La Tincin De Gram Voy a iniciar, hablandoles un poco de la importancia y origen de la tincin de Gram...... La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de rutina del Laboratorio de Microbiologa las referencias a la morfologa celular bacteriana, se basan justamente en la tincin de GRAM. Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram positivas y Gram negativas (en este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrica, sino simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias). Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas se tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes. La pared de la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la clula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula Gram -positiva es peptidoglicano. La pared de la clula Gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula Gram-negativa es peptidoglicano. A continuacin se describir en detalle la tincin de Gram:

FIJAR MUESTRA Y TEIR CON VIOLETA Las clulas del frotis, fijadas al calor sobre un portaobjeto se tien, primero con una solucin de cristal violeta durante un minuto (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para quitar el exceso de colorante con agua destilada. En este estado, todas las clulas, tanto las Gram positivas como las Gram negativas, estn teidas de azul.

COLOCAR EL LUGOL El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico durante un minuto y luego de lava. El ingrediente activo es el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas Gram positivas como las Gram negativas se encuentran en la misma situacin.DECOLORAR CON ALCOHOL ACETONA Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (Grampositivos) no se decoloran, mientras que otros (Gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin. Esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias Gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared de la clula permitiendo la salida de la tincin violeta por esos poros(y tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora.

Las clulas Gram positivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente ya que ste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las molculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Despus de la decoloracin las clulas Gram positivas son todava azules, pero las Gram negativas son incoloras. Aadiendo la Safranina Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.

Debido a que la Fundamentacin de la coloracion de Gram se debe a la estructura de la pared bacteriana es vital que tengan en claro esa diferencia. Es por ello que para reforzar ese conocimiento les coloco esta presentacin donde se explica en detalle los componentes y diferencia de la pared de bacterias Gram positiva y Gram negativa

......Ahora debesrealizar como actividad un dibujo esquemtico que permita destacar las diferencias entre las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, sealando los componentes en cada caso y publicarlo en el blog. Es importante resaltar algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram:1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s solo tiene poca afinidad con las clulas.2) La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las clulas Gram positivas. EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios.3) Cultivos ms viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta - yodo. El carcter de Gram positivo no es siempre un fenmeno del todo o nada. Algunos organismos son ms Gram positivos que otros y algunos son Gram-variables, es decir, unas veces Gram positivos y otras Gram negativos