LABORATORIO DE CALIDAD NUTRICIONAL

VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS: CASO LOWRY

MÓNICA PIZARRO S.

•

• Es un consorcio de instituciones que aspira reducir la desnutrición y mejorar la seguridad alimentaria nutricional en América Latina y el Caribe.

• AgroSalud trabaja en la investigación de cultivos biofortificados (Maíz, Fríjol, Arróz y Camote).

• En este momento AgroSalud esta en el lanzamiento del primer laboratorio en Sur América, especializado en medir la absorción de hierro, zinc, proteína, y vitamina A, a través de métodos in vitro en alimentos mejorados genéticamente.

• OBJETIVOS

• TÉCNICA ANALÍTICA

• VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO

• ANÁLISIS Y RESULTADOS

• CONCLUSIONES

OBJETIVOSValidar un método analítico para determinar el

contenido de proteína soluble, el cual es un

indicador del grado de biodisponibilidad.

Cuantificar la cantidad de proteína soluble que se

encuentra en muestras de fríjol y maíz.

Alcanzar uno de las primeras metas necesarias

para poder cumplir con las BPL.

TÉCNICA ANALÍTICAR

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALITICO

VALIDAREs verificar documentalmente que un método cumple con los requisitos establecidos.

PARÁMETROS DE VALIDACIÓN* Linealidad * Selectividad

* Precisión * Robustez

* Exactitud * Sensibilidad

PARAMETROS APLICADOS

EXACTITUD

LINEALIDAD

PRECISIÓN

SENSIBILIDAD

VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO

LINEALIDADEs la capacidad del método analítico de obtener resultados directamente proporcionales a la concentración del analito dentro de un rango definido.

PRECISIÓNExpresa el grado de dispersión entre una serie de mediciones múltiples de una muestra homogénea bajo condiciones establecidas.

VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO

PRECISIÓNPRECISIÓN

Precisión IntermediaPrecisión IntermediaRepetitblidadRepetitblidad

RepetibilidadInstrumentalRepetibilidadInstrumental

Repetibilidaddel Método

Repetibilidaddel Método

VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO

EXACTITUDExpresa la cercanía entre el valor aceptado convencionalmente como valor verdadero y el valor experimental encontrado.

SENSIBILIDADLa sensibilidad de un método corresponde a la

mínima cantidad de analito que puede producir un

resultado significativo.

ANALISIS Y RESULTADOSLINEALIDAD

y = 0.0061x + 0.0573R2 = 0.9976

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0 20 40 60 80 100 120

Concentración de proteína (mg/L)

Abs

orba

ncia

Se realizó la curva

de calibración en el

intervalo de

20 a 100 mg/L de

proteína. Cada

punto de la curva se

realizó por

triplicado.

LINEALIDADTest de Cochran, homogeneidad de varianzas

Gcalculado =0.5414 ; Gtablas (P = 0.05; K=5; n=3)= 0.6838

Gcalculado< Gtablas , las variancias de las concentraciones son homogéneas, el factor concentración no influye en la variabilidad de los resultados.

Se observa que la distribución de los residuales, es completamente aleatoria

Normalidad de los residuales

-0.02

-0.01

0.00

0.01

0.02

0 30 60 90 120

Concentración (mg/L)

Res

idua

les

No se observa ninguna tendencia

ANÁLISIS DE VARIANCIA, ANOVAANOVA

gl SS MS F Significance FRegresión 1 0.146490678 0.146490678 1229.60 5.09983E-05Residual 3 0.000357411 0.000119137Total 4 0.146848089

Ho = “El cuadrado medio de la regresion fue igual al cuadradomedio residual”

Ha = “El cuadrado medio de la regresion fue diferente al cuadradomedio residual”Fcalculado = 1229.90 ; Ftablas (P = 0.05) = 5.1E-05

Fcalculado > Ftablas

Existe correlación muy significativa entre x e y

TEST DE VERIFICACIÓN DE LA PENDIENTE

Ho = “La pendiente no es significativamente diferente de cero”.

Ha = “La pendiente es significativamente diferente de cero”.

tcalculado = 36.22; ttablas (P = 0.05; n = 5) 3.182 tcalculado> ttablas

Existe diferencia significativa entre la pendiente y cero.Intervalo de confianza de la pendiente

0.00623 ± 0.00055 (0.00568; 0.00678) y se observa que este intervalo no incluye el cero.

TEST DE VERIFICACIÓN DE LA VARIABLE INDEPENDIENTE O DE PROPORCIONALIDAD

Ho = “No existe diferencia significativa entre el intercepto y cero”.

Ha = “Existe diferencia significativa entre el intercepto y cero”.

tcalculado = 0.199 ttablas (P = 0.05; n = 5) 3.182 tcaculado < ttablas

La ordenada en el origen es estadísticamente igual a cero

Intervalo de confianza del intercepto 0.018 ± 0.036 (-0.018, 0.054) y se observa que este intervalo

incluye el cero

PRECISIÓNMétodos establecidos por la AOAC (Association ofOfficial Analytical Chemist) para comparar coeficientes de variación.

))log(5.01(2(%) CCV −=% Analito Relación Unidades CV (%)

10 10E-1 10% 2.81 10E-2 1% 2.7

0.1 10E-3 0.10% 3.70.01 10E-4 100 ppm 5.30.001 10E-5 10 ppm 7.3

0.0001 10E-6 1 ppm 110.00001 10E-7 100 ppb 15

0.000001 10E-8 10 ppb 210.0000001 10E-9 1 ppb 30

Método 1 Método 2

Concentración (ppm) CV (%)20 7.240 6.4960 6.10

PRECISIÓN

Muestra1 2 3 4 5

CV (%) 1.08 0.39 0.59 0.22 0.40

REPETIBILIDAD DEL SISTEMA

CONCENTRACIÓN ( ppm)20 40 60

CV (%) DIA 1 8.03 7.89 3.96CV (%) DIA 2 8.36 5.78 2.80

REPETIBILIDAD DEL MÉTODO

Se observa que los coeficientes de variación

son inferiores de 8.4

Se calculó los coeficientes de variación para cada uno de los parámetros evaluados: Repetibilidad(sistema y método), Precisión Intermedia (método).

PRECISIÓN INTERMEDIA DEL MÉTODO

Dia 1 Dia 1 Dia 2 Dia 2 Dia 3 Dia 312.73 16.29 9.91 10.69 12.00 12.68

Analista # 1 14.11 13.61 10.65 10.88 11.79 12.3913.08 15.70 10.14 10.91 12.71 12.30

CV(%) 5.41 9.28 3.71 1.12 3.98 1.63Dia 1 Dia 1 Dia 2 Dia 2 Dia 3 Dia 310.14 10.21 6.87 8.90 9.57 9.51

Analista #2 9.74 12.27 7.20 8.56 10.04 9.1810.81 12.81 8.72 9.20 9.66 9.81

CV(%) 5.26 11.67 12.97 3.58 2.60 3.30

Muestras de Maíz

PRECISION INTERMEDIA DEL MÉTODO

Día 1 Día 1 Día 2 Día 2 Día 3 Día 316.39 16.54 19.59 18.07 17.31 17.25

Analista # 1 18.29 16.76 19.49 20.56 18.68 18.0316.17 17.08 20.17 20.01 18.00 18.00

CV(%) 6.89 1.58 1.85 6.67 3.81 2.47Día 1 Dia 1 Día 2 Día 2 Día 3 Día 318.94 16.44 14.81 13.41 17.45 14.16

Analista #2 16.84 16.77 14.72 11.38 12.46 15.3916.07 20.51 15.50 11.68 14.82 13.33

CV(%) 8.58 12.61 2.87 9.00 16.72 7.24

Muestras de Fríjol

EXACTITUD

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

15 25 35 45 55 65

Concentración de proteina (mg/L)

Abs

orba

ncia

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

Curva Patron

curva patrón muestra 1 muestra 2 muestra 3

pendiente 0.0061 0.0057 0.0059 0.0054

Muestra de Maíz

EXACTITUD

PRUEBA t STUDENT

Ho = “No hay diferencias significativas entre laspendientes de las curvas de las muestras con adición de patrón y la pendiente de la curvapatrón.”

Ha = “Hay diferencias significativas entre laspendientes de las curvas de las muestras con adición de patrón y la pendiente de la curvapatrón.”

tcalculado = -3.39 ; ttablas (P = 0.05;n =3) = 4.303tcalculado < ttablas

Estadísticamenta las pendientes obtenidas de lascurvas de adición de patrón son iguales a las de

la curva patrón.

No hay efectos de matriz en las muestrasanalizadas.

Concentración Teórica (mg/L)x x + 20 x + 40 x + 60

0.104 0.246 0.379 0.462Absorbancia 0.121 0.229 0.358 0.469

0.127 0.248 0.372 0.473Media 0.12 0.24 0.37 0.47CV(%) 10.17 4.33 2.89 1.19

Concentración Interpolación Recuperación(mg/L) (%)

20 0.156 79.1240 0.268 94.050.252

Respuesta exp neta - blanco

0.124

Metodo de adición de patrón

Para confirmar que la recuperación essatisfactoria se aplica un test de t.

Ho = “Que el 88.46 % de recuperación essignificativamente igual al 100 % de recuperación”

Ha = “Que el 88.46 % de recuperación essignificativamente diferente al 100 % de recuperación”

tcalculado = 2.17; ttablas (P = 0.05; n =2) = 4.30tcalculado < ttablas

Se concluye: el 88.46 % de recuperaciónrepresenta el 100 % de recuperación

EXACTITUD

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

15 25 35 45 55 65Concentración de proteina (mg/L)

Abs

orba

ncia

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

Curva Patron

curva patrón muestra 1 muestra 2 muestra 3

pendiente 0.0061 0.0051 0.0059 0.0058

PARA FRÍJOL

EXACTITUD

• Prueba t Student

Ho = “No hay diferencias significativas entre laspendientes de las curvas de las muestras con adicion de patron y la pendiente de la curvapatron”.

Ha = “ Hay diferencias significativas entre laspendientes de las curvas de las muestra con adicion patron y la pendiente de la nueva curvapatron”.

.

tcalculado = -3.39 ; ttablas (P = 0.05; n = 3) 4.30

tcalculado < t tablas

Estadisticamenta las pendientes obtenidas de lascurvas de adición de patrón son iguales a la de la

curva patrón.

Se concluye que no hay efectos de matriz en lasmuestras analizadas.

Concentración Teórica (mg/L)x x + 20 x + 40 x + 60

0.160 0.310 0.446 0.496Absorbancia 0.158 0.289 0.399 0.507

0.202 0.297 0.404 0.506Media 0.173 0.299 0.416 0.503CV(%) 14.33 3.55 6.20 1.21

Concentración Interpolación Recuperación(mg/L) (%)

20 0.156 80.1940 0.268 90.5760 0.380 86.69

Media 85.81CV% 6.11

0.243

Respuesta exp neta - blanco

0.330

0.125

MÉTODO DE ADICIÓN DE PATRÓN

Para confirmar que la recuperación es satisfactoria se aplica un test de t.

Ho = “Que el 85.81 de recuperacionessignificativamente igual al 100 % de recuperacion”

Ha = “Que el 85.81 de recuperaciones significativamente igual al 100 % de recuperacion”

tcalculado= 4.0225 ttablas (α = 0.05; gl =2) = 4.303

tcalculado < t tablas

Se concluye: el 85.81 % obtenido representael 100 % de recuperación

SENSIBILIDAD

nbsyLD blbl 3+

=

Método de Bajas Concentraciones

Limite de detección = 4.8 mg/LLimite de cuantificación = 6.27 mg/L

nbsyLC blbl 10+

=

CONCLUSIONES

•De acuerdo a los análisis de linealidad, exactitud, precisión y sensibilidad se puede concluir que elmétodo de Lowry puede ser utilizado para la valoración cuantitativa de proteína en muestras de fríjol y maíz.

•Estos son los primeros pasos para lograr que elfuturo laboratorio de Agrosalud alcance la certificación.

AGRADECIMIENTOS• Al laboratorio de Mejoramiento de yuca

por su apoyo en la realización de este trabajo y por facilidad en el uso de los equipos y de sus instalaciones.

• Al proyecto de Agrosalud por permitirme realizar este trabajo, especialmente a Darwin Ortiz por su guía profesional.