LABORATORIO DE BIOCONVERSIONES

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

LABORATORIO DE BIOCONVERSIONES INGENIERÍA BIOTECNOLÓGICA

PRÁCTICA 1

Determinación de actividad enzimática y efecto de la concentración de enzima, pH, temperatura y fuerza

Iónica en la actividad enzimática (alfa-amilasa). La Práctica 1 incluye 6 módulos de iniciación de técnicas analíticas y manejo de equipo (1.1 a 1.6) necesarias para el curso y las tres últimas están enfocadas tema central relativa actividad enzimática, parte fundamental del desarrollo del curso.

Contenido 1.1 Capacitación para el uso de micropipetas y equipo de laboratorio. ...... 2 1.2. Capacitación para el uso de espectrofotómetros y centrífugas. ............ 7 1.3. Preparación de reactivos requeridos en el laboratorio de

bioconversiones. ................................................................................................. 13 1.4 Determinación de crecimiento celular por turbidimetría (D.O.), peso

seco, proteína y cuenta directa en cámara de Neubauer. ........................ 14 1.5 Determinación de azúcares reductores y azúcares totales. ................... 17 1.6 Determinación de la concentración de proteína de las enzimas

elegidas. ................................................................................................................. 20 1.7 Medición de la actividad catalítica de enzimas y/o de extractos crudos

enzimáticos: Amilasas. ...................................................................................... 23 1.8 Efecto de la concentración de enzima y fuerza iónica en la actividad de

la enzima elegida. ................................................................................................ 25 1.9 Efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimática. ...................... 27 Cada módulo se llevará a cabo en una o más sesiones, las cuales serán determinadas por el profesor, requiriéndose para toda la práctica un máximo de 9 sesiones (cinco semanas)

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1.1 Capacitación para el uso de micropipetas y equipo de laboratorio.

USO DE MICROPIPETAS AUTOMÁTICAS En las prácticas de Bioquímica los volúmenes de las soluciones que se necesitan medir son del orden de microlitros (μL). Para tomar estas cantidades con exactitud y reproducibilidad se emplean micropipetas, ya sean de volumen fijo o variable. Los errores de medida que se pueden cometer dependen principalmente del usuario y no de la micropipeta en sí, a menos que esta no esté bien calibrada. Para que las medidas sean correctas se debe de tener en cuenta las siguientes consideraciones: La pipeta debe de mantenerse siempre en posición vertical durante todo el proceso de pipeteo, nunca inclinada. También, cuando la pipeta no se utilice se debe dejar siempre en posición vertical en el soporte de pipetas. Nunca la deje horizontalmente encima de la mesa y menos una vez que tenga líquido succionado. Cada pipeta sirve para medir un determinado volumen. Las de volumen fijo miden solamente un volumen determinado. En las de volumen variable, se puede seleccionar un volumen dentro de un intervalo de valores determinado. En éstas, no se deben ajustar volúmenes superiores o inferiores a los que se recomiendan para cada pipeta. Los modelos que toman volúmenes inferiores a 200 μL usan puntas amarillas (o blancas), y las micropipetas que toman volúmenes superiores a 200 μL hasta 1 mL usan puntas azules (en algunos casos son blancas). Las pipetas que manejan volúmenes mayores de 1 o de 0.5 y 10 μL, pueden usar otro tipo de puntas específicas. La pipeta se agarra como si se tomara una empuñadura. La parte superior debe de reposar sobre su dedo índice (Fig. 1). Todas las pipetas tienen dos topes:

1) Primer tope para tomar el volumen calibrado.

2) Segundo tope para expulsar de forma más eficiente el volumen tomado y se usa solo cuando se está expulsando el contenido. .

Si antes de tomar la muestra, se lleva hasta el segundo tope, se tomará un volumen mayor al deseado, un volumen ERRONEO- El segundo tope es para sacar de forma más eficiente el volumen establecido

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Primer Tope

Segundo Tope

1 2 3 4 Posición Inicial

Fig. 1 Manera de asir una pipeta automática y tomar una muestra (presión

del émbolo).

Tanto la presión como la liberación del émbolo de la pipeta se debe de realizar lentamente y con suavidad. Si se realiza bruscamente, se pueden formar burbujas dentro de la punta de la pipeta, que alterarían los volúmenes; así mismo se podría ensuciar la parte interna de la pipeta. También se pueden formar burbujas o tomar un menor volumen si la punta no está bien ajustada a la pipeta. Procedimientos para medir correctamente un volumen con una micropipeta

1. Seleccionar la pipeta adecuada para medir el volumen deseado (que esté dentro del intervalo establecido para la pipeta).

2. El volumen requerido se fija girando el émbolo (Fig. 2). Se debe girar suavemente (evitar estar cambiando constantemente los volúmenes, para evitar descalibrar las pipetas).

Fig. 2 Manera de fijar el volumen deseado. 3. Colocar una punta desechable en el vástago de la pipeta (Fig. 3);

asegurando que esté bien sujeta, ejerciendo un ligero movimiento de torsión y presionando. Tener cuidado de no presionar mucho porque esto hace que la punta quede atorada fuertemente dificultando retirarla.

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Figura 3 Figura 4

4. Tomar la muestra presionando suavemente el émbolo con el pulgar hasta el primer tope.

5. Introducir la punta de la micropipeta en la muestra no más de 3 mm de la

superficie de líquido, manteniendo la pipeta en posición vertical (Fig. 4).

6. Succionar el líquido, relajando suavemente y controlando la presión con el dedo pulgar, sin permitir que el émbolo suba por sí solo. Se espera un par de segundos con la punta introducida en el líquido.

7. Retirar la punta de la muestra.

8. Introducir la punta de la pipeta en el tubo o frasco donde se va a verter,

colocando la punta contra la pared del tubo, sin sumergirla en la solución.

9. Presionar el émbolo lentamente, llevándolo hasta el primer tope.,

continuando inmediatamente hasta el segundo tope, para expulsar la totalidad del líquido que está en la punta.

10. Con el émbolo totalmente presionado se retira cuidadosamente la

pipeta, deslizando la punta a lo largo de la pared del tubo.

11. Llevar el émbolo a la posición inicial, controlando con el dedo (sin permitir que el émbolo suba por sí solo).

12. Sacar la punta de la pipeta, presionandoel expulsor de puntas o tirando

de ella, (Fig. 5).

En algunos casos se puede usar la misma punta, para homogenizar la mezcla, una vez adicionado el volumen, se introduce la punta en la mezcla y se baja y sube el embolo repetidamente sin llegar al primer tope. El procedimiento completo se esquematiza en la Figura 6.

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Figura 5 Figura 6

http://www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes/Practicas/Quimica/Practica00/Micropipetas.htm

TRABAJO PRÁCTICO

Cada equipo realizará lo siguiente: 1. Elegir la micropipeta adecuada para 20, 200 o 1000 μL. Seleccionar el

volumen indicado en la tabla 1 y colocar la punta adecuada.

2. Tomarla muestra indicada como se indicó anteriormente.

3. Transferir el líquido a un tubo Eppendorf, colocando la punta de la micropipeta en la pared interna del tubo Eppendorf al cual se va a transferir la muestra, depositar la muestra según el procedimiento ya indicado.

4. Eliminar la punta en un recipiente determinado para este fin, colocando

encima del recipiente la punta y presionando el pistón ubicado en la parte inferior, atrás del pistón de succión. Cada vez que se agregue un volumen seleccionado, se registrará su peso en la balanza (dependiendo de la sensibilidad de la balanza), cada volumen se hará por duplicado.

IMPORTANTE Cuando se vaya a pipetear solvente volátiles, como diclorometano, acetona, cloroetileno, cloroformo, etc. Antes de tomar la muestra, se debe saturar la pipeta con el solvente. Esto se logra introduciendo la punta en el solvente y se baja y sube el embolo repetidamente sin llegar al primer tope. Finalmente teniendo al punta en el solvente bajar el embolo hasta el primer tope y tomar toda la muestra llevando hasta la posición inicial. Cuando no se satura, al sacar la punta el solvente se sale de punta, debido a que se volatiliza dentro de la misma. Cuando se tomas muestras viscosas o densas como el glicerol, debe esperar a que suba muy lentamente todo el volumen, al no hacerlo y retirar la punta entrará aire. Esto indica que aún no se había tomado todo el volumen y se debe repetir todo el procedimiento.

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Ensayar varias veces este procedimiento con las diferentes micropipetas así como cambiar los volúmenes de acuerdo a las tablas 1 y 2:

Tabla 1. Volúmenes de agua a seleccionar para el uso de micropipetas.

1000 μL 200 μL 20 μL 600 150 16 200 100 12 100 50 8

4 1

Tabla 2. Volúmenes de glicerol a seleccionar para el uso de micropipetas.

1000 μL 200 μL 20 μL

600 150 20 200 100 10

Practicar con el profesor la toma de muestras volátiles

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1.2. Capacitación para el uso de espectrofotómetros y centrífugas. Fotometría La fotometría o "medida de la luz" es un método óptico de análisis dentro del cual se encuentran la colorimetría y la espectrofotometría, que miden la cantidad de luz absorbida por sustancias colorido o colorido e incoloras respectivamente. La luz es una forma de energía electromagnética, igual que los ultravioletas, infrarrojos etc. Que es irradiada a partir de una fuente energética en líneas o rayos virtualmente rectos. Se propaga en el vacío sin necesitar sustancia transportadora. Dentro de su trayectoria rectilínea describe ciclos en forma de ondas regulares que vibran perpendicularmente a su dirección de desplazamiento y cuya longitud de onda se sitúa entre 380 y 780 nanómetros. Longitud de onda: Es la distancia entre dos picos sucesivos de una onda. La luz que percibe el ojo humano es la luz visible y comprende desde 400 a 700 nm. Longitudes de onda superiores a 700 nm no son visibles para el ojo y se llama infrarroja; entre 100 y 400 nm es radiación ultravioleta (UV). Las medidas de absorción de luz se basan en dos leyes, la ley de Lambert y la ley de Beer. Ley de Lambert. Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la longitud del medio absorbente aumenta. I0 I = I0 ⋅ 10 -K.L log = K ⋅ L I donde:

I = intensidad de luz transmitida I0 = intensidad de luz incidente K = coeficiente de extinción L = espesor de capa K es el coeficiente de extinción definen cuan fuertemente una substancia absorbe la luz a una dada longitud de onda, por unidad de masa o por concentración molar. Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente (Fig 1), su intensidad disminuye exponencialmente a medida que aumenta la concentración de la sustancia absorbente en el medio. I0 I = I0 ⋅ 10 –K’.C log = K’ ⋅ C I donde C = concentración de la sustancia absorbente

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Sol.Absorbente concentración C

Rayo incidente Rayo emergenteLuzmonocromática

Intensidad I0 Intensidad IL

Espesor de la solución Figura 1. Diagrama del paso de luz monocromática a través de una solución Estas dos leyes se combinan en la ley de Lambert-Beer: I0 I = I0 ⋅ 10-ε⋅C⋅L log = ε ⋅ c ⋅ L I donde ε = coeficiente de extinción molar ε es el coeficiente de extinción cuando la solución contiene un mol por litro. El cociente de las intensidades se conoce como transmitancia (T) y se suele expresar como un porcentaje I - ε⋅c⋅L I T = =10 %T = x 100 I0 I0 I0 La expresión log se conoce como absorbancia (A) o densidad óptica (DO) I0 A = D.O. = log = ε ⋅ c ⋅ L ; para L=1, A = ε⋅c I T y A quedan relacionados de la forma A = - log T = 2 - log %T ESQUEMA GENERAL DE UN ESPECTROFÓTOMETRO Espectrofotómetros: Los métodos fotométricos de análisis utilizan los efectos de la interacción de las radiaciones electromagnéticas con las moléculas. Los aparatos de medición de la absorción de la radiación electromagnética se denominan "espectrofotómetros" y están constituidos de forma general de (Fig 2): Una fuente de luz, un monocromador, que desdobla la luz en haces monocromáticos, de un colimador que tiene una rendija de ajuste variable, pasando a través del mismo sólo luz de una determinada longitud de onda. La utilización de la luz monocromática o de un intervalo pequeño de longitudes de onda es importante, ya que la ley de Lambert-Beer solo se cumple en estas condiciones.

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La luz que sale del colimador se hace pasar por la solución y luego incide sobre el fototubo donde es detectada. La señal se envía a un registrador que convierte la señal a un registro análogo, digital o gráfico. En algunos colorímetros este registro consta de dos escalas, una mide absorbancias (A) y la otra transmitancias (T). La escala de A va desde 0 a ∞ , la de T va desde 0 a 100, en sentido contrario.

FototuboColimador

Celda con muestra

Registro

Fuente de luz

Monocromador

%T 0 100A ∞ 0

Figura 2. Esquema de las partes básicas de un espectrofotómetro Antes de realizar una medida, el aparato debe calibrarse, para lo cual se introduce una CELDA (o cubeta) con el blanco y se lleva a cien de transmitancia y a cero de absorbancia. Posteriormente, se introduce una celda con la muestra y se lee sea la transmitancia o la absorbancia a la longitud de onda determinada. Colorímetros: Los métodos colorimétricos son una aplicación de la espectroscopía y se basan en la medida de la absorbancia de una solución coloreada en la región visible del espectro (400-700 nm). La fuente de luz suele ser una lámpara de wolframio. Los compuestos no coloreados se transforman en otros con color, susceptibles de ser medidos colorimétricamente, mediante reacción con compuestos adecuados, y de esta forma se puede analizar en la región visible del espectro compuestos coloreados y sin color y ampliar sus posibilidades de utilización.

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CAPACITACIÓN PARA EWL MANEJO DE ESPECTOFOTÓMETROS

Actividad en laboratorio: Los maestros de laboratorio indicarán cómo operar y programar los equipos. El alumno deberá anotar en su bitácora cada paso y realizar un diagrama de flujo de los pasos, así como las consideraciones que hay que tener en el manejo, mantenimiento y limpieza del equipo. Existen diferentes modelos de espectrofotómetros en los laboratorios de docencia, de investigación y una gran gama en el mercado. Para el laboratorio se utilizarán dos o tres modelos, se debe aprender el manejo de cada uno. Para la lectura de muestras se utiliza celdas o cubetas de cuarzo o desechables de plástico, existen de diferentes volúmenes de operación 4, 2 y 1 mL. Antes de usar, siempre regístrese en la libreta de control del equipo.

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CENTRÍFUGA BECKMAN J2-MC

Antes de usar, siempre regístrese en la libreta de control del equipo.

Rotores: JA-20 para 8 tubos de 45 mL JA-14 para 6 tubos de 250 mL. Asegúrese de equilibrar los tubos de centrífuga con la muestra en una balanza. Se puede hacer con la misma sustancia o puede usar un contrapeso de agua. Para abrir: • Mueva el interruptor a la posición ON. • Accione la palanca de apertura (al lado derecho de la puerta)

Para programar: • Oprima ROTOR e introduzca el número 14 ó 20, dependiendo del tipo de

rotor a usar. • Oprima SPEED y teclee la velocidad (rpm). (verificar las velocidades

máximas para cada rotor, para esto existe una tabla) • Oprima TIME y teclee el tiempo (h : min). • Oprima TEMP y teclee la temperatura (° C) • Al terminar la selección, oprima ENTER.

Para operar: • Coloque cada par de tubos ya equilibrados en posiciones contrarias

(encontradas).Los contrarios deben tener el mismo peso • Coloque la tapa del rotor. • Cierre la centrífuga. • Permita que el equipo enfríe a la temperatura indicada antes de comenzar

el programa. • Oprima el botón START para iniciar el programa. • Se puede abortar oprimiendo el botón STOP. NOTAS: • La palanca de apertura solo funciona con el equipo encendido. • Apague el equipo manteniendo la puerta abierta para permitir que la cámara

de la centrífuga se deshiele. Asegúrese de secar la cámara. Proceda a cerrar el equipo.

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CENTRÍFUGA HERMLE Z300

Antes de usar, siempre regístrese en la libreta u hoja de control del equipo. Cuenta con tres Rotores para: 24 tubos Eppendorf de 1.5 mL

12 tubos Falcon de 15 mL 6 Tubos Falcon de 50 mL

Para cambiar rotor: • Utilice la llave del equipo. La rosca es izquierda. Girar a la derecha para aflojar,

Girar a la izquierda para apretar. Para abrir: Oprima el botón de apertura. El equipo solo se abre cuando el LED (foco o luz verde) está encendido, señal que el rotor se ha detenido y que es posible abrir. Precaución al abrir, la tapa no tiene un tope, por lo que se requiere apoyarla lentamente. Para programar: • Mantener oprimido el botón preset • Seleccionar el tiempo (min/sec) girando la perilla • Seleccionar la velocidad (rpm) girando la perilla Para operar: • Coloque cada par de tubos equilibrados en peso (con el mismo peso) en

posiciones encontrada (contrarias). Los tubos deben estar equilibrados por par (no todos los del rotor), pero es imprescindible que los tubos encontrados tengas el mismo peso.

• Coloque la tapa del rotor (si éste posee una). • Cierre la centrífuga. • Oprima el botón start para iniciar el programa. • Se puede parar oprimiendo el botón stop. En caso de que, por alguna falla en el suministro eléctrico, la pantalla se muestre intermitente, desconecte el equipo, espere unos segundos y conéctelo nuevamente. Proceda con la programación.

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1.3. Preparación de reactivos requeridos en el laboratorio de bioconversiones. Reactivo de Bradford Disolver 100 mg de azul brillante de Coomassie G-250 en 50 mL de etanol al 95%. A esta solución se le añaden 100 mL de ácido fosfórico al 85% (w/v). La solución resultante se diluye a un volumen final de 1L. Las concentraciones finales en el reactivo son 0.01% (w/v) de azul brillante de Coomassie G-250, 4.7% (w/v) de etanol y 8.5% (w/v) de ácido fosfórico. Una vez terminado el reactivo se debe verificar el color, debe ser café. Si tiene un tono azulado no es adecuada y se desecha, debiendo preparar nuevamente. Filtrar el reactivo cuando sea necesario. Reactivo del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) 1. Disolver 30.0 g de tartrato de sodio y potasio en agua destilada hasta obtener un volumen final de máximo 50 mL. 2. Agregar 1.6 g de NAOH previamente disueltos en 10 mL de agua destilada. 3. Agregar 1.0 g de DNS previamente disuelto en 20 mL de agua destilada. 4. Aforar a 100 mL con agua destilada. 5. Guardar en obscuridad y en frasco ámbar. Dejar reposar 15 min, en caso de uso inmediato. ES IMPORTANTE tener cuidado con los volúmenes que se manejan, por que el volumen final no debe ser mayor a 100 mL. Para esto, se aconseja ir disolviendo el tartrato de sodio agregando agua hasta lograr el volumen final de 50 mL (no agregar 50 mL de agua a la sal por que dará un volumen mayor) . Solución de Almidón 1% (p/v) Suspender 1g de almidón en 100 mL de regulador de fosfatos, 0.1M, pH 7.0, el cual deberá estar tibio o caliente. Posteriormente desnaturalizar calentando en baño de agua a 60 °C durante 15 min, para pre-gelatinizar el almidón. Solución de alfa-amilasa La concentración de enzima será indicada por el profesor y será en mg de proteína o enzima por mL de regulador de fosfatos, 0.1 M, pH 7.0. Solución de antrona Disolver 0.2 g de antrona en 5 ml de etanol y aforar a 100 ml con H2SO4 al 75%. Para preparar el ácido al 75%, se debe realizar en la campana de extracción, en un baño de hielo, colocar el matraz o pobreta que contienen el agua en el baño e ir agregando lentamente por las paredes el ácido. Usar material de seguridad, lentes y guantes.

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1.4 Determinación de biomasa microbiana por turbidimetría o Densidad Óptica (D.O.), peso seco y cuenta directa en cámara de Neubauer. La determinación biomasa microbiana puede realizarse por varios métodos tanto directos como indirectos, tres de estos son: 1. Densidad óptica (D.O.) o turbidimetría 2. Peso seco 4. Cuenta en cámara de Neubauer PARTE EXPERIMENTAL 1) Densidad óptica A partir de muestras obtenidas de una cinética de crecimiento, es decir del medio de cultivo a través del tiempo, (o a partir de diluciones de un cultivo concentrado), obtener la densidad óptica de las muestras leyendo a 600 nm. Las lecturas no deben ser mayores a 1 de absorbancia, es ese caso es necesario realizar diluciones, para obtener el intervalo de lectura menor a 1. El blanco es el medio de cultivo fresco utilizado; así mismo, éste se debe usar para las diluciones en muestras que den lecturas mayores a 1. Se entregará un cultivo microbiano, el cual se leerá la DO a 600 nm y a partir de la lectura se establecerán 5 diluciones para leer. Con las lecturas graficar la densidad óptica vs. dilución. La DO se puede graficar vs concentración de proteína extracelular, peso seco, numero de células, proteína celular, etc. Haciendo posible correlacionarlas 2) Peso seco a) Etiquetar charolas de aluminio y ponerlas a peso constante a 60ºC por 24

horas en una estufa, enfriar en desecador y pesar. b) Tomar una alícuota de 10 a 15 mL de la suspensión celular (de cada dilución

hecha para DO) y colocarlo en un tubo de centrífuga. c) Centrifugar las muestras a una velocidad de 6000 rpm durante 5 min.

Recuerde equilibrar los tubos antes de centrifugar. d) Eliminar el sobrenadante y resupender la pastilla celular en un poco de agua

destilada y pasarla a una charola a peso constante y previamente pesada. e) Dejar las charolas en una estufa a 60ºC por 24 h o hasta que la pastilla este

completamente seca, enfriar en desecador y pesar cada charola. f) El peso seco se obtiene de la diferencia entre el peso final y el inicial de cada

charola. g) Graficar peso seco vs DO y vs no de de células/mL.

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3) Cuenta directa en Cámara de Neubauer La cámara de Neubauer es una cámara adaptada para ser utilizada en un microscopio de campo claro o de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, con el fondo marcado con una una cuadrícula (Fig 1). Es un cuadrado de 3 x 3 mm, subdividido en 9 áreas de 1mm2 cada una. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie de cada área y el cubreobjetos es de 0.1 mm3 (0.1 microlitros). Las diferencia entre las áreas 1,3,7 y 9; 4,2,6,8 y la 5 son las subdivisiones, lo que permite en ese orden contar células de mayor a menor tamaño, contando bacterias y levaduras en el área 5, que cuenta con 25 subdivisiones y se observa en 40 o 100X

Se deben contar el número de células de cuatro o cinco cuadros de un área, la concentración en la suspensión celular será:

Cél/mL = N X 104 X F (ecuación 1) Donde: N: La media de las células contadas (suma de células contadas por subdivisión/Número de subdivisiones contadas) 25: es el número de cuadrados en cada grilla. 104: factor para pasar el número de células en el cuadrado central (volumen = 0.1mm3 = 0,1μL) a número de células por mL (1000mm3 = 1000μL=1 mL) F: factor de dilución

Figura 1. Grilla de conteo de la cámara de Neubauer (Fugelsang and Edwards,

2007).

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El conteo con la cámara se lleva a cabo de la siguiente forma:

a) Limpiar cuidadosamente con papel de arroz la cámara de Neubauer. b) Colocar el cubreobjetos sobre los canales, tal como se indica en la figura

1. c) Agitar la suspensión celular para tener una muestra homogénea. d) Con ayuda de una pipeta serológica de 1 mL o con una pipeta

automática de 100 µL, tomar 0.1 mL de la suspensión y colocar la punta de la pipeta en el borde del cubreobjetos; dejar que la solución ingrese a la cámara por capilaridad, sin que pase a los canales laterales. Si se forman burbujas se debe repetir la operación, lavando y secando la cámara previamente.

e) Colocar la cámara Neubauer en la platina del microscopio y enfocar con el objetivo 10x.

f) Localizar el cuadro central de la rejilla (ubicando la cuadrícula de 25 cuadros de 0.04 mm2), hacer un cambio de lente al objetivo de 40x y contar el número de células de 4 o más subdivisiones. Evitar contar dos veces la misma célula u omitir alguna.

g) En caso de que el número de células sea muy elevado y se dificulte su conteo, será necesario diluir la suspensión en una proporción conocida, la que deberá ser tenida en cuenta en la estimación final.

h) Calcular el número de células con la ecuación 1 Fugelsang, K.C. and Edwards, C.G. (2007). Wine Microbiology. Practical applications and procedures., Edn. 2nd. (Springer, USA).

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1.5 Determinación de azúcares reductores y azúcares totales.

1) Azúcares reductores

• Colocar 0.1mL mL de reactivo de DNS en un tubo Eppendorf, posteriormente adicionar 0.1, de la solución problema. Se puede homogeneizar con la punta.

• Se puede sellar la tapa del tubo con Egapack, para evitar que se abran durante la ebullición.

• Poner a baño maría (ebullición) por 5 min. • Llevarlo después a hielo por 10 min. • Añadir a 1mL de agua destilada. • Agitar en el vortex y dejar hasta que esté a temperatura ambiente,

posteriormente: • Leer la absorbencia a 540nm.

1.1 Curva tipo de maltosa. La curva patrón se realiza con maltosa en un rango de concentración de 0 a 2.0 g/L Preparar diluciones, por duplicado, de acuerdo a la Tabla 1 y tratarla de acuerdo a la técnica de azúcares reductores.

Tabla 1. Diluciones para la curva patrón de maltosa.

Tubo

Concentración de maltosa en la

muestra (g/L)

Volumen de la solución de

maltosa de 2 g/L (mL)

Volumen de agua destilada

(mL)

1. (Blanco) 0.0 0.00 1.00 2 0.2 0.1 0.9 3 0.4 0.2 0.8 4 0.6 0.3 0.7 5 0.8 0.4 0.6 6 1.0 0.5 0.5 7 1.2 0.6 0.4 8 1.4 0.7 0.3 9 1.6 0.8 0.2 10 1.8 0.9 0.1 11 2.0 1.0 0.0

Con el blanco se ajusta a cero de absorbancia el espectrofotómetro.

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Elaborar la curva patrón en donde se grafique en el eje de las ordenas (eje“y”) promedio de la absorbancia determinada a 540 nm y el en el eje de las abscisas (eje”x”) el promedio de la concentración de maltosa determinada en g/L.

Determina la ecuación de la línea recta que relaciona a los dos parámetros:

y = mx + b

En donde “y” representa la absorbancia determinada a 540 nm. “x” representa la concentración de maltosa determinada en g/L.

La curva patrón será correcta cuando se obtenga una r mayor o igual a 0.98, con lecturas de absorbancia entre 0 y 1.

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2) Azúcares Totales por el método de Antrona

Solución de antrona: 0.2 g de antrona disuelta en 5 ml de etanol, y aforar a 100 Ml con H2SO4 al 75%. (ver práctica 1.3)

• Adicionar 0.2 mL de muestra en un tubo Eppendorf, posteriormente

adicionar lentamente 1 mL de solución de antrona, agregar la antrona lentamente, es una reacción exotérmica. Cuando este método se realiza con volúmenes mayores ej 1 mL de muestra y 5 de antrona debe realizarse en frio (en baño de hielo porque es muy exotérmica)

• Agitar en Vortex y luego llevar a ebullición en baño Maria durante 10 min (cuidado de que no se abras los tubos, es muy ácido, se recomienda sellar las tapas con una tira de “Egapack”).

• Enfriar en hielo (para detener la reacción). Posteriormente sacar del hielo y dejar a temperatura ambiente

• Leer a 650 nm (cuando la muestra ya esté a temperatura ambiente). 2.2 Curva tipo de sacarosa.

La curva patrón se realiza con sacarosa en un rango de concentración de 0 a 100 mg/L Preparar diluciones, por duplicado, de acuerdo a la Tabla 2 y tratarla de acuerdo a la técnica de antrona.

Tabla 2. Diluciones para la curva patrón de sacarosa.

Tubo

Concentración de sacarosa en la

muestra (mg/L)

Volumen de la solución de sacarosa

100 m g/L (mL)

Volumen de agua destilada

(mL)

1. (Blanco) 0.0 0.0 1.0 2 10 0.1 0.9 3 20 0.2 0.8 4 30 0.3 0.7 5 40 0.4 0.6 6 50 0.5 0.5 7 60 0.6 0.4 8 70 0.7 0.3 9 80 0.8 0.2 10 90 0.9 0.1 11 100 1.0 0.0

Con el blanco se ajusta a cero de absorbancia el espectrofotómetro.

Determina la ecuación de la línea recta que relaciona a los dos parámetros:

y = mx + b

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1.6 Determinación de proteína. Objetivo Determinar la concentración de proteína de una solución enzimática con el método de Bradford. Introducción La determinación de la concentración de proteínas puede realizarse por varios métodos, entre ellos: 1. Leyendo la absorbancia a 280 nm, si se conoce el valor de su ∈280 [g-1L

cm-1], por ejemplo para la albúmina de suero bovino (BSA) su ∈280 [g-1L cm-1] es de 0.667. *∈280: coeficiente de extinción a 280 nm (en la región Ultravioleta del espectro de luz)

Si no se conoce el coeficiente, se puede hace una curva tipo con la albúmina de suero bovino (BSA), como se indica en la tabla 3: Tabla 3. Curva patrón de BSA para lectura en 280 nm.

Sol. de BSA 1000 μg/mL

(mL) 0.0 0.10 0.2 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.0

Agua destilada (mL) 1.0 0.90 0.80 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.0

Concentración de BSA ( μg/mL)

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

Cada una de las diluciones se realiza por triplicado. Se lee la absorbancia a 280 nm ajustando el equipo con un “blanco de reactivos” (el que no contiene proteína). Con los datos graficar, realizar una regresión lineal y obtener la ecuación de la recta, con la que se calculará la concentración de la proteína “problema”.

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2. Método de Bradford: El método de Bradford involucra la unión del azul brillante de Coomassie G-250 a la proteína. Esta unión provoca un cambio en el máximo de absorción de 465 a 595 nm y este incremento a 595 nm es lo que permite la cuantificación. Dicha unión es independiente de la composición de aminoácidos de las proteínas. La concentración de proteína se determina por medio de una curva tipo con Seroalbúmina Bovina (BSA) y el reactivo de Bradford. Desarrollo experimental Curva tipo: preparar diferentes concentraciones de BSA de 0 a 200 µg/mL, a partir de una solución de 200 µg/mL, (Tabla 4). Agregando en un tibo eppendorf limpio las cantidad de solucions de BSA y agua como se indica en la tabla 4 para obtener un volumen final de .02 mL de muetra Tabla 4. Curva Tipo de albúmina de suero bovino (BSA), para determinación de proteína por Bradford

(BSA) 200 μg/mL (mL) 0.0 0.025 0.05 0.075 0.10 0.125 0.15 0.175 0.20 0.225 0.25

Agua destilada (mL) 0.25 0.225 0.20 0.175 0.15 0.125 0.10 0.075 0.05 0.025 0.0

Concentración de BSA (μg/mL)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Posteriormente adicionar 0.75 mL de reactivo de Bradford, y dejar EXACTAMENTE 5 min y lee la absorbancia a 595 nm, ajustando el equipo con el “blanco de reactivos” o agua (el que no contiene proteína) La cantidad de proteína contenida en la muestra se determina interpolando en la ecuación obtenida con la curva tipo de seroalbúmina bovina a diferentes concentraciones. PROBLEMA: Determinar la concentración de una solución de tripsina por espectrofotometría a 280 nm. .

A partir de una solución que contenga X mg/mL de tripsina (en agua destilada) hacer por triplicado 7 diluciones adicionando 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.25, 0.5 mL de la solución de tripsina y agregar a cada uno agua destilada para llevar a un volumen final de 1.0 mL (0.99, 0.98, .095, 0.9, 0.8, 0.75 y .05 mL), de agua respectivamente) y leerlas a 280 nm.

Posteriormente de estas diluciones que tengan lecturas dentro de la curva, tomar tres de ellas para hacer la determinación de la concentración por el método de Bradford, considerando la sensibilidad de este método.

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Informe 1. Establecer la curva patrón de proteína con Bradford y otra por espectrofotometría a 280 nm. 2. Calcular la concentración de proteína de la solución de tripsina usando los dos métodos de determinación de proteína. 2. Discutir los resultados obtenidos. Cuestionario 1. ¿En qué se basa el método de Bradford? 2. ¿En qué tiempo hay que leer la muestra en el método Bradford y por qué? 3. ¿Cuál es la ventaja del método de Bradford? 4. ¿Qué otros métodos de determinación de proteína existen, en que se basan

y su intervalo de sensibilidad?

Referencia.

Bradford, M. M., 1976. “A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding”. Anal. Biochem. 72, 248-254.

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA 1.7 Medición de la actividad catalítica de enzimas y/o de extractos crudos enzimáticos: Amilasas. OBJETIVO Determinar la actividad enzimática de la α-amilasa y calcular las unidades de actividad enzimática. DESARROLLO EXPERIMENTAL 1.Preparar una solución de almidón: 1% (p/v): Se suspende 1g de almidón en 100 mL de regulador de fosfatos, 0.1M, pH 7.0, Posteriormente se desnaturaliza por calor en un baño de agua a 60 °C durante 15 min, para pre-gelatinizar el almidón. Reactivos:

Almidón 1.0 % (p/v) Regulador de fosfatos pH 7.0, 0.1M Reactivo de DNS α-amilasa Reactivo de Bradford 2. Realizar curva tipo de maltosa por el método de azúcares reductores DNS.

Realizar la curva de maltosa de 0.0 a 2.0 g/L. y determinar por método de DNS

(práctica 1.5) 3. Determinar, por triplicado, proteína por el método se Bradford (práctica 1.6)

a la solución de enzima proporcionada. Hacer diluciones si es necesario. Tomar 0.25 mL de muestra, adicionar 0.75 mL de sol. de Bradford, esperar 5 min y leer a 595 nm. Determinar la concentración con la curva obtenida en la práctica 1.6.

4. Cinética de hidrólisis del almidón: Tener antes de iniciar un el baño de agua en ebullición y otro de hielo. 1) Para cada muestra a la que se determinará actividad, tener listo un tubo

eppeddorf de 1.5 mL con 0.1/mL del reactivo DNS (10 tubos). 2) Por separado poner en tubos Eppendorf de 1.5 mL, 0.95 mL de la solución

de almidón 1% a 20°C.. 3) Aadicionar a cada tubo 0.05 mL de la solución de amilasa (excepto al

testigo) con un intervalo entre cada tubo de 30 segundos para poder detener la reacción en el tiempo exacto. Para el tiempo cero tomar inmediatamente

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0.1 mL de la mezcla de reacción (otra persona), transferirlo rápidamente a un tubo conteniendo 0.1 mL de reactivo DNS (éste será el testigo). Realizar: un el Blanco sin agregar la enzima, es decir a los 0.1 mL de DNS, adiciones 0.1 mL de solución de almidón.

4) Dejar que la reacción se desarrolle a tres tiempos y por triplicado (9 tubos) 0.0 (testigo), 3.0 y 6.0 minutos exactamente. Transcurrido el tiempo EXACTO transferir 0.1 mL de la mezcla de reacción a uno de los tubo que ya contiene 0.1 mL del reactivo DNS.

5) Tratar todos los tubos al mismo tiempo según la técnica de DNS: Poner en baño de agua a ebullición durante 5 min, exactamente. Cuidar de que no entre agua a los tubos.

6) Transcurrido el tiempo sacra y poner en hielo o un baño de agua fría durante 10 min.

7) Posteriormente añadir 1.0 mL de agua destilada a dicha solución. 8) Se homogeniza la solución invirtiendo con la mano los tubos. 9) Se determina la absorbancia a 540 nm, ajustando a cero con el blanco,

determinando la absorbancia para cada tubo testigo y problema (tiempo 3 y 6 min). La absorbancia del tubo testigo se resta al tubo problema con la finalidad de eliminar la absorbancia que no sea atribuible a la reacción enzimática. .

10) Se utiliza la curva patrón de DNS realizada con maltosa para determinar la concentración de azucares reductores expresados como mg maltosa/ mL de la muestra.

11) Expresar la actividad enzimática en unidades de actividad de alfa amilasa/mL. Considerar la siguiente definición de una unidad de actividad alfa amilasa: cantidad de enzima que libera 1 mg de maltosa a partir de almidón después de 1 min de reacción con la enzima a 20°C y pH 6.9

III. INFORME:

1. Elaborar la curva tipo Abs540nm vs concentración de maltosa y determinar la ecuación de la regresión lineal.

2. Calcular la actividad enzimática en unidades de actividad enzimática (U) y actividad específica (Uesp).

[ ] [ ]t

productoproductoU tt 01 −= [ ] [ ]( )[ ]proteínat

productoproductoU ttesp

01 −=

3. Hacer la gráfica de unidades de actividad de amilasa vs tiempo de

reacción. 4. ¿Cuáles son los productos de esta reacción? 5. Recopilar y comparar los resultados de todos los equipos, discutir si hay

diferencias.

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UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA 1.8 Efecto de la concentración de enzima en la actividad enzimática de una amilasa. OBJETIVO Determinar el efecto de la concentración de enzima en la actividad denzimática. DESARROLLO EXPERIMENTAL Preparación del sustrato: Almidón al 1.0 % en regulador de fosfatos pH 7.0, 0.1M preparado como se indicó anteriormente. Reactivos:

Almidón 1.0 % (p/v) Regulador de fosfatos pH 7.0, 0.1M Reactivo de DNS α-amilasa Reactivo de Bradford

1. Determinación de la concentración de proteína en la solución

enzimática. Determinar, por triplicado, proteína por el método se Bradford (práctica 1.6) a la solución de enzima proporcionada. Hacer diluciones si es necesario. Tomar 0.25 mL de muestra, adicionar 0.75 mL de sol. de Bradford, esperar 5 min y leer a 595 nm. Determinar la concentración con la curva obtenida en la práctica 1.6.

2. Efecto de la concentración de la enzima en la velocidad de la reacción

enzimática. a) Preparar una serie de tubos Eppendorf, como se indica en la tabla 6,

adicionando, por triplicado, 0.95 mL de sustrato a diferentes concentraciones.

b) Posteriormente adicionar a cada tubo 0.05 mL de la solución de amilasa (excepto al testigo) con un intervalo entre cada tubo de 30 segundos para poder detener la reacción en el tiempo exacto a la reacción

c) Incubar los tubos por 5 min (tiempo de reacción) en un baño o termomixer a 25°C.

d) Pasado el intervalo de tiempo tomar 0.1 mL de la mezcla de reacción y adicionarlo a un tubo conteniendo 0.1 mL del reactivo DNS.

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e) Continuar la determinación de DNS de acuerdo a lo indicado en la práctica 1.5 y 1.7.

La reacción se llevara cabo a pH (7.0), tiempo de reacción y tempertaura constante, siendo la única variable la concentración de enzima .

Tabla 6. Soluciones para determinar el efecto de concentración de la

enzima en la actividad enzimática .

Tubo

Testigo*

3P1

3P2

3P3

3P4

3P5

Soluciones de Amilasa (mg/mL)

*

0.25

0.5

1.0

2.0

3.0

Volumen de Sol. Sustrato

(mL) 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95

Vol. de sol. de enzima en PO4 pH 7.0, 0.1M

(mL)

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

* 3P, significa 3 tubos Problema *Para cada concentración de enzima se hace un testigo, para lo cual

inmediatamente después de adicionar los 0.05 mL de enzima, de pasa al tubo con DNS.

Realizar el blanco con sol de almidón Procedimiento: A INFORME: 1. Hacer la gráfica de unidades de actividad de amilasa vs concentración de

enzima. 2. Discutir los resultados de las actividades enzimáticos obtenidos por todos

los equipos del grupo.

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UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA 1.9 Efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimática. OBJETIVO Estudiar el efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimática de una enzima: α-amilasa.

1. Determinación de la concentración de proteína en la solución

enzimática. Determinar, por triplicado, proteína por el método se Bradford (práctica 1.6) a la solución de enzima proporcionada. Hacer diluciones si es necesario. Tomar 0.25 mL de muestra, adicionar 0.75 mL de sol. de Bradford, esperar 5 min y leer a 595 nm. Determinar la concentración con la curva obtenida en la práctica 1.6. 2. Efecto de la temperatura en la actividad catalítica de las enzimas.

a) Preparar una serie de tubos Eppendorf, como se indica en la tabla 7, adicionando, por triplicado para cada temperatura a ensayar, 0.95 mL de sustrato (almidón al 1%) y llevarlos a la temperatura deseada poniéndolos en un baño maría.

Tabla 7. Soluciones y temperaturas para la prueba de efecto de la

temperatura en la actividad enzimática .

Tubo

Testigo*

3P1

3P2

3P3

3P4

3P5

Temperatura de reacción

(°C)

Uno por cada temperatura

25

35

45

55

65

Sol. de Almidón 1.0 %

(mL) 0.95

0.95

0.95

0.95

0.95

0.95

*Sol. de Enzima en regulador PO4 pH 7.0

(mL)

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

*α-Amilasa: 1.0 mg/mL 3P, significa 3 tubos Problema

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c) Incubar los tubos (un triplicado, un testigo y el blanco (sin enzima), por 5 min (tiempo de reacción) en un baño a cada temperatura.



La reacción se llevara cabo a tiempo constante de reacción y concentración de enzima constante, siendo la única variable la temperatura de reacción. 3. Determinación de la concentración de proteína en la solución

enzimática. Determinar, por triplicado, proteína por el método se Bradford (práctica 1.6) a cada solución de enzima proporcionada (cada pH). Hacer diluciones si es necesario. Tomar 0.25 mL de muestra, adicionar 0.75 mL de sol. de Bradford, esperar 5 min y leer a 595 nm. Determinar la concentración con la curva obtenida en la práctica 1.6. 4 Efecto del pH en la actividad catalítica de las Enzimas Reactivos: Almidón 1.0 % (p/v) en Reguladores a diferentes pH Regulador de Acetatos pH 5.0 Regulador de Fosfatos pH 6.0, 7.0 y 7.5 0.1 M Regulador de Boratos pH 8.0, 9.0 y 10.0 Preparar las soluciones de enzima con el regulador de pH indicado por el

profesor. a) Preparar una serie de tubos Eppendorf, como se indica en la tabla 8,

adicionando, por triplicado para cada pH a ensayar, 0.95 mL de sustrato (almidón al 1%).


c) Incubar los tubos (un triplicado, un testigo y el blanco (sin enzima), por 5 min (tiempo de reacción).



28



29

Tabla 8. Soluciones de enzima a diferentes pH para determinar el efecto del pH en la actividad enzimática.

Tubo

Testigo*

3P1

3P2

3P3

3P4

3P5

3P6

3P7

pH

5.0

6.0

7.0

7.5

8.0

9.0

10.0

Sol. de almidón al 1.0

% (mL)

0.95

0.95

0.95

0.95

0.95

0.95

0.95

0.95

Enzima + regulador al pH indicado

(mL)

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

3P, significa 3 tubos Problema. * Para cada pH se hace un testigo. Seguir el mismo procedimiento indicado en el experimento del efecto de la concentración de enzima. INFORME:

1. Hacer la gráfica de Unidades de actividad de amilasa vs temperatura de reacción.

2. Hacer la gráfica de Unidades de actividad de amilasa vs pH de la reacción.

3. Discutir los resultados de las actividades enzimáticos obtenidos por todos los equipos del grupo.

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