![Fisiología Vegetal. Seminario Terpenos.[1] (1)](https://static.fdocuments.mx/doc/165x107/557211c5497959fc0b8f7873/fisiologia-vegetal-seminario-terpenos1-1.jpg)
LABORATORIO DE FISIOLOGÍA VEGETAL
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS LABORATORIO DE FISIOLOGÍA VEGETAL “PRODUCCIÓN DE HUITLACOCHE POR INDUCCIÓN DE LA INFECCIÓN EN MAÍZ CON Ustilago maydis BAJO CONDICIONES CONTROLADAS”. PROYECTO DE INVESTIGACIÓN CURRICULAR QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE QUÍMICO BACTERIÓLOGO PARASITÓLOGO P R E S E N T A: CUAUHTÉMOC GONZÁLEZ TRINIDAD ASESOR DE TESIS: QBP SILVANO MONTES VILLAFÁN Ciudad de México 2016
Transcript of LABORATORIO DE FISIOLOGÍA VEGETAL
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
LABORATORIO DE FISIOLOGÍA VEGETAL
“PRODUCCIÓN DE HUITLACOCHE POR INDUCCIÓN DE LA
INFECCIÓN EN MAÍZ CON Ustilago maydis BAJO CONDICIONES
CONTROLADAS”.
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN CURRICULAR
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
QUÍMICO BACTERIÓLOGO PARASITÓLOGO
P R E S E N T A:
CUAUHTÉMOC GONZÁLEZ TRINIDAD
ASESOR DE TESIS:
QBP SILVANO MONTES VILLAFÁN
Ciudad de México 2016
LUGAR DE DESARROLLO
El presente trabajo se desarrolló en el Laboratorio de Fisiología Vegetal del
Departamento de Botánica en el Edificio de Biología de la Escuela Nacional de Ciencias
Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, bajo la asesoría del Químico Bacteriólogo
Parasitólogo Silvano Montes Villafán.
FRAGMENTO DE “HACE FALTA UN MUCHACHO”
En cual fuere la obra en que te ensayes, si falla acaso tú primer intento no te descorazones ni
desmayes, antes vuelve a empezar con nuevo aliento. No habrá dificultad ni resistencia que
dominar no puedas con talento, con firme voluntad y con paciencia. “Es muy breve la vida, el
arte es largo”; la perfección se alcanza, sin embargo a fuerza de trabajo y experiencia.
ARTURO CUYÁS ARMENGOL
AGRADECIMIENTOS
A MI DIRECTOR DE TESIS, QBP SILVANO MONTES VILLAFAN
Por su apoyo, confianza y enseñanzas que me brindo para mi formación académica, profesional y personal. Y sobre todo por su gran ayuda en el impulso y desarrollo de mis ideas.
A MIS SINODALES
BIÓLOGA SANDRA PÉREZ JIMÉNEZ Por su gran apoyo en mi formación académica y por despertar en mí el interés en la botánica
BIÓLOGA ARCELIA PLIEGO AVENDAÑO Por su gran apoyo en mi formación académica y por despertar en mí el interés en la botánica
BIÓLOGA ABIGAIL JARDINES MARTÍNEZ Por su gran apoyo en mi formación académica y por inspirar en mi la curiosidad en el estudio de la fitopatología y el gran potencial aprovechable en esta área
M. EN C. ERIKA ROSALES CRUZ Por su guía y cada uno de sus valiosos consejos e impulsar mis capacidades profesionales y humanas.
Por la revisión de este trabajo y sus valiosos comentario, sobre todo por el apoyo en mi formación académica, personal y profesional
A TODO EL PERSONAL ACADÉMICO DEL DEPARTAMENTO DE BOTÁNICA Y DEL LABORATORIO DE HEMATOPATOLOGÍA POR EL APOYO Y LAS PALABRAS DE ALIENTO, ASÍ COMO A MIS COMPAÑEROS DE LABORATORIO, DE AULA Y DE PASILLO, MUCHAS GRACIAS.
DEDICATORIAS
A mi familia, en especial a mi madre Simona Trinidad Vásquez, por su cariño y
apoyo incondicional, por impulsarme en cada reto y alentarme a nunca desistir
en busca de mi desarrollo personal y profesional, sin ella cada uno de mis logros
sería imposible; a mi padre Eugenio González Guzmán por enseñarme que la
vida no es fácil y hay que esforzarse para logra tus metas; a mis hermanos por
su compañía y cariño Lourdes, Eduardo, Xochilt, Ana y Jesús.
A mi compañera, amiga y confidente Edith Johana Ortiz Reyes, gracias.
Y a todos mis compañeros y amigos de escuela.
Muchas gracias a todos.
i
INDICE GENERAL ÍNDICE DE FIGURAS iii INDICE DE TABLAS iv ABREVIATURAS v RESUMEN vi 1 INTRODUCCIÓN 1 1.1 Generalidades de los hongos 1 1.2 Hongos fitopatógenos 1 1.3 Basidiomicetos 2 1.4 Carbones 3 1.5 Huitlacoche 5 1.5.1 Agente etiológico 5 1.5.2 Taxonomía de Ustilago maydis 5 1.5.3 Signos y síntomas 7 1.5.4 Ciclo de vida 7 1.5.5 Factores que influyen en formación del huitlacoche 9 1.5.6 Producción de huitlacoche 9 1.5.7 Propiedades nutritivas de huitlacoche 10 1.6 Maíz 12 1.6.1 Taxonomía del maíz 13 1.6.2 Estructura de la planta de maíz 13 1.6.3 Estructura del grano de maíz 13 1.6.4 Clasificación de los tipos maíz 17 1.6.5 Etapas de desarrollo del maíz 18 1.7 Antecedentes 19
2 JUSTIFICACIÓN 22 3 OBJETIVOS 23 4 MATERIAL Y MÉTODOS 24 4.1 Selección de mazorcas con infección por Ustilago maydis 24 4.2 Selección de granos jóvenes de maíz sin infección 24 4.3 Selección de granos maduros para siembra 24 4.4 Evaluación de la eficiencia de infección de un macerado de teliospora
de Ustilago maydis 24 4.4.1 Prueba en mezcla de granos de maíz jóvenes sanos con granos
infectados con Ustilago maydis 24 4.4.2 Pruebas de inoculación de granos de maíz sanos jóvenes con
suspensión de teliosporas de Ustilago maydis 25 4.4.3 Prueba de inoculación de mazorcas jóvenes y sanas con
suspensión de teliosporas de Ustilago maydis 25 4.4.4 Determinación de la infectividad de la fase de teliosporas de
Ustilago maydis por aspersión sobre granos de maíz germinando 26 4.5 Obtención de un concentrado de teliosporas puras de Ustilago maydis 26 4.5.1 Determinación de la viabilidad de teliosporas de Ustilago maydis 27 4.5.1.1 Prueba en medio líquido de extracto de maíz 27 4.5.1.2 Prueba en medio sólido de extracto de maíz 27 4.6 Aislamiento de una cepa pura de la fase de basidiosporas de Ustilago
maydis en agar extracto de maíz 27 4.7 Determinación de infectividad de los estadios de Ustilago maydis sobre
plantas de maíz 28
ii
4.8 Comparación y selección del medio de cultivo óptimo para la propagación de la cepa comprobada de Ustilago maydis 29
4.8.1 Evaluación del crecimiento en medio sólido de extracto de maíz 29 4.8.2 Evaluación del crecimiento en medio líquido de extracto de maíz 29 4.9 Preparado de inóculos de basidiosporas de Ustilago maydis a
diferentes concentraciones 29 4.10 Inoculación a plantas adultas de maíz con la fase de basidiosporas de
Ustilago maydis 30 4.11 Confirmación de la infectividad de las basidiosporas de Ustilago maydis
obtenidas para producir huitlacoche 30 5 DIAGRAMA GENERAL DE TRABAJO 31 6 RESULTADOS 32 6.1 Evaluación de la eficiencia de infección de un macerado de teliospora
de Ustilago maydis 32 6.1.1 Mezcla de granos de maíz jóvenes sanos con granos infectados 32 6.1.2 Inoculación de granos de maíz sanos jóvenes con suspensión de
teliosporas de Ustilago maydis 34 6.1.3 Inoculación de mazorcas jóvenes y sanas con suspensión de
teliosporas de Ustilago maydis 36 6.1.4 Aspersión de teliosporas de Ustilago maydis sobre granos de
maíz germinando 38 6.2 Obtención de un concentrado de teliosporas puras de Ustilago maydis 38 6.2.1 Determinación de la viabilidad de teliosporas de Ustilago maydis 41 6.2.1.1 Prueba en medio líquido y sólido de extracto de maíz 41 6.3 Aislamiento de una cepa pura de la fase de basidiosporas de Ustilago
maydis en agar extracto de maíz 43 6.4 Determinación de la infectividad de los estadios de Ustilago maydis
sobre plantas de maíz 47 6.5 Comparación y selección del medio de cultivo adecuado para la
propagación del hongo de la cepa comprobada de Ustilago maydis 49 6.5.1 Evaluación del crecimiento en medio sólido 49 6.5.2 Evaluación del crecimiento en medio líquido 50 6.6 Inoculación a plantas adultas de maíz con la fase de basidiosporas de
Ustilago maydis 51 7 DISCUSIÓN 55 8 CONCLUSIÓN 60 9 BIBLIOGRAFÍA 61
10 ANEXO 64 10.1 Material 64 10.1.1 Material biológico 64 10.1.2 Medios de cultivo 64 10.1.3 Soluciones y reactivos 64 10.1.4 Material 64 10.1.5 Equipo 65 10.2 Preparación de medios de cultivo 65 10.2 Preparación de Soluciones reactivas 66
iii
ÍNDICE DE FIGURAS
Fig. Titulo Pag.
1 Estructura característica de basidiomicetos 3
2 Estructuras características de Teliosporas y Basidiosporas de Ustilago maydis 4
3 Ciclo de vida de Ustilago maydis 8
4 Estructura y desarrollo de la planta de maíz 14
5 Estructura del grano de maíz 16
6 Etapas de desarrollo del maíz 18
7 Evaluación de infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de maíz
tierno, dilución (1:10) 33
8 Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de
maíz tierno, dilución (1:5) 33
9 Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de
maíz tierno, dilución (2:5) 33
10 Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de
maíz tiernos, control negativo 35
11 Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de
maíz tiernos usando una concentración de teliosporas 1:3 (agua-teliosporas) 35
12 Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de
maíz tiernos usando una concentración de teliosporas 1:2 (agua-teliosporas) 35
13 Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de
maíz tiernos usando una concentración de teliosporas 1:1.5 (agua-teliosporas) 36
14 Mazorcas usadas para evaluar el efecto de las teliosporas de Ustilago maydis 37
15 Efecto de teliosporas de Ustilago maydis sobre mazorcas jóvenes 37
16 Efecto de la exposición con teliosporas de Ustilago maydis sobre granos de
maíz germinando después de cuatro semanas 38
17 Separación de teliosporas por efecto del gradiente de concentración con NaCl 39
18 Morfología microscópica de teliosporas de Ustilago maydis 41
19 Germinación de teliosporas de Ustilago maydis 42
20 Basidiosporas de Ustilago maydis en división 43
21 Colonias levaduriformes evaluadas, presuntivas de basidiosporas de Ustilago
maydis 44
22 Colonia levaduriforme evaluada, presuntiva de basidiosporas de Ustilago
maydis 44
23 Efecto de las basidiosporas de Ustilago maydis sobre plántulas de maíz 45
24 Ciclo de vida de Ustilago maydis detectado experimentalmente bajo este
protocolo 46
25 Placas de agar extracto de maíz con crecimiento de colonias de basidiosporas
de Ustilago maydis 47
26 Basidiosporas de Ustilago maydis teñidas con azul de metileno 48
27 Efecto de las fase teliosporas y basidiosporas de Ustilago maydis sobre
plántulas de maíz 48
28 Colonias de Ustilago maydis en medio de cultivo sólido 49
iv
29 Comparación en la generación de basidiosporas de Ustilago maydis en dos
diferentes medios líquidos 50
30 Basidiosporas de Ustilago maydis observadas en cámara de Neubauer 51
31 Jilotes de maíz antes de ser inoculados con basidiosporas de Ustilago maydis 52
32 Efecto de la inoculación por inyección de basidiosporas de Ustilago maydis en
jilotes de maíz 52
33 Crecimiento de basidiosporas de Ustilago maydis en agar extracto de papa 53
34 Basidiosporas de Ustilago maydis 54
35 Mazorca de maíz con huitlacoche 54
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla Titulo Pag.
1 Características de los reinos del dominio Eukaryota que contienen a los
hongos 1
2 Carbones más comunes que atacan a las plantas 4
3 Características taxonómicas de Ustilago maydis 6
4 Factores que influyen en la infección del maíz por Ustilago maydis 9
5 Comparación de la concentración en peso seco de algunos nutrientes del
huitlacoche y el maíz 11
6 Partes de la planta de maíz 15
7 Partes que conforman el grano de maíz 16
8 Clasificación de los tipos de maíz 17
9 Descripción de las etapas en el desarrollo del maíz 19
10 Concentraciones finales de los medios de cultivo líquidos usados en esta
prueba 29
11 Resultados del gradiente de concentración con NaCl en suspensión de
teliosporas de Ustilago maydis 40
12 Resultados de la germinación de las teliosporas puras Ustilago maydis
obtenidas, inoculadas en medio extracto de maíz 42
13 Resultados del crecimiento en medio sólido extracto de maíz y extracto de
papa 49
v
ABREVIATURAS
NaCl Cloruro de sodio
CuSO4 Sulfato cúprico
°C Grados Celsius
g Gramos
mg Miligramos
mL Mililitros
L Litros
vs Contra
V Fase Vegetativa
VE Fase Vegetativa de Emergencia
R Fase Reproductiva
DAS Número aproximado de días después de la siembra
PDA Papa Dextrosa Agar
UFC/mL Unidades Formadores de Colonias por mililitro
Cda. Cordova
INBio Instituto Nacional de Biodiversidad
FAO Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la
Agricultura
vi
RESUMEN
Introducción
El huitlacoche es el resultado de la infección de un Basidiomiceto parásito para el
maíz llamado Ustilago maydis, formando agallas en los granos de maíz incrementando
su volumen y formando una masa negra de teliosporas, la cual es un alimento de alto
valor nutricional por su alto porcentaje proteínico comparado con los granos de maíz sin
esta infección, con sabor único y atractivo en la cocina mexicana. El interés económico
para la producción del hongo radica en sus costos elevados, que van de 40-140 pesos
por kg. Además su producción artificial es baja, aunado a que pocas instituciones
producen y comercializan el hongo en México.
Objetivo
Diseñar un protocolo que permita inducir la enfermedad en el maíz criollo de la
localidad de San Francisco Chimalpa en Naucalpan, Estado de México, y conocer
algunos factores que puedan ser controlados para mejorar el rendimiento en la
producción del huitlacoche a bajo costo con el uso de una cepa silvestre de Ustilago
maydis.
Material y Métodos
Se evaluó un método para la obtención de un concentrado de teliosporas puras, con
el uso de métodos físicos y químicos (filtración, centrifugación, gradiente de
concentración con NaCl, y el uso de CuSO4 al 1% como bactericida), comprobando su
viabilidad al realizar su siembra en medio líquido de extracto de maíz. Así como, la
identidad de las basidiosporas en agar extracto de maíz. Se comparó la eficacia de la
infección de las fases de teliospora y basidiospora en plantas de maíz por aspersión y
por inyección, se determinó el medio adecuado para el cultivo y la concentración más
eficiente para la producción de inóculos, se evalúo la etapa de desarrollo de la planta
más susceptible a ser infectada para formar huitlacoche, se determinó la concentración
efectiva del inóculo para producir la formación del huitlacoche.
Resultados
Se logró obtener un concentrado puro de teliosporas con el método usado, así como
un cultivo puro de basidiosporas y se determinó que la fase del hongo más eficaz para
producir la infección en diferentes estadios de desarrollo del maíz fue la basidiospora,
se encontró que el medio de cultivo óptimo para obtener biomasa de basidiosporas fue
medio líquido con extracto de maíz diluido 1:2, se observó que al inocular por inyección
vii
en tejido en diferentes etapas de desarrollo resulto evidente como el jilote de la planta
adulta del maíz es la más susceptible para producir la formación de masas de
teliosporas en la mazorca, esto al inocular por inyección en el jilote de la planta a una
concentración de 2x106 basidiosporas/mL.
Conclusión
De acuerdo a esta serie de pasos en conjunto se logró obtener un procedimiento a
bajo costo para la formación de huitlacoche en maíz criollo de la localidad de San
Francisco Chimalpa en Naucalpan, Estado de México.
1
1. INTRODUCCIÓN 1.1 Generalidades de los hongos
Los hongos forman un grupo de organismos talófitos, eucarióticos, desprovistos de
clorofila (Alexopolous y col., 1996). Son organismos generalmente microscópicos
heterótrofos, productores de esporas, pueden ser pluricelulares, ramificados y a
menudo filamentosos con paredes celulares definidas que contienen quitina, celulosa, o
ambos componentes (Sobrado y col., 2013).
Los hongos son agrupados y/o clasificados de acuerdo a diversos criterios que
convergen en la taxonomía según sus interrelaciones fisiológicas, morfológicas o
moleculares. Algunas características de los reinos del dominio Eukarya que contienen a
los diversos grupos de los hongos se describen en la Tabla 1 ya que son considerados
polifiléticos, porque se reconocen tres líneas evolutivas independientes: reino fungi,
reino protozoa y chromista. Los mixomicetos y mastigomicetos han sido reubicados en
los reinos protozoa y chromista que incluyen a los protozoos y las algas
respectivamente (Carrillo, 2003).
Tabla 1 Características de los reinos del dominio Eukaryota que contienen a los hongos.
Característica Reino Fungi Reino Chromista Reino Protozoa
Nutrición
Heterotrófica
(por absorción u
osmotrófica)
Autotrófica
(fotosintética o por
absorción)
Heterotrófica
(fagotrófica) o
autotrófica
(fotosintética)
Pared celular
Celulosa con
frecuencia, sin quitina
ni β-glucanos
Quitina y
β-glucanos
Ausente en forma
trófica, variable si está
presente Tomado de: Carrillo, 2003.
La mayoría de las 100,000 especies de hongos conocidas, son estrictamente
saprófitas y viven sobre la materia orgánica muerta, a la que descomponen. Alrededor
de 50 especies de hongos producen enfermedades en el hombre y casi el mismo
número ocasiona enfermedades en los animales, la mayoría son superficiales de la piel
o de sus apéndices. Sin embargo, más de 8,000 especies de hongos producen
enfermedades en las plantas (Agrios, 2005).
1.2 Hongos fitopatógenos
Todas las plantas son atacadas por algún tipo de hongo, y cada uno de los hongos
parásitos ataca a uno o más tipos de plantas. Algunos hongos crecen y se reproducen
sólo cuando establecen una infección con las plantas que les sirven de hospedero,
2
durante todo su ciclo de vida estos hongos se conocen como parásitos obligados o
biótrofos. Otros requieren de una planta hospedera durante una cierta etapa de su ciclo
de vida, el cual lo pueden concluir desarrollándose en materia orgánica muerta o bien
creciendo y reproduciéndose tanto en materia orgánica muerta como en plantas vivas
(Agrios, 2005).
Gran parte de los hongos fitopatógenos pasan una porción de su ciclo de vida en las
plantas hospederas, y otra en el suelo o en los residuos vegetales depositados. Algunos
hongos pasan todo su ciclo de vida sobre el hospedero y sólo sus esporas alcanzan el
suelo, donde permanecen en reposo hasta que son llevadas a un hospedero en el que
germinan y se reproducen. Otros hongos deben pasar parte de su ciclo de vida como
parásitos de su hospedero y parte de él como saprófitos en tejidos muertos en el suelo,
a fin de poder concluir su ciclo de vida en la naturaleza. Sin embargo, este último grupo
de hongos se mantiene en estrecha asociación con los tejidos vivos o muertos de su
hospedero y, en la naturaleza, no se desarrollan en otro tipo de materia orgánica. Otro
grupo de hongos viven como parásitos de sus hospederos, pero continúan viviendo,
desarrollándose y reproduciéndose en los tejidos muertos de esos hospederos, incluso
pueden abandonar esos tejidos y depositarse en el suelo u otros órganos vegetales en
proceso de descomposición, donde se desarrollan y reproducen como saprófitos
obligados. Es indispensable que los tejidos vegetales muertos en los que se desarrollen
esos hongos no pertenezcan al hospedero que han parasitado. Por lo común, ese
grupo de hongos son patógenos que habitan en el suelo, que tienen una amplia gama
de hospederos y que sobreviven en el suelo durante varios años en ausencia de sus
hospederos (Agrios, 2005).
1.3 Basidiomicetos
Los basidiomicetos son un grupo de gran importancia entre los hongos, pues tienen
participación esencial en la naturaleza por la versatilidad de las especies que lo
constituyen, unas forman ectomicorrizas, otras son causantes de enfermedades como
las royas y los carbones, se encuentran también las especies comestibles como setas
que se cultivan con fines nutritivos. Pertenecen al grupo de especies con importancia en
la medicina por presentar metabolitos con actividad biológica contra una amplia gama
de patologías clínicas (Rojas, 2013).
La clase de los Basidiomycetes se considera que agrupa los hongos más
evolucionados, donde están algunos de los patógenos de plantas más importantes.
Esta clase se caracteriza por la formación de basidios estructuras tubulares o en forma
de clava y sus esporas sexuales las basidiosporas como se muestra en la Figura 1
(Islas, 1994).
3
Figura 1. Estructura característica de basidiomicetos. Se observa la estructura del basidio en
forma de clava y gemando sobre este las basidiosporas. Tomado de: INBio, 2014.
1.4 Carbones
Los Ustilaginales son hongos fitopatógenos de importancia económica debido a que
ocasionan enfermedades en monocotiledoneas de todo el mundo, se consideran la
primera causa potencial del carbón en las plantas (Tamayo, 2009).
Las enfermedades que producen masas carbonosas en órganos aéreos de la planta,
reciben el nombre de “carbones”. Estos hongos son parásitos muy importantes
causantes de grandes pérdidas a los agricultores. Tienen un ciclo de vida menos
complicado que los hongos que ocasionan los chahuistles o royas y pueden sobrevivir
en los desechos de las cosechas (materia orgánica muerta) o en cultivos de laboratorio.
Sus esporas son diseminadas por el viento, la lluvia, e implementos de labranza o por
medio de los insectos (García, 1994).
Los carbones de las plantas se encuentran en todo el mundo y son la causa de
graves pérdidas en los granos. Los carbones de los cereales son temidos por los
agricultores en mayor grado que las royas debido a que muchos de ellos atacan a los
granos y reemplazan sus contenidos con masas de esporas polvorientas y negras que
se asemejan al hollín o carbón. Además de los distintos cereales, los carbones atacan
también a la caña de azúcar, cebollas y algunas plantas de ornato tales como el clavel,
en la Tabla 2 se mencionan los carbones más comunes que atacan a las plantas. La
mayoría de los carbones atacan los ovarios de gramíneas y pastos desarrollándose en
ellos o en sus frutos, destruyendo por completo los granos de las gramíneas. Sin
embargo, varios carbones atacan a las hojas, tallos o verticilos florales. Algunos
carbones infectan semillas o plántulas antes de que emerjan del suelo y se desarrollan
en el interior de las plántulas hasta que alcanzan la inflorescencia; otros sólo producen
infecciones locales en las hojas, tallos y otros órganos. La mayoría de estos hongos
producen sólo dos tipos de esporas: teliosporas y basidiosporas. Sus teliosporas se
forman comúnmente a partir de células miceliales a lo largo de todo el micelio
localizado dentro de las agallas del carbón y sus basidiosporas geman lateralmente de
las células del basidio o se forman a manera de racimo en la punta de un basidio
4
cenocítico como se observa en la Figura 2, en los carbones no se forman las
basidiosporas sobre esterigmas (Agrios, 2005).
Tabla 2. Carbones más comunes que atacan a las plantas
Genero Especie Enfermedad
Ustilago
U. maydis Carbón del maíz
U. avenae Carbón volador de la avena
U. nuda Carbón de la cebada
U. tritici Carbón del trigo
U. nigra Carbón semivolador de la cebada
U. hordei Carbón cubierto de la cebada y de la avenas
U. scitaminea Carbón de la caña de azúcar
Tilletia
T. caries y T. foetida Carbón cubierto o hediondo del trigo
T. contraversa Añublo del enanismo del trigo
T. indica Añublo del trigo
Sphaceloteca S. sorghi y S. cruenta Carbón cubierto del sorgo
S. reiliana Carbón de las espigas del sorgo y del maíz
Urocystis U. cepulae Carbón de la cebolla
U. occulta Carbón del tallo y hojas del centeno
Neovossia N. barclayana carbón del grano del arroz
Entyloma E. oryzae carbón foliar del arroz
E. ellisii Carbón de plantas de hoja como la espinaca Tomado de: Agrios, 2005.
Figura 2. Estructuras características de Teliosporas y Basidiosporas de Ustilago maydis. A)
Teliospora de Ustilago maydis con pared gruesa y ornamentada. B) Teliospora germinado con
basidiosporas gemando del basidio. Tomado y modificado de: Alexopolous y col., 1996.
Basidio
A) Teliospora
B) Teliospora
Basidiospora
A) Teliospora
5
1.5 Huitlacoche
El carbón común del maíz también conocido como “huitlacoche” o “cuitlacoche”, es
un hongo comestible causado por la infección de Ustilago maydis en cultivos de maíz
(Zea mays) y de su probable antecesor el teozintle “Zea mays ssp parviglumis” (Ruiz,
2008).
Etimológicamente significa “suciedad que duerme”, esto indica que una parte del
vegetal no creció como debía, sino que dormía “cuitlacochtli”, de “cuitla” (excremento,
suciedad, basura) y “cochtli” (dormir) (López, 1988; Leal, 1996; Martínez y col., 2000).
1.5.1 Agente etológico
Ustilago maydis pertenece a la división Amastogomycota que son los hongos
verdaderos y la subdivisión Basidiomycotina que se caracterizan por producir esporas
en estructuras especializadas llamadas basidios y al orden Ustilaginales, también
conocido como carbón común del maíz (Alexopolous y col., 1996; Ruiz, 2008).
Es un hongo polimórfico, con una forma saprofita, la cual se desarrolla como células
haploides levaduriformes (basidiosporas) las cuales son hialina, ovalada y se
caracteriza por ser no patógena, y una fase patógena, la cual se desarrolla como
células dicarioticas miceliales y que es la forma patógena que crece en la planta de
maíz formando tumores o agallas en las partes aéreas de la planta, donde se forma una
tercera forma, las teliosporas negras, esféricas o elipsoidales que presentan
protuberancias prominentes y en forma de espina las cuales son las forma de
propagación y de resistencia (Agrios, 2005; Calderón, 2010).
1.5.2 Taxonomía de Ustilago maydis Clasificación taxonómica de Ustilago maydis según R. H. Whittaker en 1969 (Leal,
1996), las características taxonómicas se describen en la Tabla 3.
Reino Fungí
Subreino Eumycota
Rama Amastigomycota
Filo Basidiomycota
Clase Basidiomycetes
Subclase Heterobasidiomycetidae
Orden Ustilaginales
Familia Ustilaginaceae
Género Ustilago
Especie maydis
6
Tabla 3. Características taxonómicas de Ustilago maydis
Taxón Características
Reino: Fungi o Mycetae No poseen clorofila, su alimentación es por absorción, son eucariontes, son pluricelulares.
División: Amastygomycota Pierden su fase móvil, no se adaptan a sistemas acuáticos, tienen hifas septadas, forman grandes cantidades de micelio.
Subdivisión: Basidiomycotina
Son hongos que producen esporas sexuales denominadas basidiosporas o esporidias, sobre una estructura tubular o en forma de clava denominada basidio constituida por una o cuatro células, su estado diploide el basidio es muy corto, su estado dicariotico es muy prolongado, la mayoría son heterotalicas.
Clase: Basidiomycete
Son parásitos de plantas, y no forman basidiocarpo. Constituyen el segundo grupo en importancia entre los hongos superiores que se caracterizan por tener núcleo dicariótico. Se diferencian de los Ascomicetos por la mayor importancia y duración de la fase dicariótica y, ante todo, porque las esporas que se originan después de la meiosis no son endosporas, sino exosporas (llamadas basidiosporas), que se forman en general en número de cuatro en la superficie de la célula esporífera (denomina basidio).
Subclase: Teliomycetidae
Forman esporas de resistencia llamadas teliosporas con pared gruesa se encuentran envueltas en grupos en unas estructuras llamadas soros. En estas estructuras de resistencia se produce cariogamia y meiosis, después de la cual germinan, originando un basidio.
Orden: Ustilaginales
Hongos comúnmente conocidos como carbones. Atacan principalmente las estructuras reproductoras. Producen poco micelio, con promicelio septado transversalmente. Forman soros o agallas contienen teliosporas café obscuras o negras.
Género: Ustilago Ataca a plantas de importancia económica como: avena, trigo, cebada, maíz, etc.
Especie: maydis Sus teliosporas son lisas, con espinas o reticuladas, atacan al maíz y al teosinte
Tomado de: Garibaldi, 2003; Cota, 2004; Agrios, 2005.
7
1.5.3 Signos y síntomas
El desarrollo de la enfermedad se caracteriza por clorosis, disminución del
crecimiento y formación de tumores que pueden desarrollarse en hojas, espiga, tallos y
mazorcas, debido a la proliferación celular del meristemo de los tejidos. En el tumor el
tejido de la planta es reemplazado por esporas (teliosporas) cubiertas por una
membrana blanca y verdosa que más tarde se oscurece y forma una masa polvorienta
color café. La membrana gris-plateada se rompe liberando teliosporas, principal
mecanismo de diseminación de los carbones (Tamayo, 2009).
1.5.4 Ciclo de vida
El hongo hiberna en forma de teliosporas en los restos del cultivo del maíz y en el
suelo, donde se mantiene viable durante muchos años. En las estaciones de primavera
y verano, las teliosporas si encuentra las condiciones óptimas de temperatura y
humedad relativa germinan produciendo un basidio de cuatro células haploides (el
promicelio), de cada una de las cuales se desarrolla una basidiospora hialina, ovalada
uninucleada que son llevadas por las corrientes de aire y son salpicadas o arrastradas
por la lluvia hasta los tejidos jóvenes y en proceso de desarrollo de las plantas de maíz
donde germinan sobre la superficie del hospedero y producen una hifa fina
(pseudomicelio monocariotico), el cual puede vivir saprofito sobre la superficie del
hospedero y se introduce en las células epidérmicas por penetración. Sin embargo,
después de un desarrollo inicial, su crecimiento se detiene y la hifa por lo general se
marchita y en ocasiones muere, a menos que entre en contacto y se fusione con una
hifa haploide proveniente de una basidiosporas del tipo de apareamiento compatible. En
caso de que ocurra la fusión, la hifa resultante aumenta su diámetro y se vuelve
dicariótica. Esta hifa se desarrolla en los tejidos de la planta principalmente a nivel
intercelular. Las células que rodean a la hifa son estimuladas para que sufran hipertrofia
e hiperplasia y comienzan a formarse las agallas, estas pueden empezar a formarse
incluso antes de que el hongo invada a los tejidos (Agrios, 2005).
El micelio en la agalla permanece intercelularmente durante la formación de la
misma, pero antes de la esporulación, las células alargadas del maíz son invadidas por
el micelio, por lo que se colapsan y mueren. El micelio del hongo utiliza los contenidos
de la célula para desarrollarse, y la agalla consiste principalmente de micelio dicariótico
y restos de células de los granos de maíz. La mayoría de las células dicarióticas
posteriormente, se transforman en teliosporas y durante el proceso parecen absorber y
utilizar el protoplasma de las demás células miceliales, las cuales quedan vacías. Estas
teliosporas se agrupan en masas denominadas soros, las cuales se mantienen
firmemente unidas por medio de una membrana la cual cubre a la agalla y no es
afectada por el hongo, pero finalmente se rompe y las teliosporas son liberadas.
Algunas de éstas llegan a los tejidos jóvenes meristemáticos del maíz, produciendo
8
nuevas infecciones y agallas durante la misma estación, pero la mayoría de ellas caen
al suelo o permanecen en los restos del maíz, donde pueden sobrevivir durante años,
en la Figura 3 se esquematiza el ciclo de vida de Ustilago maydis (Agrios, 2005).
Figura 3. Ciclo de vida de Ustilago maydis. Al romperse el soro se liberan las teliosporas y de
cada una de ellas germinara un basidio que producirá cuatro basidiosporas haploides cada una de
estas podrá dividirse y formar pseudomicelio, al encontrar a su par sexual compatible podrá
producir la infección formando un micelio dicariótico que penetrara en todo el tejido propiciando la
hipertrofia e hiperplasia del tejido y la formación de teliosporas nuevamente. Tomado de: Tamayo,
2009.
9
1.5.5 Factores que influyen en formación del huitlacoche Para que se produzca la infección tienen que estar presentes algunos factores que propiciaran la germinación del hongo y su diseminación en el tejido de la planta de maíz los cuales se describen en la Tabla 4.
Tabla 4. Factores que influyen en la infección del maíz por Ustilago maydis
Factores Características
Temperatura
Las temperaturas relativamente altas favorecen la germinación de
basidiosporas, el crecimiento del micelio y formación de nuevas
teliosporas, el hongo se desarrolla muy bien entre 20-30°C. Sin
embargo, la temperatura no es un factor importante en la infección de
este hongo en el campo.
Humedad
La humedad es necesaria para la germinación y crecimiento del tubo
germinativo antes de que el hongo invada la planta. Se han observado
buenos resultados a una humedad relativa entre un 77-80%. Aunque en
general se considera que la lluvia y el clima húmedo son factores críticos
para el desarrollo del hongo.
Huésped
El desarrollo de la planta es de vital importancia en el crecimiento del
hongo, se sabe que las plantas que crecen vigorosamente entre 60-
90cm de alto son más susceptibles al ataque de este microorganismo.
En lotes fertilizados con nitrógeno se ha observado una mayor
incidencia de la infección, debido a que acelera el crecimiento del maíz
al mismo tiempo que aumenta la posibilidad de que un hongo infecte a la
planta, lo contrario ocurre en lotes fertilizados con potasio.
Vía de
inoculación
La inyección de basidiosporas al jilote de la planta produce un alto índice
de infección, comparada con otras como: la inyección de teliosporas,
aspersión de teliosporas en la planta, mezcla de teliosporas con semillas
de maíz.
Tomado de: Garibaldi, 2003; Valdez, 2010.
1.5.6 Producción de huitlacoche
La más temprana mención al huitlacoche o cuitlacoche la encontramos en una obra
del siglo XVI: “Historia General de las Cosas de Nueva España”, escrita por Fray
Bernardino de Sahagún, con el objetivo de salvaguardar el conocimiento indígena ante
la llegada de la cultura europea y solo se hace una muy breve mención al respecto,
indicando que es una anormalidad del maíz que lleva a que la mazorca adquiera un
color negruzco y se transforme en algo como lodo. Es aquí donde encontramos la más
antigua denominación del hongo “cujtlacochi”, que significa algo como mugre que crece
10
encima del maíz y que es molesto. En otros lugares, por ejemplo en la zona maya, se le
conocía como “Ta´wa nal chaak”, es decir, excremento del dios de la lluvia “Chaak”
(Valdez, 2012).
Recientemente, el huitlacoche ha sido considerado como un cultivo alternativo
debido al incremento de su popularidad como alimento, y ha sido introducido en la alta
cocina. El incremento en la aceptabilidad de este hongo podría estar relacionado, por
un lado, a su alto valor nutricional, pero, principalmente por su excelente sabor
(Martínez y col., 2008).
El aumento en el consumo de huitlacoche en el país y en el extranjero ha motivado el
desarrollo de tecnologías que conduzcan a la producción masiva de este hongo. Los
agricultores han tratado de producir huitlacoche desde siempre y se han utilizado
muchas estrategias un tanto rudimentarias. El huitlacoche para consumo y
comercialización en gran medida sigue siendo recolectado de campos de maíz donde
se presenta la infección de forma fortuita sin ningún procedimiento técnico establecido
donde la infección es menor al 5% del total de los cultivos de maíz (Ruiz, 2008).
Se estima que en la Ciudad de México, los principales puntos de distribución de
huitlacoche son los mercados donde se venden entre 4-500 toneladas de agallas
frescas de huitlacoche al año procedentes principalmente del centro y sur del país.
Pocas empresas son las encargadas de la comercialización de huitlacoche enlatado,
entre las que se encuentran Herdez, La Costeña, Monteblanco, San Miguel. (Al súper
en casa.com, 2016). La compañía Herdez procesa cerca de 100 toneladas de
huitlacoche al año. Para muchas personas de México este es considerado un manjar a
pesar de su apariencia, pues tiene un sabor y una textura exquisitos, los principales
estados de la República Mexicana donde se cosecha y es ampliamente consumido son:
el Estado de México, Puebla, Oaxaca, Morelos, Veracruz, Michoacán y Distrito Federal.
Actualmente, está teniendo gran interés en el extranjero a pesar que sea considerado
un fitopatógenos para el maíz y reduzca la producción de maíz (Cota, 2004).
1.5.7 Propiedades nutritivas de huitlacoche
En la época prehispánica era considerado como algo “indeseable”, porque
significaba la pérdida de la mazorca. En la época de la Colonia y hasta el siglo XIX, el
huitlacoche fue alimento de subsistencia para los indígenas y campesinos, y no es sino
hasta el siglo XX que comienza a adquirir “autonomía cultural”, pero no por ello deja de
ser considerado un manjar. El huitlacoche, además de un exquisito sabor, contiene
ácidos grasos esenciales (Omega 3 y Omega 6), es rico en aminoácidos, aporta fibra y
es bajo en grasas, contiene fósforo, vitamina C, varios minerales y sustancias con
propiedades antitumorales (Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural,
Pesca y Alimentación, 2016).
El huitlacoche contiene carbohidratos, proteínas, grasas, minerales y vitaminas que
contribuyen a su valor nutricional. El contenido de proteínas varía entre 10-20% de
11
material seco. Se puede decir que el huitlacoche tiene proteínas de muy buena calidad,
con un extraordinariamente alto contenido de lisina; muy elevado en relación a lo que
se ha reportado para el maíz y otros vegetales. Aquí vale la pena insistir que las
proteínas del maíz son deficientes en lisina, por lo que fue un inteligente acierto
nutricional la complementación histórica que hicieron las distintas culturas mexicanas al
consumir huitlacoche con tortilla. El contenido de carbohidratos 55.1-66.5% y fibra 16.0-
23.5% es muy alto y contiene poca grasa 1.6-2.3%; no obstante tiene gran cantidad
ácidos grasos como: linolenico, linoleico (conocido como omega 3) y palmítico, esencial
para el consumo humano, en la Tabla 5 se comparan las concentraciones de algunos
nutrientes del huitlacoche y el maíz en peso seco (Valdez y col., 2009; Juárez y col.,
2011).
Tabla 5. Comparación de la concentración en peso seco de algunos
nutrientes del huitlacoche y el maíz
Nutriente Huitlacoche
(Ustilago maydis) Maíz
(Zea mays)
Aminoácidos
Lisina 14.8% 2.6-3.5%
Leucina 10.4% 12.0-15.8%
Glicina 11.3% 2.6-4.7%
Acido aspártico 8.2% 5.8-7.2%
Metionina 0.69% 1.98%
Ácido graso
Oleico 41-46% 20-46%
Linoneico 27-34% 35-70%
Linolenico 1.2-1.8% 0.8-2%
Palmítico 14% 7-19%
Ácido araquidico 2-4.4% 0.1-2%
Monosacárido
Glucosa 140-180 mg/g 0.1-8.9 mg/g
Fructuosa 60-100 mg/g Hasta 7.6 mg/g
Glicerol 8.82 mg/g No determinada
Manitol 3.17 mg/g No determinada
Sorbitol 4.45 mg/g Hasta 3.7 mg/g
Sacarosa No es encontrada 4.4-94.6 mg/g
Polisacárido
Total de fibra dietética 40-60% 7-12%
Fibra dietética soluble 10-30% 1.5%
Fibra dietética insoluble 30-50% 5-10% Tomado de: Juárez y col., 2011.
Se ha reportado que este hongo produce vitaminas del complejo B como: riboflavina,
biotina, niacina y ácido fólico, con excepción de la vitamina B12, al igual se han
encontrado compuestos fenólicos en altas concentraciones, los cuales poseen
propiedades antioxidantes que son muy útiles para la prevención de enfermedades
12
como el cáncer y la arteriosclerosis, se le puede incluir en lo que ahora se les conoce
como alimentos nutracéuticos (Valdez y col., 2009; Jiménez, 2013).
1.6 Maíz
Maíz, significa literalmente “lo que sustenta la vida”. Botánicamente, el maíz (Zea
mays) pertenece a la familia de las gramíneas y es una planta anual alta dotada de un
amplio sistema radicular fibroso (FAO, 1993). El maíz es uno de los cereales utilizados
por el hombre desde épocas remotas y una de las especies vegetales más productivas,
tanto en su producción global (cerca de 600 millones de toneladas por año) como en su
productividad (más de 4 t/ha). Su centro de origen está en México desde donde se
difundió a todo el mundo después del primer viaje de Cristóbal Colón a fines del siglo
XV (Paliwal, 2015).
El maíz es la forma domesticada de una subespecie de teocintle (Zea mays ssp.
parviglumis), un pasto silvestre, la domesticación del teocintle ocurrio aproximadamente
entre los 4 – 3,000 años A.C. El maíz que actualmente conocemos es un pasto gigante
domesticado (Zea mays ssp. mays) de origen mexicano. La planta es usada para
producir granos y forraje, los cuales constituyen la base para la elaboración de un buen
número de alimentos tanto para nuestra especie como para otros animales, así como
para la industria farmacéutica y manufacturera. El cultivo del maíz, y la elaboración de
diversos productos alimenticios están ligados con el surgimiento y evolución de las
civilizaciones mesoamericanas pre-colombinas. Debido a su adaptabilidad y
productividad el cultivo del maíz se expandió rápidamente alrededor del mundo
después de que los españoles y otros europeos exportaron la planta de las Américas en
los siglos XV y XVI. Actualmente el maíz es producido en la mayoría de los países del
mundo siendo el tercer cultivo por la superficie involucrada después del trigo y del arroz
(Salvador, 2001).
La mayor parte de la producción de maíz ocurre en los Estados Unidos, China y
Brasil, países que en conjunto obtienen un aproximado de 60% de la producción global
anual estimada en 1,000 millones de toneladas. México, ocupa el octavo lugar de
producción mundial, actualmente produce alrededor de 23 millones de toneladas
(Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, 2015).
13
1.6.1 Taxonomía del maíz
Clasificación taxonómica del maíz R. H. Whittaker en 1969 (Sánchez, 2014).
Reino Plantae
Phylum Magnoliophyta
Clase Lilipsida
Orden Cyperales
Familia Poaceae
Subfamilia Panicoideae
Género Zea
Especie mays
1.6.2 Estructura de la planta de maíz
La planta de maíz es de porte robusto de fácil desarrollo y de producción anual. Se
puede definir la planta del maíz como un sistema metabólico cuyo producto final es
fundamentalmente el almidón depositado en unos órganos especializados: los granos.
(FAO, 1993).
Se trata de una especie que se reproduce por polinización cruzada y la flor femenina
(elote, mazorca, choclo o espiga) y la masculina (espiguilla) se hallan en distintos
lugares de la planta. En la Tabla 6 y en la Figura 4 se describen y muestran las partes
de la planta de maíz (FAO, 1993).
1.6.3 Estructura del grano de maíz
Los granos de maíz se desarrollan mediante la acumulación de los productos de la
fotosíntesis, la absorción a través de las raíces y el metabolismo de la planta de maíz
en la inflorescencia femenina denominada espiga. Posee de 10-22 líneas de granos
por mazorca de y de 18-42 granos por línea. Esta estructura puede contener de 300 a
1,000 granos según el número de hileras y el diámetro y longitud de la mazorca. El
peso del grano puede variar mucho, de aproximadamente 19-30g por cada 100 granos.
El color del grano de maíz es muy variado pero el más común es amarillo, al igual que
su forma que puede ser prismática, ovoide, liso, picudo. (FAO, 1993). En la Tabla 7 se
describen las partes del grano de maíz y en la Figura 5 se observa su estructura.
14
Figura 4. Estructura y desarrollo de la planta de maíz. Se observa el desarrollo de una planta de maíz desde la germinación de un grano
hasta observar una planta adulta de maíz. A) Raíces seminales, B) Raíces permanentes, C) Raíces adventicias, D) Tallo, E) Hoja, F) Flor
femenina y G) Flor masculina. Tomado de: Condori, 2014.
15
Tabla 6. Partes de la planta de maíz
Parte Descripción
Raíz
La raíz de una planta de maíz es fasciculada con un potente desarrollo.
Tienen tres tipos de raíces:
A) Seminales: Nacen en la semilla después de la radícula. No son
permanentes.
B) Permanentes: En este grupo están incluidas las principales y
secundarias. Están nacen por encima de las primeras raicillas en una zona
llamada corona. Este grupo constituye el llamado sistema radicular
principal.
C) Adventicias: Nacen de los nudos inferiores del tallo y actúan de sostén
en las últimas etapas del crecimiento, absorbiendo a la vez agua y
sustancias nutritivas.
Tallo
Es erguido, sencillo y nudoso. Tiene surcos longitudinales en la parte
inferior. Tiene una altura de unos 2 metros (lo más común aunque hay de
mayor altura) con una serie de entrenudos de unos 16cm.
El primer tallo que emerge de la semilla se llama mesocotilo, que se alarga
más o menos según la profundidad de siembra, al final de este tallo se
forma la corona y luego el tallo final y las raíces.
Hoja
Las hojas son alternas, abrazadoras, anchas, paralelinervias, lanceoladas y
ásperas. Su longitud es de 40-45cm y 6-8cm de ancho. La planta tiene de
cuatro a cinco hojas embrionarias que van protegidas hasta que salen a la
superficie por el coleoptilo, que se rompe saliendo la primera hoja.
Flor
Es una planta monoica, en la cual se distinguen dos tipos de flores:
Las flores femeninas, se encuentran en la axila de algunas hojas, están
formando una inflorescencia en espiga rodeada por largas bracteas que la
cubren por completo. La espiga llamada mazorca está formada por una
serie de espiguillas, cada una de las cuales está formada por dos flores de
las cuales la inferior aborta. Cada espiguilla, en caso de fecundación dará
un grano. En el extremo de la mazorca se desarrollan unos estilos largos
llamados sedas en los cuales cae el polen y se desarrolla el tubo polínico.
La flor masculina está en la extremidad del tallo agrupada en panículas que
se llaman penachos. Está formada por 3 a 10 filas de espiguillas
emparejadas, cada una de ellas compuesta por dos glumas y contiene dos
flores con tres estambres cada una siendo las dos flores fértiles.
Grano
El grano se dispone en hileras longitudinales y hay varios cientos en una
mazorca. Es generalmente aplastado en un plano perpendicular al eje de la
mazorca, como es el caso de la mayoría de los híbridos actuales.
El grano se inserta a la mazorca por el pedúnculo de la flor. Tomado de: Pavón, 2003.
16
Tabla 7. Partes que conforman el grano de maíz
Estructura Característica
Pericarpio
Protege la semilla antes y después de ser sembrada impidiendo la
entrada de hongos. La lesión en la cubierta puede inutilizar la
semilla.
Endospermo
amiláceo
Es la reserva nutricional del grano, está compuesto por un 90% de
almidón, 7% de proteína y el resto son aceites minerales. La función
principal consiste en proporcionar nutrientes al embrión durante su
germinación y sustenta las etapas primarias del crecimiento, hasta
que sus raíces y hojas estén bien desarrolladas para satisfacer sus
necesidades nutricionales. En el endospermo, las proteínas
conforman una matriz córnea en cuyo interior se hallan los gránulos
de almidón.
Embrión
Está formado por el eje embrionario y por el escutelo. El eje
embrionario está formado por la plúmula (de 4-5 hojas) y radícula. El
escutelo corresponde al cotiledón. Tomado de: Pavón, 2003.
Figura 5. Estructura del grano de maíz. Se observa cada una de las partes que conforma la
estructura de un grano de maíz, la porción más externa y que protege al grano el pericarpio,
seguida del endospermo y la porción central el embrión o germen. Tomado de: FAO, 1993.
17
1.6.4 Clasificación de los tipos maíz
La característica variable del maíz que más se relaciona con sus usos como alimento
es la composición de su endospermo. En la Tabla 8 se describe una sencilla
clasificación del maíz se basa en las características del endospermo donde se
distinguen cinco tipos de maíz.
Tabla 8. Clasificación de los tipos de maíz
Tipo Descripción
Palomero
Consiste de pequeños frutos esféricos con un núcleo de almidón
harinoso (suave) y una capa de endospermo compacto (duro). La
humedad atrapada en el almidón harinoso se expande mediante la
aplicación de calor haciendo que el almidón salga a través de dicha
capa endurecida, produciendo así las populares palomitas.
Cristalino
(Duro)
Similar al maíz palomero, pero con frutos más largos. El maíz cristalino
probablemente fue desarrollado a partir de maíces palomeros mediante
la selección de frutos de mayor tamaño y rendimiento. Este tipo de maíz
es producido en áreas donde puede requerirse tolerancia al frío o bien
en zonas donde las condiciones de germinación y almacenaje son
pobres.
Harinoso
(Blando)
El descubrimiento y selección de esta característica constituyó un paso
esencial para la amplia dispersión, desarrollo y adopción de una gran
cantidad de alimentos elaborados a base de maíz. La harina de maíz
continua siendo la forma preferida para la elaboración de productos de
consumo humano directo, debido a que consiste de almidón blando que
es fácilmente utilizable para producir alimento que puede consumirse
directamente (pinole), o bien para elaborar pan plano (tortilla), masa
cocida (tamal) o bebidas (atole).
Dentado
Consiste de un núcleo de almidón harinoso con inclusiones laterales de
almidón duro. Debido a que el ápice del fruto consiste de almidón
harinoso, la pérdida de humedad de esta área al alcanzar la madurez
causa un ligero colapso en el volumen lo cual le brinda la típica
apariencia de un diente. Este es el tipo de maíz que se produce más a
nivel mundial, siendo usado en la alimentación del ganado así como
para diversos productos industriales (almidón, jarabe, aceite, alcohol).
Dulce
El endospermo consiste principalmente de azúcar soluble, con un poco
de almidón y una forma intermedia de un polímero de azúcar llamado
fitoglicógeno. Tomado de: Salvador, 2001.
18
1.6.5 Etapas de desarrollo del maíz
El desarrollo de la planta se puede dividir en dos fases fisiológicas. En la primera, o
fase vegetativa, se desarrollan y diferencian distintos tejidos hasta que aparecen las
estructuras florales. La fase vegetativa consta de dos ciclos. En el primero se forman
las primeras hojas y el desarrollo es ascendente; en este ciclo, la producción de materia
seca es lenta y finaliza con la diferenciación tisular de los órganos de reproducción. En
el segundo ciclo se desarrollan las hojas y los órganos de reproducción; este ciclo
acaba con la emisión de los estigmas. La segunda fase, también llamada fase de
reproducción, se inicia con la fertilización de las estructuras femeninas que se
diferenciarán en espigas y granos. La etapa inicial de esta fase se caracteriza por el
incremento de peso de las hojas y otras partes de la flor; durante la segunda etapa, el
peso de los granos aumenta con rapidez, se describen cada una de las etapas del
desarrollo del maíz en la tabla 9 y se observan en la Figura 6 (FAO, 1993).
Además, las etapas de crecimiento se pueden agrupar en cuatro grandes períodos:
Crecimiento de las plántulas (etapas VE y V1)
Crecimiento vegetativo (etapas V2, V3... Vn)
Floración y la fecundación (etapas VT, R0, y R1)
Llenado de grano y la madurez (etapas R2 a R6)
Figura 6. Etapas de desarrollo del maíz. Se observa el desarrollo de la planta de maíz, donde:
VE) es la fase de emergencia donde el coleoptilo emerge del suelo, V2) es la fase vegetal se hace
visible el cuello de la segunda hoja, V3) es la fase vegetal se hace visible el cuello de la tercera
hoja V6) es la fase vegetal donde es visible el cuello de la hoja número 6, V12) es la fase vegetal
donde es visible la hoja número 12, VT) fase vegetal donde comienza la floración masculina es
visible la última rama de la panícula, R1) fase reproductiva donde comienza la floración femenina y
son visibles los estigmas del jilote, R6) se alcanza la madures de la planta del maíz. Tomado de:
Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz Y Trigo [CIMMYT], 2015.
Siembra
V6
V3 V2
Floración
masculina R1
VT
Floración
femenina R6
VE
V12
19
Tabla 9. Descripción de las etapas en el desarrollo del maíz
Etapa DAS* Características
VE 5 El coleoptilo emerge de la superficie del suelo
V1 9 Es visible el cuello de la primera hoja.
V2 12 Es visible el cuello de la segunda hoja.
Vn
Es visible el cuello de la hoja número "n". ("n" es igual al número
definitivo de hojas que tiene la planta; "n" generalmente fluctúa entre
16 y 22, pero para la floración se habrán perdido las 4 a 5 hojas de
más abajo.)
VT 55 Es completamente visible la última rama de la panícula.
R0 57 Antesis o floración masculina. El polen se comienza a arrojar.
R1 59 Son visibles los estigmas saliendo del jilote.
R2 71 Etapa de ampolla. Los granos se llenan con un líquido claro y se
puede ver el embrión.
R3 80 Etapa lechosa. Los granos se llenan con un líquido lechoso blanco.
R4 90 Etapa masosa. Los granos se llenan con una pasta blanca. El
embrión tiene aproximadamente la mitad del ancho del grano.
R5 102
Etapa dentada. La parte superior de los granos se llena con almidón
sólido y, cuando el genotipo es dentado, los granos adquieren la
forma dentada. En los tipos tanto cristalinos como dentados es visible
una "línea de leche" cuando se observa el grano desde el costado.
R6 112 Madurez fisiológica. Una capa negra es visible en la base del grano.
La humedad del grano es generalmente de alrededor del 35%.
* DAS: Número aproximado de días después de la siembra en tierras bajas tropicales,
donde las temperaturas máximas y mínimas pueden ser de 33°C y 22°C,
respectivamente. En los ambientes más fríos, se amplían estos tiempos. Tomado de: CONACYT, 2014.
1.7 Antecedentes
El huitlacoche es un alimento de alto valor nutricional por su alto contenido proteínico
de buena calidad que van del 10-20%, su rico contenido de carbohidratos del 55.1-
66.5% y de fibra 16.0-23.5%. Así como, baja cantidad de grasas del 1.6-2.3%, aunado a
sus propiedades antioxidantes (Valdez y col., 2009; Juárez y col., 2011), comparado
con los granos de maíz sin infección con tan solo 9% de contenido proteínico y una
mayor concentración de grasas que es de un 5% (Departamento de Agricultura de los
Estados Unidos, 2016). Debido a su importancia económica, el costo va de 40-140
pesos por kg (Central de Abastos de la Ciudad de México, 2007). Por lo cual, se han
20
buscado metodologías para la producción de este hongo para mejorar el rendimiento y
lograr la infección con el uso de diferentes cepas y estadios del hongo.
Actualmente, se busca la forma de producir a gran escala este hongo ya que los
métodos para la inducción aún siguen siendo rudimentarios como la aspersión de
teliosporas sobre la mazorcas o el campo, a pesar que ya excitan algunos métodos
para mejorar los resultados en la infección estos son caros y necesitan de instalaciones
adecuadas para manipular al hongo. Por lo tanto se busca lograr una metodología
sencilla y económica para lograr la infección inducida, otro punto importante para su
producción es su remuneración económica ya que es más elevada comparada con la
venta del maíz sin infección.
Leal (1996) evaluó el tipo de inóculo para obtener mejores resultados para inducir la
infección de plantas de maíz comparando teliosporas y basidiosporas de Ustilago
maydis, la frecuencia de inoculación, vía de inoculación y la concentración del inóculo,
obteniendo las teliosporas a partir de una mazorca infectada triturando las agallas y
tamizándolas con mallas del número 80mm hasta obtener solo teliosporas y
germinandolas en el medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA) posteriormente se
obtuvo biomasa de basidiosporas en un medio mínimo mineral líquido, se encontró que
es conveniente usar inóculo de basidiosporas en lugar de teliosporas encontrando
mayor incidencia de formación de agallas con el uso de basidiosporas, al comparar la
aplicación de una solo dosis de inóculo o dos, se encontró que al aplicar dos dosis de
basidiosporas incrementan el porcentaje de formación de agallas la primera al formarse
el jilote y la segunda cuando emergieron los estigmas, al comparar una concentración
de 1x105/mL y otra de 1x106/mL de teliosporas y basidiosporas, no se encontró
diferencia en la incidencia de infección, se determinó que la aplicación endógena
(inyección) es mejor la aplicación exógena (aspersión sobre la planta).
Martínez y col. (2000) evaluaron y seleccionaron cepas de Ustilago maydis con alta
virulencia sobre el maíz partiendo de teliosporas obtenidas de mazorcas totalmente
cubiertas con agallas de huitlacoche desinfectando las agallas y sembrando las
teliosporas en el medio de cultivo PDA hasta obtener basidiosporas generando biomasa
en este medio y ajustando los inóculos de basidiosporas a 106/mL con agua destilada y
con estas últimas inocular plantas de maíz, de 100 cepas de basidiosporas aisladas se
encontraron 12 cepas con un porcentaje de infección mayor al 70%.
Cota (2004) evaluó cepas locales de Ustilago maydis del Valle de Yaqui en Sonora
en plantas de maíz para la producción de huitlacoche en esa localidad, en su
investigación evaluó cruzas de cepas y cepas solas de basidiosporas seleccionadas de
un trabajo previo del Instituto Tecnológico de Sonora recolectadas en el 2004 por
Clavero de distintos puntos de la localidad, adaptadas a condiciones de laboratorio y
reactivadas en caldo dextrosa de papa, encontrando mayor porcentaje de infección en
las mazorcas de maíz usando las cruzas de cepas de basidiosporas.
Valdez y col. (2009) evaluaron la susceptibilidad de 15 diferentes genotipos de maíz
criollo de Guanajuato para la producción de este hongo usando basidiosporas de
21
Ustilago maydis a una concentración de 1x106/ml adaptadas a condiciones del
Laboratorio de Biotecnología de Alimentos del CINVESTAV-Irapuato reactivándolas en
medio PDA y generando biomasa en medio líquido extracto de Papa obteniendo
porcentajes de infección mayores al 90% en el maíz criollo de la localidad de Loma de
Cabra Guanajuato.
Madrigal y col. (2010) realizaron ensayos bajo condiciones de invernadero para la
producción de huitlacoche en hidropónia, evaluó la producción del hongo en híbridos
comerciales de maíz con cepas de teliosporas provenientes de los mismos tipos de
híbridos de maíz para considerarlos apropiadas cada uno de ellos, germinado las
teliosporas en medio PDA y así generar los inóculos de basidiosporas ajustando la
concentración a 1x106/mL con agua destilada, encontrando mayor incidencia de
infección en el hibrido comercial 30G40.
Jiménez (2013) obtuvo teliosporas de la localidad de Miahuatlán Veracruz las cuales
fueron sembradas en medio PDA para que estas germinaran en basidiosporas,
posteriormente generó biomasa en medio PDA y ajustó un inóculo de basidiosporas a
1x106/mL con agua destilada, conservándolas a 4°C hasta su uso, con esto produjo un
inóculo artificial de Ustilago maydis.
Escalante (2013) evaluó la infectividad de las teliosporas y basidiosporas de Ustilago
maydis en diferentes híbridos comerciales de maíz, obteniendo las basidiosporas de un
experimento anterior conservadas desde el 2001 en un cepario del laboratorio de
fitotecnia de la Universidad Autónoma de Chapingo estas se reactivaron en PDA y
ajustando los inóculos de basidiosporas a una concentración de 1x106/mL con agua
destilada y cloranfenicol, y las teliosporas obtenidas a partir de mazorcas con agallas
donde se trituraron las agallas en una licuadora domestica para así obtener el
concentrado de teliosporas, encontrando que se obtienen los mejores resultados en
infección con el uso de un inóculo de teliosporas a una concentración de 1x106/mL
sobre los híbridos de maíz.
Moncada (2014) evaluó un método para la obtención de teliosporas purificadas de
Ustilago maydis para encontrar cepas patógenas y así producir huitlacoche,
recolectando mazorcas con agallas las cuales fueron trituradas y filtradas,
posteriormente, lavadas con agua destilada y desinfectadas con sulfato de cobre al
0.5% sembrando las teliosporas lavadas, en medio de cultivo completo descrito por
Holliday en 1974, obteniendo colonias de basidiosporas sexualmente compatibles por
tener crecimiento de aspecto algodonoso al mezclar colonias levaduriformes.
22
2. JUSTIFICACIÓN
La realización de este trabajo se basa en que el huitlacoche a pesar de ser un hongo
fitopatógeno para el maíz es considerado como alimento en la comida mexicana con
alto valor nutricional, al tener controlados algunos factores ambientales y
microbiológicos se puede lograr la producción a gran escala para su comercialización.
En la actualidad, pocas son las empresas encargadas de su comercialización entre las
que se encuentran: Herdez, La Costeña, Monteblanco, San Miguel, aunado a que la
obtención de este hongo se da por el crecimiento dado en los cultivos de maíz de
manera fortuita, y no son específicos, con un desarrollo en condiciones normales menor
al 5%.
Actualmente, el costo de este producto oscila entre los 40-140 pesos por kg
reportado por la Central de Abastos de la Ciudad de México, de acuerdo a la temporada
del año, en temporada de lluvia es la épocas del año en donde es fácil conseguirlo e
incluso es más económico.
Este trabajo estuvo encaminado en realizar un procedimiento donde se controlen
algunos factores que alteran el desarrollo del hongo en forma natural, como vía de
inoculación, concentración del inóculo con esporas, y la producción de inóculo
adecuado, de forma eficiente y económica para su posterior uso en la producción del
huitlacoche bajo condiciones controladas.
23
3. OBJETIVOS
Objetivo general
Desarrollar un protocolo para la inoculación de Ustilago maydis en maíz bajo
algunas condiciones controladas para la producción de huitlacoche a bajo costo.
Objetivos particulares
Obtener un concentrado puro de teliosporas de Ustilago maydis.
Determinar la viabilidad de las teliosporas de Ustilago maydis.
Aislar una cepa pura de basidiosporas de Ustilago maydis. Evaluar las condiciones óptimas para el crecimiento de la fase de basidiospora de
Ustilago maydis.
Comparar y seleccionar el medio de cultivo adecuado para la propagación del hongo
y generación del inóculo.
Evaluar la eficiencia de infección del hongo Ustilago maydis en diferentes etapas de desarrollo del maíz con el uso de teliosporas y basidiosporas.
Determinar la vía de inoculación más adecuada para obtener mayor eficiencia en la
infección de maíz, así como la concentración de inóculo adecuado.
24
4. MATERIAL Y MÉTODOS
4.1 Selección de mazorcas con infección por Ustilago maydis
Los criterios para la selección de las mazorcas infectadas por Ustilago maydis
fueron: mazorca sin estado de descomposición, evidente presencia de agallas color
grisáceas al abrir estas agallas debían tener una masa negra de teliosporas, y que aun
estuvieran cubiertas por las hojas y que estas siguieran verdes, se evitó aquellas que
tuvieran hojas con polvo, secas o marchitas para disminuir carga microbiana externa,
posteriormente se desinfectaron.
4.2 Selección de granos jóvenes de maíz sin infección
Los granos utilizados para las primeras pruebas tenían que ser de mazorcas recién
cortadas de cultivo de la localidad de San Francisco Chimalpa, Naucalpan, Edo. de
México, las mazorcas tenían que estar aún cubiertas por las hojas que lo recubre y
estás hojas sin marchitez, sin polvo y sin presencia de insectos, posteriormente se
desinfectaron.
4.3 Selección de granos maduros para siembra
Los granos ocupados tenían que ser granos de la recolección del año anterior, sin
evidencia de insectos e intactos, evitando aquellos rotos o con insectos, posteriormente
se desinfectaron.
4.4 Evaluación de la eficiencia de infección de un macerado de teliospora de
Ustilago maydis
4.4.1 Prueba en mezcla de granos de maíz jóvenes sanos con granos infectados
con Ustilago maydis
La primer prueba realizada fue determinar si era posible infectar granos de maíz
jóvenes, realizando una mezcla de granos de maíz jóvenes sanos y un macerado de
granos infectados con Ustilago maydis (fase de teliospora), lo primero fue la selección
de una mazorca infectada con Ustilago maydis aquella que presentara evidente
hipertrofia y una masa negra de teliosporas, retirando las hojas que lo cubrían y lavando
al chorro de agua corriente para eliminar restos de hojas, polvo y otros artefactos
contaminantes de la muestra, se desgrano y seleccionaron los granos en mejores
condiciones los más grandes y con abundancia en teliosporas, estos se lavaron con
solución jabonosa preparado con agua corriente más jabón líquido comercial, se eliminó
el exceso de jabón con agua corriente, posteriormente se sumergieron en hipoclorito de
25
sodio al 1% por 15 minutos y después se realizaron tres lavados con agua corriente
escurrieron perfectamente y posteriormente se trituraron los granos en un recipiente
con una cuchara previamente desinfectados con hipoclorito de sodio al 1%, hasta
obtener una masa homogénea.
Posteriormente, se lavaron las mazorcas sanas con granos jóvenes de la misma
forma que a las agallas hasta obtener los granos limpios. Con este macerado de los
granos infectados más los granos sanos se realizaron mezclas por triplicado en
proporciones volumen a volumen (V:V), infectado vs sano en diferentes diluciones 1:10,
1:5 y 2:5 y se colocaron en vasos de plástico de 250mL cubriendo los recipientes con
una malla de plástico, y se observaron periódicamente durante un mes para observar
los cambios en los granos sano.
4.4.2 Pruebas de inoculación de granos de maíz sanos jóvenes con suspensión
de teliosporas de Ustilago maydis
Se obtuvieron las teliosporas de la misma forma a lo antes mencionado (4.4.1), y se
prepararon diferentes diluciones (1:3, 1:2 y 1:1.5) del concentrado de teliosporas y agua
potable volumen a volumen (V:V), de cada dilución se inocularon por inyección 0.2mL
en granos jóvenes sanos utilizando siete granos por cada dilución, dichos granos se
desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1% y otra serie de siete granos utilizada como
control negativo se inocularon 0.2mL de agua potable en las mismas condiciones.
Posteriormente, se colocaron los granos en cajas Petri a temperatura ambiente,
observando periódicamente durante un mes observando los cambios sobre los granos
de maíz.
4.4.3 Prueba de inoculación de mazorcas jóvenes y sanas con suspensión de
teliosporas de Ustilago maydis
Se seleccionaron mazorcas jóvenes, las cuales se limpiaron a chorro de agua para
eliminar los restos de polvo o artefactos, sin retirar las hojas que cubren los granos para
mantenerlos protegidos, se desinfectaron sumergiendo en una solución de hipoclorito
de sodio al 1% por 15 minutos, después se realizaron 3 lavados con agua corriente y se
escurrieron perfectamente. Se realizaron diferentes diluciones (1:3, 1:2 y 1:1.5) de un
concentrado de teliosporas más agua potable (V:V), se tomó 1mL de cada dilución y se
usó como inóculo por inyectar en la base de las mazorcas, otra mazorca fue usada
como control negativo a la cual se le inyecto 1mL de agua potable, posterior a la
inoculación las cuatro mazorcas se colocaron en un recipiente incubando a temperatura
ambiente y se observó periódicamente durante un mes, transcurrido este tiempo se
retiraron las hojas que protegían las mazorcas y se evaluó el efecto de cada
concentrado.
26
4.4.4 Determinación de la infectividad de la fase de teliosporas de Ustilago
maydis por aspersión sobre granos de maíz germinando
Se desinfectaron granos de maíz y se colocaron en caja Petri con algodón
humedecido hasta observar su germinación, cuando tenían dos semanas de desarrollo
se les agrego una suspensión de teliosporas que los cubriera dejando actuar por una
semana, después se sembraron en vasos de 250mL con suelo estéril y se observó
periódicamente el efecto producido.
4.5 Obtención de un concentrado de teliosporas puras de Ustilago maydis
Se realizó la selección de una mazorca infectada con Ustilago maydis, ya
presentaban una evidente hipertrofia y una masa negra de teliosporas, se prepararon
como en el apartado (4.4.1), se desgranó y se seleccionaron los granos en mejores
condiciones aquellos que fueran más grandes y con abundancia en teliosporas, a partir
de este punto se trabajó en condiciones asépticas en campana de flujo laminar, se
lavaron los granos con solución jabón líquido comercial, se eliminó el exceso de jabón
con agua destilada estéril, se sumergieron los granos en hipoclorito de sodio al 1% por
15 minutos, posteriormente se eliminó el exceso de hipoclorito con tres lavados de agua
destilada estéril escurriendo perfectamente, se procedió a realizar el macerado de estos
en un tubo para centrifuga de 15mL con ayuda de un aplicador de vidrio
El macerado obtenido se separó en tubos para centrifuga de 15mL, cada tubo con un
volumen de la mezcla de teliosporas y macerado del maíz de 5mL se aforaron a un
volumen final de 10mL con agua destilada estéril, y posteriormente se centrifugó por 15
minutos y decantó el sobrenadante, después se realizaron dos lavados más con agua
destilada estéril y centrifugando por el mismo tiempo, el concentrado de teliosporas se
retó ante diferentes concentraciones de NaCl, para generar un gradiente de
concentración y separar los restos de tejido vegetal de las teliosporas, partiendo de una
solución al 0.85%. Posteriormente a diferentes concentración de: 1%, 1.5%, 2%, y
aumentando gradualmente la concentración en 0.5%, hasta una concentración del 30%
de NaCl, se centrifugó cada una por 15 minutos y retiraron los restos vegetales que
quedaban en el sobrenadante. Se evaluaron las diferentes concentraciones de NaCl
para determinar la óptima para lograr separar el tejido vegetal de las teliosporas.
Después de encontrar la concentración óptima para separar tejido vegetal de las
teliosporas para su posterior evaluación de viabilidad, se realizaron tres lavados con
solución fisiológica al 0.85% de NaCl y se centrifugaron en cada caso por 15 minutos.
Posteriormente, al concentrado de teliosporas se le agregó una solución de CuSO4 al
1% como agente bactericida y se dejó actuando por 24 horas, se realizó un lavado con
solución fisiológica estéril para eliminar el exceso de la solución de CuSO4, se
conservaron las teliosporas en refrigeración a 4°C hasta su uso.
27
4.5.1 Determinación de la viabilidad de teliosporas de Ustilago maydis
4.5.1.1 Prueba en medio líquido de extracto de maíz
De los concentrados de teliosporas retadas con concentraciones de 4% y 30% de
NaCl, se prepararon dos tubos para cada concentración y se colocó un volumen de
2mL del concentrado de teliosporas por tubo, se les adicionó 8mL de medio líquido de
extracto de maíz a cada uno hasta obtener un volumen final de 10mL, se incubo el tubo
con la suspensión de 4% de NaCl y el de 30% de NaCl a 37°C mientras que la otra
serie de tubos se incubo a 27°C, cada 24 horas en la campana de flujo laminar se tomó
una gota y se colocó en un portaobjetos más una gota de azul de metileno y se observó
al microscopio a (40X), hasta observar la germinación de las teliosporas.
4.5.1.2 Prueba en medio sólido de extracto de maíz
De los concentrados de teliosporas retadas con concentraciones de 4% y 30% de
NaCl, se prepararon dos tubos para cada concentración y se colocó un volumen de
2mL del concentrado de teliosporas por tubo, se le adicionaron 8mL de solución salina
al 0.85% a cada tubo hasta obtener un volumen final de 10mL. Después, se tomó 1mL
de cada uno de los cuatro tubos preparados y se inocularon por duplicado placas de
agar extracto de maíz por cada tubo, se incubo una serie que constaba de dos placas
con la suspensión de 4% de NaCl y dos placas con la suspensión de 30% NaCl a 37°C
y la otra serie se incubo a 27°C, se realizaron observaciones cada 24 horas, hasta
observar crecimiento.
4.6 Aislamiento de una cepa pura de la fase de basidiosporas de Ustilago maydis
en agar extracto de maíz
Se realizó la selección de una mazorca infectada con Ustilago maydis, que ya
presentaban una evidente hipertrofia y una masa negra de teliosporas, se prepararon
como se mencionó anteriormente en el punto (4.4.1), se desgrano y se seleccionaron
los de granos en mejores condiciones aquellos que fueran más grandes y con
abundancia en teliosporas, a partir de este punto se trabajó en condiciones asépticas
en campana de flujo laminar, se realizó un corte transversal y uno longitudinal pasando
por el centro de los granos con ayuda de bisturí, aguja y pinzas estériles.
Asimismo, se tomó una asada de teliosporas y se sembraron cuatro placas de agar
extracto de maíz por estría cruzada, dos placas se incubaron a 27°C y dos a 37°C,
realizando observaciones cada 24 horas hasta observar crecimiento, después de
obtener colonias, se realizaron las observaciones macroscópicas y microscópicas de
cada colonia obtenida, se descartaron las colonias con crecimiento micelial y
bacteriano, se seleccionaron solo las colonias con morfología microscópica
28
levaduriforme, resembrando cada colonia levaduriforme en agar extracto de maíz por
estría simple (una colonia por placa), se incubó a 37°C por 96 horas, para generar
biomasa, transcurrido este tiempo se realizó una suspensión de cada placa de agar
tomando cinco colonias por placa y resuspendiendo en 5mL de solución salina al
0.85%, después se tomó 1mL de cada suspensión en jeringa hipodérmicas y se
inocularon por inyección a plantas de maíz de un mes de desarrollo, se esperó observar
los efectos en las plántulas así inoculadas y posiblemente infectadas por este método.
Tres semanas después de los ensayos de infección con Ustilago maydis se
realizaron cortes de las zonas afectadas, se tiñeron con azul de metileno, se realizó la
observación al microscopio a (40X) y (100X), buscando el micelio y las teliosporas para
confirmar infección y la presencia del hongo, seleccionando las colonias que
presentaran las mismas características morfológicas macroscópicas y microscópicas
que produjeron la infección y se resembraron en medio agar extracto de maíz para su
posterior uso.
4.7 Determinación de infectividad de los estadios de Ustilago maydis sobre
plantas de maíz
Se realizaron tres pruebas para evaluar los dos estadios del hongo (teliosporas y
basidiosporas), así como, la combinación de colonias de basidiosporas:
1) Se resembraron seis colonias provenientes de la misma placa de agar extracto
de maíz con las mismas características levaduriformes, por lo tanto, la misma cepa
confirmadas de Ustilago maydis (cepa haploide) en un tubo con 10mL de medio
líquido de extracto de maíz y se incubo a 37°C por 96 horas.
2) Después se seleccionaron seis colonias provenientes de diferentes placas con
morfologías levaduriformes y también seleccionando aquella que presentaba
pseudomicelio y con morfología microscópica idéntica, por lo tanto se consideraban
diferentes cepas confirmadas de Ustilago maydis para generar un apareamiento
sexual y formar un inoculo con cepas diploides, se resembraron en un tubo con 5mL
de medio líquido de extracto de maíz y se incubo a 37°C por 96 horas.
3) Por último se tomó un volumen de 1mL del concentrado de teliosporas, obtenidas
anteriormente como se mencionó en el punto (4.5) y se resuspendieron en 4mL de
solución salina estéril para obtener un volumen final de 5mL.
Se inoculó 1mL de cada uno de los tres preparados en el tallo de plantas de maíz de
un mes de desarrollo, observando periódicamente los efectos producidos.
29
4.8 Comparación y selección del medio de cultivo óptimo para la propagación de
la cepa comprobada de Ustilago maydis
4.8.1 Evaluación del crecimiento en medio sólido de extracto de maíz
Se resembró una colonia de basidiosporas en 50mL de medio líquido de extracto de
maíz y se incubo a 37°C por 24 horas. Y después se sembraron cinco placas de agar
extracto de maíz y cinco de extracto de papa 1mL del medio anterior a cada una de las
placas incubando a 37°C hasta obtener crecimiento, comparando los medios para
observar cual presentaba mayor desarrollo.
4.8.2 Evaluación del crecimiento en medio líquido de extracto de maíz
Se prepararon diluciones con agua destilada estéril de los medios líquidos extracto
de maíz y de papa, obteniendo tres tubos por cada medio (concentrado, y diluciones de
1:1, y 1:3), las concentraciones finales en un volumen de 10mL se observan en la Tabla
10. A partir del medio líquido de extracto de maíz inoculado con basidiosporas
mencionado en el punto anterior (4.8.1) incubado por 96 horas, se inocularon con 1mL
los tubos con medio concentrado, diluido al 50% 1:1 (V:V) y el diluido al 25% 1:3,
después se dejó incubando por 24 horas a 37°C y se evaluó el crecimiento por conteo
celular en cámara de Neubauer.
Tabla 10. Concentraciones finales de los medios de cultivo líquidos
usados en esta prueba.
Medio de cultivo líquido Extracto de maíz Extracto de papa
Concentrado Harina de maíz 40%,
Sacarosa 0.5%
Extracto de papa 20%,
Sacarosa 0.5%
Diluido 1:1 (V:V) Harina de maíz 20%,
Sacarosa 0.25%
Extracto de papa 10%,
Sacarosa 0.25%
Diluido 1:3 (V:V) Harina de maíz 10%,
Sacarosa 0.125%
Extracto de papa 5%,
Sacarosa 0.125%
4.9 Preparado de inóculos de basidiosporas de Ustilago maydis a diferentes
concentraciones
De un cultivo de 96 horas de basidiosporas de Ustilago maydis en medio líquido de
extracto de maíz (1:1) se tomó una alícuota y se colocó en una cámara de Neubauer
para realizar el conteo del número de levaduras obteniendo un conteo de 6x105
basidiosporas/mL. Posteriormente, se realizaron diluciones para obtener las
concentraciones de 6x104 basidiosporas/mL y 6x103 basidiosporas/mL.
30
4.10 Inoculación a plantas adultas de maíz con la fase de basidiosporas de
Ustilago maydis
Se tomaron 3mL de las tres diferentes concentraciones de basidiosporas preparadas
en el punto anterior (4.2.9) en jeringas hipodérmicas y se procedió a inocular tres
plantas adultas de maíz que fueron sembradas en macetas de un volumen de 20L con
suelo de cultivo de maíz de la localidad de San Francisco Chimalpa, Naucalpan, Edo.
de México por cada concentrado, inyectando en la base, centro y ápice del jilote 1mL
por cada porción, se realizó la observación después de tres semanas de su inoculación,
retirando las hojas que cubría la mazorca.
4.11 Confirmación de la infectividad de las basidiosporas de Ustilago maydis
obtenidas para producir huitlacoche
Los resultados anteriores no fueron tan representativos al no presentase la evidencia
de agallas en la mazorca, por lo tanto se procedió a realizar una nueva prueba en
plantas de maíz de la misma localidad usando suelo de compostaje.
Se colocaron a germinar granos de maíz en cajas de Petri humedecidas con agua
potable, dos semanas después cuando emergieron se sembraron en macetas de 20L
con suelo de compostaje, hasta tener una planta adulta con el jilote emergiendo. Las
teliosporas tratadas con el gradiente de concentración de NaCl conservadas a 4°C se
sembraron en agar extracto de papa y se incubaron a 37°C por 72 horas, después del
crecimiento de las colonias de Ustilago maydis se seleccionaron cuatro colonias las
cuales presentaron evidencia de pseudomicelio confirmado en observaciones al
microscopio.
Las cuatro colonias seleccionadas se resembraron en medio líquido de extracto de
maíz y se incubaron a 37°C por 72 horas, se confirmó su pureza al tomar una alícuota y
observarla al microscopio tiñendo con azul de metileno, por la abundancia de
pseudomicelio se procedió a realizar diluciones decimales las cuales fueron 10-1
, 10-2
y
10-3 a un volumen final de 10mL, se tomó 0.1mL de cada dilución sembrar por
dispersión con varilla acodada en medio agar almidón incubando a 37°C por 48 horas
para realizar el conteo de UFC/mL, obteniéndose el número de UFC/mL.
Posteriormente, se tomaron 3mL de la suspensión de basidiosporas y se inoculó 1mL
de la suspensión en la base del jilote de la planta de maíz en estadio R1 (11 días
después de la salida del estigma de los jilotes), 1mL en la base y 1mL en el ápice del
jilote, después de cuarta semanas se realizaron las observaciones de la mazorca.
31
5. DIAGRAMA GENERAL DE TRABAJO
Selección de
material biologico
Obteción de
granos jovenes
sanos
Obtención de
un concentrado
de teliosporas
Granos
maduros de
maíz
Mazorcas
infectadas por
Ustilago maydis
Mazorcas
jovenes sanas
de maíz
Purificación de
teliosporas
Obtención de
basidiosporas
Determinación
de la viabilidad
de las
teliosporas
Evaluación de
la eficiencia de
infección de
teliosporas
Plántulas de
maíz
Plantas adultas
de maíz
Germinación de
granos de maíz
Determinación
de infectividad
en plantulas de
maíz
OBTENCIÓN DE
HUITLACOCHE
Determinación
de infectividad
en plantas
adultas de maíz
Comparación y
selección del
medio de cultivo
óptimo para la
propagación de
basidiosporas
32
6. RESULTADOS
6.1 Evaluación de la eficiencia de infección de un macerado de teliospora de
Ustilago maydis
6.1.1 Mezcla de granos de maíz jóvenes sanos con granos infectados
La primera prueba consistió en evaluar la posibilidad de producir la infección típica de
Ustilago maydis formando agallas y masas negra de teliosporas en granos jóvenes de
maíz sin la manipulación de plantas adultas de maíz, por lo tanto se evaluó la
capacidad de producir infección en granos de maíz tierno usando altas concentraciones
de teliosporas de Ustilago maydis, comparando el efecto que se produjo en las mezclas
(V:V) granos infectado vs sano en diferentes diluciones 1:10, 1:5 y 2:5.
La primera mezcla (Figura 7) fue una parte de granos infectados con diez partes de
granos sanos colocados en vasos de plástico, en la imagen A se muestran los granos
antes de agregar el macerado de granos infectados al día cero dichos granos se
encuentran en condiciones normales, en la imagen B se observan granos de maíz con
teliosporas en la segunda semana de exposición los granos se observan con un ligero
estado de descomposición, sin observarse hipertrofia o masas negras dentro de los
granos, en la imagen C se observan granos de maíz con teliosporas en la tercera
semana de exposición los granos ya se aprecian con un evidente estado de
descomposición sin cambios característicos de agallas de huitlacoche.
De igual forma se prepara una mezcla (Figura 8) con una parte de granos infectados
con cinco partes de granos sanos colocados en vasos de plástico, la imagen A nos
muestran los granos antes de agregar el macerado de granos infectados al día cero
dichos granos se encuentran en condiciones normales, en la imagen B se observan
granos de maíz con teliosporas en la segunda semana de exposición los granos se
observan con un ligero estado de descomposición, sin observarse hipertrofia o masas
negras dentro de los granos, en la imagen C se observan granos de maíz con
teliosporas en la tercera semana de exposición donde los granos ya se aprecian con un
mayor estado de descomposición sin cambios característicos de agallas de huitlacoche.
Por último mezcla número tres (Figura 9) que fue con dos partes de granos
infectados con cinco partes de granos sanos colocados en vasos de plástico, la imagen
A nos muestran los granos antes de agregar el macerado de granos infectados al día
cero dichos granos se encuentran en condiciones normales, en la imagen B se
observan granos de maíz con teliosporas en la segunda semana de exposición los
granos se observan con un ligero estado de descomposición, sin observarse hipertrofia
o masas negras dentro de los granos, en la imagen C se observan granos de maíz con
teliosporas en la tercera semana de exposición donde los granos ya se aprecian
destruidos en su mayoría pero sin cambios característicos de agallas de huitlacoche.
33
A) Día 0 C) Semana 3
A) Día 0 B) Semana 2 C) Semana 3
A) Día 0 B) Semana 2 C) Semana 3
Figura 7. Evaluación de infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de maíz
tierno, dilución (1:10). A) Al día cero, se observan granos de maíz, tiernos y sanos, B) En la
semana dos de exposición de los granos de maíz con teliosporas, se observan un ligero estado de
descomposición en los granos y C) En la semana tres, los granos ya se aprecian con un evidente
estado de descomposición sin formación de hipertrofia.
Figura 8. Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de maíz
tierno, dilución (1:5). A) En el día cero, se observan granos de maíz, tiernos y sanos, B) En la
semana dos de exposición de los granos de maíz con teliosporas, se observan con un ligero
estado de descomposición en los granos y C) En la semana tres de exposición, los granos ya se
aprecian con mayor estado de descomposición sin formación de hipertrofia.
Figura 9. Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de maíz
tierno, dilución (2:5). A) En el día cero se observan granos de maíz, tiernos y sanos, B) En la
semana dos de exposición de los granos de maíz con teliosporas, observan con un ligero estado
de descomposición los granos y C) En la semana tres se observan los granos con mayor estado
de descomposición sin formación de hipertrofia.
B) Semana 2
34
6.1.2 Inoculación de granos de maíz sanos jóvenes con suspensión de
teliosporas de Ustilago maydis
Este experimento consistió en optimizar la metodología de inoculación de granos de
maíz con teliosporas de Ustilago maydis y mantener controlados los factores externos a
los granos inoculados manteniendo estos granos en cajas Petri para evitar el contacto
con el exterior y se mantuvieron hidratados al colocar los granos sobre algodón
humedecido con agua potable dentro de la caja Petri. Se evaluó la capacidad de
producir infección en granos de maíz tiernos con el uso de teliosporas de Ustilago
maydis, se obtuvo una masa de teliosporas, y se prepararon diferentes concentrados de
(teliosporas-agua) V:V, para ser inoculadas en granos de maíz tiernos.
En la Figura 10 se observa el control negativo, donde solo se les inyecto agua
potable a los granos, la imagen A corresponde al día cero de la inoculación, en B se
observan los granos una semana después de inoculadas, en C se observan dos granos
ya con brotes de germinación después de dos semanas de la inoculación y en D se
observan los granos después de tres semanas de inoculados con la cuatro granos
germinados.
Los granos inoculados con la dilución (1:3) del concentrado de teliosporas y agua
potable (V:V) se observan en la Figura 11, la imagen A corresponde al día cero de la
inoculación observándose un área negra en la zona de inoculación esas son las
teliosporas inoculadas, en B se observan los granos una semana después de
inoculadas, en C se observan tres granos ya con brotes de germinación después de
dos semanas de la inoculación y en D se observan los mismos tres granos germinados
con el brote más grande después de tres semanas de inoculados y algunas zonas de
los granos se observan en estado de descomposición.
Se observan los granos inoculados con la dilución (1:2) del concentrado de
teliosporas y agua potable (V:V) en la Figura 12, la imagen A corresponde al día cero
de la inoculación observándose una área negra en la zona de inoculación esas son las
teliosporas inoculadas, en B se observan los granos una semana después de
inoculadas, en C se observan dos granos con brotes de germinación después de dos
semanas de la inoculación y en D se observan tres granos germinados con el coleoptilo
de mayor tamaño después de tres semanas de inoculados y algunas zonas de los
granos se observan en estado de descomposición.
Mientras que en la Figura 13 se observan los granos inoculados con la dilución
(1:1.5) del concentrado de teliosporas y agua potable (V:V), la imagen A corresponde al
día cero de la inoculación observándose una área negra en la zona de inoculación esas
son las teliosporas inoculadas, en B se observan los granos una semana después de
inoculadas, en C se observa un grano germinando después de dos semanas de
inoculación y en D se observa que solo un grano logró germinar después de tres
semanas de inoculación y todos los granos se observan en estado de descomposición.
35
Figura 10. Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de maíz
tiernos, control negativo. A) Día cero de inoculación, B) Granos después de una semana de
inoculación con teliosporas, C) Granos después de dos semanas de inoculación con teliosporas y
D) Granos después de tres semanas de inoculación con teliosporas.
Figura 11. Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de
maíz tiernos usando una concentración de teliosporas 1:3 (agua-teliosporas). A) Día cero
de inoculación, se observa una pequeña porción negra en el sitio de inoculación de las
teliosporas, B) Granos después de una semana de inoculación con teliosporas, C) Se observan
tres granos germinando después de dos semanas de inoculación con teliosporas y D) se
observan los tres granos con su coleoptilo más grande después de tres semanas de inoculación
con teliosporas, algunos granos con evidente estado de descomposición.
Figura 12. Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de
maíz tiernos usando una concentración de teliosporas 1:2 (agua-teliosporas). A) Día cero
de inoculación, se observa una pequeña porción negra en el sitio de inoculación de las
teliosporas, B) Granos después de una semana de inoculación con teliosporas, C) Se observan
tres granos germinando después de dos semanas de inoculación con teliosporas y D) Se
observan los tres granos con su coleoptilo de mayor tamaño después de tres semanas de
inoculación con teliosporas, pero todos los granos con evidente estado de descomposición.
A) Día 0 C) Semana 2 D) Semana 3 B) Semana 1
A) Día 0 C) Semana 2 D) Semana 3 B) Semana 1
A) Día 0 C) Semana 2 D) Semana 3 B) Semana 1
36
Figura 13. Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de maíz
tiernos usando una concentración de teliosporas 1:1.5 (agua-teliosporas). A) Día cero de
inoculación, se observa una pequeña porción negra en el sitio de inoculación de las teliosporas, B)
Granos después de una semana de inoculación con teliosporas, C) Se observa un grano
germinando después de dos semanas de inoculación con teliosporas, los demás en estado de
descomposición y D) solo un grano germino después de tres semanas de inoculación con
teliosporas, todos los granos con evidente estado de descomposición.
6.1.3 Inoculación de mazorcas jóvenes y sanas de maíz con suspensión de
teliosporas de Ustilago maydis
Se evaluó la capacidad de producir infección en mazorcas tiernas con el uso de
teliosporas de Ustilago maydis, obteniendo una masa de teliosporas y preparando
diferentes diluciones (1:3, 1:2 y 1:1.5) de un concentrado de teliosporas más agua
potable (V:V), inoculando 1mL de cada dilución en la base de las mazorcas jóvenes,
otra mazorca fue usada como control negativo a la cual se le inyecto 1mL de agua
potable, a las mazorcas no se les deshojo para protegerlas de infecciones no deseadas,
estas mazorcas se colocaron en un recipiente con volumen de agua constante para
hidratar a las mazorcas y se cubrió con una malla para evitar la entrada de insectos
pero que se mantuvieran ventilados y se incubo a temperatura ambiente (imagen A,
Figura 14), a la tercera semanas se revisaron las mazorcas, retirando las hojas que
protegían a los granos, dichas hojas presentaban clorosis (imagen B, Figura 14), en la
zona de inoculación solo se observó un ligero estado de descomposición en la mazorca
inoculada con la dilución (1:1.5) el resto de las mazorcas en el sitio de inoculación no
presentaron cambios, solo en la porción apical de la mazorca se observó un estado de
descomposición en todas las mazorcas como se puede apreciar en la Figura 15.
A. Día 0 C. Semana 2 D. Semana 3 B. Semana 1
37
B
D) Control Negativo E) Dil. 1:3 F) Dil. 1:2 G) Dil. 1:1.5
A
Figura 14. Mazorcas usadas para evaluar el efecto de las teliosporas de Ustilago maydis. A)
Mazorcas en un recipiente humedecido con agua potable para mantenerlas hidratadas y cubiertas
por sus hojas para protegerlas de infecciones no deseadas y B) Una de las mazorcas inoculadas
con teliosporas con las hojas cloróticas a la tercera semana de incubación.
Figura 15. Efecto de teliosporas de Ustilago maydis sobre mazorcas jóvenes de maíz. D)
Control negativo, E) Mazorca inoculada dilución 1:3 de las teliosporas, F) Mazorca inoculada
dilución 1:2 de las teliosporas y G) Mazorca inoculada dilución 1:1.5 de las teliosporas. Se aprecia
un estado de descomposición en la porción más distal del sitio de inoculación señalas por las
flechas tanto en el control negativo como en las inoculadas con las diluciones 1:3, 1:2 y 1:1.5 de
las teliosporas. Solo la mazorca inoculada con la dilución 1:5 presenta un ligero estado de
descomposición en la base (zona de inoculación).
38
6.1.4 Aspersión de teliosporas de Ustilago maydis sobre granos de maíz
germinando
Al dejar actuar las teliosporas sobre plántulas de maíz, transcurridas cuatro semanas
de contacto las plántulas comenzaron a presentar evidencia de clorosis y a las cinco
semanas necrosis y muerte (Figura 16), en la sexta semana todas las plántulas
murieron.
Figura 16. Efecto de la exposición con teliosporas de Ustilago maydis sobre granos de maíz
germinando después de cuatro semanas. Se observan hojas necróticas y el tallo clorótico en
plántulas de maíz, después de cinco semanas de ser expuestas a una suspensión de teliosporas.
6.2 Obtención de un concentrado de teliosporas puras de Ustilago maydis
Se evaluó un método para lograr obtener un concentrado de teliosporas libres de
tejido vegetal aplicando un gradiente de concentración con diferentes concentraciones
de NaCl partiendo de una concentración de 0.85%, luego una de 1%, 1.5%, 2% y
aumentando gradualmente la concentración en 0.5%, hasta una concentración del 30%
de NaCl, después de aplicar la solución de NaCl se centrifugó y se observaron tres
fases (fondo con las teliosporas, centro una solución acuosa y la superficie con el tejido
vegetal) como se muestra en la Figura 17, este gradiente al mismo tiempo tenía como
39
objetivo eliminar la microbiota bacteriana asociada que pudiera estar presente para
obtener teliosporas puras.
Figura 17. Separación de teliosporas por el efecto del gradiente de concentración con NaCl.
A) Suspensión de teliosporas al 8% de NaCl, B) Suspensión de teliosporas al 10% de NaCl, S)
Superficie con restos de tejido vegetal, M) Medio con solución acuosa y F) Fondo concentrado de
teliosporas.
A B
S
M
F F
M
S
40
En la Tabla 11 se observan los resultados de la separación de los restos de tejido
vegetal usando las concentraciones 0.85%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 5%,
6%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25% y 30% de NaCl, marcando con un signo negativo (-)
aquellas que no lograron separar los restos vegetales de la suspensión de teliosporas y
con un signo positivo (+) las que sí lograron separa los restos vegetales de la
suspensión de teliosporas, la cantidad de signos positivos (+) es proporcional a la
concentración de tejido vegetal separado de la suspensión, por lo tanto, a mayor
cantidad de signos positivos mayor cantidad de tejido vegetal separado, esta cantidad
de tejido vegetal separado se media en volumen al ocupar tubos para centrifuga
graduados. Se aprecia que a una concentración de 4% de NaCl se logró separa el
tejido vegetal y a la concentración de 6% de NaCl fue mayor la concentración de tejido
vegetal separado, a medida que aumentaba la concentración de NaCl no solo el tejido
vegetal se iba a la superficie también las teliosporas, este efecto se hizo evidente a la
concentración de 10% de NaCl como se observa en la Figura 17.
Tabla 11. Resultados del gradiente de concentración con NaCl en
suspensión de teliosporas de Ustilago maydis
Concentración
de NaCl
0.85% 1% 1.5 % 2% 2.5% 3% 3.5% 4% 5%
Resultado de
separación
- - - - - - - + +
Concentración
de NaCl
6% 8% 10% 15% 20% 15% 20% 25% 30%
Resultado de
separación
+++ +++ +++* +++* +++* +++* +++* +++* +++
*
(-): sin efecto en la separación de los desechos de tejido vegetal y las teliosporas; (+): efecto positivo en la
separación de los desechos de teliosporas y restos de tejido vegetal;* las teliosporas se quedaron en la superficie.
De cada suspensión de teliosporas con las diferentes concentraciones de NaCl se
tomó una alícuota y se colocaba entre portaobjetos y cubreobjetos realizando la
observación al microscopio en la Figura 18 se observan teliosporas de Ustilago maydis
características por su pigmento café, su ornamentación crenada señalada por la flecha
en la letra (B) y su doble pared señalada por la flecha con la letra (A), cabe destacar
que en todas las diferentes concentraciones de NaCl no se observó destrucción de las
teliosporas, solo malformación debidas al cambio de turgencia de las teliosporas en las
concentraciones salinas por arriba del 20% por lo tanto se evaluaría la viabilidad de
estas al sembrar en medio líquido y sólido de extracto de maíz.
41
Figura 18. Morfología microscópica de teliosporas de Ustilago maydis. Se observan las
teliosporas pigmentadas observadas a (100X). A) Señala la doble pared y B) Señala la
ornamentación espiculada.
6.2.1 Determinación de la viabilidad de teliosporas de Ustilago maydis
Después del tratamiento al que fueron expuestas las teliosporas por el gradiente con
las diferentes concentraciones de NaCl para su separación y purificación, se tenía que
evaluar si las teliosporas al pasar por el estrés osmótico aun eran viables, así es que se
procedió a confirmarlo sembrando las teliosporas en medio extracto de maíz, utilizando
extracto de maíz ya que es el sustrato natural de este hongo.
6.2.1.1 Prueba en medio líquido y sólido de extracto de maíz
Se determinó la viabilidad de las teliosporas usando medio extracto de maíz líquido y
sólido y se compararon las condiciones óptimas de temperatura y tiempo para su
germinación. Solo se observó desarrollo con las teliosporas tratadas con 4% de NaCl,
mientras que las tratadas con 30% NaCl no tuvieron desarrollo. Los resultados se
muestran en la Tabla 12, donde se puede apreciar que en el medio líquido y en el
medio sólido germinaron las teliosporas a 37ºC, mientras que a 27ºC no se observó
crecimiento, en el medio sólido el crecimiento se hizo evidente a las 72 horas con el
desarrollo de colonias, mientras que en el medio líquido se observó crecimiento hasta
las 96 horas evidenciado al tomar alícuotas cada 24 horas para realizar observaciones
microscópicas.
A
B
42
Tabla 12. Resultados de la germinación de las teliosporas puras
Ustilago maydis obtenidas, inoculadas en medio extracto de maíz
Medio de
cultivo
Agar extracto de maíz Medio líquido extracto de
maíz
Temperatura 27°C 37°C 27°C 37°C
Tiempo de
crecimiento y
germinación
- +
72 horas
- +
96 horas
(-) sin crecimiento; (+) con crecimiento
Al tubo incubado a 27ºC y al incubado a 37ºC se le realizaron revisiones periódicas,
cada 24 horas se tomaban alícuotas para ser observadas al microscopio, colocando
una gota del medio inoculado más una gota de azul de metileno entre portaobjetos y
cubreobjetos, se observó que solo el tubo incubado a 37ºC presento crecimiento a las
96 horas de incubación.
En la Figura 19 se muestran teliosporas germinando del medio líquido de extracto de
maíz a las 96 horas de incubación vistas al microscopio, las flechas en la imagen A y B
señalan basidios gemando de las teliosporas a un aumento de (40X).
Igualmente se observa una preparación de una alícuota tomada del medio líquido de
extracto maíz inoculado con teliosporas incubada por 120 horas a 37°C en la Figura 20,
donde se aprecian basidiosporas dividiéndose formando pseudomicelio teñido con azul
de metileno observado a (100X).
Figura 19. Germinación de teliosporas de Ustilago maydis. Observaciones del concentrado de
teliosporas incubado a 37°C en medio líquido extracto de maíz por 72 horas, preparaciones teñidas
con azul de metileno; A) se observa un conjunto de teliosporas y las flechas señalan la
germinación de estas a (40X) y B) se observa una teliosporas al centro germinando una de ellas a
(40X).
A B
43
Figura 20. Basidiosporas de Ustilago maydis en división. Basidiosporas dividiéndose teñidas
con azul de metileno vista a inmersión, se encuentran formando pseudomicelio después de 120
horas de incubación a 37°C.
6.3 Aislamiento de una cepa pura de la fase de basidiosporas de Ustilago maydis
en agar extracto de maíz
Para la obtención de una cepa pura de la fase de basidiosporas de Ustilago maydis
se realizó seleccionando solo las colonias con morfología levaduriforme, evaluando tres
cepas levaduriformes para determinar si tenían la capacidad de producir la infección
característica de Ustilago maydis en plántulas de maíz de un mes de desarrollo.
Por lo tanto, después de 96 horas en las placas de agar extracto de maíz donde se
observó el crecimiento de colonias con aspecto de levadura se les realizó la
observación macroscópica y microscópica, descartando las colonias con crecimiento
micelial y las colonias bacterianas.
Se continuó trabajando solo con las colonias levaduriformes, a estas colonias
obtenidas se les realizó observación microscopia a (40X) tomado una asada de cada
colonia y se observaron en fresco agregando una gota de azul de metileno, en la Figura
21 se observan levaduras en forma ovalada (imagen A) y levaduras polimórficas
(imagen B), en la Figura 22 se observan células alargadas con artefactos refringentes
en su citoplasma, cada una de estas se resembraron por estría cruzada en placas de
agar extracto de maíz para generar biomasa y ocuparlas en experimentos posteriores.
44
B A
Figura 21. Colonias levaduriformes evaluadas, presuntivas de basidiosporas de Ustilago
maydis. A) Primera colonia levaduriforme evaluada con células en forma ovalada observadas al
microscopio a (40X) y B) Segunda colonia levaduriforme evaluada se observan células polimórficas
al microscopio a (40X).
Figura 22. Colonia levaduriforme evaluada, presuntiva de basidiosporas de Ustilago maydis.
Se observa la preparación al microscopio de la tercera colonia levaduriforme seleccionada teñida
con azul de metileno, con células alargadas y en su citoplasma se observan artefactos refringentes
a (40X).
Posterior a la selección de las colonias levaduriformes se tomaron cinco colonias de
cada cepa y se resuspendieron en 5mL de solución fisiológica, cada una de las colonias
45
A B C
en tubos diferentes, se tomó 1mL de cada suspensión de células y se inoculó por
inyección a plantas de maíz de un mes de desarrollo, hasta observar algún cambio
sobre las plantas, dos semanas después de la exposición en la planta inoculada con la
cepa número tres (Figura 23) se señalada con una flecha la zona hipertrófica en el sitio
de inoculación (imagen A), también se muestra una planta a las tres semanas de la
explosión donde se aprecia la planta con una malformación severa con el tallo doblado
(imagen B), en dicha zona se realizó un corte y se observó al microscopio a (40X) en
donde se aprecia la presencia de teliosporas (imagen C) confirmando con esto la
obtención de la cepa de Ustilago maydis.
Se logró completar el ciclo de vida del hongo Ustilago maydis al obtener un
concentrado de teliosporas puras y viables, capaces de germinar y producir
basidiosporas infectivas para plantas de maíz (Figura 24), donde se observan las
teliosporas obtenidas por el método de purificación usando un gradiente de
concentración del 4% de NaCl (imagen A), dichas teliosporas germinaron en medio
líquido de extracto de maíz (imagen B), y en medio agar extracto de maíz obteniendo
basidiosporas (imagen C), al ser pasadas a medio liquido de extracto de maíz se
observó división de las basidiosporas formando pseudomicelio (imagen D), la biomasa
de basidiosporas generada fue usada para inocular plántulas de maíz (imagen E),
después de dos semanas de exposición al inóculo de basidiosporas se aprecia una
zona hipertrófica en la planta de maíz (imagen F), tres semanas después de la
exposición al inóculo con basidiosporas la planta de maíz presento un notable daño al
tallo el cual se encuentra malformado debido a la hipertrofia (imagen G) a dicho sitio se
le realizaron cortes los cuales fueron observados al microscopio encontrando
teliosporas (imagen H), con esto se logró confirmar que la colonia usada para infectar a
la plántula era una cepa de Ustilago maydis.
Figura 23. Efecto de las basidiosporas de Ustilago maydis sobre plantas de maíz. Se evaluó
la cepa levaduriforme número tres sobre una planta de maíz con un mes de desarrollo, A)
Corresponde al efecto producido después de dos semanas de exposición, la flecha señala una
zona hipertrófica en el sitio de inoculación, B) corresponde al efecto producido después de tres
semanas de exposición la flecha señala la zona hipertrófica que produjo malformación severa de la
planta y C) Donde se observan teliosporas en un corte de tejido afectado de la planta de maíz.
46
Figura 24. Ciclo de vida de Ustilago maydis detectado experimentalmente bajo este
protocolo. A) Teliosporas purificadas, B) Teliosporas germinando en medio liquido extracto de
maíz, C) Basidiosporas en medio sólido extracto de maíz, D) Basidiosporas con pseudomicelio en
medio líquido de extracto de maíz, E) Plantas de maíz de un mes, F) Zona hipertrófica y G) Tallo
atrofiado, H) Teliosporas en corte de hoja de maíz.
A
B
C
D
E
F
G
H
47
A B C
6.4 Determinación de la infectividad de los estadios de Ustilago maydis sobre
plántulas de maíz
Se determinó que estadio del hongo Ustilago maydis produce los mejores resultados
en infección en plantas de maíz, comparando si existe diferencia entre una cepa de
basidiosporas y una mezcla de cepas de basidiosporas, así como comparar la fase de
teliosporas inoculando plantas de un mes de desarrollo con 1mL de las suspensiones
preparadas.
Las colonias de basidiosporas seleccionadas se observan en las placas de agar
extracto de maíz (Figura 25), la suspensión de basidiosporas de la misma cepa se
realizó tomando seis colonias con aspecto levaduriforme (imagen A),
microscópicamente se aprecian basidiosporas alargadas teñidas con azul de metileno
(imagen A, Figura 26), la suspensión de basidiosporas de diferente cepa se realizó
tomando seis colonias de placas diferentes dos colonias fueron tomadas de las dos
placas observadas en las (imágenes B y C, Figura 25) las colonia tomadas de estas
placas señaladas por las flechas son crateriformes y con pseudomicelio también
observadas al microscopio en donde se aprecia la presencia de pseudomicelio (imagen
B, Figura 26).
Figura 25. Placas de agar extracto de maíz con crecimiento de colonias de basidiosporas de
Ustilago maydis. A) Placa de agar extracto de maíz con colonias levaduriformes de basidiosporas
de Ustilago maydis. B) Placa de agar extracto de maíz con colonias cerebriformes de
basidiosporas de Ustilago maydis. C) Placa de agar extracto de maíz con colonias pigmentadas
con pseudomicelio de basidiosporas de Ustilago maydis.
48
A B
Figura 26. Basidiosporas de Ustilago maydis teñidas con azul de metileno. A) basidiosporas
unicelulares. B) Basidiosporas dividiéndose formando pseudomicelio señaladas por las flechas.
En la Figura 27 se observan las plantas inoculadas, en la planta inoculada con la
suspensión de teliosporas se observa que la zona del tallo donde se realizó la
inoculación ya se ha marchitado (imagen A), la planta inoculada con la suspensión de
seis colonias de basidiosporas de la misma cepa se encuentra de menor tamaño y
marchita, en el sitio de inoculación se observa un ligero estado de hipertrofia señalado
por la flecha (imagen B), la planta inoculada con la mezcla de seis cepas de
basidiosporas de diferentes placas se observa completamente marchita y en el sitio de
inoculación una agalla prominente señalado con la flecha (imagen C).
Figura 27. Efecto de las fase teliosporas y basidiosporas de Ustilago maydis sobre plantas
de maíz. Se observa el efecto producido por cada uno de los concentrados de las fases de
Ustilago maydis después de un mes de la inoculación. A) corresponde a la planta inoculada con el
concentrado de teliosporas, donde las hojas más viejas señaladas con la flecha se observan
marchitas y cloróticas, B) Corresponde a la planta inoculada con una suspensión de una sola cepa
de basidiosporas, donde se observa que las zonas de las hojas más viejas se encuentran
necróticas, cloróticas y de menor tamaño a la primera y C) Corresponde a la planta inoculada con
la mezcla de las seis cepas de basidiosporas, donde se observa la plántula completamente
marchita y en la sitio de inoculación hipertrofia.
A B C
49
6.5 Comparación y selección del medio de cultivo adecuado para la propagación
del hongo de la cepa comprobada de Ustilago maydis
Se comparó el crecimiento de la fase de basidiospora de Ustilago maydis en los
medios de cultivo líquido y sólido a partir de partir de extracto de papa y extracto de
maíz.
6.5.1 Evaluación del crecimiento en medio sólido
En la Tabla 13 se observan los resultados obtenidos del crecimiento en los medios
sólidos sembrados por publicado, se calculó el promedio y se obtuvo que en el agar
extracto de maíz el crecimiento fue de 6 UFC/mL y en el agar extracto de papa el
crecimiento fue de 20 UFC/mL (Figura 28), se observan mayor crecimiento en el medio
agar extracto de papa (imagen B) y un menor desarrollo en el medio agar extracto de
maíz (imagen A).
Tabla 13. Resultados del crecimiento en medio sólido extracto de
maíz y extracto de papa
Medio de cultivo Agar extracto de maíz Agar extracto de papa
UFC/mL 6 20
Figura 28. Colonias de Ustilago maydis en medio de cultivo sólido. Se muestra el desarrollo
de las colonias de basidiosporas de Ustilago maydis después de 72 horas de incubación a 37°C.
A) Corresponde al medio agar extracto de maíz donde se observa clara mente menor crecimiento y
B) Corresponde al medio agar extracto de papa donde se observa una mayor cantidad de colonias.
6.5.2 Evaluación del crecimiento en medio líquido
A B
50
Para la determinación del crecimiento de basidiosporas en medio líquido se realizó el
conteo celular con ayuda de una cámara de Neubauer, evaluando el medio líquido
extracto de maíz y el medio líquido extracto de papa, cada medio líquido se diluyo con
solución fisiológica al doble teniendo un medio concentrado un medio diluido 1:1 (V:V) y
un medio diluido 1:3 (V:V) de cada uno, encontrando que el mayor crecimiento celular
se presentó en el medio extracto de maíz diluido 1:1 con 1.28x107 basidiosporas por
mililitro, seguido por el medio líquido extracto de maíz concentrado con 4.22x106
basidiosporas/mL, el medio que presento menor crecimiento fue el medio líquido
extracto de maíz diluido 1:3 con 8.4x105 basidiosporas/mL (Figura 29).
Figura 29. Comparando la generación de basidiosporas de Ustilago maydis en dos
diferentes medios líquidos. Se comparó el crecimiento en medio líquido extracto de maíz
representado con las barras azules y el crecimiento en medio líquido extracto de papa
representado con barras naranjas a diferentes concentraciones de los medios. Se observa que el
mayor desarrollo se presentó en el medio líquido extracto de maíz diluido 1:1, y el menor desarrollo
se presentó en el medio líquido extracto de maíz diluido 1:3.
0.0E+00
2.0E+06
4.0E+06
6.0E+06
8.0E+06
1.0E+07
1.2E+07
1.4E+07
Basid
iosp
ora
s/m
L
Concentración del medio
Medio líquido extracto de maíz
Medio líquido extracto de papa
Concentrado 1:1 1:3
4.22x106
1.21x106
8.40x105
2.20x106
3.12x106
1.28x107
51
En la Figura 30 se aprecian las basidiosporas de Ustilago maydis contadas al
microscopio en cámara de Neubauer a un aumento de (40X) para realizar el cálculo de
basidiosporas/mL, se señalas las basidiosporas con flechas.
Figura 30. Basidiosporas de Ustilago maydis observadas en cámara de Neubauer.
Observación al microscopio en cámara de Neubauer a (40X) de las basidiosporas de Ustilago
maydis las flechas señalan las formas levaduriformes en un cuadrante de la cámara.
6.6 Inoculación a plantas adultas de maíz con la fase de basidiosporas de
Ustilago maydis
Se prepararon los inóculos a partir del medio de cultivo líquido con extracto de maíz
dilución 1:1 (V:V) (Concentración de harina de maíz del 20% y de sacarosa del 0.25%)
incubado por 96 horas, se tomó una alícuota de este medio de cultivo y se le realizó el
conteo celular al microscopio en cámara de Neubauer encontrando que se tenían 6x105
basidiosporas/mL del medio. Posteriormente, se realizaron diluciones para obtener las
concentraciones de 6x104 basidiosporas/mL y 6x103 basidiosporas/mL, teniendo un
volumen final de 10mL de cada concentrado de basidiosporas.
Se tomaron 3mL de cada concentrado de basidiosporas en jeringas hipodérmicas
para inocular el jilote de plantas adultas de maíz en estadio R1 (una a dos semanas
después de la salida del estigma del jilote) fueron sembradas en macetas de un
volumen de 20Lt (0=0.02m3) con suelo de cultivo de maíz de la localidad de San
Francisco Chimalpa, Naucalpan, Edo. de México (Figura 31), tres plantas fueron
52
inoculadas con la concentración de 6x105 basidiosporas/mL (imagen 1B), tres con la
concentración de 6x104 basidiosporas/mL (imagen 2B) y otras tres con la concentración
de 6x103 basidiosporas/mL (imagen 3B).
Figura 31. Jilotes de maíz antes de ser inoculados con basidiosporas de Ustilago maydis.
1B). Jilote antes de ser inoculado con una suspensión de 6x105 basidiosporas/ml, 2B) Jilote antes
de ser inoculado con una suspensión de 6x104 basidiosporas/ml y 3B) Jilote antes de ser inoculado
con una suspensión de 6x103 basidiosporas/ml.
A los 24 días de inoculación se retiraron las hojas que protegían a la mazorca de
prueba se encontró únicamente efecto sobre las mazorcas inoculadas con una
concentración de 6x105 basidiosporas/mL (Figura 32) se aprecia una zona negra
(imagen A) a la cual se le realizó un corte para confirmar la presencia del hongo,
observando en fresco de micelio con azul de metileno (imagen B).
Figura 32. Efecto de la inoculación por inyección de basidiosporas de Ustilago maydis en
jilotes de maíz. A) Mazorca después de 24 días de inoculación con concentrado de 6x105
basidiosporas/mL, la flecha señala la zona afectada por el hongo y B) Micelio del hongo tenido con
azul de metileno.
A B
53
La prueba anterior no fue tan representativa como se esperaba esto por factores
ambientales que afectaron el desarrollo de la planta de maíz por la temporada del año
de siembra (como temperatura y humedad relativa), así como la calidad del suelo de
cultivo, pero se demostró la infección en una de las mazorcas infectadas, por lo cual se
procedió a realizar una nueva prueba en plantas de maíz de la misma localidad usando
suelo de compostaje.
Se tomó una alícuota de 0.1mL del concentrado de teliosporas tratadas con el
gradiente de concentración de NaCl conservado a 4°C y se sembró en placa en agar
extracto de papa incubando a 37°C por 72 horas (Figura 33) las colonias presentaban
un aspecto crateriforme (imagen A), se seleccionaron cuatro colonias con evidencia de
pseudomicelio (imagen B) para resembrarlas en medio líquido de extracto de maíz.
Figura 33. Crecimiento de basidiosporas de Ustilago maydis en agar extracto de papa. A)
Colonias cerebriformes con crecimiento pseudomicelial y B) Basidiosporas formando
pseudomicelio tenidas con azul de metileno observadas aun aumento de (40X).
Las colonias seleccionadas se sembraron en medio líquido extracto de maíz a 37°C
por 72 horas, tomado una alícuota para observar el crecimiento observando abundantes
basidiosporas en división formando pseudomicelio (Figura 34), después de confirmar la
pureza y calidad del inoculo del medio de cultivo líquido se procedió a realizar el conteo
de las UFC/mL por dispersión con varilla acodada en medio agar almidón, obteniendo
un conteo de 2x106 UFC/mL con esto se obtuvo un conteo de las células viables
capaces de producir la infección, se inyectaron 3mL de la suspensión de basidiosporas
de Ustilago maydis en el jilote de una planta adulta de maíz en estadio R1(11 días
después de la salida de los estigmas del jilote) y a la cuarta semana se realizó la
A B
54
observación de la mazorca de maíz encontrando las agallas típicas del huitlacoche
(Figura 35).
Figura 34. Basidiosporas de Ustilago maydis. Se observan abundantes basidiosporas
dividiéndose y formando pseudomicelio en medio líquido de extracto de maíz.
Figura 35. Mazorca de maíz con huitlacoche. Se observa la infección característica de Ustilago
maydis sobre una mazorca de maíz formando agallas grisáceas.
55
7. DISCUSIÓN
El objetivo de este trabajo fue desarrollar un protocolo que permitiera la producción
de huitlacoche a bajo costo y con algunas condiciones controladas en maíz criollos de
la localidad de San Francisco Chimalpa, Naucalpan, Edo. de México, los parámetros
que lograron manipularse fueron la fase del hongo, el estadio de desarrollo del maíz
más susceptible a la infección así como la concentración de inóculo óptima para
producir el huitlacoche y la vía de inoculación de la planta de maíz.
La primer pregunta que nos realizamos fue ¿se podrá producir la infección con
Ustilago maydis y como tal la forma conocida como huitlacoche a partir de granos
jóvenes de maíz, sin la necesidad de infectar la etapa adulta del maíz?, esto conllevaría
a economizar en tiempo y costos de producción, ya que se reduciría el tiempo, no se
tendría la necesidad de esperar el tiempo necesario para que crecieran las plantas de
maíz, tampoco se tendría la necesidad de mantener en condiciones óptimas toda la
planta, con esta pregunta se realizó la primer metodología en la cual se mezcló un
concentrado de teliosporas con granos jóvenes de maíz, realizando observaciones
periódicas donde el criterio a evaluar fue si se producida la infección típica en el maíz
ocasionada por Ustilago maydis con aumento en el volumen de los granos y la
formación de una masa negra de teliosporas, pero conforme transcurrían los día solo se
observaba un evidente estado de descomposición de los granos de maíz los que
demuestra la necesidad imperiosa de la implantación del hongo sobre la planta viva,
quedando como evidencia la necesidad de aislar y purificar al agente etiológico y se
continuo con ensayos más refinados donde se usó un concentrado de teliosporas en
cual se diluyó en 1:3, 1:2 y 1:1.5 inoculando granos jóvenes de maíz manteniéndolos en
cámara húmeda en caja Petri aislados de un ambiente externo que pudiera producir
contaminación.
Pero al igual que el procedimiento anterior no se observó evidencia de la infección
característica de Ustilago maydis pero se logró observar que a medida que aumenta la
concentración de las teliosporas inoculadas disminuía la capacidad de germinación de
los granos de maíz, por lo tanto se comprobó que a etapas tempranas de desarrollo del
maíz las teliosporas de Ustilago maydis tiene un efecto letal sobre la germinación.
El mismo procedimiento de inoculación con diferentes diluciones del concentrado de
teliosporas se extrapolo aplicándolo en mazorcas desarrolladas y observar el efecto de
las teliosporas sobre las mazorcas sin retirar las hojas que protegen a la mazorca de
microorganismos no deseados y evitar el efecto de descomposición observado en las
pruebas anteriores, pero al término de la evaluación de este procedimiento no se
observó ningún efecto esperado como hipertrofia e hiperplasia o que se generara una
masa de teliosporas negras, tan solo se observó un estado de descomposición en el
ápice y la base de la mazorca inoculada con el suspensión de teliosporas diluida 1:5
(Figura 15), esto nos demuestra que la infección de Ustilago maydis requiere de
condiciones específicas para poderse manifestar con las características que las
56
distinguen y que no en cualquier etapa o estadio de crecimiento de la planta de maíz
esta infección se puede implantar.
Se evaluó otro método de infección de maíz utilizando una suspensión de teliosporas
donde se sumergieron granos germinando, encontrando que a medida que crecía la
plántula se presentaban zonas de clorosis y necrosis y a las seis semanas del contacto
con las teliosporas todas las plantas jóvenes murieron por lo tanto esto demuestra que
aun en granos germinados la infección por Ustilago maydis causa el mismo daño que
en el caso anterior confirmando que en etapas tempranas del crecimiento del maíz este
hongo resulta nocivo para la planta.
Por lo anterior, se procedió a la obtención de un concentrado de teliosporas por
medio de un macerado de granos infectados con Ustilago maydis, limpiando y
desinfectando con hipoclorito de sodio al 1% y purificando las teliosporas, utilizando un
gradiente de concentración de NaCl logrando obtener solo teliosporas libres de restos
vegetales y con ayuda de una solucion al 1% de CuSO4 como agente bactericida igual
al usado por Moncada en el 2014 se eliminó la microbiota asociada, encontrando que la
concentración a partir de la cual se lograron separar los restos vegetales fue al 4% de
NaCl y a la concentración de 6% de NaCl fue mayor la concentración de tejido vegetal
separado, a medida que aumentaba la concentración de NaCl no solo el tejido vegetal
se mantenía en la superficie sino también las teliosporas, este efecto se hizo más
evidente a la concentración del 10% de NaCl, se evaluó la viabilidad de las teliosporas
después de este tratamiento donde se compararon las teliosporas tratadas con NaCl al
4% y con 30% de NaCl, donde solo se obtuvo germinación de teliosporas en medio
líquido extracto de maíz y agar extracto de maíz con el tratamiento al 4% de NaCl, en
tanto con el tratamiento usando NaCl al 30% no se logró observar germinación en
medio líquido extracto de maíz de las teliosporas tampoco su desarrollo en agar
extracto de maíz. Al evaluar la viabilidad de las teliosporas se determinaron las
condiciones óptimas de incubación, donde la temperatura optima de desarrollo y
germinación de las teliosporas en medio líquido extracto de maíz fue después de 96
horas a 37°C y en agar extracto de maíz se comenzó a observar crecimiento a las 72
horas a 37°C, sin observar desarrollo ni germinación de las teliosporas en los medios
incubados a 27°C por lo tanto la germinación se da a 37°C y con este dato se comenzó
a trabajar en los siguientes procedimientos.
Para confirmar que las colonias obtenidas eran realmente de Ustilago maydis, se
tuvieron que comparar las cepas aisladas con características levaduriformes, al
obtenerlas por estría cruzada en agar extracto de maíz y así obtener colonias aisladas y
de fácil obtención de la siguiente fase del hongo Ustilago maydis la basidiospora, se
consideraron los postulados de Koch para lograr la confirmación de la cepa, se obtuvo
la fase de resistencia del hongo logrando aislar formas levaduriformes presuntivas de la
fase de basidiospora, inoculando plantas sanas jóvenes, y volviendo a aislar la fase de
resistencia (teliosporas), con esto se confirmaba la identidad de la cepa y la infectividad,
esto por carecer de una cepa tipo de Ustilago maydis para su comparación.
57
Al lograr obtener la cepa de la fase de basidiospora de Ustilago maydis, se tenía que
evaluar con cuál de las dos fase se lograba una eficiente infección, así es que se
comparó inoculando en plantas de maíz en estadio V5 (Tabla 4) la fase de teliospora y
la fase de basidiospora, logrando observar mejores resultados al inocular la fase de
basidiospora obteniendo una zona tumoral donde se encontraba una masa de
teliosporas nuevamente (imagen B, Figura 27), mientras que al inocular la fase de
teliospora solo se observaba clorosis y necrosis en las planta (imagen A, Figura 27),
confirmando lo que había encontrado Leal en 1996 y Cota en 2004, contrario a lo que
encontró Esclante en el 2013. De igual forma se comparó la combinación de cepas para
observar el efecto infectante sobre las plantas, esto ya que Ruiz en el 2008 cita la
necesidad que una basidiospora debe estar en contacto con su par sexual compatible
para que forme un micelio dicariótico y penetre al tejido del hospedero originando así la
infección, por lo tanto se comparó inoculando tres plantas de maíz con una solo colonia
y otras tres plantas con una combinación de 6 colonias, al final de esta prueba se
observó que al inocularse la combinación de 6 cepas se obtenía una zona hipertrófica
en el lugar de la lesión y una masa de teliosporas en la misma (imagen C, Figura 27),
mientas que al inocular con una sola colonia se observaban zonas cloróticas en el lugar
de la lesión y zonas necróticas en las zonas de las hojas más maduras de las plantas
con una ligera hipertrofia no tan marcada como la anterior (imagen B, Figura 27). Por lo
tanto la combinación de cepas resulto más eficiente para inducir la infección, al producir
una agalla y una masa de teliosporas abundante y con un efecto letal sobre las plantas
jóvenes en estadios V5 de maíz (Figura 27), mientras que con la fase de teliospora no
se logró observar los efectos de interés, como son la agalla y obtener nuevamente
teliosporas, de igual forma no se observó este efecto al inocular una sola colonia de
basiodiosporas, confirmando lo que describió Cota en el 2004 con el uso de cepas
sexualmente compatibles.
Las colonias confirmadas de Ustilago maydis crecidas en medio agar extracto de
maíz eran color crema y tomaban una coloración café conforme envejece el cultivo, son
circulares, con bordes enteros, convexas, con superficie lisa, y de aspecto húmedo con
consistencia suave (imagen A, Figura 25), con una morfología microscópica
levaduriforme con cuerpos refringentes como se muestra en la Figura 22 se tiene la
hipótesis que estas colonias son haploides. Las colonias apareadas con su par sexual
compatible presentaban una morfología microscópica con el mismo tipo de levaduras
refringentes pero formadoras de pseudomicelio (imagen B, Figura 26) presentaban una
coloración crema, circulares, con bordes filamentosos, con elevación crateriforme y
superficie rugosa con aspecto seco y consistencia suave (imagen B y C, Figura 25).
Se comprobando que es más eficiente la infección con la fase de basidiospora y es
más fácil obtenerla por un cultivo en medio sólido y/o líquido, en comparación con la
fase de teliosporas que necesitan un método físico-químico, es indispensable aplicar
este método de separación para obtener las teliosporas puras y poder realizar su cultivo
y obtener a las basidiosporas y con ello lograr inóculos eficientes para la infección de
58
Ustilago maydis y producción del huitlacoche. Por lo tanto, la fase de interés para
infectar a las plantas de maíz son las basidiosporas, por lo que se procedió a comparar
medios de cultivo con los cuales se obtendría una mayor cantidad de biomasa de
basidiosporas, primero evaluando que medio de cultivo sólido presentaba mayor
crecimiento de las basidiosporas al inocular 1mL de medio líquido crecido por 24 horas
a placas de agar extracto de maíz y agar de extracto de papa, encontrando que se
obtiene mayor desarrollo en agar extracto de papa al tener un desarrollo de 20 UFC/ml
mientras que en agar extracto de maíz se obtienen 6 UFC/ml como se muestra en la
Figura 28, de igual forma se comparó el medio a base de extracto de maíz y medio a
partir de extracto de papa, cada uno se diluyo en 1:1 y 1:3. determinando en cuál de los
seis diferentes medios líquidos se obtenía el mejor resultado, el cual fue el medios
extracto de maíz diluido 1:1 con 1.28x107 basidiosporas/mL, seguido del medio extracto
de maíz concentrado con 4.22x106 basidiosporas/mL, después el medio extracto de
papa diluido 1:1 con 3.12x106 basidiosporas/mL, luego el medio extracto de papa
diluido 1:3 con 2.2x106 basidiosporas/mL, hasta llegar a los que obtuvieron el menor
desarrollo el extracto de papa concentrado con 1.21x106 basidiosporas/mL y extracto de
maíz diluido 1:3 con 8.4x105 basidiosporas/mL como se muestra en la Figura 29.
Con los datos obtenidos como se menciona anteriormente se prosiguió a generar
biomasa para tener los inóculos y con ellos infectar plantas adultas de maíz en los
jilotes, aplicando inóculo de 6x105, 6x104 y 6x103 basidiosporas/mL, inyectando 1mL
por zona de la mazorca; en la base, en el centro y en el ápice. Después de 24 días se
evaluó la presencia de infección, en donde solo se observó evidencias de la formación
de micelio y algunas teliosporas en la mazorca inoculada con la concentración de 6x105
basidiosporas/mL, mientras que a la concentración de 6X104 y 6x103 basidiosporas/mL
no se logró observar la evidencia de teliosporas, solo un estado de descomposición en
el sitio de inoculación (imagen A, Figura 32).
Los resultados anteriores no fueron tan representativos al no presentase la evidencia
de agallas en la mazorca esto influenciado por factores ambientales que pudieron
afectar el desarrollo de la planta y la calidad del suelo, pero se tenía la evidencia del
crecimiento micelial y producción de teliosporas en la mazorca inoculada, por lo tanto
se procedió a realizar una nueva prueba en plantas de maíz de la misma localidad
usando suelo de compostaje rico en nutrientes, ya que Garibaldi en el 2003 menciona
que los suelos ricos en nitrógeno son propicios para la formación del huitlacoche, por lo
tanto se volvió a generar basidiosporas a partir de las teliosporas obtenidas por el
tratamiento con el gradiente de concentración de NaCl las cuales se habían conservado
en refrigeración, al obtener las colonias de basidiosporas se seleccionaron cuatro
diferentes cepas por sus diferentes características macroscópicas en especial aquellas
que presentaran pseudomicelio, se generó biomasa con estas y un inóculo de 2x106
UFC/mL con las que se inoculó en el jilote de una planta adulta de maíz estadio R1 (11
días después de la salida de los estigmas del jilote), después de cuatro semanas de
59
inoculación se observó la infección típica de Ustilago maydis con la formación de
agallas grisáceas y la presencia de abundaste teliosporas (Figura 35).
60
8. CONCLUSIÓN
Se logró obtener un concentrado puro de teliosporas a partir de una mazorca infectada con Ustilago maydis.
Se comprobó la viabilidad de las teliosporas obtenidas después del tratamiento de purificación.
Se logró obtener la fase de basidiosporas en cultivo puro.
Las condiciones óptimas para generar el inóculo de basidiosporas fueron a 37°C, incubando por 48 horas como mínimo.
El medio de cultivo adecuado para generar el inóculo es agar extracto de maíz diluido 1:1.
Se logró obtener un medio de cultivo económico y eficaz para la generación de biomasa para producir inóculos de basidiosporas.
La vía de inoculación más eficiente para generar la infección típica del maíz con Ustilago maydis para la formación del huitlacoche es por inyección directa en la etapa adulta del maíz etapa R1 (después de una a dos semanas de la salida del estigma del jilote).
La concentración adecuada para generar la infección típica del maíz con Ustilago maydis para la formación del huitlacoche fue con 2x106 basidiosporas/mL.
61
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64
10. ANEXO
10.1 Materiales
10.1.1 Material biológico
Mazorcas de maíz con agallas por infección de Ustilago maydis recolectadas de
un mercado ubicado en Tacuba de la Cuidad de México.
Granos de maíz criollo recolectados de la localidad de San Francisco Chimalpa,
Naucalpan, Edo. de México.
Mazorcas jóvenes de maíz recolectadas de la localidad de San Francisco
Chimalpa, Naucalpan, Edo. de México.
10.1.2 Medios de cultivo
Medio líquido de extracto de maíz (Harina de maíz 40%, Sacarosa 0.5%)
Medio líquido de extracto de papa (Extracto de papa 20%, Sacarosa 0.5%)
Agar extracto de maíz (Harina de maíz 4%, Sacarosa 0.5 %, Agar 2%)
Agar extracto de papa (Extracto de papa 20%, Sacarosa 0.5%, Agar 2%)
10.1.3 Soluciones y reactivos
Agua destilada estéril
Agua corriente
Agua potable
Alcohol al 70%
NaCl
Azul de metileno
CuSO4
Hipoclorito de sodio comercial
(Cloralex)
Jabón líquido comercial (Axión)
10.1.4 Material
Gasas estériles
Algodón
Cinta adhesiva
Diurex
Papel aluminio
Papel Craft
Tijeras para cortar papel
Cerillo
Encendedor
Agujas de disección
Tijeras de disección
Pinzas de disección
Bisturí
Asa bacteriológica
Asa micológica
Mechero Bunsen
Mecheros Fisher
Matraces Enlenmeyer de (50,
100, 250, 500 y 1000/mL)
65
Buretas de (25, 50, 100, 250,
500, 1000 y 2000/mL)
Pipetas Pasteur
Pipetas volumétricas de (1, 5 y
10/mL)
Tubos de ensaye de vidrio
Tubos para centrifuga de plástico
con tapón de rosca
Cubreobjetos
Portaobjetos
Cámara de Neubauer
Cajas Petri de vidrio
Cajas Petri de plástico
Varilla de vidrio
Varilla acodada de vidrio
Espátula
Jeringas hipodérmicas con
agujas de 5 y 10mL
Frascos de vidrio de 250mL con
tapón de rosca
Vasos de plástico de 250mL
Vasos de unisel de 250mL
Macetas con volumen de 20L
Suelo de cultivo de un maíz de la
localidad de San Francisco
Chimalpa, Naucalpan, Edo. de
México.
Suelo de compostaje
10.1.5 Equipo
Campana de flujo laminar
Centrifuga
Incubadora a 37°C
Refrigerador a 4°C
Microscopio óptico
Vórtex
Balanza granataria
Autoclave
Potenciómetro
10.2 Preparación de medios de cultivo
Agar extracto de maíz
Composición
Harina de maíz……....................................….40g
Sacarosa………………...………..…….….……10g
Agar…………………………..…………..………20g
Agua destilada……………………..…….…1000mL
Preparación
Hervir por una hora 40g de harina de maíz en 1L de agua, filtrar con
gasa y agregar sacarosa y agar, ajustando a 1L, esterilizar a 15
libras por 15 minutos.
Agar extracto de papa
Composición
Papas…………..…………………………..…..200g
Sacarosa……………………………..………….10g
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Agar……………………………..………...……..20g
Agua destilada…………………………...…1000mL
Preparación
Hervir por una hora 200 g de papas cortadas en trozos pequeños
en 1L de agua, filtrar con gasa y agregar sacarosa y agar, ajustando
a 1L, esterilizar a 15 libras por 15 minutos.
Medio líquido extracto de maíz “concentrado”
Composición
Harina de maíz………….……………………….40g
Sacarosa……………………………..…….……10g
Agua destilada…………………………...…1000mL
Preparación
Hervir por una hora 40g de harina de maíz en 1L de agua, filtrar con
gasa y agregar sacarosa, ajustando a 1L, esterilizar a 15 libras por
15 minutos.
Medio líquido extracto de papa “concentrado”
Composición
Papas…………………………………..….…..200g
Sacarosa………………………………...….….10g
Agua destilada………………………….…1000mL
Preparación
Hervir por una hora 200 g de papas cortadas en trozos pequeños
en 1L de agua, filtrar con gasa y agregar sacarosa, ajustando a 1L,
esterilizar a 15 libras por 15 minutos.
Medios líquidos diluidos (1:2 y 1:4)
Se obtenían a partir de los medios líquidos concentrados se usando agua
destilada como diluyente.
10.3 Preparación de soluciones reactivas
Solución salina
Composición
Cloruro de sodio (NaCl)……………..…...…0.85g
Agua destilada………………...………..….100mL
Preparación
El NaCl pesado se afora a 100 mL y se disuelve.
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Soluciones salinas (diferentes concentraciones porcentuales)
Composición
Cloruro de sodio (NaCl)……………………...….Xg
Agua destilada………………….………...…..10mL
Preparación
X = a la concentración de NaCl dependiendo del porcentaje de la
solución. El NaCl pesado se aforaba a 10mL y se disuelve.
Solución de sulfato cúprico (CuS04) al 1%
Composición
CuS04…….………………………...…….…...…..1g
Agua destilada...…………………...………..100mL
Preparación
El CuS04 pesado se afora a 100mL y se disuelve.
