Universidad Jurez Autnoma de Tabasco Divisin Acadmica de Ciencia Biolgicas

La integridad del ADN de los eritrocitos del Squalius cephalus l. como un indicador de la contaminacin relacionada con la genotxicidad en el Ri Sava Genotoxicologa M. En C Reyna Lourdes Fcil Monterrubio Quiryat Jarim Crdenas Ochoa Lic. En BiologaMirjana Pavlica Anamaria tambuk Lana Malovic Marin Mladinic Gran I. V. Klobucar Received: 28 August 2009 / Accepted: 9 July 2010

IntroduccinAguas

Destinarios finales

ContaminantesEstrs ambiental Inters primordial

Problema

Organismos Acuticos

Ocurren efectos de

Daa ADN afectan

Variacin de genotoxicos

Genotxicos

Xenobioticos

Salud

Estabilidad de ecosistemas

Fisiologa

Metabolismo

Ensayo cometa

Detecta dao en el ADN

Clulas de diferentes organismo eucariticos

Ensayo cometa Marinos Organismos acuticos Prueba de biomonitoreo ambiental en Agua Dulce

Organismos terrestres

Ensayo de Microncleos

Detecta dao clastognico

Rotura de cromosomas o efectos aneugnicos

Adaptado para Ensayo de microncleos

Mamferos, invertebrados, vertebrados y plantas

para

Los agentes clastognicos son agentes fsicos o qumicos capaces de inducir roturas cromosmicas. Aneugenicos son agentes qumicos que, a nivel molecular, impiden la fijacin de las fibras del huso al cinetocoro, provocando el desplazamiento de cromosomas en la anafase.

PRUEBAS DE GENOTXICIDAD

La importancia del uso de Microncleos y del ensayo cometa es la detencin de los eventos de rotura de ADN y el efecto aneugnico en el impacto grave en la salud.

Biomonitoreo acutico

usados

Estudios de genotoxicidad

Especies de peces como indicadores

Bajas concentraciones de contaminacin ambiental

Mutgenos

Squalius cephalus l.Es ampliamente distribuida en todas las aguas dulces de Europa. Pez ciprnido del orden Cypriniformes.

Usado como biomonitoreo de contaminacin

Por su relacin

La toxicidad en los ros europeos.En donde se evalan

Los efectos genotxicos

Causados por

Desechos industriales, desechos domesticos.

Los diferentes niveles de contaminacin en el ro Sava.

ContaminantesContaminantes en forma de desecho qumico o biolgico, provocado por las actividades humanas.

Antropognicos

como

Los tensioactivos inicos, los farmacuticos y aguas residuales urbanas

Se realizaron dos biomarcadores de genotoxicidadSe midi

Eritrocitos

Detectar la primera respuesta a la contaminacin genotxico (ensayo cometa), as como su resultado final, debido al efecto mutagnico (prueba de microncleos).

Materiales y mtodosrea de estudio El Sava (945 kilmetros) es el mayor afluente. En su flujo a travs de Croacia, que recibe una variedad de desechos municipales e industriales.

Se realizaron muestreos en la primavera (marzo-abril) y otoo (septiembre) en 2005 y 2006.

para determinar

si la temporada perodos influye en la respuesta genotxica en los peces.Parmetros medidos

La sangre fue el parmetro principal para realizar el ensayo cometa, de ttanos materno y neonatal.

fsico-qumicos (temperatura, disuelto, pH)

agua oxgeno

Ensayo cometaSe hizo de acuerdo con el protocolo bsico de Singh.1 Se diluy 5 ul con PBS 200 y se mezclo con 95l bajo fusin al 0.5 % (LMP) de agarosa y se coloca en la primera capa Las cuales fueron dejados 2,5 min, en el congelador para solidificar la agarosa. La tercera capa LMP agarosa al 0,5 % y se polimerizo. Despus de solidificacin se coloco en portaobjetos en una solucin de lisis durante 1 hora en la oscuridad a 4 C.

2

3

4

Despus, los portaobjetos se lavaron con agua destilada y se coloco en electroforesis para una desnaturalizacin preparada con tampn , la cual duro 20 min. Despus fueron fijadas en metanolacido actico durante 5 min y se seco durante la noche. Se tieron con 10 mg / ml bromuro de etidio.

Microncleos

1

Muestras de sangre fueron inmediatamente despus del muestreo.

realizadas

2

Se tieron con bisbenzimida a 1 mg / ml para 5 min, se enjuag con agua destilada, y se montaron en glicerol-Mcllvaine tampn.

3

Se mantuvieron en la oscuridad a 4 C antes de examinar en el microscopio.Slo las clulas intactas con distinta nucleares y de las membranas celulares se anot. de microncleos(MN) se identific de acuerdo con los criterios descrito por Kirsch-Volders et al. (2003).

4

Anlisis estadsticoSe observ en la primavera de 2005 y 2006 se elevado el hepato-somtico (HI) (aunque menos prominente) en todos los sitios. Adems, el ndice gonado somtico (IG) fue mayor en Otok Samoborski en la primavera de los dos aos estudiados. En la primavera de 2005, en todos los sitios investigados, los peces mostraron una mayor HI.

Longitud total (cm)

Peso Total (g)

Tamao de la muestra, una media de ndice estndar. CI condicin (peso / longitud), HI hepato-somtico (peso del hgado), GI ndice gonado somtico (peso de la gnada / peso total del cuerpo).

ResultadosDatos Biomtricos Medido (peso, longitud) (condicin, somtico. hepatoEspecmenes

Los ndices gonadosomtico)Se observaron

Muestra que en la primavera del 2005-2006; un elevado aumento de hepato-somatico (HI).

El ndice gonadosomtico (IG) fue mayor en Otok Samoborski en la primavera de los dos aos.

Ensayo Cometa

El nivel basal de dao en el ADN, oscilo entre 4-16% tDN.

Los daos del ADN en los eritrocitos

primavera y el otoo

El nivel ms bajo de dao en el ADN presenta como porcentaje de la cola de ADN (tDNA%)

sitio Otok Samoborski (aguas arriba de Zagreb).

El nivel de ADN daos en este sitio fue mucho mayor (3 veces) en primavera que en otoo.

dao en el ADN

El mayor potencial genotxico se en primavera; el aumento de dao era de 1,5.

el nivel ms bajo de dao en el ADN.sitios En la primavera, hubo un aumento de 3,5 en el dao del ADN en el sitio de Zagreb Los daos del ADN en los eritrocitos recogidos en el ro Sava, en la primavera y el otoo en el 2005,muestran el nivel ms bajo de dao en el ADN presenta como porcentaje de la cola de ADN (tDNA%) se observ por lo menos contaminado del sitio Otok Samoborski (aguas arriba de Zagreb). Sin embargo, el nivel de dao en el ADN en este sitio fue mucho mayor (3 veces) en primavera que en otoo. La misma tendencia se observ para los sitios contaminados: en la primavera, hubo un aumento de 3,5 veces en el dao del ADN en el sitio de Zagreb en comparacin con el otoo, en el sitio.

El anlisis de regresin de los datos del ensayo del cometa y HI.

Ensayo cometa

Porcentaje de eritrocitos superiores a 50% de la cola ADN

HI Hepato-somaticLos peces muestreados en la primavera de 2005 en todos los sitios, se observ efecto citotxico de acuerdo con el porcentaje de apoptosis (muy daado) de las clulas.

La frecuencia de microncleos (, media SEM) en los eritrocitos recogidos en los sitios de monitoreo en el ro Sava en los aos 2005 y 2006

Microncleosel ao 2005 el sitio hubo aumento de contaminantes en Zagreb (ambas temporadas) y Oborovo (primavera).

mostr el menor dao citogentico con valores ms bajos en primavera que en otoo.

Los resultados de MNT han indicado Zagreb como el sitio con el mayor impacto mutagnico; mientras que en el ensayo del cometa tanto Zagreb y Oborovo mostraron una mayor incidencia de dao en el ADN. La mayor frecuencia de microncleos en los eritrocitos se observ en el otoo de 2005 en el sitio de Zagreb, mientras que el ensayo del cometa en el mismo lugar mostraron el menor dao del ADN.

Conclusin

El ensayo cometa realizado en los eritrocitos de la Squalius cephalus l. en los sitios monitoreados en el ro Sava fue en funcin de su intensidad de la contaminacin.

El ensayo cometa mostr ser ms sensible en los sitios contaminados.

El ensayo de Microncleos indico que Zagreb fue el sitio con el mayor impacto mutagnico; mientras que en el ensayo del cometa, mostro tanto en Zagreb y Oborovo mostraron una mayor incidencia de dao en el ADN.

La prueba cometa mostro la mas baja influencia de genotoxico en el sitio menos contaminado , mientras que el mayor dao en el ADN se observo en los sitios con mayor contaminacin.

El ensayo de microncleos mostro que en el sitio menos contaminado el dao era mas bajo citogeneticamente. El numero de eritrocitos micro nucleados fue ms alto en los lugares mas contaminados.

Ambos ensayos se deben utilizar en los estudios de biomonitorizacin, debido a su capacidad para detectar diferentes mecanismos de genotoxicidad.