Lab7. enzimas

FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PROGRAMA ENFERMERÍA

Practicas de Laboratorio de Bioquímica Enzimas

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Guía No.07

INTRODUCCIÓN Los organismos vivos pueden obtener y gastar la energía muy rápidamente debido a la presencia de catalizadores biológicos llamados enzimas. Como sucede con los catalizadores inorgánicos, las enzimas modifican la velocidad de reacción química sin afectar el equilibrio final; y solo se requieren pequeñas cantidades para efectuar la transformación de un gran número de moléculas de sustrato. Sin embargo, a diferencia de la mayoría de catalizadores inorgánicos, las enzimas son bastante especificas ya que catalizan un número comparativamente pequeño de reacciones y en algunos casos tan solo una reacción. Así mismo, las enzimas funcionaran solamente bajo condiciones muy definidas de pH, temperatura, concentración de sustrato, cofactores, etc. Estas características particulares están condicionadas por la naturaleza proteica de los catalizadores biológicos. Labilidad térmica de las enzimas. La velocidad de una reacción catalizada por una enzima, al igual que la mayoría de las reacciones químicas, aumenta con la temperatura. Esto se debe principalmente al efecto sobre las constantes de velocidad de las diversas reacciones parciales que componen la reacción total, y a la afinidad de la enzima por los cofactores, activadores, etc. A elevadas temperaturas, la proteína de la enzima se desnaturaliza dando como resultado una perdida de actividad. Esto significa que la velocidad inicial de la reacción aumentara con la temperatura hasta que se haga prácticamente imposible de medir debido a una inactivación casi inmediata. En la practica, la mayoría de las enzimas son completamente inactivadas por encima de los 70 ºC. Al bajar la temperatura la enzima disminuye su actividad también, sin embargo el enfriamiento no causa desnaturalización de la enzima y por lo tanto su activación puede ser reversible. Influencia del pH sobre la actividad de las enzimas. Las enzimas son activas en un intervalo limitado de pH. El pH al cual se obtiene la actividad máxima se conoce como pH óptimo y es característico de la enzima, siempre y cuando esta sea estable en las condiciones experimentales usadas. Los cambios de actividad con el pH se deben a cambios en el estado de ionización de la proteína enzimática y de los otros componentes de la mezcla de reacción. Michaelis y Davidsohn sugirieron en 1911 que de las diferentes formas de ionización de la proteína solo una es activa. A valores de pH por encima o por debajo del pH optimo disminuye la cantidad de esta forma y por lo tanto se produce una disminución en la actividad enzimática. Especificidad de la enzima. Las enzimas se distinguen de los catalizadores inorgánicos por su especificidad excepcionalmente alta. La etapa inicial del proceso catalítico consiste en la formación del complejo enzima-‐sustrato, es decir, la unión del sustrato con el centro catalítico de la enzima: la formación espacial del centro de sustrato debe estar en la correspondencia geométrica exacta con la estructura de la molécula del sustrato. Solamente en este caso es posible la formación del complejo enzima-‐sustrato y el cumplimiento de la función catalítica de la enzima. La especificidad de las enzimas consiste en el hecho de que el sustrato le corresponde a la enzima, como una llave a una cerradura.




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Influencia de los activadores e Inhibidores. La regulación de la actividad de las enzimas se realiza tanto en la célula como fuera de ella, mediante la fijación sobre la molécula de enzima de una serie de sustancias de bajo peso molecular. Tales sustancias pueden causar efectos positivos o negativos. Los agentes que causan efecto positivo o activadores, al adicionarse a la molécula de precursores no activo, son capaces de cambiar su conformación dando lugar a la formación de un compuesto que posee actividad catalítica. La función de activadores se cumple con frecuencia, por iones de metales y algunos aniones. La acción de los agentes que causan efecto negativo, inhibidores, se realiza mediante la alteración de la conformación nativa de la enzima. Los inhibidores pueden ser sales inorgánicas, metabolitos u hormonas. El lugar de fijación del agente a la molécula se denomina centro alostérico. OBJETIVO • Analizar el efecto de diversos factores en la actividad enzimática de la amilasa salival. CONSULTAS PRELIMINARES • Cuales son los factores que afectan la velocidad enzimática? • Cuales son las condiciones optimas para que la amilasa salival actúe a la velocidad

catalítica optima? MATERIALES Solución de cloruro de sodio 1% Solución de almidón 1% en cloruro de sodio 0.3% Soluciones amortiguadoras pH: 5.0, 6.8 y 8.0 Solución sacarosa 2% Reactivo de fehling Reactivo de Lugol Solución sulfato cúprico 1% PROCEDIMIENTO Obtención de la muestra de saliva diluida. Se enjuaga la boca con agua destilada. Luego tome 20 a 25 mL de agua y coléctela en un vaso. Labilidad térmica de las enzimas En cada uno de tres tubos de ensayo se vierte 1 mL de saliva diluida (amilasa). La saliva del tubo 1 se hierve durante 1 ó 2 minutos. La saliva del tubo 3 se coloca en hielo a 0ºC. Luego en todos los tubos de ensayo se añade 2 mL de solución de almidón. Los tubos de ensayo 1 y 2 se colocan en el termostato (37ºC) donde se mantienen durante 10 min. Al transcurrir este tiempo, en cada tubo de ensayo se añade una gota de lugol. Los resultados de la observación se anotan en la tabla que indica la influencia de pH sobre la actividad de la amilasa de la saliva. Influencia del pH sobre la actividad de las enzimas En tres tubos de ensayo se vierten de 2mL de disoluciones amortiguadoras de distintos pH (5.0; 6.8; 8.0). En todos los tubos de ensayo se añade de 1 mL de saliva diluida (amilasa) y




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2mL de disolución de almidón, se mezcla y se incuba durante 10 minutos en el termostato (37ºC). Luego, en cada tubo se ensaya 1 gota de reactivo de lugol. Los resultados de la observación se anotan en la tabla que indica la influencia del pH sobre la actividad de la amilasa de la saliva. Especificidad de la enzima. Rotule cuatro tubos de ensayo. En los tubos de ensayo 1 y 2 se vierten 2 mL de solución de almidón. En los tubos de ensayo 3 y 4 se vierten 2 mL de solución de sacarosa. En los tubos de ensayo 1 y 3 se añaden 1 mL de saliva diluida (amilasa) y en los tubos de ensayo 1 y 4, se añade 1 mL de disolución de sacarasa (invertasa). Agite los tubos de ensayo e incube durante 10 minutos en el termostato a 37 ºC. Luego en los tubos de ensayo 1 y 2 se añade 1 gota de reactivo de lugol y en los tubos 3 y 4, 0.5 mL de reactivo Fehling y se calienta. Anote las observaciones. Influencia de los activadores e inhibidores. En dos tubos de ensayo se vierten 2 mL de disolución de almidon, En el tubo de ensayo 1 se añade 1 mL de disolución de cloruro de sodio. En el tubo de ensayo 2 se añade 0.5 mL de disolución se sulfato cúprico. En ambos tubos se añade 0.5 mL de saliva diluida. Agite los tubos e incube durante 10 minutos en el termostato a 37ºC Luego en cada tubo de ensayo se añade 1 gota de lugol. Anote las observaciones. OBSERVACIONES Tabla 1. Labilidad térmica de las enzimas. Tubo ensayo

Enzima Condiciones experimento

Sustrato Incubación Coloración con yodo

1 Amilasa Enzima desnat. Almidón 10 min, 37ºC 2 Amilasa Enzima nativa Almidón 10 min, 37ºC 3 Amilasa Enzima nativa Almidón 10 min, 0ºC Tabla 2. Influencia del pH sobre la actividad de las enzimas. Tubo ensayo

Enzima pH del medio

Sustrato Incubación Coloración con yodo

1 Amilasa 5.0 Almidón 10 min, 37ºC 2 Amilasa 6.8 Almidón 10 min, 37ºC 3 Amilasa 8.0 Almidón 10 min, 37ºC Tabla 3. Especificidad de las enzimas. Tubo ensayo

Sustrato Enzima Incubación Coloración con yodo

Reacción de Fehling

1 Almidón Amilasa 10 min, 37ºC 2 Almidón Sacarosa 10 min, 37ºC 3 Sacarosa Amilasa 10 min, 37ºC 4 Sacarosa Sacarosa 10 min, 37ºC




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Tabla 4. Influencia de activadores e inhibidores. Tubo ensayo

Enzima Agente Sustrato Incubación Coloración con yodo

1 Amilasa NaCl Almidón 10 min, 37ºC 2 Amilasa CuSO4 Almidón 10 min, 37ºC Para su análisis de resultados recuerde: Explicar el significado de la coloración. Indique las reacciones que se llevan a cabo en cada tubo de ensayo Concluya sobre las condiciones ideales de trabajo de la enzima. PREGUNTAS

1. Que reacción catalizan la invertasa y la amilasa (salivar) 2. Cual es el sustrato especifico para la sacarasa (invertasa) y la amilasa. 3. Cual es la finalidad de utilizar lugol o solución de fehling?

BIBLIOGRAFIA 1. Plummer DT, Barrera LA. Bioquímica práctica: McGraw-‐Hill; 1981. 2. Practicas de laboratorio Bioquímica de alimentos. Departamento de Química. FACNED.

UNICAUCA. 3. Lehninger AL, Nelson DL, Cox MM. Lehninger : principios de bioquímica: Ediciones

Omega, S.A.; 2009.

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