Forataunecli al. bayo recentí>’ reported thaliporun, the mitacboradrial-outer-membraraepore-formingprotoira, also becamos activalied ira permeabilizedhepatocytes upan mild trypsin digestiora of extra-mirochoradrialcelí componaralis(27). Iris worth raotirag titarlibe digostiora conditioras employad ira libe presenli paparwereoxtremel>’milder titanrhasapraviouslyusadby Kashfiarad Coak lio studylibe effecli of prateolysisora CP’I’-I (e.g.28), arad libaraforo libo twa liypes of experimeralisaro raotcomparable.In lino witb aurobservatioras,Frasarat al. (29)did not observe an>’ offecli of trypsin ora CFI’-! undardigestion conditions more ar iess comparablelio ours.Intorestungly,ceil pretreatmentwith OA rendarodCPT-Irelucliarali ra activatioraby trypsira, suggestiragthat bolih QAarad trypsin ma>’ sharea cammonmecbaraismto relieveCFI-! from inhibition. Secorad, incubation of intaclihepaliocytos witit IDPN increased CPT-I activit>’ in abasicalí>’ raon-additive mararaer w¡Lh respeaL to OA,suggestiraga commonmecitaraismof actian.Titiad, CPT-Iactiv¡ty m isolatod míLochoradriawasdepressedira a dosa-deporaderarfasitiora by tite addition of a totai-cytoskeletorafractionarad acytokeratin-onrichedcyliaskalelialfractiora,tSelarrer beirag3 timesmorepoterat liban libe formar. Fourtit,taxolprevoratadlibe OA-iraduceddesensitizationof CPT-I liotrypsira activation,as well as libe OA- arad IDPN-inducedstimulaliion of CPT-!. In sborr, al) titese daLasuggostthalidisruptianof interactionsbetwaeraCFI’-! arad cytoskeletal

component(s)ma>’ relievo CPT-I from inhibition aradtitorefore incroaseerazymeacliivity.

The passibililiy libat CFI’-! inlieracts witb cyroskalalialcomporaenlisas pur forward ira libis paparis ira lino with libocurrerat nation libar the dynamics and intracelulardistributiora of mitochondria ira living colis ma>’ rasulli fromspecific interactioras of mitoebondria with compononlis oftite cyroskololian (25,26). In libe case of rar brainmitochondria, accruing evidence indicatos libali specif¡cinteractiorasoccurbotwaenmitocboradrial-auter-membranaprolieinsaradcytoskelotalproroiras,aweli doscribedoxamplebeinglibe intoracrianberwoanpena,micrarubule-associatadprotain 2, and libo neurofilamontal prateins NF-E arad NF-M (26,30). fo axisronce of direct conract sitas berwaaninliermediate filamonlis and libe mitochondrial autormembranahasboen reportad nor only ira neuroras, buli alsoira smoatb muscle myocytes(31) arad adrenal cortax celis(32). As far as wa know, altbough rat livor mitochandriaitavo been sitawn to intoract witb micrarubules (33), diroctevidancafor titeir interactianwitb intermediarefilanienlis issliill lacking.

It hasbeonsuggesredlibat a funclilon of libe interacliiansbetweanmitachondriaaradintermediarefilamenlis ma>’ beto locate mitocbondria in precise sites wilibin libe cel(25,26,34). This idea is basadon experimoralisshowingaparallel redislinibutian of mitochondriaand intermediareftlamanlis upan cal expasure lio agonts tbar disruptinliermedialie filamonlis (34) ar ira cerrain strosssitualiians(35). TSemitochondnialaltaratiansobservadira dosmin-nuil

‘mice alsa supparli this bypotitosis (36,37). Since thoorganizaliianof iratermediatefilamantschangosdramaticail>’in a number of livor palibologios (38), libe abservationsdescribedira Lhe praseratpaparpradicli libar CPT-I activiliyas affacrodb>’ cytaskeloralcompanenlisma>’ changouradorpatba-pbysialagicalsituationsla wbich libe orgaraizarionoftite cytoskoletonis altored,eg. ira trarasformodcelIs. Tbus,wa hayo recenlil>’ observad(aulibar;’ urapublishadresullis)that CPT-I specific activir>’ 1; similar la miliocitandriaisolatedfrom bepatomacalsandnormal hepatocytes,bulijust abaut italf in permoabilizod hapaliocytes liban anpermoabilizeditepaliomacol];; in addiliion, CFI’-! becamasreluctantLo stimulation by OA ira bopatomacelis. Theseobservaliionssupporli Lhe noliion titar la bapatocytasOAraleasesCP’I’-I fromcertaincorasliricliiansimposadby extra-mitochondrial cali camponenlislibat da noÉ aparatecirberira isalatedmitachondriaor in transformadlivor celis.

Involvemeneof Ca2~/CM-PKJI ¡it the contml of CPT-Iacdvity - Provious exporimonlis la orn laboratorios hayoshown that KN-62, an inhibitar of Ca’~/CM-PKII (21),antagon¡zostite OA-iraducodstimulationof bepatiaCP’I’-Iactívir>’ (11). In contrasli, nailiher H-7 -an initibitor ofcAMP-dependentprateinkinaseandprotainkinasoC- nar0F109203X-a protain kinasaC inhibitar- were able roprevent libe OA-iraduced stimulation of CP’I’-I (11).Likewise, inhibirorsof libe mitogan-activatedprotoinkinasocascadosucb as wortmararaira,apiganinand PD98059 arounabia La preveratlibe OA-iraducadsti¡raulation of CPT-I

6

(autbors’ urapublisbad rosullis). Ca2~/CM-PK1I becomoscarastitutivol>’ activated wbera autophaspitarylatedla kaysermeor libreanuneresidueson tite autoraomysite of libeerazyme(13). Autophospitorylationis sufflciorat Lo disrupttite autoirahibitor>’domainof Ca2~/CM-PKII, leadingto apermananli da-inhibition of libo kinasa (13). It is LitusconceivablalibaL parmanentactivation of Ca2~/CM-PKIIerasuesupanirabibitiorab>’ OA of libe pitospitatasesinvolvadira libo depbospborylaliiora(= deactivation) of Ca2 /CM-PKI!. Ca2~/CM-PKIIautopbosphorylatiaraitasladeadbeendemorastraliedin bepatocyliesuporachafleragelia OA (13).

Tbepresentdalia polali Lo alink betweenCa2~/CM-PKIIand libe c>’toskalatonin tbo corataxli of CFI’-! ragulatiora.Thiscoraclusionis basadmostí>’ on titreeobservatioras.Firsli,purified Ca2~/CM-PKI! was able to activato CFI’-I ni

permeabilizadcelís buL nat ira isolatedmitochondria.Tbisís ira agroamerat with previous evidence againsli titeinvolvement of direcr phospitorylationira tite OA-inducedstimulation of CFI’-! (10) arad iradicates titar extra-mitochondrial cdl comporaenlis are raqulrad for liberegulation of CFI’-I acrivit>’ by Ca2~/CM-PKII. In Lhisrespecli, it is wortb notirag diaL parmeabilization ofhepatocyteswitb digilionira seemsLo preservequite wallbatb tite generalmorpboiog>’of tite cefi arad tite structureof libo cyroskaloron (39), arad titerefore tite potentialinteractiarasbotweanlibe cylioskeletonand calI orgaraellosma>’ remain basicail>’ uraaffected upora titis type ofmanipulatiara.Secorad,wbon isolatad mitocitoradria weranícubatadwitb a cyliokeratin-enricitodcytoskoletalfraction,purifiedCa2t/CM-PKIIwas abiato abrogatalibe iraitibitionof CPT-l iraducedby tbat cyliokeratla fraction. It is clearfrom titaseexperimonlistitali a simpleroconstitutedsystemcompasadby isolaliadmitochondria,a cyliokeratin-eraricbedfracrion arad purified Ca2~/CM-PKI! may reflect titesituatioraaccurrlagira Lite intaethepatacyte,iradicaliing diaLtbeselibreecompanentsaresuflicieratfor titemalonyl-CoA-iradaperadoraliacutocontrol of CPT-I to be demonstraliedinvitro. Third, Lite Ca2~/CM-PKII irahibitor KN-62 preveratedlibe OA-iraduced pitospborylation of cyrakeratins inbepatocylios, poiratirag Lo a role of Ca2~/CM-PKII oncytokeratinpbospborylationira intact itepatacylies(23,24).Pbosphorylationof cytokoratla intormediatefilamenlis byCa2~/CM-PKI! in wbolo ceils lead; Lo tite disruption oftbesestrucliuras(23,24), aradliberaforetuis observationf¡tswitb tite OA- and IDPN-inducedstimuiatioraof CPT-I.

Additioraal evidoracefar libe involvomeat of cytokeratinsira tite conLrol of CFI’-I activili>’ is givon by tbe lackof effoctof A23187 ora cyrokeratiraphosphorylatioraira hepatocyros.In lihis coraliext, challerageof itepatocytosLo OA leadsLoCFI’-I activaLiora arad c>’tokeraliin pitospborylatiora,witoreasalevationof cytosolic frae Ca2t coracentratiorab>’ A23187has no effect ora aither CFI’-! activit>’ (40) or cytokaratiraphospitorylation(Lito prosealipapar).Tite passibility thatliver Ca2t/CM-PK!I ma>’ bayo a different palitern ofactivationby Ca2~/calmodulinarad b>’ autopbospitorylatiaratitan brain Ca2t/CM-PKII (cf. 11) is a; yot ara openquostiora.

It is wortb notirag tbat neither cAMP-proteira protaira

kinase nor protela kinase C alfocted CFI’-I activiliy lapermeabilizad bepatocyres la spilio of titair abilir>’ Lapbospitorylata cytokeratlas itt vitro (23,41,42). However,saveral linos of avidaraca indicata libar neitber of libase Nropratein kinasespía>’ mi imporrarar role in Lba direor controlof iratarmedialia filamerar integrity ira inliact bepaliocytes.Thus, it itas beon sbawn libat pratein kinase C may beresporasiblefor maintairaung basal lovais of phospbarylaLionon cytakeraliiras 8 arad 18 witbout altorlag cyrokeraliinfilamerat assombly(41). As a matter of fact, exposureoflatact hepaliocytosLo phorbol estor; inducesc>’tokaratinpitaspbor>’lation buli doc; noÉ allier argaraization oflatormedialio filamenlis filamerat, wbich appearas fuil>’assembledraotwarks(42). In addition, phosphopeptidemapsof bopatiecytokoratinspbospitorylatadin vivo and itt vitrocloarí>’ indicate lihat cAMP-daperadant protein kinase is notmucb iravolvedira c>’tokeratinpitaspbor>’laliionira iratactcelis(23). Ira contrast,aradira lirae with datala tite presenLpaper,Ca2t/CM-PKII basbeenshowrato pía>’ a majarrolo in titepbospborylaliion and furactional laliogrity of hepatiecytokoratinsitt vivo (23). It has tren also suggestadlibatactivatian of Ca2~ /CM-PKI! (arad noÉ of aliber pratolakiraases) is rasponsible far tite OA-laduced disruption ofhepatocytocytoskolaron(16). Ah ¡ibis pountsra afuractionalinvolvomerat of rbi; protein . kinasa ira libe control of titelategrity of bepaliiccytoskolelion.

¡«‘4-62

~kioase

oPases ¡/2A

OA

Trypsin

e

Cytcske¡eton(intacO

Taxol

(¡esa active)

Q (more active>

O CPT-

IDi’N ~® O-®

(ytoske¡eton(dknuptrd)

SCHEME 1. Pnposed modal for lb. maionyl-CoA-independent aculecontrol of hepatie CPT-I aetivity. Seo tÉ ten for abbreviations aradfurther detaila.

Malonyl-CoA-dependentand rnalonyl-CoA-independentcontrol of CPT-I activi¡y - Togetitar wiLb previousobsarvatioras(10-12), dalia la ¡ibis paparallow a modal toexplaintbo OA-iraducodmalarayl-CoA-iradapendentcontrolof bapaticCP’I’-I. As sbowralaScbeme1, OA ma>’ activataCa2t/CM-PK!! by increasiragit; degreeof pbospbar>’lationupan irabibition of protein phospitaliases1 and 2A; tuiseffect would be prevantodb>’ KN-62, an lahibitor of

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TItE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY (en rev¡oén)

Ca2 /CM-PKII aurapbospbarylation.AcLivated Ca2~/CM-PKII would pbospitarylate cytoskelotal camponents,perbapscytokeratins8 arad 18, tbereb>’disrupting puliariveirahibitor>’ irateractiarasboliwearalibe cytoskaiotora and CPT-I.StimulaLion of CPT-! upandisruptianof libo cytoskolatonwould be also acbievodb>’ challengaof intact bepaLocyreslio IDPN or b>’ Lrealimenliof permeabilizedbepaliocyteswitbtrypsla ira mild coradiliions.Stabilizationof libo cyroskalatonwilib Laxol ma>’ provarattite malorayi-CaA-indopendentaculiostimulaLian of CFI’-I.

It is obvious ritat libe raotion tbat fatr’y acid traraslocationlato mitochondriama>’ be controladit>’ madulationof libeirateractiorasbotweeraCFI’-I arad cyraskeletalcomponenlis(i.e. by a malara>’l-CoA-iradeporaderatmechanism)does raolidiminisbLite imporliancaof maiorayl-CoAasapitysiolagicalmadulatorof CPT-I activir>’ (5,8). Ora onobarad, sincelibopioneeringwork of McGarryaradcoworkers(8,43),citaragesla long-chaira fality acid oxidation urader man>’ diffareratpatbo-pbysiolagicalsituatiorasbayoboensbownLa belirakedLo changos ira iratracellular malonyl-CoA concentrationand/orcitaragosira tite serasitivit>’of CPT-I Lo ma]ora>’l-COA(1,2,5).OnLite aLbarbatid, severalobservatiorassuggeslilibalimalonyl-CoA-depondorat arad malarayl-CoA-iradeperaderataculie control of bepaticCP’I’-I activir>’ migbt aperateincoracerli.First, Wc itave rocenLí>’ showra libat stimulatianofLite AMP-activated proteira kinase -a majar protela kinasa¡ravolvedla libe controlof bepaticlipid metabolism-laadstoara acrivationof bepaticCPT-I by ma]on>’l-CoA-dependontarad malon>’l-CoA-indapendentmocitanisms(44). Second,a fractiaraof bapaLic acatyl-CoAcarboxylase,tite arazymeresparasiblofor libe s>’rathosis of malon>’l-CoA, has beonreconlil>’ suggosliedLo be bound ta Lbo cytaskoletan(45).Third, ir itasbeonpuÉ forwardtitar libe 280-KDaisoform ofaceLyl-CaAcarbox>’lasemigbL interactwitb libe outerleaflerof tbe mitocitoradrial autormembranaira order Lo citannelmalon>’l-CoA for CP’I’-I initibition (46). Fourtb, tite rocentobsorvation libar Lite bulk of tite CPT-I protein seemsLoface libo cytoplasmic sido of Lite mitocitandrial autermembrane (29) makes more Iikel>’ LitaL interactiarasbeliwoon CFI’-I arad cytoskeleta]camparaerat;migbt occur.Ira tbo conten of tbe emergirag role of cytoskelolialfilamentausraoNrorksla intracelularsigraaling(47), curraratresoarcbira our laboratoriosis focussedora Lito possibleaxisrencaof a coardinaliecontrol of CPT-! arad acet>4-CoAcarbax>’laseactivitiesby modulationof interaction;betweentite cylioskoletoraandlibe mitochoradrialautormembrarae.

.4cknow/edgements- Wa are iradetited to Dr. IsmaelGaiya aradMs. TeresaGómezdel Pulgar for expart techaicalasistarace,aswell asLo Dr. AlejandraAlonso arad Dr. JeanEraracoisLeterrierfor ha¡pfuL critical commerats.

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9

Canítulo 2 ResultadosyDiscusión

DISCUS!ÓN

Los resultados experimentalesexpuestos era el presente capitulopermitenidentificar algunosde los alamentosque parecenestarimplicadosenla regulacióna cortoplazodela CPT-I:

i) Diferentes pruebasindicanque el citoesqueletodesempeña‘un papelimportanteen la regulaciónde la CPT-I y que, podría constituir el elementoextramitocondrialnecesarioparaquese verifique la regulaciónde la CPT-I quese pierde tras el aislamiento de mitocondrias. De eratre los diferentescomponentesdel citoesqueleto,los filamentos intermedios (y sus principalesproteínasconstituyentesen hígado, las citoqueratinas) surgen como losprincipalescandidatosa estardirectamenteimplicadosen la regulación de laCPT-I. A pesarde que resultatentadorespecularcon una interacción entrecitoqueratinasy CPT-I (o alguna otra proteína mitocondrial que pudieraparticipar en la regulacióna corto plazo de la enzima) lo cierto es que noexistenpruebasdirectas,por lo quede momentodichahipótesispermaneceenelplano especulativo.

u) La Ca2t/CMPKII ha sido identificadacomo un factor solubleque seperderíatras la penneabilizaciónde loshepatocitosy queseríaunadianade laacción de las proteínafosfatasas1 y 2A en la activaciónde la CPT-I. Así, latrahibición de estasproteínafosfatasaspor ácido okadaicoo por tautomicana,impediríaquepuedallevarsea cabo la desfosforilaciónde la quinasa,que alaumentarsu nivel de fosforilaciónpasaa encontrarsemayoritariamenteen elestadoautónomo. La quinasaactivadafosforilaría diferentessustratosen lacélulay entreellos diferentescitoqueratinas.Con ello podríaestarinduciendola despolimerización del citoesqueleto (o al menos de los filamentosintermedios)y coraello un aumentoenla actividadCPT-I.

A la vista de los datosexpuestoseraestecapítulo esposiblepresentarunmodelo de regulaciónde la CPT-I independientede maionii-CoA que ligaactivación de Ca2~/CMPKII, fosforilación y ruptura del citoesqueletoyactivaciónde la CPT-I. Sin embargo,las modificacionesque el ácidookadaicoinduce en nuestrosistemaexperimental,probablementedifieran notablementedelas queocurrenhabitualmenteenla célula, ya quela alteracióndel equilibriode fosforilación/desfosforilaciónque ganera es probablementede un ordenmayorque el queresultade la activaciónfisiológica de lasdiferentesquinasas.Parello, a pesarde la utilidad queel ácidookadaicoposeecomo instrumentoparael estudiodela regulacióna cortoplazode la CPT-I, es necesarioverificarel posiblepapelfisiológico queestemecanismopudierateneren la regulacióndela oxidacióndeácidosgrasos.

2.3. Posiblepapelfisiológicoregulaciónaplazo (independientedemalonil-CoA)CPT-I

delacorto

dela

Capitulo 2 Resultadosy Discusión

INTRODUCCIÓN

Unavezdeterminadala importanciaqueel citoesqueletoy la regulacióndesu estadode organizaciónpuedenteneren el controlde la CPT-l, sehizo necesariobuscarlas implicacionesque estemecanismopudieratener era el contextode laregulaciónfisiológica de la oxidaciónde ácidosgrasos.

Por una parte, estudiamos la regulaciónde la actividadde la CPT-l encélulasde hepatoma(Fao y HepG2).Puestoqueel ácidookadaicoes un conocidoagentecarcinogénico,que produce entre otros efectos la desorganizacióndelcitoesqueleto,nosplanteamosdeterminarquétipo da regulaciónpresentala CPT-len unascélulas, como las de hepatoma,en lasque (dadasu condición de célulastumorales)el citoesqueletotambiénse encuentradesorganizado.

Por otra parte, teniendo en cuentaque la AMPK es quizá la proteínaquinasamás importanteen la regulacióndel metabolismohepáticodeácidosgrasos(Hardie y Carling, 1997), nos planteamosestudiarsi estaenzima podría estarimplicadatambiénea la regulciónde la CPT-l no solo a travésdel controlde laactividadACC (y conello de los nivelesde malonil-CoA),sinotambiéna travésdeun mecanismoindependientede malonil-CoA.

Por último, una serie de estudios- acerca de la posible localización

subeeluiarde la ACC indicaronque ambosmecanismosde regulaciónde la CPT-l(dependientee independiente de malonil-CoA), podrían estar estrechamenterelacionados.

Bibliograria

Hardie, D.C. y Car¡ing, D. (¡9971 Lur. J. B¡oehem. 246,259-273

LOSS OF RESPONSE OF CARNITINE PALMITOYLTRANSFERASE 1

TO OKADAIC ACID IN TRANSFORMEDHEPATIC CELLS

Guillermo Velasco’,PatriciaPassilly’, Manuel Guzmán~andNorbertLatruffe’

‘Departmentaf BiachemistryaradMolecularBiolagy 1, Faculry of Biology,CompluteraseUniversity,28040

Madrid, Spain; arad ‘Laboratoirede Bialagie Moleculaire et Cellulaire, Facultédes SciencesMirande,

Universitéde Bourgagne,BP 400, 21011 Dijon, France

ABSTRACr. The specificactivity of carnitinepalmitoyltransferase1 (CPT-I) wassimilar in mitacharadria

isalatedfram rat Fao and humanHepG2heparamacelís arad from rat hepatocytes,bur almost 2-foid

higberin permeabilizedhepatomacelístharaira permeabilizedheparocytes.Short-rermexposuretaakadaic

acidinducedaca.80%stimulationof CPT-Iira hepatocytes,whereasno significantresponseof theenzyme

from hepatomacelís was eviderat. Thus, libe high CPT-I activir>’ displayedby hepatamacelis may be

reachedby hepatocyliesupanchallerageta okadaicacid.Thepresentdatamaybeexplainedby adisruption

of irateractiorasbeliweeraCPT-I arad cytoskeletalcomponeratsira tumorcelíswbicb maybe involved ira lihe

okadaicacid-inducedactivatianof hepatieCPT-I aspreviauslysuggested[BiochemBiophysResCommun

224~ 754-759,1996].

Mitochandrial fatty acid axidatianprovidesa majorsaurceof ener~’ ira beart,skeletalmusclearad liver

(reviewedira [1-3]).Hepatic fatty acid oxidarionalsasuppliesexírahepatietissueswith keronebodiesas

aglucase-replacingfuel[1-3].Carnitinepalmitayltrarasferase1 (CPT-I),theauter-mitachoradrial-membrane

carnitine palmitoyltransferase,calialyzes libe paco-settiragstepof long-chairafatty acid transiacarianinta

Abbrevlatlons:CPT-I, carnitine palmitayitransferase 1; ODH, glutamate dehydrogenase

torresponding autitor: Dr. Manuel Guzmán, Deparlimerat of Biocheniistry arad Molecular Biology 1, FaculÉ>’ of Biology,

Complutense Uraiversit>’, 28040-Madrid, Spain.Telephone: (1) 3944671.Far (1) 3944672.E-mail: mgp@solea.quim.ucm.es

lihe mitochondrialmatrix [1-31.Receratdeterminationof flux coratralcoefflcieratsof the enzymesinvolved

ira hepaticlong-chairafatty acid oxidatiarashows thar CPT-I plays a pivatal role in contralling the flux

Lhroughtitis patbwayunderdifferentsubstratecancenliratiorasaradpatho-pbysiolagicalstates[4,5].It iswell

establishedthat lang-termchangesira hepatieCPT-I activity occur ira responselio alterationsin the

rautritianalaradhannonalstatusof theanimal [1-3].Ira additian,CPT-I is subjectedto allostericinhibition

by malorayl-CoA[1-3].

Duringthe lastyears,anovelmochanismaf controlof hepaticCP’F-I activity hasbeeraput forward.

Severalstudiesusiragpermeabilizedheparocyteshaveshownthat variausagentsexertshart-ternieffects

an CPT-I activity ira parallelwith charagesira the rateof long-chainfatty acid oxidation(reviewedira [1]).

Thus,cAMP analagues(e.g.dibutyryl-cAMP) [6], effectarswhich increaseintracellularcAMIP levels(cg.

glucagara,forskalin) [6] arad proteinphosphataseirahibitors (e.g.okadaicacid) [6,7] are able ro stimulate

hepaíicCPT-I. This shart-termactivatiaraof CPT-I is assumedto be mediatedby a malorayl-CoA-

indeperaderatmechanism[8] libar may involve the phosphorylatioraof cytoskeletalcomporaerat(s)and the

subsequerardisruptioraof interactiorasbetweeraCPT-I aradthecytoskeletora[9,10].However,thesignificance

of this putative mechanismof control of CPT-I activity is as yet uraknowra. In the contefl of the

aforementionedhypathesis,it is conceivablethat the regulatorypropertiesof CPT-I may changeurader

patho-physiolagicalsituatiorasira which libe arganizationof the cytoskeletanis altered.Since it is welI

establishedrhat the cytaskeletoraof transformadcelis is disorganized,the presentwark wasundertaken

to study libe regulationof CPT-I activity by okadaicacid ira hepatomacelíscomparedto hepatocyresira

primary cultures.

MALTERL&LS AND METHODS

Ceil culture

The rat hepatomacelI une Fao arad lihe humanhepatomaceil line HepG2were culturedas previously

described[11].Theywere trarasferredto titeir respectiveserum-freeculturadmedia[11] supplemented

with 1% (w/v) dafattedarad dialyzedbavineserumalbumin24 h prior lio tbe experiments.Hepatocytes

were isolated from malo Wistar rats (250-300 g) which had free accessto foad and water by libe

callagenaseperfusioramethoddescribedira [7].TheywereinoculatediraDMEM cantaining10%(y/y) fetal

calf serum.Aftar calI attachmerat(ca.6 h), the mediumwasreplacedwith serum-freeDMEM contairaing

10 raM dexamethasaraearad1% (w/v) defatredaraddialyzedbovineserumalbuniira,aradlibe hepatocytes

wereculturad for 14-18 h befarelibe exparimeratswere performed.

CPT-I assay

CPT-I activity was determiraedira digitonin-permeabilizedcelis as the tetradecylglycidate-sensitive

incorparation of radialabelledL-carraitine irata palmitaylcarraitine.Briefly, alitachedcalis (plated ira P6

pIales)ar celísira suspensiora(scrapedfram F75 flasks),asindicatedira ever>’case,were preiracubatedfor

45 mira ira the absencaor ira rhe preseraceof 20 ~M tetradecylglycidate(kiradly donatedby Dr. J.M.

Lowenstein,BrandeisUraiversity,Waltham,MA, USA), a speciflc irreversibleinhibitor of CPT-I (cf. [7]).

Incubatioraswere cantinuedfor an additianal45-mm period ira the preseraceor tha absanceof varyirag

coracenlirariorasof akadaicacid. Subsequeralily,carnitine palmitoyltrarasferaseactivity was manitoredira

hapatocytemonolayers[5] ar susperasioras[7].

Farlibe determinatioraof CPT-I activity ira isalatedmitochoradria,theculturemediumfrom 10-15

F75 flaskswas aspirated,celiswara washedira NaCl/P1,scrapedfrom libe flasks, aradhomogenizedira a

madiumcoratainirag10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.25 M sucrosearad 1 mM EDTA. The resultingcrude

bamogenatesweredirectly usedfor isolationof mitochondriaanddeterminatioraof CPT-I aradglutamate

dehydrogeraase(GDH) activities exactly as describedira [8].

Ststisticalanalysis

Rasullis shawnrepresentthe means±S.D. of tha raumberof experimenlisiradicated in eachcase.Each

axperimeratalcoraditiarawasalwayscarriedout at leastira quadruplicate.Sliatisticalanalysiswasperformed

by the Studerat’st tost.

RESULTS AND DISCUSSION

‘¡‘be propertiesof CPT-Iwarestudiedira twa hepatomacdl liraes,namel>’humanHepG2celísand ratFao

calís,which arecommoralyusadas a modalro sliudy liver lipid matabolism(cf. [12-14]).As showraira Table

1, CPT-I specificactivity was not sigraificantly different in mitachondriaisolatedfrom hepatomacellsthan

ira mitochondriaisolatadfrom hepatacytesira primaryculture. Similar qualitative resulliswere olitairaed

wheravaluesof enzymaactivity ware referredta massof mitachondrialproteinarad to activity unilis of

GDH, a mirochoradrialmarker (Table 1). ‘¡‘bis indicaresthat no differeracesira the massof mitochoradria

areevidentaraioragtite threatypesof celís.

CPT-I activity was subsequantlymoraitoradin a permeabiized-celísystem.The useof this assay

allows measuremerarof heparocellularCP’T-I activity in its physialogicalenvironirnerat[7].As showraira Fig.

1, CF1-I activity ira primary hepatocyteswas about half of that ira hepatomacelis.This clearly indicates

that CPT-I activity iraside tite hepatacyteis subjectedto certairacorastricti¿nsthat do raot aperateira

hepatomacelísor ira preparatiansof purified bepaticmirochoradria.‘¡‘bis is ira lina with libe receraridea

lihat interactiorasbetweeralibe mitocharadrialautermembranearad extra-mitacharadrialcelí componanlis,

mastIikely localizadin the cytoskeleron,might be involved ira the caratrolof hepaticCPT-I activity [8,9].

‘¡‘bese interactioras could be readily lost ira preparationsof purified mitochondria.

Ta test libis hyparhesis,the offact of libe phosphaliasainhibilior okadaicacidon CPT-I activity was

determinadira lihe libree celís testad.One of libe most remarkableeffects elicited by okadaicacid ira

hepatocyliasaradarbercalI typasis libe hyperphosphoxylaliioraaradsubsequeratdisruptioraof libe cytoskeleton

(cg. [15,16]).Fig. 1 sbawsthat a remarkable80% srimulationof CPT-I ansuedupanexposureof primary

hapaliocytasto akadaicacid. Fifty percarar activariara of CP’1’-I accurredat ca. 10 raM okadaicacid,

TABLE 1. CPT-I acrivity in mitochondria isolated fi-orn hepatomacelisand prhnary hepatocytes

CPT-I activity

(ramal/mira par (nniol/mira par

Celís mg protein) unir GDH activity)

Fao 1.87±0.25 2.56±0.79HapG2 2.19±0.34 1.87±0.41Hepatacytas 1.81±0.22 2.34±0.68

Valuescorresporadto 3 separateexperiments.Seo Llie Materialsarad Methodsfor further details.

iradicatiragthat CPT-I stimulatiorais mediatadby the inhibitiora of proteinphasphatase1 [9,16].Titis is ira

agraemerarwilih tha obsarvatiara tbat prateirapbosphatase1 seamsto be libe mairaphospbataseiravolvad

ira tbe ragularionof libe phospbarylatiorastateof libe cytoskoleton,aradira turra ira libe controlofcytoskeletal

iraliagrity [16]. Ira caratrastta beparocytes,a sligbt but raot staliisliically sigraificarat stimulatioraof CPT-I lio

okadaicacid was avidenli ira bepaliomacelís (Fig. 1). Tbarefora, libe bigh ‘CPT-I activity displayed1,>’

bepatamacelísmay be reachedby hepatacytasupan challeragelic akadaicacid.

1.2 -

Ea)o

> D~tE

E1---

EE

1.0

0.8

0.8

0.4

*

tH’ 0 1 2 3

¡cg [okadaicacíd] (riM)

FIG. 1. Effect of okadaic acid on CPT-I activity in atrachedhepatoma celis and priniary hepatocytes. Feo celis (e),HepGl celis (o) andprimary hepatocytes(‘)wereincubatedwith varying concentrationsof okadaic acid (0,5, 50, 100and500 nM) for 45 mm and CPT-I activil>’ was subsequentí>’determined with the permeabilized-ceII assay. See theMaterisis and Methods for further detalis. Valuescorrespondtu 4 separateexperiments. Significantly different(P<0.O1) froin prtmary hepatocytes.

TABLE 2. Comparative effect of okadaic acid on CPT-l act¡vity in hepatoina celis andhepatocytes,both in suspensionand in atrachedstate

Okadaicacid

CPT-l relarive activiliy (%)

CelIs (500raM) Attachedcelís Celís in suspensiora

Fao No 100±17 100±22Yes 112±11 (5) 119±10(3)

HepG2 No 100±23 rad.Yes 120±7(4) rad.

Hepatocyres No 100±18 100±12Yes 180±1»(5) 171±18 (4)

Values correspand ro the number of experiments indicated un parentheses.Sea rite Materíals arad Metbodafor furtiter details. rad.: noÉ determinad. Signiflcantly dilferent (P<0.01) from tite correspondingvalueswitit no okadaicacid.

It mighr be arguadthat the disliiract bebaviourof primaryhepatocytasaradhepatomacelísmay be

a reflactiora of differences ira tbeir attacbmaratta libe subsrrare,tbat ma>’ ira tui-ra involve differanr

configurationsof tba cytoskeletora.Henca,CPT-I acrivir>’ was moraitoredira ccli susperasionsafler cali

scrapingfrom tbe flasks.As showra ira Tabla 2, okadaicacid produceda significant stimulationof CPT-I

ira hapatocytesusperasiarasbut nat ira Fao-cellsusparasions.

Ira conclusion, libe prasarar data support libe notion libat disruptian of irataractiorasbeliweera

mitochondriaarad irahibiliary cytaskelatalcomporaeratsma>’ be iravolved ira tba okadaic acid-iraduced

activadoraof hepaliicCPT-I [9].Wc hayarecaratlyobservad(autbors’urapublisheddata)rhatiratermadiate

filameratsare libe camparaentsof libe cytoskeletanmost likoly involved ira the control of CPT-I activity.

Irateresdngly,libe intaractiorasbetwaerairatermediatafilamaralis and mitochoradriabecomedisruptedira a

sliresssituatiorasuchashaatshock[17].Our rcsultsindicatetbatthis might be libe reasorafar libe enhanced

CPT-I activiliy ira hepatamacelís.

Titase iravastigatioras weresupportod by libe SparaishComisiónInterministerialdeCienciay Tecnología(SAF

96/0113), the FrencbARC (Associationpour la Reclierchesur le Cancer), arad the Ligue Baurguignone

contre le Cancer.

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ARCHIVES OF BIOCHEMJSTRYAND BIOPHYSICS

Vol. 337. No. 2, January15, pp. 169—175, 1997Article No. BB969784

Control of Hepatio Fatty Acid Oxidation by 5’—AMP-Activated Protein Kinase Involves a Malonyl-CoA-Dependent and a Malonyl-CoA-Independent Mechanism

Guillermo Velasco,* Math J.H. Geelen,t” aradManuelGuzmán**Department of BiochemistryandMolecular Biology1, Faculty of Biology, ComplutenseUniversity,28040-Madrid,Spain;anátLaboratory of Veterinary Biochemistry,GraduateSchoolof Animal Health, Utreche Uniuersity, PO. Box80.176,3508TD Utreeht, Tite Netherlands

ReceivedJuly 30, 1996, and in revisedfon,, October25, 1996

Incubation of rat hepatocyteswith 5-aminoimidaz-o¡e-4-carboxamideribonucleoside (AICAR), aix activa-liar of the 5’-AM?P-activated protein kinase (AMPK),produced a twofoíd stimuíation of palmitate oxidationarad of the activity of carnitine pahnitoyltransferase1 (CPT-I), together with a profonrad decreaseof theactivity of acetyí-CoAcarboxyíasearad of lihe iratracel-lular levelof malorayí-CoA. AICAR-induced CPT-I stim-ulation progressivelyblunted with time after ccli per-meabilization, pointing to reversal of conformationaleonstraints of the enzyme ira control celis due to thepermeabilizatiora-triggered dilution of intracelularmalonyl-CoA. The stimulation stabilized at a steady20—25%. This 20—25% mercaseira CPT-I activity sur-vived upon completeremoval of malonyl-CaA from thepermeabilizedcelís, indicating that it was not depen-denton themalonyí-CoA concentration oflibe eclI. Thismalonyl-CoA-indcpendeixtactivatiora of CPT-I was notcvident wheix mitochondria wcre isolated for assayofenzymeactivity or whencelíswere disrupted by vigor-aus sonication. lix addition, libe microtubule stabilizcrtaxol prevented lihe malonyí-CoA-independent stimu-lation of CPT-I inducedby AICAR. Henee, stimuíationof hepatic fatty acid oxidatiora by AMPK seemsto relyon lihe activation of CPT-I by two different mecha-nisms: deinhibition of CPT-I induced by depíetion ofintracellular maíonyl-CoA leveísand maíonyl-CoA-ira-dcpendent stimulation of CPT-I, which might involvemodulation of interaetioras between CPT-I arad cy-toskelctal Components. o 1997 Academie Press

The5’-AMP-activatedproteirakinase(AMPK? playsa majar role ira tbe regulatioraof lipid metabolismiramammals.Thus, AMPK pbospborylatesand inacti-vateskeyregulatoryenzymesof lipid metabolismsuchasaeetyl-CoAcarboxylase(fatty acid syratbesis),3-hy-droxy-S-methylglutaryl-CoAreductase(sterol/isoprera-oid syratbesis),arad bormone-serasitivelipase (triacyl-glycerol/cholesterylesterbreakdowra)[reviewed ira Ref.(1)]. Although severalprotein kinasescara pbospbory-late purified acetyl-CoAearboxylasearad S-hydroxy-3-metbylglutaryl-CoAreductasein vitro, it is curreratlyacceptedthaI ira iratact hepatocytesarad ira the liver invivo this phosphorylation.is mairaly performed byAMPK [cf. Refs. (1—3)].

Severalstudieshavebeeraperformedorathe potentialinvolvemeratofAMPK ira Ibe controloffattyacidoxida-tiora ira theisehemiébeart(4,5) aradtheworkiragmuscle(6). However, the possiblerole of this kiraase ira tbecontrol of hepatie fatty acid oxidation has raot beerastudiedto date.Uraliketbe beartaradthe skeletalmus-cíe, the liver is capableof expressirageitberbigh ratesof lipogeraesisor higb ratesof fatty acid oxidatiorade-peradiragon Ihe hormonalaradrautritional statusof theanimal, arad herace regulatioraof fatty acid axidatioraseemsto be more complexira liver [reviewed ira Ref. (7)]thanira heart[reviewed ira Ref. (8)] aradskeletalniuscle[reviewed ira Ref. (9)]. Carnitinepalmitoyltrarasferase1 (CPT-I) is the keyregulatoryerazymeira the trarasportof long-chairafatty acids irato the mitochoradrialmatrix(7, 10, 11). This enzymeis subjectto allosterieinhibi-tion by malorayl-CoA, the produetof the reactioracaía-

To whom correspondenceshould be addressed.Fax: **31302535492.E-mail: m.geelen~biochemdgk.niunl.

2 Ahbreviations used: AMPK, 5’-AMP-activated protein kinnse:

CoA, coenzymeA: CPT-I, carnitinepalmitoyltransferase1; AICAR,5-aminoimidazote-4-carboxamideribonucleoside;ZMP, 5-aminoin,id-azole-4-carboxamideribonucleosidemonophosphate.

0003-9861,97$2500Copyright 0 1997 by Academic PresaMI rights of reproduction jo any form reserved.

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VELASCO ET AL.

lyzed by acetyl-CoAearboxylase(7, 10, 11). Duriragthepastfewyears,a novel meeharaismof sbort-termcon-trol of hepatieCPT-I has beeraput forward [reviewedira Ref. (7)]. Severalstudiesusingpermeabilizedhepa-tocytes have showra that various ageratsexert short-term effectsora CPT-I activity ira parallelwitb charagesira the rate of long-chairafatty acid oxidationmeasuredira Ihe same celí preparatioras.Thus, cAMP araalogs(e.g., dibutyryl-cAMP) (12), effectors that mareaseira-tracellular cAMP leveis (e.g., glucagoraarad forskolin)(12), aradproteira phosphataseinhibitors (e.g., okadaicacid)(18) areableto stimulatehepatiaCPT-I, whereasCa2~-mobiliziragagerats(e.g., vasopressira,a

1-adreraer-gie agoraists, arad extracellularATP) irahibit hepatiaCPT-I (14). Siracetheseshort-term changesira CPT-Iactivity arevery stablearad survivecompleteremovalof malonyl-CoA from the medium,theyareassumedtobe mediated by a malorayl-CoA-iradeperaderatmata-raismwhich might iravolve phosphorylatioraof putativemediatorprotein(s)(7, 16).

Ideratificatiora of physiological substratesof AMPKhasbeerabamperedby the laek of specific methodsforaetivatiragtbe kiraase ira iratací celís.AMPK was rou-tiraely activated ira iratact hepatocytesby incubatiorawitb fructoseor by heatshockor arseraite[cf. Ref. (1)].Thesetreatmentsalí deplete iratracellular ATP arad,tberefore,baverraaraynoraspecifieside effects.However,a morespecific melbod for activatiragAMPK ira iratactcelís has beerareceratlyreparted.Incubationof intaethepatocyteswith 5-amiraoimidazole-4-carboxamideri-boraucleoside(AICAR) causesuptakeof this componradarad subsequerataccumulatiorawithira the cefi of itsmoraophospborylated form, 5-amiraoimidazole-4-car-boxamideribonucleosidemoraophosphate(ZMP) (16).The latíer has beenshowrato mimie the effect of 5’-AMP oraallosterieactivatioraofrat liver AMPK withoutcbaragiragtbe levels of ATP, ADP, aradAMP withira tbehepatoeyte(16, 17). Thus,exposureto AICAR hasbeerashowralo inactivateacetyl-CoAcarboxylasearad 3-hy-droxy-8-methylglutaryl-CoAreduetaseira isolated he-patocytes(8, 17) aswell ashormone-serasitiveupaseiraisolatedadipocytes(18). Ira thepreseratrepodwe showthat activationofAMPK producesa stimulatiaraofhe-patie long-chairafatty acid oxidatiora, which relies iraturra ora activatioraof CPT-I by malorayl-CoA-deperaderatarad iradeperadentmecharaisms.

MATERIAIS AND METHODS

Materia/a. L1-’4ClPalmitie acid, LL-’4C]octanoic acid, L-[Me-’4C]-

carnitine.rl-’4Clacetyl-CoA. and 3H,Owere supptiedhy AmershamInternational(Amersham,Bucks, UK). Digitonin, collagerarase(type1), AICAR. ZMP, 5-AMP, arad taxol were purchasedfroin SigmaChemicalCo. (St. Lorais,MO). Okadaicacid wras supplied by Calbio-chem (SanDiego, CA). Tetradecylglycidicacid was a kirad gift fromDr. J. Nl. Lowensteira(BraradeisUniversity, Wraltham,MA).

Hepatocyteisolationandincubation. MaloWistar rats(250—300g) which had free acceasto food aradwater wereusedthroughoutinthis study. l-Iepatocytes‘vero isolatedby the collagenaseperfusioramethoddescribedira Ref. (19). Becauselipogenesisis markedly de-pressedjust after hepatocyteisolation, celia were incubatedfor 15mio at37~Cira a gyratorymetabolicshakeraradsubsequentlyfilteredthroughnylon meshprior to use(20). Celí viability, asdeterminedbytrypanblue exelusiora,always exceeded95%in the final hepatocytesuspension.

Hepatocyteswere incubated irn Krebs—Heraseleitbicarbonatobulfer supplementedwith 10 mM glucoseand 1% (w/v> defattedanddialyzedbovino serumalbumin. Incuhatioras(4—6 mg of cellularpro-teira/mí) were perforined ira a total volume of 2 ml at M’C, withconstantshakirag(85 oscillationa/min)aradunder an atinosphereof0

2/C02(19:1).StocksolutionaofAICAR, okadaicacid,aradtaxol werepreparedin Me2SO. Therefore,control incubatiorashad the corre-spondingMe,SOcoratent.No significaratirafluenceof Me2SOon anyof the experira,eratallydeterminedparameterawas observedat thefinal coracentrationused(0.1%,y/y).

Reteoffatty acid oxidation. Fordetern,inatioraoftherateof fattyacid oxidatiora,hepatocyteswereincubatedfor 15 mm with thecellu-lar effectorsiradicated in every case.Reactionawere subsequentlystartedby the additionto celí incubátiorasof L1-’

4C]fatty acid (eitherpalmitate or octanoate,0.05 Ci/mol, 0.5 nn¡ final coracentration)bouradto albura,in.Afrer 10 mm, renetionswerestoppedwith 0.5 mlof 2 M perchlorie acid and oxidation productawere extractedaradquaratifiedexactly as describedbefore(13). Total oxidatioraproductawere calculatedras theSun, of acid-solubleproductaand CO,.Acid-solubleproducta(mostly ketoneSodios)routinelyaccountedfor 90—95% of total oxidation producta(18):

CPT-I assay. Tho activity of CPT-I was determiraedras thetetra-decylglycidate-sensitiveincorporatiora of radiolabeled t-carnitiraeinto palmitoylcarnitineby four difi’erent methods(A, B, C, and O).fn brief, hopatocytesworopreiracubatedfor 20 mirain theabseraceorIn the presenceof 10 pM tetradecylglycidate,a apecifieirreversibleinhihitor of CPT-I (13, 21). Incubationawere coratinuedfor an addi-tional 15-miraperiodira thepreseneeof thecollularelYectorsindicatedIn everycase.Subsequently,aliquotawereremovedfrom theincuba-tioras to monitor CPTactivity with the four differeat typesof assay.

In methodsA arad B, CPT activity was measuredira digitonin-pernicabilizedhepatocytes.Both methodswereperformedusingthesanie detergerat/cellproteiraratio (about40 pgdigitonin/nig ceIlpro-tein). Enzymeactivity wasroutiraelydetenninedby methodA (“ono-stepassay”). Ira this method, 100 pl of hepatocytesuspensiorala di-roctly addedte 100 pl of prowarmeddigitorain-containiragassayme-diun, exactlyasdescribedira Rol. (13). Renco,monitoriragofenzyn,eactivity is perforzraedimn,ediatelyuporapermeabilizationof thecelís(13, 22). In method3 (“two-atepassay”),hepatocyteaarepermeabil-izedaradthoroughlywashedprior to detern,inatioraof erazynxeactiv-ity. Thus, 1.0 ml of hepatocytesusperasionwas permeabilizedwith0.20 mgof digitorain dissolvedira 1.0ml of 5 mp.x Tris—HCI (pH 7.4),50 mM RE, 100 m¿ KCI, 2.5 mM EDTA, arad 2.5 mr¿ BOTA (Fmediumí.The resultiragmix was gently shaken for 5 s andrapidlydiluted by tranaferLo trabescoratainirag40 ml of ice-cold F~ medium.Cotíghostswere sodimoratodby centrifugationat 350g for 15 a, andpellota were takenup ira 1.0 ml of prewarniedF mediuni.The re-sultirag susperasionaof coll ghostswere incubatodat 370C for 5—15mira andthon CPT activity was moraitored(15).

IramethodC,CPTactivity wasmeasuredira sonicatedhopatoeytos.Celíswere sedimoratodby low-apeedcentrifugatiora(50g, 2 mira). Thecelí peltet was resusporadedira F medium aradsoraicatedfor twoperiodsof 10 a while beiragcooledin ico/water.Saniplesof soraicatedproparationswere usedfor detern,inatioraof CPT activity (15).

Jo methodD. CPTactivity wasmeasurodira mitochoradriaisolatedfrom hepatocytosuspensiorasexactlyasdescribedbefore(15). Prepa-ratiorasof mitochondriawere practically devoid of peroxisomes,as

CONTROL OF FATTY ACID OXIDATION BY M4P-ACTtVATED PROTEIN KINASE 171

judgod froni measuromontaof recoveryof catalaseactivity (alwnyslasathara10%of total cellularactivity).

Other ana¿ytical methods. Intracollular lovels of malorayl-CoA‘vero determinadjo neutralizedperchtoric acid cett extractaby nrndioerazymnticrnothodas doscribedira RoL (19). Ratosof de novofatty acid aradcholesterolsyutheaiaworo monitorodastheiracorpora-tion of ~H

2Ointo total fntty acidaanddigitorain-precipitablosterols,i-ospectivoly(23). Acotyl-CoA carboxylaseactivity wasmeasurediradigitonira-pormeabilizedhepatocytesras te incorporationof radiola-beled acetyl-CoAmro fatry acids in a reactioncoeplod to the fattyacid synrhaaereactiora(23). Fntty acid synthasoactivity ‘vas deter-miraed jo digitonira-permeabitizedhopatocytosras the malorayl-CoA-deporadorarincorporationof radiolabeledacotyl-CoA irato fatty racida(23). Protoinwras doterminodby themethodof Lowry et al. (24), withboviraeserumalbumira as a standard.

Stotistical anolysis. ResultaahownroprosorattSemeansa SD oftho numberof hopatocytopreparationaindicatedira evory caao.CalIincubatiorasarad/ororazyrnoassrayswerealwayscarriedout in tripli-cate.Statisticalanalysiswasporformedby Student’at teat.

RESULTS AND DISCUSSION

The effectofAICAR orafatty acidoxidatiorawasstud-ied ira iracubatiorasof rat hepatocytes.Pilot experimeratswereperformedto testthe validity of aurexperimentalsystem.As previouslydescribed(3, 16), additionof 0.5mM AICAR to the hepatocyte iracubatiora mediumstroraglydepressedacetyl-CoAcarboxylaseactivity (94

o% inhibitiora, n = 4) arad denovo fatty acidsyrathesis(92 t 16% irahibitiora,n = 4). Denovo cholesterolsyra-thesiswas similarí>’ depressed(90 ±8% inhibitiora, n= 3). Ira additiora,0.5 mM AICAR hadno effect on theactivity of fatty acid syrathase(results raot showra), alipogeraicerazymewhich is raotbelievedto beasubstratefor AMPK.

AICAR stimulatesfis parallel CPT-I and long-chainfrztty acid oxidation. Figure 1 shows the effect ofAICAR ora hepatie fatty acid oxidatiora. AICAR pro-dueeda dose-deperaderatiracreaseira the rate of [‘

4C]-palmitate oxidatiora. Similar results were obíairaedwhera [‘4C]oleate was used as substrate(results raotshown). Ira contrast,[‘4C]oetaraoateoxidatiorawas raotaffected by ALCAR. It is well establishedthat long-chaira fatty aeidslike palmitate arad oleateare traras-podedirato mitochoradriaby acarraitirae-deperaderatpro-cess,whereasmedium-chairafatty acidslike octanoateeratermitochondriairadeperaderatlyof carraitine(7, 10,11>. Therefore,this observationsuggeststhat the tar-gel for AICAR actioramight beCPT-I, the erazynrethatcatalyzesthe pace-settiragstepof long-chairafatty acidtransíacatiorairato themitochoradrialmatrix (7, 10, 11).The other comporaeratsof the fatty acid-traraslocatiragsysrem,raamelyacyl-CoA syrathetase,CPT-II, arad car-nitirae:acylcarmtiraetraraslocase.aregeraerallynot con-sideredto play a sigraiflcarat regulatory role in thetrarasportof lorag-chainfhtty acids irato the mitochora-drial matrix (7, 10, 11).

As shownira Fig. 1, CPT-I activity was enharacedby

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200 -

100 -

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FTG. 1. Doso-dopondenteflectofAICAR on fattyacid oxidationandon CPT-I activity. Hopatocytoswereproiracubatedfor 15 mira ira tSeprosonceof differerat conceratrationaof AICAR. Subsequontly,ah-quotaworo removedto determinetSe rataof [‘4Clpalniitate <O) arad[t4C]octanoate(e) oxidatiora,ng well as CPT-I activity by methodA(E) (see MaterialaaradMothods). Reactioratime of the CPT-1 aaaay~vas20s.TSe 100%valuesof oxidatiorafor L’4C]palrnitatearad [“Cl-octanoateworo 58.7 ± 6.4arad122.0± 16.5 omol fattyacid convertedjatototat oxidationproducts/h/mgcollular protoira,respectively.TSe100%value of CPT-I activity waa 1.37 t 0.86 ramollmin/mgcellularprotoira. Resultacorreaporadto four difl’orerat hepatocytoprepara-tioras.

exposureof hepatocytesto.AICAiR. Whera CPT-I activ-ity was determiraedat a very sbort assaytime (20 sira Fig. 1), a good correlatiorawas observedbetweeramaximal stimulatioraof eflzyme activity (210 t 16%)aradpalmitateoxidation(217 t 22%).Furthermorc,0.5mM ALCAR wasfauradto depressintracellularmalorayl-CoA coraceratratiorafram 87 ±12 pmol/mg celí protein(iracubatioraswith no additiaras)ta levelshardlydetect-able by the radioerazymatieassay(3 ±3 pmol/mg celíproteira,n = 4, E < 0.01 vs incubatioraswith no addi-tioras). It is thus conceivablethat tbe ALCAR-iradueedstimulatioraof long-chairafatty acid oxidatiaramay bemediated by tbe AMPK-deperadentphosphorylatiora(inaetivatiora)of aeetyl-CoA carboxylase,therebyde-creasiragintracellularmalorayl-CoAlevels.

Hepatocytestakeup AJOAR, which is subsequeratlyphosphorylatedto produce ZMP (16). Ira additiara,AICAR is raotremovedfrom themediumbefareerazyrraeactivity is determiraedby methodA. Tberefore,to ruleout thepossibilitytbat eitherAlGAR orZMP maybavea direct effect ora CPT-I activity, erazymeactivity wasdeterminedira isolatedliver mitochondriaincubatedirathe preseraceof 0.5 mrvi AlGAR ar 10 mM ZMP [cf. Ref.(16)]. Assayson mitochondriairacubatedwitb 1 rraiM 5’-AMP were also carriedoutasa control. CPT-I activitywas also determiraedira the permeabilized-celíassay(methodA) afterhepatocytepreiracubatiorawith no ad-ditioras but addirag 1 m~i ALGAR, 20 uní ZMP, or 2m~ 5’-AMP to the digitonira-coratairairagassaymixture.

t00 -4 -3

)og LAICARI <M)

VELASCO ET AL.

However,no effect of AlGAR, ZMP, or 5’-AMP ora CPT-1 activity ira eitherof the twa systemsconíd bedetected(results raot showra>.

Malonyl-CoA-dependent and .independent mecha-n¿smsare involved in tite AJCAR-inducedstimulationofCPT-1? It hasbeenshowrathat CPT-I is reversiblyserasitizedto malonyl-CoA inhibition by malonyl-CoAitself[reviewed ira Ref.(11)]. Thus,wheramitoehondílaare incubatedira the abseraceor preseraceof malorayl-CoA, theenzymebecomeslessormoreserasitiveto irabi-bitiora, respectively(11). This effect is also observedirawhole-cell systems:incubatioraof isolated hepatocyteswitb compoundsthaI decreaseintracellular malorayl-CoA leveismakesthe enzymeacquirea relaxedcorafor-mationwhich exhibitshigh activity arad low serasitivityto inhibitiora by malonyl-CoA ira a subsequeratassay(11). The oppositeensueswhera hepatocytesare ex-posedto compoundsthat iracreasemalonyl-CoA concera-tration, i.e, Ihe enzymeacquiresa tight coraformatiorawith low activity aradenhaneedsensitivityto inhibitioraby malorayl-CoA(11). Becausepermeabilizationof Iheplasmamembraneof Ihe hepatocyteleadslo a largedilutioraof cytosoliccomporaentsiracludiragmalonyl-CoA(22), aradthetransitiorabetweenIhetwo differentsensi-tivity states is very fasí at 370C (11), tbe coraforma-tional state of CPT-I within the intaet hepatocyteisonly retairaedfor very short periodsof time ira perme-abilizedcelís [cf. Ref. (15)]. The permeabilized-hepato-cytesystemtbusallowsmonitoriragtheconformationalstateof CPT-I when tbe assayof erazymeactivity isperformedat different times after permeabilization.

We usedIhis experimentalapproachlo leal whetherthe stimulation of CPT-I observedira AICAR-treatedhepatocytesaetuailyiravolvesa deereaseof intracellu-lar malonyl-CoA levela. As atatedaboye, the AlGAR-iradueedatimulationof [‘4G]palmitate oxidatioracorre-latedwell with theAICAR-iraducedstimulationof CPT-1 wheraerazymeactivity wasdetermiraed20 s after per-meabilizatiora of Ihe hepalocyte plasma membrane(Pig. 1). Ira control incubatioras,a lag phaseira Ihe CPT-1 assaywasobservedat very shortreactiontimes(Fig.2). This lag phaseseemstobeduetothecoraformationalcorastrainísof the CPT-I proteiniraducedby intracellu-lar malonyl-CoA [cf. Ref. (15)], arad it rapidly disap-pearsafter completeleakageof malorayl-CoAfrom thepermeabilizedceils, allowing relaxationof the enzyme(Fig. 2). Ira contrast,by depletiragintracellularmalorayl-CoA, ALGAR wasindeedableto eliminateIhelagpbaseinhereratto thepermeabilized-ceilassayof CPT-I activ-ity (Fig. 2). Themagnitudeof theAICAR-inducedstim-ulation of CPT-I wasreducedlo 45 t 14% at 40 saflerpermeabilizatioraaradlo 30 t 12%at 60 safter permea-bilization (Fig. 2), indicating thaI differencesin theconformationalstateof the CPT-1protein belweeracon-

oo.

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o-ao

o 60Reactiontime (s)

120

FIO. 2. Effact of AICAR on CP’I’-l activity at dilfororat reactiontimos. Hepatocyteswereproincubatedfor 15 mira ira tSeabseraco(O)or ira thepreserace(e) of0.5 mM AICAR. Subsoqueratly,aliquotswOreremovedto dotermiraeCPT-I activity at difToront reactiontimes bymethodA. Noto that enzymevolocity (aradnot productaccurnulatiora)‘a represeratedora tSey-axis.Resultscorresporadto six different Sopa-tocytepreparratioras.

trol arad AICAR-treated celís are disappearing.How-ever, a constaral20—25%stimulatioraof CPT-I activitywasobservedira MCAR-treatedhepatocytesup to 140a afterhepatocytepermeabilizatiora(Fig. 2). Ira auraya-tem, this time is believedto ‘be more than eraoughtoallow reversalof coraformationalcorastrairataof CPT-Iinducedby charagesira intraceilular malarayl-CoAcon-ceníratiora[cf. Ref. (11)].

To obtainmoredirecíevidencefor theinvolvemeralofa malonyl-CoA-independentcomponeníira theAlGAR-iraducedatimulatioraof CPT-L erazymeaetivity wasde-termiraedby a more complex procedurewhicb elimi-natesanyposaibleinterfereraceofmalorayl-CoA.Ira suchara assay(method B), hepalocytesare penneabilizedwith digitonira, followed by rapid aradextensivewash-íngof permeabilizedcelís to allaw completeremavalofmalorayl-CoA.Thera,permeabilizedcelís are iracubatedal 370C for up la 15 mira prior lo determinatioraof era-zymeactivity, so thaI anyconformationalcarastrairalofthe CPT-I enzymewill disappear(15). The useof tbispracedurecorroboratedthaI a 20—25%atimulation ofCPT-I by AlGAR is exertedby amalorayl-CaA-iradepera-denímecharaism(Fig. 3). Mareover,Ihe magrailudeoftbe stimulalioraof CPT-I as delermiraedby method Bwas ideraticalwith reactioratimes of 20, 60, arad 120 s(resulta nol shown). Note thaI for determinabanofCPT-I activity by method B cytosolie proteira thatleaked from the permeabilizedcella is removedpriorto determinatioraof erazymeaetivity, arad so erazymespecific activity (referredlo as milligrama of prolein)waa alwayshigherira melbodB Ihanira methodA (noteto Table1).

2’—

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173CONTROL OF’ FArPY ACID OXIDATION BY AMP-ACTI7VATED PROTEIN tUNASE

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Method

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A 8<5> 8(15> C D

FIG. 3. Differential offect of AICAR on CPT-l activity as deter-mineé by methodsA, B, C, aradD. Hepatocyteswero preiracubatedfor 15 mira ira tho absenceor ira tSe preseraceof 0.5 m=¿AICAR.Subaequeratly,aliquotswereremovedto determineCPT-tactivity bythe variousmethoda.In tSe caseof methodB, theghostsof perme-abilizedcelia woro iracubatedatMt for Sor 15 miraprior to dotermi-natiora of enzyxraoactivity. Roactioratime waa20 a for methodA arad60 a for methodsB, C, ané D. Resultacorresporadto eight differerathepatocytepreparatioras.Significaratly difforerat vorsus incubatioraswith rao additions: *~P c 0.05; **~P < 0.01.

Malonyl-CoA-independentstimulation of CPT-I byAICA.Rmayinvolve interaction of CPT-Iwith cytoskele-tal components. The obaervatiorathaI Ibe phospba-taseirahibitor okadaicacid atimulateshepatieCPT-I bya stablemecharaismled lo Ihe auggeslionthaI irabibi-hora of Ihe pbosphalaaesmight have resulled ira ira-creasedphosphorylationof CPT-I, with a corasequeraliracreaseof erazyrraeaetivity (7). However, iracubalionof purified mitochoradrialautermembranesor isolatedmitoehoradriawith differerat proteirakiraases(iracluding

AMPK) aradproteinphosphatasesdid nol lead to araycharageira Ihekiraeticaradregulatorypropertiesof CPT-1(15). It has also beenshowrathaI the malonyl-CoA-iradeperadeníiracreaseof CPT-I activity observedira oka-daic acid-treatedhepatoeytesis not due lo Ihe direcíphoaphorylátioraof Ihe erazyme,buímayinvolve modu-lation of interactiorasbetweenCPT-I aradraoradiffusibleextramitochoradrialcomporaerata(15). Three observa-tiona indicate that Ibis may also be Ihe caseof themalorayl-CoA-iradeperaderatcomponeníofIheALGAR-ira-ducedstimulaíioraof CPT-I::

(1) Stimulationof CPT-I wasnol apparentwhenera-zymeactivity waameasured,ira mIad mitochoradriaiso-latedfrom ALCAR-treatedhepatocytes(meihodD), de-spile Ihe presenceof 50 mM fluoride ira ah Ibeisolatiorabuifera(Fig. 3).Likewise, whenhepatocyleswerevigor-oualy disrupled by soraicatioraafter AlGAR trealmení(methadG), Ihe stimulatoryeffect of ALGAR ora GPT-Iwaa nol preserved(Fig. 3). Thus, malorayl-GoA-inde-pendenístimulatioraofCPT-I by ALGAR is oraly evideralwheramitochoradriaarestill assoeiatedwith olbercellu-lar fractioras, le., ira Ihe ghosta of Ihe permeabilizedcelís, buí nol after separalioraof mitochondria fromolber celí componerats.Therefore,it appearathai themalonyl-GoA-iradeperaderatstimulatiora of CPT-I byAlGAR requirescomporaenísof Ihe extramitocharadrialcompartmeratof Ihe celí.

(u) Tbe possibility Ihat cytoakeleíal comporaeraismaybeinvolved ira Ihemalorayl-GoA-iradeperadeníaIim-ulatioraof CPT-I by AlGAR was leatedby usiragtaxol.This complex dilerpenoid binda lo tubulin arad atabi-lizos mierotubules,preveratiragthe disaasemblyof mi-crotubulesiraaveryeffieientfashion(25). Iraterestiragly,malorayl-GoA-iradeperaderatactivatioraof CPT-I iraduced

TABLE 1

CombinodEffects of AICAR, OkadaicAcid. aradTaxol on the Activitiesof CP’I’-I andAcetyl-CoAGarboxylase

Adéitiona

CPT-I activity (ramol/minlmgprotoira)Acetyl-CoA carboxylaseactivity

<nmol/min/mg protein)Method A Method E

Nono<n = 10> 1.44 0.36 2.37 ±0.37 0.26 t 0.14AICAR (n = 8) 3.07 0.86* 2.94 ±0.31 0.01 ±0.01*Okadaicacid (n = 4) 2.38 t 0.46* 3.93 ±0.52” 0.03 ±0.01*Taxol (n = 4) 1.43 t 0.23 2.35 0.26 0.26 z 0.02AICAR + okadaicacid(n = 6) 4.51 1.15* 3.93 ±0.88* 0.01 t 0.01*AICAR -~- traxol (n = 6) 2.82 t 0.40* 2.30 t 0.52 001 ±0.01*Okradaicacid -4- traxol (n = 4) 1.50 0.26 2.44 ±0.33 0.06±0.03”

Note. Hepatocytoswere preiracubatodfor 20 mm with or without 10 pM taxol. Incubationawore coratinuedfor ara additioraal 15 mm withor w,thout 0.5 mnc AICAR and/or 0.5 pM okadaic acid. Subsequently,aliquota were removedto determiraothe activities of acetyt-CoAcarboxylasearadCFI’-!. The nctivity of CPT-I wasassayedby methodsA aradE. In niethodA, aaaaytime waa20 a. Ira methodE, tSeghostaof the permeabilizedcolla wereincubatedat M

0C for 15 mm prior to dotorminatioraof enzymoactivity in a 60-aassay.Resultacorrespondto tSeraumberof hepatocytepreparationashowra ira pareratheses.

Significantly different versusiracubationawith no additions: “P < 0.01; 5~P < 0.05.

174 VELASCO ET AL.

by ALGAR was eompletelyabolishedby preírealmeralof hepatocyteswiíh taxol (Table1, methodB). Likewise,laxol aratagoraizedIheokadaicacid-inducedstimulationof GPT-I (Table 1). It is alsoraoteworlhythat Ihe inhibi-tiora of acelyl-GoA carboxylaseby okadaic acid orALGAR waaraot preveratedby taxol (Table1), iradicatiraglhat the aratagoraisticeffect of taxol ora okadaieacid-aradAIGAR-iraducedCPT-I stimulalion is iradeperaderalof charagesira iratracellularmalorayl-CoAconeentralion.Herace,it seemsthaIblockadeof microtubuledyraamicsprevenlsmalonyl-GoA-iradeperadentatimulaliora of GPT-Iby AlGAR.

(iii) Síimulatiora of GPT-I by ALGAR arad okadaicacid waa raearlyadditive whera enzyme activiíy wasdeterminedby methodA, buínol wheraenzymeactiviíywasdelerminedby methodB (Table 1). Thia iradicatesthaIIheeffecíofALGAR observedira methodA ismosílyduelo amalonyl-GoA-deperaderatmeeharaism,whereasAlGAR andokadaicacidseemlo ahareacommoramalo-rayl-GoA-iradeperaderatpathway to stimulale CPT-I asevidencedby meíhodE.

CONCLUDINO COMMENTS

Ira Ihe preaentreportweshowthaI exposureof mIadhepatocyteslo ALGAR producesaatrorag(twofold)síim-ulaliora of long-chairafatly acid oxidatiora. Thia effecíseemalo rely on Ibeactivatioraof GPT-I by Iwo differeratmechanisma.Ora Ihe ono harad,AMPK-iraducedacetyl-CoA carboxylaaeinactivatiorawould load lo Ihe deple-hora of iratraceilular malorayl-GoA, with coracomitanídeinhibilionof CPT-I. Thismeehaniam,whichhasbeeraproposedlo operateira Iheisehemicheart(4, 5) arad Ihoworkirag muscle(6), seemsto make a major coratribu-tiora <ca. 80%)lo Ihe AIGAR-iraducedatimulatioraof he-palie long-chaira fatty acid oxidatiora. Ora the otherharad,AlGAR inducesa 20—25%atimullatiora of CPT-Iby a atable,malonyl-GoA-iradopondentmechanism.Wehave previously reported that incubalion of purifiedmitochoradrialouíermembraraesor isolated mitochon-dna wilh AiMPK urader phosphorylation conditiorasdoesnol leadoither lo the phosphorylaíionof GPT-I orto aray changoira Ihe kinetic aradregulalorypropertiesof GPT-I (15). Irastead,dala ira Ihis paporsuggeatIhalmalorayl-CoA-iradependeratmodulatioraof GPT-I acliv-iíy rnight real ora the modulatioraof interaeliorasbe-Iweera GPT-I aradcyloakeleíalcomporaenís.II hasboeraostablishedthaI Ihedyraamicsof mitoehoradriaira livingcelís (ahapechangos.dislocalion. arad fusion arad fis-siora)mayresulí from specific interactionaof mitochora-dnawith comporaenísof Iho cytoskeloton(26). Ira addi-tiora, it hasbeerashowraIhal ponin aradhexokiraasearelocalized ira domairasof Ihe milochoradrialoutor mem-branewhich iníeractspecificallywith microtubulo-aradmicrofilamerat-associaledproteiras. as well as wilh

otheratilí unidoratifiedcytoskeletalor cyloplasmicele-monIs (27,28). Ira livor colla, Iheseintoractiorasmayiraturra determineIhe permeabilil>?of Ihe milochondrialouter membranelo ADP (29). Mitochondriahavealsoboerashowralo coralairaapecificbindiragsilesfor phalloi-dira-síabilizedF-actin (30) aswell aafon fodrira, ara ae-tira-biradingproteira(27). Ira hepalocylesand ira severalcelí linos, hyperphosphorylatioraof microtubules,actiramicrofilamerats, arad iralermedialefilamerals leada lodisruplionof Ihe cytoskelelon(31—33). Ira fact,wehaverecently oblained dala iradicalirag thaI cytoskeletalcomporaentamight be iravolvedira Ihe okadaicacid-ira-ducedatimulatioraof GPT-I (34). WhetherAMPK mayphosphorylatecyloakelelal comporaeratarelated to Ihocontrol of CPT-I activity ja an intriguirag posaibililywhich is currently undersludy ira our laboratory.

The resultashownira Ihis reporímuatbeinlerpreledwith caution,sinceALGAR mayhaveeffectaapartfnomactivalion of AMPK. Thua, for example,ZMP mimicaIhe inhibitiora of fructose1,6-bis-phosphataseby AiMP,aradthuaIrealmoralofhepalocyteswilh ALGAR inhibitagluconeogeraesis(17). Ira olhor celí typessuch as Ghi-nosebamsterfibroblasís arad ovary colla, exposureloALGAR has beerashowralo alíenIhe levelaof differeratpurine arad pyrimidirae raucleolides(35—37). However,as discuasedby Cortanet al. (16), nono of Ihesearacil-lary changosira nucleotideaareevideníira ral bepato-cytea.Ira Ihe lalter, ALGAR aeemslo bearatherapecifieactivatorof AMPK or al leasíIho mosí apocifie eom-poundfor activaliora of AMPK availableto dale(16).

The ALGAR-induced malorayl-GoA-deperadenldein-hibitioraofGPT-I isquantitativelymoreimportaralIharaIhe malorayl-GoA-iradeperaderaldoirahibilion of erazymeactivity. Nonetheleas,Ihe lalton dala are acluallyhighly reproduciblearadstatiatically sigraificaral(Table1). II is remarkablethaI the two mochanismaoporalosimultaneouslyira the short-lerm control of hepalieGPT-I activily, especiallysinco ALGAR is nol expecledlo produce arayatable(covaloral)modificatioraof GPT-Ior Iho putalivo regulatoryproteinaof Ihecytoskeletora.¡lis alsoworlh notiragthaI wheraGPT-I activity is mea-suredby melhodE lo determineIho malonyl-GaA-inde-ponderalcompaneralof IheALGAR effect, cellaareexíen-sively washedarad furíhor iracubaledfor up lo 15 miraal 370G. Iclorace,if Ihe malonyl-GoA-indopenderatdom-hibilion of CPT-I activity reliesora proteira—proteinira-teractioras,ihesemay partially disappearaflor Ihe po-tential modiflealionaof Ihe orazyrraemicroenviroramoral.Therefore,il is conceivablethaI malonyl-GoA-iradopera-doral control of GPT-I aclivily may be quaratitalivelymore impontaníwithira the celí Ihan is evideníuradorthe coraditiorasof aunassay.

ACKNOWLEDGMENTSThia studywna finaracially supportedby a grnratfron, tSe Sparaish

CICX’T (SAF93/0281>.We also ackraowledgetSe supportin pad by

CONTROL OF FAflY ACID OXIDATION BY AMP-ACTIVATED PROTEIN TUNASE 175

tha NetherlaradsFonradationfor ChemicalReseareh(SON) with fi-nancial aid from tSe NetherlaradsOrgaraizationfor Scientific Re-soarch(NWO)

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BIOCHEMICAL A=4DBIOPH’YSJCAI.RE5EARCHcOMMUNICAflONS 233, 253—257 (1997)ARTICLE NO. RC976437

Studies on the Intracellular Locatizationof Acetyl-CoA Carboxylase

Math J. Hl. Geelen,*l CaspaarBijleveld,* Guillermo Velasco,tRonaldJ.A. Waraders,taradManuelGuzmánt*Laborato,yof VeterinaryBiochemistryand In-stituteofBiomembranes,Utrecht University, 3508 TD Utrecht,

Tite Netherlands;tDepartmentofBiochemistryand MolecularBiology 1, Faculty ofBiology, ComplutenseUniversity,

28040-Madrid,Spain;and tEmmaChildren’s Hospita4AmsterdamUniversity, 1100DD Amsterdam,Tite Netherlands

ReccivedMarch7, 1997

The presentwork wasperformed to identify the sub-celular ¡ocalizatioix of hepatie acetyl-CoAcarboxylaseACC). Celular organeilesinvolved ira fatty acidonda-don that contain a malonyl-CoA sensitivecarnitinepa]mitoyltransferase (CP’r> activity or that are linkedto the control of this activity were analysedfon thepresenceof ACC. No significant amount of ACC wasobservedira the mitochondrial fraetion prepared frornisolated rat hepatocytes.Furthermore, no associationof ACC aetivity sudmasswith isolated hepatie peroxí-sornescouldbe detectad.Ira cubation of isolatedhepa-tocytes -with cornpoundsknown to affect the integrityof the cytoskeletonlike okadaic acidor taxol indicatesthat ACO is associatedwith this subeeflular structurcof dxc hepatocyte.Suchassoeiationma>’ allow for effi-eient regulation of CPT activity arad thus of fatty acidoxidation. e ini AcadeaúcPresa

Deperadingora Ihe pbyaiologicalataleof the animal,Ihe liver is a tiasuethaI canejtherexhibil high ratesof fatty acid biosyralbesisor high ralea of fatty acidoxidation. Control of Ihe aclivily of acelyl-GoAcarbax-ylase(ACO) isof apecialirateresíin Ibis nespecíbecansetbe product of ACO, malorayl-GoA, is nol only a sub-strato far Ihe cytosolicprocesaof long-chairafalty acidsyntbeaisbuíja alsoarainhibitor of theactivily of carrai-tine palmiloyllranaferase(GPT), ara imporlaral pace-settingonzyme of long-chairafalí>’ aeid oxidatiora (1).As amallenof fací,malorayl-GoAsensitiveGPTactivilyis prosent both ira mitochondrial ouler membranea(GPT-I) (2) and ira Iho peroxisomalmatrix (3).

GiveraIhe funcliorasof malonyl-GoAira or on differenlorganellesof Ihe coil, Ihe enzymereaporasiblefor itsproduclion,ACO, may be eompartmeratalizedas well,

1 To whom correapondencoahouldbe addreased.

Siraceita original discoveryasasolubleenzyme(4) AAChasbeenasaurnedto belocaledira Ihe cytoplasm.Ea-lier work coracludedIhal Ihe activily of Ihe enzyrnewasnol associaledwilh subeellularparticles(5), buí lalerrepartairadicatedlhat activily ofACO canidbedetectedira high apeadprecipitabaof ral-liver bamogenalea(6-8) and ira a so-calledmitocharadrialfraclion of suchha-mogenales(9,10). Furlhermore, permeabilizalioraofisolaledhepatocyteswilh digitorairaalsaauggestedas-sociationof Ihe enzymewitb sornekind ofintracelularslructure(11).

Thesecanclusionahayaralied on aasaysof erazymeactivity ira cellular fraclioña (6-11) arad on meaaure-monI of AGG masaby a lecbniqueemployingIhe birad-irag of radiolabelledavidin (9,10).Bolb procedureaarepronoto error.Themeasurameralofte activity ofAGOis aubjectlo modifi cationof lbat activity by sevaralfaclara(12-18),aradIhe avidin binding meihodis serasí-live lo iratenfereraceby ollien biolin-containingproteínacompelingfor labefledavidin (16)-Therefore,Ibedatar-minalionof subcellulardiatnibulion oraIbabasiaof aví-din biradiragor enzymeactivily ja difeulí lo interpret.

The availability of ACG anlibodies(17) sudIba tecb-niqueof penmeabilizingisolaledhapataeyteawilh dig-itonira (15) haspermutadlo ne-addraasihe issueof la-calizalioraofACO aradtacir cumvanlsorneoftherneth-odolagicalproblema.

MATERIALS AND METI-<ODS

Malo Wistar rata <250-300g) which liad free accesato food andwaterwereusodthroughoutira this study.Hepatocyteswereisolatedaradiracubatedasdoscribodira (18). Acetyl-CoAcarboxylaseactivity,iaoform distribution arad masaweredeterminedira isolatedhopaticmitochondria,isolatedhepatio peroxisomesor ira digitonin-perme-abilizedhopatocytes.For isolationofmitochondriafrom liver tissue,tho proceduredescribodby Romara-Lopezet al. (19) wasfollowod.Mitochoradriafroin hepatocyteswereisolatedby homogenizingcelia(4-6 mg ofproteira)with aloose-fitting Douncehomogenizerin alow

0006-2912(/97$2500Copynght 0 1997 by Academic PresaAh righta of reproduction in aray fon reservad.

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Vol. 233, No. 1. 1997 BIOCHEMICAL ANO BIOPHYSICAL RESEARCH COMMT.JNICATIONS

íonxc streragth,iso-osmotiomediun,consistiragof 0.3 M maranitolarad2 mM lepaspH 7.4 ira thepreseraceof aproteinaseinhibitor mixture(17). The homogenatewas ceratrifugedat 1500 >< g for 2 mira. Thepellot wasdiscardedaradthe superraatantceratrifugedlcr 2 mira at16.000 x g. Theresultingaupernataratwastermedthecytosolicfrac-tiora. The pellet was washodonce by resuaperasioraira tSe low ionicstrength medium and receratrifugation at 16.000 >< g. TSe resus-pended firaral pollot was terrned the mitochondrial fraction. Peroxi-sorneswereisolatedfrom animalsfeda standardpelleteddiet supple-meratedwith 1% di(2-ethylhexyl)phtaiateira orderto proliferate theperoxisomalcompartmorat(20). Treatmentof anúnalaarad isolatioraof peroxisomeswasperformedasira (20). .4.11 homogeraizingatepaandaubsequentprocedureswereporformedat4’ C.Theisolatedfractiorasxvere sraapfrozeraira liquid raitrogeraaradatoredat —20’ C. To deter-mine theaniouratclACO retainedira thecdl ghostsfollowirag incuba-tiora of tho intact hepatocyteswith different cellularcifectora,theisolated celia were pornioabiizedarad thoroughly washodprior toharvesting the ccli ghosts.Thus, 1.0 ml of hepatocyteausperasionwaa pormeabilizedwith digitorain (ca. 60 gg por mg cdl prateira)diasolvedira a medium corataining50 mM Hopes(pH 7.5), 0.25 Minannitol, 5 mM 2-mercaptoetharaoiarad aproteinaseirahibitor mix-tureasira (17).The reaultiragmix of collaaradpenneabilizingmedian,wasgently shakerafor 5 a. aradrapidly diluted by trarasferte tabescontairairag40 ml of ice-cold madiumwithout digitoraira. Ceil ghostsweresedimeratedby ceratrifugationatSSOgfor 15 s, aradpeílotaweretakeraup ira 1.0 ml ice-coidmediumcoratairairag50pl ofthaproteinaseinhibitor mixture.The reaultingsusperasionaofcell ghostswerekeptat —80’ C tul massniensurementawereparformed.Detenninatioraof total ACC masaretairaedira ceil ghoatafollowing digitonira traat-mentorassociatedeitherwith isolatadmitochondriaor peroxisomes,wasperforniedwith anELISA assayesseratiallyza deacribadby Iver-sonetal. (21) employiraga primary aratiserumagairastrat-liverACO(17). Thedistribatioraof isoformawasdeterminedusingimmunopra-cipitatiora, SDS/PAGE,immunoblottingaradautoradiographyas iii(17). Activities of ACO aradfatty acid synthasewere monitoredex-actly ng describedbefore(15,17). Seurcesof chemicaisza ira (17).

RESULTS

me prasentstudy waa undenlakoralo identifr Ihesubeellularlacalizatioraof ACO. Ira ordenlo invealigatea posaibleassaciationof ACG with mitochondnia—asauggestadby Alíred aradco-workers(9,10)—milochora-dha were preparadfrom isolated hepalocyles.Witbsuchapraparalionleasmechanicalfonce is roquiredteliberale milochondria as comparedlo whole liasne aathealarlirag material.Mechanicalinterferencewith suassocialioraof ACC aradmitochondniawasfurther keptto aminirnunxby usinga loase-fiítiragDauncebomaga-raizer. To iratenfene aa litíle as poasibla with polenlialolectrostatieinteractiorasbetwearaarazyrraearadongan-elle, a low ionic slrengthmediumwaschosorafon isola-lion of theaubeellularfraelioras.Ira addiliora, thewholeisolation procedure—iracludiragsubcellular fraclion-ation by coralnifugalion—wasaimed al spaedratherIbanal racovery.Aclivily measuremenísfon AGG ofIbaresnlting subeellularfracliorascould not be ponformedbocausaof Iba preseraceof malorayl-GoAdecarboxylasaira mitachandnia.The laltor enzymeiralenferaswilb Iheassayfon AGG activity (15). The subeellularfraclionawarasualysadby SUSgel electrophoresiafon Iba proa-once of Ihe 265-kDa azul 280-ma iaofonms of AGC

ASO - 250

265

‘9“ ,~,$ ‘.

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4>4? 4>

FIG. 1. Acetyl-CoA carboxylase(ACO) araalysiaof subeellularfractiorasof hepatocytesfrom noz~mahlyfed rato by SDSgel electro-phoresis. Cytcsolic (Cyto) arad milochoradrial (Mito) fractioras ob-tairaedfrom isolatedhepatocytes(seaMaterialaand Methoda)werearaalysedfor tSe preseraceof the ACC-265 aradACC-280. A sampleequivaleratte 100 gg of proteiraof eachfiaction was loadedte thelanas ng iradicated.Following labeliragwith [~S]streptavidin, SDS/PAGE aradtrarasferto nitrocellulose,thebiotira-coratairaingproteinawerevisualizadby aatoradiography.“Indicatesthat theinimunopre-cipitate with apriman’ antiseruniagainstrat-liverAOC waaloadadira that Jane; iradicatesthat nra iiramunoprecipitatewith a pre-im-mufle serun,wasloaded;theprefix sup. iradicatesthat Ihe superna-tantof tizo imniunoprecipitatewásloaded.

(AGG-265 arad ACG-280, reapectivaly). The twa isa-formahayobeenauggastadlo play differeral biolagicalroles. Ira particular,ACC-280 is of intaresíira ibis re-apecíbecauseit mighl beinvolvad ira Ibe syntbesisofmalonyl-GoAfon inhibition of GPT-I (22,23). SinceIbalalter enzymahasamilocharadniallocajization(24),suassoeiatianof AGG-280 witb milochondria would befoasible. Fig. 1 shows Iba analysisof ihe presenceofAGG isoformaira Ibasubeaflularfractionaframisolatedhepatocytes.Theresultada nol revealamitochondniallocalization of ejíher of Ihé two AGC isofarma.Ira suatíempílo sparepotentialhydrapbobicinteracliorasbe-tweera AGG sud mitochoradria, Ihe lalter organaflaswerealso preparadfrom is¿laledhepatocylasira abighiaraic strengthmadium(0.9% NaCí sud 20 mM TrispH 7.4) exactlyasdescribedfor Iba law jonie slrenglhmedium.Mao ira Ibis caseno aasociaíionof any of IbaAGO-isaformawilb Iba miloebandrialfractiorawaa ap-pareral(dalanol sbowra).Theanalysisof Iba presenceof AGC-isoformnaira Ihe mitochondnialfraction wasre-peatedwitb lwo diffeneratpximaryanlisenaalsonaisadagainal ral-liver AGG. Thé resulís wera idanlical loIbosepresentadira Fig. 1. (dalanol abowra).Tha sualy-sisof Ibaprasoraceof ACO isoformawasalsoperformeden subcellularfractiona of tal-livor calla from araimaisira differerat nutrilional atatea,Le. síarvadfon 48 b sudsíarvedfon 48 h fol lowadby refeadingacarbohydrate-íicb, fal-peordiet fon 48 h. No sigraifiesulmasaofeitberACC isoform waa observadira Iha mitochoradrialfrac-tiara ira suy of Iba nutritional sIales(dala nol sbown).

254

Vol. 233. No. 1, 1997 BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS

TABLE 1

ActivitiesofPizospizogiucoisomerase(PGI), Gatalase,FaítyAcid Syníhase(FAS), aradAcetyl-CoA Carbozyiase(AGC) iraPost-NuclearSupernataral(PNS) arad in Isolated Peroxi-sornesfrom Livor of Control arad Di(2-ethylhexyl)phtaiate(DEHP)-TreatedRata

Erazvnie

PNS Peroxisonies

Control DEHPCoratrol DEHP

(gmol/min/mgproteira)

Catalase

PGI

0.83 0.97

0.55 0.39

10.6

0.013

6.64

0.023

(omol/min/mgproteja)

FASACC

1.88 0.11 1.14 = 0.030.34 t 0.03 0.42 0.01

rad.raM.

rad.rad.

Note. PGI andcatainsearemarkerenzymesfor cytosolaradperoxi-sornes,reapectiveiy.Data roproaeratmearasof two control arad twoDEHP-treatedaninials.nd., noradetectable.

Hapatieperoxisamesaxbibil GPTactivity thaI is sen-sitive lo inhibilion by malorayl-CoA (3, 25). To studyapoasibleaaaociationofAGG with Ibis organelle,peroxi-sorneswore isolaled from liven liaaueoblainad fromrata treated with di(2-olhylbexyl)pbíalate(DEll?), aproliferator afilie peroxisomalcomparlmení(20). Thedataira Table 1 indicale Ihat Ibera is no associalianofACG aclivily witb peroxisomeafrom both control sudDEHP-lraatedaniniala.Likewise,no signiñcaníasaaci-ahoraof AGG lo peroxisomeswasobsanvedora Ihe basiaof measunemerataof enzyxnamasa(dala nol sbawn).

QurreceralabservationIbal cyloakeletalcompanantaare mosí likely involved ira Ihe control of Ihe activilyof GPT-I (26) promptedus lo corasidera cyloskelelallocalizalioraof ACG, sincethe latíanerazymeis pivolalira Iha conírolof CPT-I activity (1). To sualyaeapolen-tial aasociatioraof AGG witb Iba cytoskeleíon,isolaledhepatocylaaware ineubaledwilh vaniouacompaundaknowra lo affect cyloakelatal integrily. Subaequenlly,celis werepermeabilizedby shorl-termtrealmeralwilhdigilorain followed by rapid removal of releasedeyto-salic proteirasiracludingACG. Ira Ibis approacb,AGGasaoeiatedwith a aubeellularsíruelunewill be sedi-meníed. Tbe resulting pellel waa used lo detennineAGG masa. The poasibilily of ara aaaacialiorabetweoraACO arad cytoakeletalcomporaentawas teslad by theuseof okadaicacid (OA), taxol aradcolchieine.QA hasbeeraahownto disrupíIhe cytoskeleloraof hepalocytos(27). Taxol birada lo lubulira arad síabilizea microtn-bules,preveraíiragIba diaaaaemblyof microlubuleaira averyefficieralfasbiora(28). Tbepolymaricatateof micro-tubulescanbe dissociatedby colehicine(29). Tbe dataof laMe 2 shawthaI incubatioraof bepalocyteawilb OA

resultedira Ibe releaseof substaratiallymoreAGC tbsuira control colla. Interestiiigly, Iba OA-iraduced effeclwas eomplalely abolisbedby pretraating Iba hepalo-cytea wilh taxol (Tabla 2). Likewiaa, prelreatmeraloftha colla wilh KN-62, a specific inhibitor of Ca2t’cal-modulin-deperaderalproleira binase II, also preveraladIhe OA-iraducedreleasaof hapatieAGO. 5-Aminoimid-azole-4-carboxamideribonucleaside(AlGAR), aspaciñcactivalarof5’-AMP-activaíedprolainbinase,waswilh-out effect on Ihe retaralionof AGG maasira celí gbosls(Tabla2). Incubalioraof he~alocyteswitb colehicinedidnol affecl tbereleaseofACC from digilorain-permeabil-izedcella ajíhar.The dalaobtainedwitb amyloglucosi-dase(Tabla2) suggeatthaIglycogangranulasnepresoralasubeellularsíructurecaSableof bindingAGG. To de-termina whelher Ibe two AGG isofonmawill diffarera-tially releaseupan permeabilization,Ihe ceil gbostswene alao analyaadfor Ihe presenceof ACC-265 sudAGG-280.However, irrespecliveof Iba incubalioracon-dition, Iba ratio ofAGC-265/AGG-280wasidentical,j.c.AGG-280was alwaysabout anathird of Ihe total ACOmasa(dalanol ahown).

DISCUSSION

Saveralaludiesperforniedby albera(6-10)aswell as

by ourgroup(11) lod lo Ibe auggastionof aasocialionof

TABLE 2

MassMeasuremerataof Acetyl-GoA CarboxylaseRelamedira Digitorain-PenneabiizedRal Hepalocyles

AdditiorasPerceratageof total ACO masa

retairaedira ce11 ghosts

Control 53.2 ±18.0OA 20.6 ±8.0*Taxol + OA 55.5 ±6.6KN-62 -4- (JA 48.5 z 10.5AICAR 46.0 ±19.5Colchicine 64.5 8.7Taxol + colchicine 67.9±1.0Control’ 15.8 ±2.8Control -4- amyloglucosidase’ 4.6 ±1.0*

Note. Hepatocyteswere prein¿ibatedfor 20 mira with or without10 pM taxol or 30 gM KN-62. incubadoraswere coratinaedfor 15additionalmirawith orwithout 0.5 mM 5-amiraoimidazoie-4-carboxa-mide riboraucleoside(AiICAR), 0.5 gM okadaicacid (OA) or 0.1 mMcoichicine.Subsequently,ccli ghostswere preparedas describediraMaterialaaradMetizoda.ACC retainedira tize cefighostswasquanti-Sed by avidin-basedELISA annlysisusingas tize probirag aratihodya primaryantiaerumagainstrat-liverACC (17).

‘mese resuits aro from two setaof ccii gizoste of control celiaresuspendedarad iracubatedfor 15 ndditionaimirawith or without 50U amylogiucosidnse.Resultarepreseratthemean 5.1). of3 differenthepatocytepreparatioras.TizeaniouratofACC preseratira intacthepa-tocytes wassetnt 100%. Values of OA are signiñcantiydiffererat(Pco.01)versasita controlusingtheStuderat1 test.This alsoappliesto aznyloglucosidase(P.<O.O1)versasita control.

255

Vol. 233, No. 1, 1997 BIOCIjEMICAL AND BIOPHYSICAIL: RESEARCII COMMUNICATIONS

AGC to asubeellularorganalla.However,after carefulisolatiora, no associalioraof ACO wilh eilhar milochon-dria or peroxisomescould be observadira Iba proseralsíudy. Nonelbeleas,ira Iba mIad calí ara aasocialioramayexisíthaIis nol firm sothaI Ibeenzyinecaraescapeinto Iba supannataralduriragIhe biochemicalprepara-tiaraprocadure.The preseníapproachof usingIhetech-raique of pormaabiliziragisolalad bepalocytesraíharlbsu bomogeniziragIbe cella ravealedsu associalionof AGG wilb Iba cytoakelelon.The implicalion of Ibiscytoakelatalconnectionof bolh ACG (Ibis síudy) sudGPT-I (26) is thaI it allowa fon an efficienl ragalalioraof fatly acid oxidation lbrougb malonyl-CoA-iraducadcharagesira GPT-I activily. Furtbarinore,Iba differenldigilorain-releasa-paltarraof ACG following iracubalionofhepatocyleswitb OA ascomparadlo Iba controlsitu-alían raises Iba possibiily thaI AGG may Irsuslocatefram ono comparlmeratlo anolber,depandiragora Ihesilualiora of Iba celí, and Ihus efficiently control Iheactivily of GP’r-I.

II couldbe arguadthaI Iba releasepalterraof ACGfollawing digilorain penneabilizatianis a refiaction ofits síate of aggragalioraarad thaI OA by favoring Ibamonomericalaleof Iba erazyimawauldcauselasa AGGto beratainadby Iba celígliosta.Howaver,theidenticalAGG raleasepallarrafollowing iracubalionof hapalo-cytea wilb inaulin on glucagora—putalive affectorsofIhe aggregaliorastaleof AGO (30)—is nol ira lina withIbis reasoning(urapublisheddataof Iba aulliora). Theinability of ALCAR lo altar ACG retentiora by calí gbostamay also indicala thaI Ibera is no relatiora betwaaraphoaphorylaliora—aIleast by 5’-AMP-aclivalad pro-1am kinaae—aradratenlion of Ihe enzyma by caligbosts.

The sutagoraislicaffecí of KN-62 arad taxol 011 OA-iraducedreleaseof ACG is quita similar lo Iba anlago-niatie affecl of Iba Iwo formancompauradaon Iba OA-inducadatimulalianof CPT-I aclivity (26,31).Dala ofKN-62 areof apacialinteresísinceIbis compoundalsoprevenísquila affactivelyIba OA-iraducedirahibiliora ofAGG activily asmeasuredira a permeabilizad-cail assay(unpublished dala of Iba antbors). This implicalesCa2~/calnodulin-dependentprolein kinaaa II ira Ihecontrol of both AGO and CPT-I arad ja at odda withIbeopinionthaI 8’-AMP-acíivatedproteinbinaseis Ibemoal impartant—if nol unique—protein binase ira-volved ira Ihecontrol of ACO ira iralactbapaloeylea(32).Ira addiíion, pbosphorylalioraof cytoskelelal compo-nenIa—asshowraby Iba effacls of KN-62 sud QA—mayberaquiredfon AGClo beroleasedftam ita anchan-ing placaon Ibacytaskelelara.Iralenealingly,colebicinawaawithaut eltecíjusí like ira Iba caseof GPT-I aelivily(26) auggealingIbal apecifie protain-proteiniralerac-tiorasbeíweenIba lwo arazymessudcytoskelalalcompo-nenIasudnol Iba meredisruptionof Iba cyloakalatora

may be iravolved ira Ihe iníracellulanbahaviorof Iba

twa enzymeasud Ibeir control.

ACKNOWLEDGMENTS

Tizeseinvestigatioraswere supportedira pafl by tize NetherlaradsFoundatiorafor ChemicalReseaÑiz(SON)with firaaracialaid fromtheNetizerlaradaOrgaraizatiorafor Scieratific Researciz(NWO) aswell asby tize Spanish“Comisión Interministerialde Cieraciay Tecraologia(SAE 98/0281).”

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Relvultadosy DiscusiónCapítulo 2

DISCUSIÓN

Los datos expuestosen el presentecapitulo permiten sugerir que elmecanismode regulación de la CPT-l independientede malonil-CoA podríadesempeñarun papelsignificativo enel controldel metabolismodeácidosgrasos.

Enprimer lugar, los resultadosobtenidosconcélulasdehepatoma(capítulo3.1), aunquetodavíapreliminares,sonacordescon la ideade que las interaccionescon el citoesqueletoestán implicadasen el control de la actividad CPT-l. Lacapacidadcarcinogénicadel ácido okadaico, cuyas acciones sobre la célulaincluyen la ruptura del citoesqueletoy la alteraciónde la forma celular, podríaconllevar alteracionesdebidas a la la pérdida de divetsas interaccionesdelcitoesqueletocon diferentesenzimastalescomo la CPT-l. Así, los efectosque elácidookadaico ejercesobre la CPT-I en hepatocitospodríanmimetizara los quetienenlugar durantela transformaciónde una célulaen tumoral,en la que diversasproteínas sufren alteracionesde su fimcionalidad. Durante estos procesos,numerosasquinasasven alteradasuregulacióny sufrenun aumentode su actividad

2+por encimade loslímitesfisiológicos. Así, la activaciónde la Ca /CMPKII que elácidookadaicotraeconsigoen hepatocitosaislados,podríano ser equiparablea laque tendríalugartras la activaciónmediantemediadoresfisiológicosen unacélulano transformada,peropudieraser del mismo ordenque la ‘que tiene lugar en unacélulatumoral.

Por otra parte, la AMPK también pareceestarimplicadaera el control acortopíazode la CPT-l. Los efectosdel AlGAR sobrela actividadde estaenzimapuedendividirse en dependientese independientesde malonil-OoA (capítulo2.3.2). Estosdatos,junto a la posible localización de parte de las moléculasdeACG en el citoesqueleto, indican que ambos mecanismospudieran estarinterrelacionados.

La regulaciónde la CPT-l dependientede malonil-CoA havenido siendoconsideradacomoel principal mecanismoderegulacióna cortopíazode la enzima.En el interior de la célula, donde no es esperableque ningún agoraista ejerzaalteraciones tan drásticas como las producidas por el ácido okadaico, lacontribución del mecanismo independiente de malonil-CoA podría sercomplementariaa la del dependientede los niveles de este metabolito. En estesentido, los datos obtenidostrás la activaciónde la AMIPK por AICAR podríanacercarsemás a lo que ocurre in vivo. Además,la posible localizaciónde la ACCen el citoesqueletosugiere asimismoque ambos mecanismosactúande formacoordinada,ya que si la ACC y la CPT-l se localizasenpróximas entre si en elinterior de la célula, la concentraciónefectiva de malonii-CoA en esos puntospodríaser muchomayorproduciendoasí una inhibición mucho másefectivade laCPT-l. Así, la desorganizacióndel citoesqueletotraeríaconsigono solola pérdidade lasposiblesinteraccionesreguladorascanla GPT-l sino un alejamientofisico dela ACC y con ellade lafuentedemalonil-CoA.

3. DiscusiónGeneralyConclusiones

Cavitulo .3 ¡3kcu~iónGeneralyConclusiones

Desdeque haceahora20 años,McGarryycolaboradoresdescubrieranque la CPT-l es inhibi-da por malonil-CoA dichainhibición (quepermiteel establecimientode un control coordinado desíntesisy oxidación de ácidos grasos)ha venidosiendo consideradacomo el principal mecanismode regulaciónde esta enzima(McGarryy Erowra,1997). Sin embargo,a lo largo de los últimos añosse ha puestode manifiestoque la regulaciónde laCPT-l también dependede un mecanismoinde-pendientede malonil-CoA (Guzmán y Geelen,1993; la presentememoria),que se basaríaen laexistenciade interaccionesentre ciertos compo-nentesdel citoesqueleto(probablementelos fila-mentos intermedios) y las mitocondrias. Así, elcontrol de la actividad GPT-I podría ejercerseatres niveles(Esquema1):

i) Actividad de la ACO/niveles de malorail-CoA.

u) Interaccionescitoesqaeleto-mitocondrias.iii) Localizaciónsubcelularde la ACC.

1. Regulacióna cortoplazode la CPT-I

z) ActividadACC.El primer puntode control de la actividad CPT-lseriael de los niveles de malonil-CoA, que vienen

determinadospor la actividad de la ACG. El con-trol de estaactividad enzimáticaen hígado depen-de de diferentesfactores, pero fundamentalmentedel gradode fosforilación delaenzimay por tantode la actividad de las quinasasimplicadasen sufosforilación(Hillgartner el aL, 1995).

~0Interaccionescitoesquelet¿-mitocondrias.En el interior de la célulapodríanestablecerseunaseriede interaccionesentrediferentescomponentesdel citoesqueleto(probablementelas citoquerati-nas)y la CPT-l (o algunaotraproteínaquepudieraestar implicada en regularía). Estas interaccionespodríanconstituir un mecanismoregaladorde laCPT-I, de tal maneraque su rupturaprodujeseunaumentode la actividad de la enzima (Capítulo2.2). -

La naturalezade estasinteraccionesaúnno ha sido determinada,pero el hechode que laCPT-l puedaadoptardiferentesconformacionesenfunción de la concentraciónde malonil-OoA a laque ha sido expuesta(Zammit, 1994),junto a quela mayorpartede la enzima(incluyendo los domi-nios catalítico y regulador parecen encontrarselocalizadoshacia la cara citoplásmicade la mem-brana mitocoradrial extema(Fraseret aL, 1997),posibilitaría la existenciade contactoscon proíef-

Esquema1

2~ccAc 6-.

(menosactiva),

Estimulaciónde la CPT-I

e

¾e CPT-I

(mas activa)

Esquema 1. Modelo de regulación acorto plazo de la actividad CPT-I. La actividadCPT-l podríaverse reguladaacorto plazo a tres niveles: 1) Actividad ACC/nivelesde malonil-CoA. 2) Jnteraccionesentrecitoesqueleto y mitocon-drias. 3) Localización subcelular de la ACC. Estos tresniveles de regulaciónpodrían actuar demaneracoordinadaparadeterminar la actividad de la CPT-l en las diferentessituaciones fisiopatológicas. Abreviaturas: ACC, acetil-CoA carbo-xilasa; CPT-l,carnitina palmitoiltransferasa 1; M-CoA, malonil-CoA

Canitulo 3 DiscusiónGeneraly Conclusiones

nas localizadasfuerade la mitocondria(comoporejemplo las citaqueratinas)quepudieranfavorecerla conformaciónmenosactiva(tensa)de la enzima.En este contexto resulta interesantela sugerenciade queuna proteínade la membranaexternamito-condrial (bcl-2) interaccionacon la CPT-l en loquepodriaconstituir tambiénunaforma de regula-ción de la enzima (Paumenel aL, 1997b). La re-gulación de esasinteraccionespodríadependerdela actividadde unaserie de proteínaquinasasquecontrolanel grado de organizacióndel citoesqae-leto.

iii) LocalizaciónsubeelulardeIaACC.Se ha propuestoque la isoenzimade 280

KDa de la ACC podríateneruna localizaciónsub-celular próximaa laCPT-l, asociándosea la propiamembranamitocondrial externa(Ha el aL, 1996).En la memoriase sugiereque una fracción de laACC hepatocelularse encontraríaasociadaal ci-toesqueleto(Capítulo2.3.3). Así, la concentraciónefectiva de malonil-CoA para inhibir a la CPT-lpodríasermucho mayorcuandola ACO se encon-traseen las proximidadesde la enzima. Los mis-mos factoresqueestánimplicadosen el control delgradode polimerizacióndel citoesqueletopodríancontrolarel porcentajede ACC asociadaal mismo,y conello la proximidaddeéstaa la CPT-I.

2. Principalesproteínaquinasasimplicadasenel control a cortoplazodela CPT-I

Puestoque el control de esastresvías de regula-ción de la CPT-l dependeen granpartedel gradode fosforilación de las diferentesproteínasimpli-cadas,el control de la actividadde ciertasquinasases el que determinala actividada corto plazode laCPT-l.

¡) Ca2 ¡ /CMPKIL

La activaciónde estaquinasaque induce el ácidookadaicoconlíeva: 1) la fosforilación y rupturadelos filamentos intermedios(CapItulo 2.2; Toivolael aL, 1997)y 2) la fosforilación e inactivacióndela ACC (Haysteadel aL, 1988). Ambosprocesostraenconsigo unafuerte estimulaciónde la activi-dad CPT-l. Sin embargo, la incubacióncon dife-rentescompuestosqueproducenun incrementoenla concentraciónde Oa2~ intracelularno modificala actividad de la CPT-l, lo que -como ya se hadiscutido anteriormente(CapItulo 2.2)- podría serel reflejo de un diferentepatrónde activaciónde laCa2~/CMPKll de hígadoconrespectoa la de otrostejidos másestudiadoscomo el cerebro. Por ellonos planteamossi el papelfisiológico que desem-peñaesta quinasaen la regulación de la CPT-Ipodríadependerno tanto deun aumentotransitoriode la concentraciónde Ca2 intracelularcomo de

otros factoresque hicieranque la Ca2~/CMPKll sevieraestimuladade una formamásprolongada.

Puestoque el ácidookadaicoes un agentepromotorde tumores(Wera y Hemmings,1995)yen célulasde hepatomatieñe lugar la sobreexpre-sión de diferentesproteína’quinasas(Yang el al.,1996; Tanakay Wands, 1996), el nivel de activa-ción de la Ca2~/CMPKll que induce el ácido oka-daicopodríasermásparecidoal quepuedeencon-trarse en el interior de las célulastransformadasque al debido a una activación mediadapor unincrementode la concentraciónde Ca2~ intracelu-lar. Dado que una de las característicasde dichascélulas transformadases qúe se producengrandesalteracionesen la morfologíacelular mediadasporuna desorganizacióndel citoesqueleto,los estudiosllevados a cabo en células‘de hepatoma(Capitulo2.3.1)sondegraninterés, Estosdatosindican que,en célulasFao y HepG2el ‘ácido okadaicono mo-dula la actividadde CPT-I, que estaríaaumentadacon respectoa la de hepatocitos.La posibilidaddeque esafaltade respuestaseadebidaa unapérdida(quepodríaser constitutivaen esascélulas) de lasinteraccionescon el citoesqueletaaparececomoatractiva,puestoqueestaria~enconsonanciacon losdatosanteriormenteexpuestos.

Por otraparte,comoya se hamencionado,recientementese ha establecidouna relaciónentreactividad CPT-I y apoptosis (Paumen el aL,1997a), de tal maneraque una inhibición de laCPT-l aumentaríala disponibilidad de palmitoil-CoAparala síntesisde cerámidasque actúancomomediadores en dichos procesos de apoptosis(Hanraun,1996). Es interesanteque: 1) las célulasde hepatomacuyaactividadGPT-l es másalta quela de los hepatocitosnormales(Gapítulo2.3.1),sonresistentesa la inducción de apoptosispor ácidopalmítico (Paumenel al, 1997a); 2) partede losefectos de las ceramidasestánmediadospor unaproteína fosfatasaactivada’por ceramida(CAPE’)que es inhibible por ácido okadaico (Hanraun,1996); 3) bcl-2, una proteínaque desempeñaunpapel importanteen la regulaciónde la apoptosisinteraccionacon la CPT-l en la membranamito-condrial externa (Paumenel aL, 1997b). Todosestos datosconsideradosconjuntamenteapuntanaque la regulaciónde la actividadGPT-I podría serimportanteen el control de los procesosapoptóti-cos.Era suma,la activación de la CPT-l observadaera célulasde hepatomapodría ser una forma defavorecerque la célulano ~ntraseen apoptosis.Enesesentidoresultamuy atractivoconsiderarque ladesorganizacióndel citoesqueleto(característicadelas célulastumoralesy que‘ha sidodescritaen estetrabajo como un mecanismode regulación de laGPT-l ) pudieracontribuir a dicho bloqueo de laapoptosis(Esquema2).

Cacílulo 3 DiscusiónGeneraly Conclusiones

Esquema2

OA Célulastransformadas

Apoptosis >4 Cer1$-

>1.

APOPTOSISAciI-CoA

•..r~ A1CA¡

r ¡1a

mitocondi

Esquema 2. La pérdida de las interacciones con el citoesqueleto podría contribuir a la inhibición de la apoptosís encélulas de hepatoma. La actividadOPT-l podría estar aumentada en célulasde hepatomadebidoa la pérdidade de lasinteracciones con proteínasdel citoesqueleto. Este aumentode actividad podría favorecerla metabolización del palmi-toil-CoA (precursorde la síntesisdeceramidas)contribuyendoasí al bloqueode la apoptosis~Abreviaturas:Cer, cera-mida; CKJI, Ca2t’calmodulina proteína quinasa II; (JA, ácidookadaico.

W AMPKDiferentesdatosaportadosen estamemoriaapun-tan a que estaqumasaparticiparíaen la regulaciónde la actividad CpT-l a travésde los mecanismosdependientee independientede malonil-CoA. Así,el AICAR, un activador de la AMPK (Vincent elal., 1996) estimulala GPT-l (Capítulo 2.3.2). Enhígado,la AMPK esla principal quinasaresponsa-ble de la fosforilación e inactivaciónde la ACC,con lo que los niveles de malonil-CoA dependenen gran medida de la actividad de la AMPK(Hardie y Carlirag, 1997). Sin embargo,partedelefecto activadordel AICAR no es debido al des-censoen los niveles de malonil-CoA y puedeserprevenido por el taxol. Recientemente,hemosobservadoque la adición de AMPK a célulasper-meabilizadasproduce un fuerte incrementoen laactividad CPT-l (datos no publicados), lo quesugiere que esta quinasa (al igual que laCa2~/CMPKll) podríaafectar al estadode polime-rizacióndel citoesqueletoy estimularasí a laGPT-1. Aunque por lo que sabemosaún no se ha des-crito que la AMPK fosforile a elementosdel ci-toesqueleto,esta hipótesisresultamuy atractivapues implicaríaque la principal quinasaencargadade la regulación del metabolismolipidico podría

establecerun control coordinadode la síntesisyoxidaciónde ácidosgrasosincidiendo en los tresmecanismosdescritosal comienzode la presentediscusión:actividad AGO/nivelesde malonil-CoA,interacciones citoesqueletó-mitocondriasy portanto localizaciónsubeelularde la ACO (Esquema3).

3. Efectosde otros mediadores

Numerosos mediadores extracelularesejercensus efectos sobrela GPT-l y muchosdeellos lo hacena travésde un mecanismoindepen-diente de malonil-CoA (Guzmány Geelen, 1993;la presentememoria).El principalfactor reguladordel metabolismode ácidos!grasoses el cocienteinsulina/glucagón(Zammit, 1996). Sin embargoelmecanismoa través del cual las variacionesendicho cocientepuedeninducir las modificacionesen la actividad CPT-l no ha sido completamenteaclarado.La incubaciónde‘hepatocitoscon gluca-gón, forskolinao db-cAMP produceuna activaciónde la CPT-l (Guzmán y Geelen, 1993), pero laadiciónde PICA a célulaspermeabilizadasno pro-duceningúncambioen dichaactividadenzimática(CapItulo 2.2.2). Además,estaquinasano parece

Capítulo3 DiscusiónGeneraly Conclusiones

Estadoscetóticos(l~1ipogluce,raia,

4lnsulina?Olucagón, ¿7)

OA9

Esquema3AG

AMP

---.9A

X~PK

Cítoesqueleto

—st

Mitocondria

¡ GG

Esquema3. La Ca2~/CMPKIIy la AMPK sonlas dosprimeipalesproteínasquinasasresponsablesdel control de

la actividadCPT-1.La fosforilación y desorganizaciónde los filamentosintermediospodríaser llevadaa cabopor laCa2t’CMPKII y quizástambiénpor la AMPK. Abreviaturas:ACC, acetil-CoA carboxilasa;AMPK, proteínaquinasaactivadapor AMP; CKJI, Ca2~/calmodulinaproteínaquinasaII; CC, cuerposcetónicos; CPT-l, carnitinapalmitoil-rransferasa1; M-CoA, malonil-Co; (JA, ácidookadaico.

ser responsablede la fosforilación in viyo de lascitoqueratinas(Toivola el aL, 1997)por lo que suimplicación en la regulaciónde las interaccionesentre citoesqueletoy mitocondrias parece pocoprobable.Por otra parteaunquese ha descritoquela PKA puedefosforilar a la ACG (Hillgartner elaL, 1995) y que los niveles de malonil-GoA dismi-nuyen tras la incubaciónde los hepatocitosconglucagón(Guzmán y Geelen, 1993), actualmentese considera que la principal proteína quinasaresponsablede la inactivaciórade la ACO era híga-do es la AMPK (Hardie y Carling, 1997); cuyaactivación no se ha podido demostraraún quedependade la acciónde mediadoresextracelulares.

Tanto la insulina (Guzmán y Geelen,1993) como los agentes que movilizan Ca2~(Capítulo 2.1.1) o el hinchamiento celular(Capítulo 2.1.2) inhiben a la CPT-l utilizando unmecanismodesconocido.Si bien en todos esoscasosse ha descrito la activación de proteínaqui-

- nasaso fosfatasas,las posiblesdianasde su acciónno han sido determinadas. Por ejemplo, el ATPextracelularparecemediarsusefectos inhibitoriossobrela CPT-l a travésde la activaciónde la PKC

(capItulo 2.1.1). Sin embargo, la adición de estaquinasaa célulaspermeabitizadasno tiene ningúnefectosobrela actividad GPT-l (Capitulo2.2.3),yaunque se ha descrito que la PKC puedeestarimplicadaen la fosforilación de citoqueratinas,nopareceafectara la fosforilación de los filamentosintermedios(Gadrin el aL, 1992).

Así., aunquepermaneceabierta la posibi-lidad de que otras proteínaquinasasque se veanactivadasen respuestaa las diferentessituacionesfisiopatológicasqueregulanla oxidaciónde ácidosgrasosy la cetogénesispuedanfosforilar a dife-renteselementosdel citoesqueletoy modularasí laactividad de la GPT-l, hastael momentosolo haypruebasde la implicación de la Ca2~/CMPK11en lafosforilación y reorganizacióndel citoesqueletoloque junto a la modulación¿le los niveles de malo-nil-CoA, podríamediarla activaciónde la CPT-l.

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Canítulo3 DiscusiónGéneraly Conclusiones

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