LABHISTO-01
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DEPTO. DE CS. BIOLÓGICAS Y QUÍMICAS -------------------------------------------------------------------- CURSO : LABORATORIO HISTOLOGIA HUMANA CÓDIGO : DBIO1035
MANUAL DE TRABAJOS PRÁCTICOS
CAPITULO I : HISTOLOGÍA BÁSICA
ESTA GUIA PERTENECE A ...........................................................................................
2
PROLOGO
El Manual de Trabajos Prácticos tiene por finalidad complementar el
curso teórico de Histología, con la realización de actividades experimentales que
han sido seleccionadas por los docentes.
Dicho manual constituye un material de apoyo para los alumnos de las
carreras de la Salud de la USS, dado que está complementado con una serie de
ilustraciones que han sido realizadas, adaptadas, modificadas y/o extraídas por
la propia autora, desde distintos textos afines. Estas tienen por objetivo
entregar al alumno imágenes que clarifiquen ciertos aspectos morfológicos de
estructuras, eventos o fenómenos biológicos.
Este manual, dada su extensión se ha subdividido en dos tomos
correspondientes a los dos grandes capítulos que abarca este curso:
I. Tomo : Histología Básica
II. Tomo : Histología de Sistemas
Finalmente, es importante destacar que el uso de este manual es
imprescindible durante el desarrollo del laboratorio y debe ser completado de
acuerdo a la realización de las actividades experimentales.
3
BIBLIOGRAFIA 1. CORMACK, D., Histología de Ham. 9 Edit. México 1990 2. LEESON, T., Texto Atlas de Histología, Edit. Mc Graw - Hill México 1992 3. BELIMANN, H., Histología Veterinaria. Zaragoza 1980 4. BACKA W., Atlas Color de Histología Edit.. Interamericana Bs.Aires última edición 5. GARTNER, L y HIATT, J., Texto Atlas de Histología, Edit. Mc Graw - Hill México 2003 6. JUNQUEIRA L.C. y CORNEIRO J., Histología Básica, última Edit.Salvat Editores S.A. - Barcelona España 7. DI FIORE M., Diagnóstico Histológico y Atlas de Histología Normal Edit., El Ateneo. Bs. Aires, última edición 8. FAWCETT D.W. , Tratado de Histología, Edit. Interamericana Bs. Aires, última edición 9. KRSTIC, R. Los tejidos del hombre y los animales, Edit Interamericana Bs. Aires, última
Edición 10. KRSTIC, R. Human microscopic anatomy: an atlas for students of medicine and biology. Berlin .
DIRECCIONES DE UTILIDAD EN INTERNET
www.vh.org/Providers/Textbooks/MicroscopicAnatomy/MicroscopicAnatomy.html http://www-sci.lib.uci.edu/HSG/MedicalAnatomy.html http://www.meddean.luc.edu http://www.meddean.luc.edu/lumen/MedEd/Histo/frames/histo_frames.html www.med.uiuc.edu/histo www.icbl.ufg.br/histologia/incapa.htm http://www.histol.chuvashia.com/atlas-en/content-en.htm www.kumc.edu/instruction/medicine/anatomy/histoweb http://escuela.med.puc.cl
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TRABAJO PRACTICO N°1
TECNICAS HISTOLÓGICAS
INTRODUCCIÓN
La Histología se define literalmente como la ciencia que estudia los
tejidos, históricamente surge como una Anatomía Microscópica y es su principal
objetivo el análisis de cada una de las diversas asociaciones celulares, sus
características, funciones y localización.
Biológicamente un tejido se define como una agrupación de células que son
morfológicamente semejantes, derivan de una misma hoja embrionaria (ecto,
endo o mesoderma) y cumplen una función similar.
Dentro de sus propiedades se encuentran:
La capacidad de crecimiento y/o regeneración
La capacidad de cultivo
La especificidad
De acuerdo con su forma y función todos los tejidos se subdividen en 4
familias:
1. TEJIDO EPITELIAL
2. TEJIDO DE SOSTEN O CON SUSTANCIA INTERCELULAR
3. TEJIDO MUSCULAR
4. TEJIDO NERVIOSO
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Para el estudio de los tejidos se requiere de elaboración de preparaciones
histológicas, las cuales han sido obtenidas a través de un complejo procedimiento
que involucra una serie de etapas consecutivas.
Todas las células, salvo aquellas en que su citoplasma posee como
inclusiones sustancias o partículas coloreadas de origen endógeno (caroteno,
melanina, licopeno) o exógeno (carbón), son incoloras. Por este motivo, para poder
ser estudiadas con el microscopio óptico, ellas deben ser coloreadas o teñidas.
Para esto, se aprovecha la afinidad química de los componentes estructurales de
la célula o los existentes en su citoplasma, con sustancias que poseen un color
característico (colorantes) el que será transmitido a la estructura en estudio,
cuando la reacción química entre ambos se produzca.
Cuando se trata de estudiar células aisladas o disociadas, o bien tejidos
muy delgados, como es el caso de las pleuras, peritoneo, pericardio, meninges y
otras, el proceso de coloración no tiene problemas. El problema se produce
cuando se quiere estudiar órganos o tejidos voluminosos, en donde por la
densidad celular, tanto la coloración como la observación de ellos ofrece gran
dificultad, sobre todo si se piensa, que la observación al microscopio óptico se
basa en que lo observado debe ser transparente para que pueda ser atravesado
por el haz de luz, proveniente de la fuente luminosa.
La única manera de poder estudiar los tejidos formados por una gran masa
de células, es cortarlos de un grosor tal (7 a 10 m), que queden transparentes,
lográndose así una excelente y clara observación.
Como se dijo anteriormente, no sólo basta que el tejido sea delgado, ya
que las células por ser incoloras, no podrán ser puestas en evidencia con claridad
basándose solamente en la diferente refringencia de sus estructuras. Esta
dificultad se elimina, tiñendo las células con sustancias químicas específicas.
Para lograr cortes muy delgados, los que posteriormente serán teñidos, se
debe seguir todo un proceso. Este incluye los siguientes pasos:
1.- Fijación y lavado del tejido
2.- Deshidratación del tejido fijado
3.- Inclusión del tejido ya deshidratado
4.- Pegado de los cortes
5.- Desparafinaje e hidratación de los cortes
6.- Coloración
7.- Montaje definitivo
1. Fijación y lavado del tejido
Al realizar el estudio de una célula o tejido, lo más importante es que sus
estructuras se presenten ojalá sin alteración, es decir que éstas estén y se
conserven lo más próximo a lo real en que ellos estaban en la célula en el
momento de su muerte.
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Normalmente esto es difícil ya que como consecuencia de la muerte
celular, las enzimas de las vacuolas intracitoplasmáticas (lisosomas) se liberan y
esto provoca la autodestrucción o autolisis celular. Considerando este hecho, se
utiliza la fijación del tejido o célula, para esto se usan compuestos químicos
solos o asociados (soluciones o medios fijadores), los que tienen la particularidad
de penetrar rápidamente la membrana plasmática y provocar, ya sea la
coagulación de las proteínas citoplasmáticas o formar compuestos proteicos
complejos que se mantienen en la célula y por lo tanto ella dará una imagen muy
cercana a como estaba en el momento en que se sacó del cuerpo del individuo.
2. Deshidratación del tejido fijado
No debe olvidarse que para poder observar un tejido, él debe cortarse en
trozos tan delgados que dejen pasar la luz y por lo tanto las estructuras a
observar pueden verse por transparencia. La única posibilidad de hacer cortes de
entre 1 a 10 m es utilizando un instrumento llamado micrótomo y la pieza a
cortar debe ser de una dureza tal, que no permita que ésta vibre. Esto se alcanza
embebiendo el tejido en sustancias que le dan una consistencia característica.
Entre estas sustancias se pueden mencionar: los plásticos y la parafina sólida.
Como estas sustancias son muy apolares, y por lo tanto, insolubles en agua, la
única posibilidad de que ellas penetren el tejido es eliminando el agua que éstos
contienen. Dicho objetivo se logra, pasando el trozo de tejido por una batería
ascendente de alcoholes, es decir, desde un alcohol que tenga mucho agua hasta
uno que no contenga nada.
El alcohol (etílico o butílico) es un enérgico deshidratante, saca el agua de
donde ella está presente y como el tejido ya está fijado, el paso por estos
alcoholes no lo altera.
El tejido fijado no debe pasar directamente a alcoholes de 100° porque la
deshidratación sería muy enérgica apareciendo en el tejido espacios, en lugares
donde ellos no existían en la realidad; si esto ocurre se habla de un “artefacto
de técnica”.
Como la sustancia que da mayor consistencia a un tejido (parafina sólida)
es poco soluble, se debe utilizar una sustancia química que intervenga como
eslabón entre el alcohol y la parafina, es decir, que sea muy soluble en ambos
compuestos. Entre estas sustancias podemos mencionar: el xilol, el benceno, el
tolueno. El paso del tejido ya deshidratado, por estos compuestos se llama
“diafanizado”. En este momento el tejido está totalmente deshidratado y
comúnmente se observa que él ha tomado una mayor consistencia, haciéndose
quebradizo.
3. Inclusión del tejido
El tejido ya deshidratado y diafanizado debe ser endurecido para poder
ser cortado a grosores de 1 a 10m. Entre las sustancias utilizadas para
endurecer (incluir) el tejido se pueden mencionar: resinas naturales o sintéticas
y parafina sólida.
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Para esto se sumerge el tejido en este compuesto fundido y se mantiene
en él por varias horas, de modo que se de tiempo suficiente para que él se
introduzca en el tejido, atraviese la membrana celular y forme un todo con la
célula. Se obtiene así un molde que contiene una masa sólida formada por el
tejido y la sustancia endurecedora que lo ha penetrado totalmente.
4. Corte del tejido
En esta etapa se hace uso de un aparato (micrótomo) formado por una
cuchilla fija por la cual pasa el tejido endurecido cada vez que se gira una
manivela. Con cada vuelta de la manivela el tejido se acerca a la cuchilla un
número dado de micrones para así obtener un corte del grosor deseado.
El hecho de trabajar con cortes en dos dimensiones genera dificultades en
el estudio del tejido. Dado que se desconocerán parámetros tales como forma,
tamaño o volumen de la muestra estudiada. Por lo tanto se hace necesaria la
interpretación de los cortes. Esto implica tener que imaginar la estructura
tridimensional de los órganos estudiados bidimensionalmente.
Analice los esquemas que a continuación se presentan.
ESQUEMAS QUE ILUSTRAN DIFERENTES PROBLEMAS
EN LA IDENTIFICACION DE CORTES DE ACUERDO CON
LOS PLANOS DE SECCIONAMIENTO
1.- Diferentes planos de corte de un
huevo
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2.- Diferentes planos de corte de una
naranja.
3.- Diferentes planos de corte de un
cable con hilos aislados
4.- Diferentes planos de corte
de un tubo curvo.
5.- El dibujo de la parte inferior muestra cómo se visualizan en un corte un grupo
de células de dimensiones regulares.
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6.- Diferentes planos de corte
de un tubo recto
5. Pegado de los cortes
Para poder colorear y observar los tejidos ya cortados, éstos deben ser
pegados en portaobjetos muy limpios a través de sustancias adhesivas (solución
acuosa de albúmina) y posteriormente deben ser estirados y secados.
6. Desparafinaje e hidratación de los cortes
A pesar de que los cortes de tejido son muy delgados, no es posible
distinguir las estructuras celulares ya que el tejido y las células están embebidos
en parafina, lo que dificulta cualquier observación. Además, como se mencionó
anteriormente, las células son transparentes, de modo que aunque se elimine la
parafina las estructuras internas no podrán ponerse en evidencia salvo que ellas
sean previamente coloreadas. Basándose en estos hechos se debe continuar
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procesando el tejido ya pegado para eliminar la parafina que lo embebe lo cual se
realiza con xilol y luego se rehidrata el tejido ya que los colorantes que se usan
son solubles en agua. Para realizar esto último se hace uso de una batería de
alcoholes de graduación descendente (desde un alcohol que no contenga agua,
hasta uno que tenga mucha agua y finalmente poder enjuagar la muestra sólo en
agua.
7. Coloración o Tinción
La coloración de los tejidos o células se basa en la propiedad que tienen
algunas soluciones coloreadas (colorantes o tinturas) de asociarse selectivamente
a ciertas estructuras celulares, tiñéndolas. Se las utiliza en histología para que
los detalles estructurales se hagan evidentes, fácilmente visibles y resalten en
medio del resto de las estructuras que permanecen incoloras o que serán teñidas
posteriormente de un color diferente. De este modo, el estudio de un tejido o
células se realiza mediante el análisis cromático de las diferentes estructuras
que conforman la preparación. Por lo tanto, para que un colorante resulte útil en
histología, es indispensable que tiña difusamente y que no tiña con igual
intensidad todas las estructuras celulares.
El colorante deberá fijarse con determinada especificidad sobre
determinados elementos del citoplasma o del núcleo. Las estructuras coloreadas
serán aquellas que tienen la propiedad de absorber de manera selectiva los rayos
luminosos de una determinada longitud de onda y que transmitan por
transparencia o difusión las radiaciones complementarias no absorbidas. En
histología se considera que una estructura se ha teñido cuando el tejido no se
destiñe con un lavado efectuado en el mismo solvente empleado para preparar la
solución de ese colorante. Se admite y se explica este hecho porque en la tinción
el colorante se combina íntimamente con la sustancia coloreable. Esto se debe a
la presencia de agrupaciones moleculares básicas o ácidas de los colorantes
originando sales insolubles.
Ehrlich, divide los colorantes en ácidos, básicos y neutros.
a.- Los colorantes ácidos son sales cuya base es incolora y el ácido es coloreado.
Así por ejemplo, en la eosina o eosinato de sodio, la propiedad colorante es
debida al ácido eosínico y no a la base, sodio, que es incolora.
b.- Los colorantes básicos poseen la base coloreada y el ácido incoloro. Por
ejemplo, el azul de metileno, que es un clorhidrato de azul de metileno, el poder
colorante es debido al compuesto básico: azul de metileno (tetrametiltionina) y
no al ácido clorhídrico que es incoloro.
c.- en los colorantes neutros, tanto el ácido como la base que intervienen son
coloreados. Por ejemplo, el eosinato de azul de metileno.
Los colorantes ácidos tienen una afinidad especial por el citoplasma por lo
que se les llama también “colorantes citoplasmáticos”, ejemplo: eosina, floxina,
eritrocina, etc. y a las estructuras que se tiñen se les llama “estructuras
acidófilas”
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Los colorantes básicos, en cambio, se fijan sobre la cromatina nuclear,
llamándoseles por lo tanto, “colorantes nucleares” y a las estructuras que se
tiñen con estos colorantes se les llama “estructuras basófilas”, como por ejemplo
de estos colorantes se pueden mencionar: la hematoxilina, el azul de metileno, el
azul de toluidina, etc.
Después de la coloración se procede a realizar una deshidratación con una
batería de alcoholes ascendente y un diafanizado con el fin de proceder al
montaje definitivo.
8. Montaje definitivo
Para dejar una preparación permanente y definitiva, se coloca sobre el
tejido ya diafanizado, una gota de bálsamo de Canadá o de Permount (sustancia
adhesiva) y se cubre con un cubreobjeto muy limpio y se deja secar.
OBJETIVOS
1.- Describir una preparación histológica de acuerdo a parámetros definidos.
2.- Identificar diferentes tipos de tinciones histológicas.
3.- Identificar cómo se colorean las estructuras celulares y/o tejidos con
distintas tinciones.
4.- Valorar el uso de las tinciones para el análisis y diagnóstico histológico.
5.- Identificar planos de corte
6.- Interpretar diferentes tipos de corte
* * *
ACTIVIDADES
1. TINCIONES
A. Observe atentamente el set de imágenes que se le entregará.
B. Reconozca en cada uno de ellos la técnica utilizada. Fundamente en base a los
colores observados.
C. Distinga el tipo de corte
D. Identifique el aumento utilizado.
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I.
1. Técnica : …………………………………………………………………….………….……………………………………………………………
Fundamentación ……………………………………………………………….………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………..…………………………….……………………………………………………
2. Corte : …………………………………………………………………….………………………… Aumento ……………..…………
II.
1. Técnica : …………………………………………………………………….………….……………………………………………………………
Fundamentación ……………………………………………………………….………..……………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………..………………….……………….……………………………………………………
2. Corte : …………………………………………………………………….………………………… Aumento ……………..…………
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III.
1. Técnica : …………………………………………………………………….………….……………………………………………………………
Fundamentación ……………………………………………………………….………..……………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………..………………….……………….……………………………………………………
2. Corte : …………………………………………………………………….………………………… Aumento ……………..…………
IV.
1. Técnica : …………………………………………………………………….………….……………………………………………………………
Fundamentación ……………………………………………………………….………..……………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………..………………….……………….……………………………………………………
2. Corte : ……………………………………………………………………………………………… Aumento ……………..…………
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V.
1. Técnica : …………………………………………………………………….………….……………………………………………………………
Fundamentación ……………………………………………………………….………..……………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………..………………….……………….……………………………………………………
2. Corte : ……………………………………………………………………………………………… Aumento ……………..…………
VI.
1. Técnica : …………………………………………………………………………………..…………………………………………………………
Fundamentación ……………………………………………………………………………….……………………………………..………………………
…………………………………………………………………………………..…………………………..……………………………..……………………………
2. Corte : ……………………………………………………………………………..………..…… Aumento ……………..…………
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2. CORTE
A. Realice en plasticina un esquema tridimensional de los siguientes tipos
celulares :
Fibra muscular estriada esquelética
Fibra muscular lisa
Enterocito
Hepatocito
Neurona motora
Neurona ganglionar
NOTA: Para realizar el esquema debe conocer previamente las formas de dichas
células
B. Represente el citoplasma y núcleo en colores diferentes
C. Utilizando un cuchillo, corte en 3 planos diferentes.
D. Dibuje la célula y sus planos de corte
E. Dibuje la imagen bidimensional de los planos de corte obtenidos
1. Fibra muscular estriada esquelética
Esquema tridimensional y planos de cortes Corte bidimensional
1.
2.
3.
2. Fibras muscular lisa
Esquema tridimensional y planos de cortes Corte bidimensional
1.
2.
3.
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3. Enterocito
Esquema tridimensional y planos de cortes Corte bidimensional
1.
2.
3.
4. Hepatocito
Esquema tridimensional y planos de cortes Corte bidimensional
1.
2.
3.
5. Neurona motora
Esquema tridimensional y planos de cortes Corte bidimensional
1.
2.
3.
6. Neurona ganglionar
Esquema tridimensional y planos de cortes Corte bidimensional
1.
2.