LA HEMOGLOBINA: UNA MOLÉCULA PRODIGIOSA

Rev.R.Acad.Cienc.Exact.Fís.Nat. (Esp)Vol. 104, Nº. 1, pp 213-232, 2010XI Programa de Promoción de la Cultura Científica y Tecnológica

LA HEMOGLOBINA: UNA MOLÉCULA PRODIGIOSALUIS FRANCO VERA*

* Real Academia de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Valencia. [email protected]

A primera vista, el adjetivo prodigiosa, que,referido a la molécula de hemoglobina aparece en eltítulo de la presente contribución, puede parecer pococientífico. Se piensa con demasiada frecuencia que laciencia ha de ser una actividad fría, desprovista deemociones y no hay nada más lejos de la realidad. Enoctubre de 1989 el Profesor Severo Ochoa pronuncióuna conferencia en Valencia con el sugerente título “Laemoción de descubrir”. La conferencia empezó así:

«Quisiera hoy discurrir sobre la satisfacción quepuede producir el dedicar la vida a la investigación cien-tífica. Pocas veces he sentido emoción más intensa quecuando creí haber hecho descubrimientos de algunatrascendencia».

Y algunos años antes, Konrad Lorenz escribía:

«Es un desatino decir que la investigación positiva,la Ciencia, el conocimiento de las relaciones naturales,menguan el placer que procuran las maravillas de laNaturaleza».

Pueden bastar estos testimonios de dos científicos,galardonados con el premio Nobel, para ilustrar la tesisde que ni la producción científica ni su diseminacióntienen que carecer de las mismas sensaciones queexperimentamos ante un objeto bello, ante una noticiasorprendente, ante una experiencia satisfactoria. Tantoel científico como el estudiante de ciencia puedenentusiasmarse ante el objeto de su estudio, de su con-templación. Es más, son muchos los autores que con-sideran esta actitud como un requisito esencial paraproducir o asimilar la ciencia de calidad. Por tanto, sípueden tener cabida en el léxico del científico califica-tivos como asombroso, admirable, sorprendente, pro-digioso..., adjetivos todos que bien pueden aplicarse a

la molécula objeto del presente artículo, la hemo-globina. Sólo desde esa perspectiva se comprende queel estudio de esta molécula haya atraído la atención delos investigadores hasta el punto de que el número depublicaciones sobre ella crezca ininterrumpidamente,para superar en la actualidad los 6 000 artículosanuales (Fig. 1).

Si se tiene en cuenta tal abundancia de información,es evidente que resulta imposible revisar ni tansiquiera una mínima parte de lo que hoy se conocesobre la hemoglobina. Por eso, este artículo sólo pre-tende presentar algunas de sus propiedades elemen-tales, que la capacitan para desempeñar una función

Figura 1. Evolución ttemporal dde llas ppublicaciones ccientíficassobre hhemoglobina. La representación recoge el número totalde artículos que tratan de hemoglobina recogidos cada año enla base de datos PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/).

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esencial para la vida de todos los vertebrados y dealgunos invertebrados: el transporte de oxígeno. Esapresentación se hará desde una perspectiva molecular.Efectivamente, si se quiere llegar al fondo de lascausas del comportamiento de los sistemas biológicos,hay que descender al nivel molecular, para comprendercómo ese comportamiento biológico viene deter-minado por los cambios —químicos o estructurales—que experimentan las biomoléculas.

EL TRANSPORTE DE OXÍGENO POR LASANGRE

Todos los organismos superiores son estrictamenteaerobios; necesitan indispensablemente el oxígeno. Sedebe a Lavoisier, que descubrió el oxígeno en 1778, laidea de que la respiración animal equivale a una com-bustión lenta, en la que el carbono de la materiaorgánica se transforma en CO2 con el correspondienteconsumo de oxígeno. Realmente, el proceso es máscomplicado y no se acabó de aclarar hasta mediado elsiglo XX. La materia orgánica, con algunas escasasexcepciones, no se oxida directamente por el oxígenoatmosférico, sino por distintas coenzimas, que quedanreducidas en consecuencia. El oxígeno molecular seemplea para reoxidar esas coenzimas, un proceso queen los organismos eucarióticos tiene lugar en las mito-condrias y recibe el nombre de cadena respiratoria.Pero, en cualquier caso, el balance de la oxidaciónequivale al de una combustión, como anticipóLavoisier. Por ejemplo, la oxidación completa de laglucosa obedece globalmente al esquema este-quiométrico:

C6H12O6 6O2 6CO2 6H2O,

por más que el mecanismo real sea muy complicado eimplique docenas de reacciones, incluidas las de lacadena respiratoria.

Los vertebrados terrestres captan el oxígeno através de los pulmones y han de transportarlo a todoslos órganos, puesto que todos ellos lo requieren para lacadena respiratoria. El vehículo mediante el que seproduce el transporte es la sangre. La compleja red delsistema circulatorio, que en un adulto humano llega aalcanzar los 96 000 km de longitud si se suma la detodas las arterias, venas y vasos, asegura la llegada deloxígeno a todas y cada una de las células, cuyo número

está comprendido entre 10 y 100 billones. Pero se pre-senta una importante dificultad para este transporte. Lamolécula de dioxígeno, O2, es muy apolar y como el79% de la sangre es agua, la cantidad de oxígeno quese puede transportar disuelto en la sangre representasólo el 2% del requerido. Para transportar el 98%restante del oxígeno, se utiliza la hemoglobina, unaproteína de peso molecular 68 000, que puede cargarsecon 4 moléculas de dioxígeno. Aquí se aprecia ya undato sorprendente: teniendo en cuenta que el pesomolecular de la molécula de dioxígeno es 32, larelación entre la masa transportada y la del trans-portador es de 1:531. La situación equivaldría a la deun camión de 8 Tm, que sólo pudiera llevar una cargade 15 kg. Estos números, ¿son el resultado de lo quepodríamos llamar un fracaso de la naturaleza?, o, porel contrario, ¿reflejan una precisa función para cuyodesempeño se requiere ese aparente derroche? Losdatos que irán apareciendo a lo largo del presenteartículo permitirán decidir que la segunda opción es laque responde a la realidad.

El examen microscópico de la sangre, como es biensabido, revela que una fracción importante de suvolumen, que se aproxima al 50%, está ocupado porcélulas. De estas, las más abundantes son loseritrocitos o hematíes, vulgarmente conocidos comoglóbulos rojos, de los que hay entre 4,7 y 6,1 millonespor mm3 en los varones y entre 4,2 y 5,4 en lasmujeres, con lo que, si se tiene en cuenta que elvolumen de sangre en un adulto ronda los 5 l, resulta lafabulosa cantidad de unos 25 billones de eritrocitos porpersona adulta. Los eritrocitos son unas células deapariencia discoidal, algo hundidas por su regióncentral y con un diámetro de unos 7,1 m. Su organi-zación es extremadamente simple: no contienenningún orgánulo subcelular, son células carentes deDNA, y por tanto, genéticamente inactivas y su meta-bolismo es muy sencillo. Sólo son capaces de realizarla glicolisis hasta lactato y algunas reacciones de laruta de las pentosas. Su función primordial es la dealmacenar la hemoglobina, de la que cada uno llega aencerrar 270 millones de moléculas, que se encuentranen un alto grado de compactación. De este modo, elnúmero total de moléculas de hemoglobina presentesen un ser humano adulto es de alrededor de 6 750 tri-llones. La sangre contiene, además de los eritrocitos,una cantidad mucho más pequeña de leucocitos —lospopulares glóbulos blancos—, implicados mayorita-

riamente en funciones inmunes y de defensa, y las pla-quetas, células esenciales para la coagulación san-guínea. Como ninguna de estas células está involu-crada en el transporte de oxígeno, no se harán más re-ferencias a ellas en este artículo.

Como se verá más adelante, la unión de oxígeno ala hemoglobina es reversible y sigue los principiosgenerales de las interacciones proteína-ligando,

P L PL,que se rigen por las leyes del equilibrio químico. Estohace que en los pulmones, en los que al estar en con-tacto directo con el aire, la presión parcial de oxígenoes elevada, del orden de 100 torr, el equilibrio sedesplace hacia la unión del oxígeno, que forma uncomplejo con la hemoglobina. En los tejidos, no acce-sibles directamente al aire atmosférico, la presiónparcial de oxígeno es más baja y el equilibrio revierte,con la consiguiente liberación de oxígeno. Un casoparadigmático es el del músculo, en cuyas célulasabunda la mioglobina —una molécula relacionadaestructural y evolutivamente con la hemoglobina—,también capaz de ligar dioxígeno y con mayor afinidadque la hemoglobina. Por eso, el oxígeno liberado poresta se une a la mioglobina hasta su utilización.

La figura 2 reproduce la estructura de ambas pro-teínas, hemoglobina y mioglobina. La primera estáformada por cuatro cadenas polipeptídicas, dos y dos

, mientras que la mioglobina posee una única cadenapolipeptídica. Aunque luego habrá ocasión de contem-plarlo con más detalle, ya se puede adelantar —y sepone de manifiesto en la figura 2— que la estructuraterciaria de la mioglobina es muy parecida a la de lascadenas de la hemoglobina.

Volviendo a los aspectos funcionales, la hemo-globina transporta O2 desde los pulmones hasta lostejidos, donde puede o no almacenarse temporalmenteunido a la mioglobina hasta su utilización. Como se hacomentado antes, esta utilización, en último término,produce CO2, que, al disolverse en el medio acuosointracelular, produce ácido carbónico. Se trata de unareacción que se produce de modo espontáneo, aunqueuna enzima, la anhidrasa carbónica, facilita aún más lareacción desde un punto de vista cinético. El ácido car-bónico es un ácido diprótico, cuyos valores de pKa son3,601 y 10,33. Como consecuencia, en el mediointracelular se encuentra fundamentalmente en formadel anión bicarbonato, , lo que conlleva lapérdida de un protón. Todas estas reacciones quetienen lugar en los tejidos se esquematizan en la figura3. El CO2 se transporta desde los tejidos hacia los pul-

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Figura 2. Comparación dde llas eestructuras dde lla hhemoglobina(Hb) yy dde lla mmioglobina ((Mb) hhumanas. La figura está construi-da con el programa RasMol a partir de los datos de Fermi yPerutz (1984) para la hemoglobina y de Kondrashov et al.(2008) para la mioglobina. En la hemoglobina, que se ve desdeel eje binario de simetría, las cadenas están coloreadas enamarillo y las en azul.

1 El valor que aquí se da es estrictamente el del ácido carbónico. Pero hay que tener en cuenta que en medio acuoso la especie química H2CO3sólo existe en equilibrio con el CO2, por lo que la concentración real del ácido es menor y el pKa para la mezcla real es mayor. De todas for-mas, eso no es obstáculo para que la especie más abundante en el medio fisiológico sea el anión bicarbonato, como se comenta en el texto.

Figura 3. Representación eesquemática ddel ttransporte dde ggasesentre llos ppulmones yy llos ttejidos. Véase el texto para másdetalles.

3HCO

mones de dos formas: una parte, como ion bicarbonatodisuelto en el plasma sanguíneo; otra parte se une a lahemoglobina del modo que luego se verá. En los pul-mones tienen lugar las mismas reacciones que en lostejidos, pero en sentido inverso debido a que la presiónparcial de CO2 es baja. La figura 3 también da cuentaesquemáticamente de este intercambio gaseoso.

ESTRUCTURA DE LA MIOGLOBINA Y LAHEMOGLOBINA

Se ha comentado ya algo acerca de la estructura dela hemoglobina y de la mioglobina y se apuntado que,mientras la estructura terciaria de la mioglobinarecuerda a la de las cadenas de la hemoglobina, unadiferencia esencial es que la mioglobina carece deestructura cuaternaria. Ahora es el momento de pro-fundizar en las diferencias y similitudes entre ambasproteínas. El examen de la estructura primaria de lamioglobina y de las dos cadenas de la hemoglobinasugiere un origen evolutivo común. Al alinear lassecuencias de la mioglobina y la cadena de la hemo-globina se encuentran 23 aminoácidos idénticos. Entrelas dos cadenas de la hemoglobina, la identidad seeleva al 46% (66 residuos). La semejanza estructuralse observa más aún en los niveles secundario y ter-ciario (figura 4). Las tres cadenas poseen una elevadaproporción de hélice (alrededor del 75%) y carecentotalmente de estructura . Como se adelantó, puedeobservarse en la figura que las estructuras terciarias delas tres cadenas son prácticamente superponibles. Hay

que tener en cuenta que, por ejemplo, entre las cadenasy de la hemoglobina además de los 66 residuos

idénticos hay otros 21 que corresponden a sustitu-ciones conservativas. Todo ello hace posible que lasestructuras secundarias y terciarias sean tan seme-jantes.

Siguiendo la propuesta de Watson y Kendrew(1961), es tradicional designar los 8 segmentos dehélice de las cadenas de la mioglobina y hemo-globina mediante letras mayúsculas, ordenadasalfabéticamente desde A hasta H a partir del extremoN-terminal. Dentro de cada segmento de hélice, losdiferentes residuos se numeran correlativamente deacuerdo con su secuencia. Cuando se habla, porejemplo, de la histidina F8 se está haciendo referenciaal octavo residuo contando a partir del extremo N-ter-minal de la hélice F. Los segmentos no helicoidalesque se encuentran entre las distintas hélices se desig-nan AB, BC, y así sucesivamente. Y los situados alinicio o al final de la cadena se identifican como NA yHC respectivamente, donde las letras N y C hacen re-ferencia a los extremos N- y C-terminales de lascadenas.

Hay que tener en cuenta un detalle estructural fun-damental del que no se ha hecho mención hasta ahora:la mioglobina y la hemoglobina son proteínas conju-gadas y en ambos casos el grupo prostético es el hemo,o protoporfirina IX (figura 5). El grupo hemo es unamolécula prácticamente plana. Su sistema de doblesenlaces conjugados hace que los electrones estén


Figura 4. Comparación dde llas eestructuras ssecundaria yy tterciaria dde llas ddos ccadenas dde lla hhemoglobina yy dde lla mmioglobina hhumanas.La figura está construida con el programa RasMol a partir de los datos de Fermi y Perutz (1984) para la hemoglobina y de Kondrasovet al. para la mioglobina. Solo se recogen el esqueleto de las apoproteínas en forma de cintas, para visualizar mejor la estructurasecundaria. Las tres imágenes están en la misma orientación y escala.

deslocalizados en ambas caras del plano. El hierrocentral es un ion Fe2+, coordinado a los 4 nitrógenos delos anillos pirrólicos. Con la salvedad de este ion y delos dos carboxilatos de las cadenas laterales, el con-junto de la molécula es bastante apolar.

El ion Fe2+ tiene posibilidad de formar 6 enlaces decoordinación, con una geometría octaédrica. Loscuatro formados con los nitrógenos de los anillos pi-rrólicos se dirigen aproximadamente desde el centrohacia los vértices de un cuadrado, por lo que los dosrestantes pueden dirigirse en dirección perpendicularal plano del hemo, uno a cada lado. Uno de estosenlaces precisamente se emplea para unir el grupohemo firmemente a la apoproteína, concretamente através de un nitrógeno del imidazol de un residuo dehistidina. La figura 6 muestra la disposición del hemoen una cadena de la hemoglobina, aunque, dada lasimilitud entre ambas cadenas y de ellas con la mio-globina, la figura 6 sirve también, en general, parailustrar la posición del grupo hemo en la cadena y enla mioglobina. La histidina que establece el quintoenlace de coordinación con el hemo es la F82. Al otrolado del plano se encuentran los residuos de feni-lalanina CD1 y valina E11, que proporcionan unentorno apolar adecuado para el acoplamiento delhemo y, como se verá inmediatamente, para la entrada

de la molécula apolar de dioxígeno. Como se apreciatambién en la figura, los carboxilatos del hemo seproyectan hacia la superficie de la molécula, que estáen contacto con el medio polar. En conjunto, se puededecir que el grupo hemo ocupa una hendidura, delimi-tada por las hélices E y F que están orientadas enforma de V abierta hacia la superficie de la molécula.

La unión de la molécula de dioxígeno tiene lugarpor medio del sexto enlace de coordinación del hierrohemínico, como se muestra en la figura 7. Como con-secuencia de esta unión, la molécula de dioxígeno sepolariza lo suficiente como para establecer un enlacede hidrógeno con el imidazol protonado de la histidinaE7. Así pues, hay dos histidinas importantes en elentorno del hemo, la F8 y la E7, que frecuentemente sedesignan como proximal o distal, respectivamente,atendiendo a su distancia al grupo hemo. Se puede uniruna molécula del ligando a cada uno de los cuatrogrupos hemo, de donde resulta la estequiometría, ya


Figura 5. Estructura ddel ggrupo hhemo. A la izquierda se apre-cia la fórmula desarrollada, mientras que a la derecha aparecela estructura que el hemo adopta en la cadena de la hemo-globina. Esta figura está construida con el programa RasMol apartir de los datos de Fermi y Perutz (1984). Para mayor clari-dad se ha adoptado un modelo de bolas y varillas, en el quelos átomos de carbono aparecen en gris, los de nitrógeno enazul, los de oxígeno en rojo y el de hierro en naranja.

Figura 6. Estructura dde lla ccadena de lla hhemoglobina. Larepresentación es equivalente a la de la figura 4, pero muestraademás la localización del grupo hemo y los aminoácidos conque interacciona.

2 El sistema de identificación de los residuos al que antes se ha aludido tiene una ventaja: aunque el lugar que ocupa en la secuencia varía deuna cadena a otra, dada la homología de las cadenas de la hemoglobina y de la mioglobina, en los tres casos el residuo F8 es una histidina yes la que está coordinada con el hemo.

adelantada, de 4 moléculas de dioxígeno a cadamolécula de hemoglobina. La unión puede describirsepor una serie de 4 equilibrios consecutivos:

Hb O2 HbO2HbO2 O2 Hb(O2)2

Hb(O2)2 O2 Hb(O2)3

Hb(O2)3 O2 Hb(O2)4

en la que Hb representa la desoxihemoglobina, o he-moglobina totalmente desoxigenada, mientras que laforma totalmente cargada con el ligando, Hb(O2)4,suele denominarse oxihemoglobina. En la mioglobinael oxígeno se une del mismo modo, aunque, como sóloexiste un grupo hemo por molécula, sólo se da unúnico equilibrio:

Mb O2 MbO2

La unión del O2 a la hemoglobina está acompañadade unos sutiles cambios en el grupo hemo y en suentorno. En primer lugar, el hierro en la desoxihemo-globina se encuentra en un estado de espín alto (S 2),mientras que en la oxihemoglobina el estado de espínes bajo (S 0) (Perutz, 1990). Otros cambios seaprecian claramente en la figura 7. Por ejemplo, en ladesoxihemoglobina el hierro no es perfectamentecoplanar con el resto del grupo hemo y el conjuntoadquiere una estructura algo abovedada. En la oxihe-moglobina, por el contrario, el menor radio iónico delhierro permite su coplanaridad con el resto del grupohemo (Perutz, 1970). Este desplazamiento del hierroconlleva un acercamiento de la histidina proximal alplano del grupo hemo: pasa de estar situada a 2,7 Å delplano a colocarse a una distancia de 2,1 Å. Estedesplazamiento de 0,6 Å de la histidina F8 arrastra lahélice F, que se aproxima así al grupo hemo, con lasconsecuencias que luego se comentarán.

Tanto la hemoglobina como la mioglobina soncapaces de ligar monóxido de carbono del mismomodo que el oxígeno. El tamaño y apolaridad de lasmoléculas CO y O2 son semejantes, así como su posi-bilidad de formar enlaces de coordinación con el hierrodel grupo hemo. Esta semejanza hace que el CO sea unpotente inhibidor competitivo de la unión de oxígeno.Como, por otro lado, la disociación del CO es muydifícil, el monóxido de carbono posee una elevada to-xicidad.

COOPERATIVIDAD EN LA UNIÓN DEOXÍGENO A LA HEMOGLOBINA

La curva de unión de oxígeno a la hemoglobina essigmoide (Fig. 8), lo que está relacionado con el hechode que el ligando se une de modo cooperativo, es decir,la unión de oxígeno favorece su ulterior unión. En elcaso de la mioglobina, al poseer un único centro deunión de oxígeno no cabe hablar de cooperatividad y lacurva de saturación es hiperbólica, como también semuestra en la figura 8.

La cooperatividad en la unión de oxígeno a lahemoglobina es de la máxima importancia funcional.Puede verse en la figura 8 que la saturación de la pro-teína por su ligando es prácticamente del 100% parauna presión parcial de oxígeno de 100 torr, es decir, la


Figura 7. Entorno ddel ggrupo hhemo een lla ccadena de lla hhemo-globina. Se observa con detalle el grupo hemo y su entorno enlas formas desoxigenada (A) y oxigenada (B) de la hemoglobi-na. Además de la histidina distal marcada en la figura (E7) seaprecian las cadenas laterales de la histidina proximal en colorCPK, de la valina E11 (verde) y de la fenilalanina CD1 (azul). Losátomos de oxígeno orgánicos están coloreados con el códigoCPK (rojo), pero los de la molécula de dioxígeno se represen-tan en color morado. La orientación de la figura implica ungiro de 180º alrededor de un eje horizontal con respecto a lafigura 6.

presión parcial de ese gas que existe en los pulmones.En consecuencia, la hemoglobina sale de los pulmonescargada de un modo casi total. En los tejidos peri-féricos la presión parcial de oxígeno oscila aproxi-madamente entre 15 y 45 torr, dependiendo del tipo detejido y de su actividad metabólica. Por ejemplo, en lasfibras musculares en reposo, con sólo una actividadmetabólica basal, la presión parcial de oxígeno estápróxima al límite superior, mientras que durante unejercicio violento, en el que la actividad metabólica esmuy intensa para proporcionar todo el ATP requeridopara la contracción muscular, el consumo de oxígenoes elevado y, por tanto, su presión parcial es baja.

Es evidente que un transportador ideal debe liberartanto más oxígeno cuanto mayor sea la demanda queexista de él. Por seguir con el ejemplo del párrafoanterior, en el músculo en reposo basta con liberar unapequeña cantidad de oxígeno, cantidad que habrá derondar la máxima posible en un caso de ejercicio vio-lento. Pues bien, como se ha comentado anteriormente,las leyes del equilibrio hacen que éste se desplacehacia la liberación de oxígeno en los tejidos y la figura8 proporciona una forma de cuantificar esta liberación.Por ejemplo, en un tejido cuya presión parcial de

oxígeno fuera 20 torr, la hemoglobina sólo retieneaproximadamente el 30% de oxígeno y, si se habíacargado al 98% en los pulmones (véanse las líneas depuntos en la figura 8), la cantidad liberada será el 68%.Por el contrario, en condiciones de baja demanda deoxígeno, por ejemplo, cuando la presión parcial es de40 torr, la hemoglobina retiene aún un 75% y, por tantola cantidad liberada será aproximadamente el 23%. Elexamen de la figura 8 pone de manifiesto que estecomportamiento es posible gracias a la forma sig-moide de la curva de saturación, es decir, gracias a lacooperatividad con la que la hemoglobina une eloxígeno. En efecto, si su curva de saturación fueracomo la de la mioglobina, aunque la proteína se car-garía totalmente en los pulmones, la cantidad retenidaa presiones parciales de oxígeno comprendidas entre20 y 40 torr sería superior al 90% o, dicho con otraspalabras, la cantidad liberada sería muy pequeña. Laforma sigmoide de la curva de saturación de la hemo-globina, en la que la región de máxima pendiente tienelugar precisamente en el intervalo 15-45 torr, aseguraque la respuesta de la hemoglobina a la demanda deoxígeno —medida por la presión parcial existente encada lugar— es la adecuada para un transporte ideal.

Por otro lado, la comparación de las curvas de satu-ración de la hemoglobina y de la mioglobina explicapor qué en los músculos el oxígeno liberado por laprimera queda unido a la segunda: es una cuestión deafinidad por el ligando, mayor en el caso de la mio-globina como muestra la figura 8.

Así pues, la estructura tetramérica de la hemo-globina permite la existencia de cooperatividad, cir-cunstancia que hace de esa proteína un transportadorideal. Pero para que haya cooperatividad en la uniónde ligando a una proteína no basta con que haya másde un sitio de unión. Se precisa que haya una comuni-cación entre ellos, de modo que un sitio detecte si hayotros ocupados o no y la afinidad de la unión deligando se ajuste en consecuencia. Dicho de otromodo, cuanto se ha considerado en este apartadoexplica por qué la conducta cooperativa de la hemo-globina representa una ventaja fisiológica para suactuación como proteína de transporte, pero no explicalas causas de la cooperatividad. Más adelante se daráuna explicación molecular de la cooperatividad, peroantes es preciso seguir describiendo las propiedades dela hemoglobina.


Figura 8. Curvas dde uunión dde ddioxígeno aa lla mmioglobina yy aa llahemoglobina. Se representa la saturación porcentual en fun-ción de la presión parcial de oxígeno. La franja sombreada enrosa indica la presión parcial de oxígeno en los pulmones anivel del mar. La franja sombreada en verde indica el intervalode presiones parciales de oxígeno en los tejidos periféricos.

EL EFECTO BOHR

Christian H. L. P. E. Bohr (1855-1911), fisiólogodanés y padre del físico Niels Bohr (Fig. 9), descubrióen 1903 que la sangre retenía menos oxígeno cuantomás bajo era su pH. En términos actuales, se puededecir que la unión del oxígeno a la hemoglobina estáregulada por el pH sanguíneo, de modo que undescenso de pH disminuye la afinidad de la proteínapor su ligando (Fig. 10). Si se observa de nuevo lafigura 3, se recordará que el CO2 producido en lostejidos como consecuencia de la actividad metabólicaacaba convirtiéndose en ácido carbónico, que sedisocia liberando protones, es decir, bajando el pH delmedio en que se produce la reacción. Estos procesostienen lugar también en el propio eritrocito, como serecoge en la figura 11. El CO2 que se produce en lostejidos pasa en parte a la sangre y, por difusión, seintroduce en los eritrocitos. Evidentemente, cuantomayor sea la actividad metabólica de los tejidos, tantomayor es la cantidad de CO2 que se produce y, en con-secuencia mayor es la disminución del pH de loseritrocitos. El efecto Bohr permite de esta manera quela hemoglobina libere más oxígeno cuanto mayor seala actividad metabólica de un tejido. La ventaja fisio-

lógica de la existencia del efecto Bohr es, pues, fácil deentender. Pero, como se decía al principio de esteartículo, profundizar en las causas del comportamientode los sistemas biológicos, implica llegar al nivelmolecular. En este caso, será necesario comprender elmecanismo por el que un descenso de pH hace que el


Figura 9. Christian BBohr ((1855-1911).

Figura 10. Influencia ddel ppH ssobre lla uunión dde ddioxígeno aa llahemoglobina. Se aprecia la variación de la saturación de lahemoglobina por oxígeno al variar el pH (efecto Bohr).

Figura 11. Esquema ddel iintercambio ggaseoso een eel eeritrocito.Se pone de manifiesto el desplazamiento de la unión deoxígeno a la hemoglobina al descender el pH (efecto Bohr). Elmecanismo molecular responsable del efecto Bohr se estudiamás adelante en el texto. Por esa razón el desplazamiento delequilibrio de unión Hb-O2 se señala con un signo de interro-gación en la figura.

equilibrio de unión de las moléculas de dioxígeno a lahemoglobina se desplace en el sentido de su diso-ciación. En otras palabras, es preciso despejar el inte-rrogante que, de una forma gráfica, se recoge en lafigura 11, cuestión que se abordará más adelante.

EFECTOS DEL 2,3-BPG

En 1967 se describió que el 2,3-bisfosfoglicerato(2,3-BPG), un compuesto con elevada densidad decarga negativa, como se aprecia en la figura 12,actuaba como un inhibidor de la unión del oxígeno a lahemoglobina (Benesch y Benesch, 1967). En efecto, alaumentar la concentración de 2,3-BPG disminuye lasaturación de la hemoglobina por oxígeno (Fig. 13). El2,3-BPG se había descubierto años atrás como compo-nente de los eritrocitos y, al analizar la sangre de difer-entes etnias, se había encontrado que los habitantes delas altiplanicies andinas poseían una concentraciónmuy alta de ese compuesto, por lo que inicialmente secreyó que constituiría un marcador característico deese grupo étnico. Pero cuando se analizaron condetalle las curvas de unión de oxígeno a la hemo-globina en presencia de concentraciones normales yelevadas de 2,3-BPG, se pudo comprobar que su efectoinhibidor constituye la base de una excelenteadaptación a la altura. Efectivamente, a una alturaelevada sobre el nivel del mar, por ejemplo, 4 000 m,la reducida presión atmosférica hace que la presiónparcial de oxígeno en los pulmones se sitúe en torno a60 torr, en vez del valor de 100 torr antes considerado,que es válido al nivel del mar. Pues bien, al observar la

figura 14, que es una repetición de la anterior conalgunas precisiones, se ve que en una persona con unnivel normal de 2,3-BPG en su sangre que seencuentre al nivel del mar la hemoglobina se carga conoxígeno en sus pulmones prácticamente al 100%,como se ha visto antes. En un tejido cuya presiónparcial de oxígeno sea un poco inferior a 40 torr la sa-turación de la hemoglobina es solo del 70% aproxi-madamente. Eso significa que la hemoglobina liberaen ese tejido un 30% de oxígeno, en términos de sucapacidad total, como indica la barra roja en la figura14. Si esa persona se traslada a una altura de 4 000 m yla presión parcial de oxígeno en sus pulmones es algoinferior a los 60 torr, la hemoglobina se cargará sólo al90% y, por tanto, al llegar al tejido en cuestión, dondela saturación es del orden del 70% liberará solo un20% de su capacidad total (barra roja de trazos). Enotras palabras, al pasar del nivel del mar a 4 000 m dealtura, la cantidad de oxígeno transportada a los tejidosdisminuye a los dos tercios de la que se transportaríainicialmente. Este es el origen del malestar que sufrenlas personas que se trasladan a un lugar de gran alturasobre el nivel del mar, el conocido soroche o mal dealtura. El déficit de transporte de oxígeno a las célulasdel sistema nervioso central provoca mareo, cefalea y,en algunos casos, irritabilidad. Por su parte, el déficiten los músculos es el causante de atonía y cansanciogeneralizados.


Figura 12. Estructura ddel 22,3-bisfosfoglicerato ((2,3-BPG).

Figura 13. Efecto ddel 22,3-BPG ssobre lla uunión dde ooxígeno aa llahemoglobina. Se representan dos curvas de saturación, una enpresencia de una concentración normal de 2,3-BPG (4,5 mM),como la que tiene una persona que habite al nivel del mar, y laotra en presencia de una concentración elevada del efector(5,8 mM), característica de los habitantes de las altiplaniciesandinas.

Sin embargo, para una persona que posea una con-centración elevada de 2,3-BPG en su sangre la curvade saturación de la hemoglobina es distinta. En lafigura 14 se representa en color azul y en ella se puedeobservar que, si bien a 4 000 m de altura la hemo-globina se satura aún menos con oxígeno en los pul-mones (del orden del 85%), la inhibición causada porel 2,3-BPG es más acusada en los tejidos3; en elejemplo que se está usando y que viene precisado porlas rectas punteadas en la figura 14, el oxígenoretenido en el tejido de referencia con una elevada con-centración de 2,3-BPG está en torno al 55%, con loque la cantidad transportada es equivalente a la que setransportaría a nivel del mar en un individuo con nivelde 2,3-BPG normal.

En contra de lo que se pensó en un principio, laconcentración de 2,3-BPG en sangre no depende decaracterísticas étnicas, sino que es consecuencia de unproceso de adaptación metabólica. Al cabo de un cierto

tiempo de estar a presión atmosférica baja, la concen-tración de 2,3-BPG aumenta y, de modo inverso,cuando se retorna a una situación de presión atmos-férica alta, el nivel de ese compuesto vuelve a losvalores normales. De este modo, la ventaja fisiológicaque proporciona el efecto inhibidor del 2,3-BPGresulta evidente: se trata de un mecanismo deadaptación a las alteraciones de presión atmosférica,como las que siguen a las variaciones grandes de alturasobre el nivel del mar.

LA EXPLICACIÓN MOLECULAR

En los párrafos precedentes se han descrito trespropiedades de la unión de oxígeno a la hemoglobina:la existencia de cooperatividad, el efecto Bohr, esdecir, la influencia del pH en la curva de saturación yel efecto inhibidor del 2,3-BPG. Además, se han puestode manifiesto las ventajas fisiológicas que reportanesas propiedades. Pero esta descripción no basta, ytampoco es suficiente que se comprendan las ventajasde tal comportamiento. Si se quiere profundizar cientí-ficamente en un proceso biológico, hay que buscar suscausas y, como ya se ha comentado, es preciso llegar alnivel molecular para comprender con profundidad esascausas. De este modo, cabe ahora plantearse una triplepregunta: ¿qué tiene la molécula de hemoglobina paraque haya cooperatividad en la unión de oxígeno; paraque esta venga influenciada por las variaciones de pH;para que sea inhibida por el 2,3-BPG?

A lo largo del tiempo, se han intentado dar muchasrespuestas a esa triple pregunta o, al menos, a algunade sus partes. Por ejemplo, Hill elaboró hace un sigloel primer modelo que intentaba explicar la coopera-tividad. Pero el modelo de Hill se quedó en una simpledescripción matemática de la cooperatividad, sin daruna interpretación molecular del fenómeno. La formageneral actual de la ecuación de Hill es:

En la ecuación [I] representa la función de satu-ración, [L] la concentración de ligando, n es el número


Figura 14. Función ddel 22,3-BPG. Sobre las curvas de la figura13 se han añadido detalles para comprender la función del2,3-BPG en la adaptación a la altura. La barra vertical roja re-presenta la cantidad de oxígeno liberada en un tejido cuya pre-sión parcial de ese gas sea de 37 torr, por una persona que,con una cantidad normal de 2,3-BPG respire a nivel del mar. Labarra vertical roja de trazos es la cantidad de oxígeno que li-beraría en el mismo tejido esa misma persona situada rápida-mente a 4 000 m de altura sobre el nivel del mar. La barra ver-tical azul corresponde a la cantidad de oxígeno liberada a4 000 m de altura sobre el nivel del mar por una persona conuna concentración elevada de 2,3-BPG. Véase el texto paramás detalles.

3 Hay una clara razón geométrica para esta diferencia, ya que, como se ha comentado antes, el carácter sigmoide de la curva hace que el tramode mayor pendiente se sitúe precisamente en la zona correspondiente a la presión parcial de oxígeno habitual en los tejidos.

[I]

de sitios de unión de ligando por cada molécula de pro-teína, cH indica el coeficiente de Hill y K es una con-stante que carece de significado físico4. La función desaturación es una magnitud que se emplea en el estudiode las interacciones proteína-ligando para evaluar elnivel de unión de ligando a una concentración dada deligando. Se puede definir como los moles de ligandounido por mol de proteína total. Es evidente que elvalor de , que aumenta al aumentar [L], puede oscilarentre 0 y n. El coeficiente de Hill, que varía tambiénentre 0 y n, es una medida del grado de cooperatividad:cuanto más se aproxime a n mayor es la cooperatividadque presenta la unión de ligando a la proteína.

La ecuación [I] puede adaptarse fácilmente paraaplicarla a las curvas de saturación de la hemoglobina.Basta tener en cuenta que, si se quiere evaluar la satu-ración de forma porcentual y en vez de concentraciónse utiliza la presión parcial de oxígeno, como se havenido haciendo hasta ahora, la ecuación toma laforma:

donde S es el porcentaje de saturación y p la presiónparcial de oxígeno.

Como se acaba de apuntar, el tratamiento de Hillno puede dar una explicación molecular de la coopera-tividad de la hemoglobina —y mucho menos delefecto Bohr o de la inhibición causada por el 2,3-BPG—, sino solo cuantificarla. Los primeros intentosde justificar la cooperatividad, tal vez inspirados enla idea latente en una propuesta de Linus Pauling,intentaban dar una explicación microscópica, es decir,la cooperatividad se explicaría a nivel de cadamolécula concreta, o sea, la unión de ligando a unsitio de una molécula conllevaría el aumento de laafinidad de los demás sitios de esa misma molécula.Evidentemente, aunque la naturaleza de las comunica-ciones que pueden existir entre los diferentes sitios deunión de una moléculas se desconozca, parece a

simple vista lógico pensar que esa comunicaciónpuede existir.

Habían de pasar muchos años, fecundos en lainvestigación sobre la estructura y propiedades de lasproteínas, para que se empezaran a vislumbrar lasposibles causas de la cooperatividad en la unión deloxígeno. En general, se puede hablar de coopera-tividad en la unión de ligandos, ya que este compor-tamiento no es, ni mucho menos, exclusivo de lahemoglobina. A finales de la década de 1950 se des-cubrieron algunas enzimas que presentaban coopera-tividad en la unión de sus sustratos y que, por tanto, envez de presentar la clásica cinética de Michaelis-Menten, con sus típicas curvas hiperbólicas5, seobtenían curvas sigmoides al representar la velocidadinicial frente a la concentración de sustrato. Entre esasenzimas se encontraba la treonina desaminasa, queconstituía el tema de la investigación predoctoral deJean Pierre Changeux. Dos consagrados investi-gadores del Instituto Pasteur de París, Jacques Monody François Jacob le habían propuesto al alimón en1959 iniciar una tesis sobre la retroinhibición de la tre-onina desaminasa por isoleucina.

Monod y Jacob llevaban algún tiempo colaborandoen el estudio de la regulación genética y llegaron apostular en 1961 el famoso modelo de regulación deloperón lac de Escherichia coli, que les valdría laobtención del premio Nobel. Lo mismo que en eloperón lac la proteína represora cambia su capacidadde interaccionar con el DNA al unirse a una moléculano relacionada estructuralmente, la treonina desami-nasa, que cataliza la primera etapa de la biosíntesis deisoleucina, pierde su capacidad de unir sustrato enpresencia de ese producto final, que no está rela-cionado estructuralmente con la treonina. Changeuxobservó que la enzima, poseía varias subunidades yque por calentamiento ligero se hacía insensible a losefectos del inhibidor, isoleucina, pero no se modi-ficaba su capacidad catalítica. Este fenómeno, que elpropio Changeux comenzó a llamar desensibilización,parecía indicar que sustrato e inhibidor se unían a

1001

H

H

c

cKpSKp


4 En el tratamiento original de Hill, K sería la constante de afinidad para la un ligando que presentara cooperatividad infinita en su unión. Laecuación [I] corresponde a una reelaboración del tratamiento inicial, en el que K carece generalmente de sentido. A pesar de las deficienciasmatemáticas, la ecuación se sigue utilizando en la actualidad para determinar el coeficiente de Hill.5 La cinética de Michaelis-Menten se ha tratado en otro artículo de este programa, perteneciente al año 2005 (Franco, 2007).

[II]

sitios diferentes en la enzima. Precisamente entonces,Monod acuñó el término alosterismo. Esta palabra deraíz griega significa precisamente eso: otro lugar.

Monod y Jacob (1961) por un lado y Changeux(1961) por otro, presentaron sus resultados en laedición de 1961 de los Cold Spring Harbor Symposia.Cuando el volumen que recogía sus intervenciones sepublicó, la comunidad científica tuvo ocasión de leerpor primera vez la palabra alosterismo, que Monod nohabía llegado a pronunciar en público. Monod,Changeux y Jacob (1963) definen el mecanismoalostérico con una condición negativa y con otra posi-tiva. La primera niega la existencia de interaccionesdirectas de cualquier género entre el sustrato o sus-tratos de una proteína alostérica y el efector,metabolito que controla su actividad. La segundaestablece que el efecto alostérico se debe totalmente auna alteración conformacional reversible inducida enla proteína cuando se une el efector específico.

Cuando Monod, Changeux y Jacob (1963)establecieron estos conceptos, se conocían aún pocasenzimas cuyo comportamiento se pudiera definir comoalostérico. En su artículo se detienen expresamente en6, pero, además de las enzimas, añaden precisamentela hemoglobina —enzima honoraria, la llamarían mástarde—, cuyo comportamiento tanto tiene en comúncon la treonina desaminasa y el resto de las enzimasalostéricas: el estar formada por varias cadenaspolipeptídicas, la cooperatividad en la unión del

ligando y la inhibición de esta unión por una moléculano relacionada, el 2,3-BPG.

El primer modelo que dio cuenta de un modo satis-factorio de las posibles causas moleculares de la coo-peratividad y del alosterismo fue fruto de la intuiciónde Monod, que siguió contando con la participación deChangeux e inició una colaboración con JeffriesWyman (Fig. 15). Era este investigador norteameri-cano, que trabajaba entonces en Roma, uno de losmejores conocedores de la hemoglobina, la enzimaalostérica honoraria. El resultado del esfuerzo coor-dinado de los tres investigadores, fue una publicaciónen la que se proponía “un modelo plausible” paraexplicar la naturaleza de las transiciones alostéricas(Monod et al., 1965). Con frecuencia se ha identi-ficado ese modelo con las iniciales de sus tres autores:MWC.

Gran parte del artículo está dedicada a explicar lacooperatividad y sobre este extremo es precisodetenerse inicialmente. Postulan la existencia en esasproteínas, aun en ausencia de ligando, de dos estadosconformacionales, T y R, que difieren en cuanto aafinidad por el ligando —mayor para las formas R—,y que pueden interconvertirse libremente. No admitenla existencia de estados intermedios, que poseanpropiedades estructurales híbridas entre T y R. Los nsitios de unión de ligando a las formas R son equiva-lentes e independientes6 entre sí, y otro tanto ocurrecon los sitios de las formas T. Es obvio que, si no fuera


Figura 15. Jacques MMonod, 11910-1976 ((izquierda), JJeffries WWyman, 11901-1995 ((centro) yy JJean-Pierre CChangeux, 11936- ((derecha).

6 En el estudio de las interacciones proteína-ligando se habla de sitios equivalentes e independientes para referirse a aquellos cuya afinidadno varía con el grado de saturación que posea la proteína. En otras palabras, no existe cooperatividad.

por la coexistencia de T y R, la unión de ligando trans-curriría sin cooperatividad. Pero cuando se tienen encuenta los presupuestos anteriores, es evidente que, alañadir ligando, éste se unirá preferentemente a lasformas R, las de afinidad mayor. Una simple conside-ración de las leyes del equilibrio químico nos indicaque la presencia de ligando conlleva un desplaza-miento del equilibrio T R hacia estas últimas formas,lo que da lugar a un incremento global de la afinidad.La figura 16 muestra esquemáticamente el proceso deunión de ligando a una proteína que, como la hemo-globina, posea cuatro sitios, uno en cada cadenapolipeptídica.

Es evidente que, a medida que avanza la unión delligando, la población de formas R irá creciendo. Si ini-cialmente el equilibrio T R está muy desplazadohacia la izquierda, al irse uniendo ligando el desplaza-miento progresivo hacia la derecha puede dar lugar a

que la proteína totalmente saturada por ligando seencuentre prácticamente toda en forma R. A medidaque aumenta la proporción de formas R, su con-tribución a la unión de ligando se hará más y másimportante y, puesto que estas formas son las de altaafinidad, es obvio que la constante de unión delligando a la proteína irá aumentando progresivamente.La interpretación de la cooperatividad que implica elmodelo de Monod, Wyman y Changeux es macroscó-pica, esto es, la cooperatividad existe a nivel del con-junto de las moléculas presentes en la disolución.Ciertamente, las propiedades de cada moléculaconcreta son decisivas, pero se ponen de manifiestosolo como consecuencia del comportamiento de la di-solución. Se ha hecho anteriormente una referencia alas leyes de los equilibrios químicos y vale la penarecordar que la validez de estas leyes es macroscópicay no tienen por qué regir a nivel microscópico.

La figura 17 puede aclarar cuanto se viene diciendosobre el carácter macroscópico del modelo MWC. Enla situación concreta representada, que no tiene queocurrir necesariamente, en ausencia de ligando sonmás abundantes las formas T. Eso hace que al añadirligando, este se pueda unir en números absolutos a másformas T que R, pero la mayor afinidad de estas


Figura 16. El mmodelo dde MMonod, WWyman yy CChangeux. Enausencia de ligando coexisten dos formas T y R. El ligando (S)se puede unir a ambas formas, con lo que todos los equilli-brios que se muestran en la figura son posibles. No caben for-mas intermedias entre T y R. En todos los casos, el subíndicede T y R indica el número de sitios ocupados por ligando.

Figura 17. Esquema qque mmuestra eel ccarácter mmacroscópico ddelmodelo MMWC. (A) Una disolución de una proteína tetramérica,como la hemoglobina, en la que las formas T predominansobre las R. (B) Al añadir ligando, se ocupan más sitios en lasformas T por ser más abundantes, pero proporcionalmente laocupación de sitios (simbolizada por el color rojo de la sub-unidad cargada con ligando) es superior en las formas R, demayor afinidad. Este hecho distorsiona el equilibrio entre lasformas T y R vacías. Para que el equilibrio se restablezca, algu-na forma T (por ejemplo, la señalada con la flecha verde) ha deconvertirse en R. (C) Situación de la disolución de proteína trasla conversión de una forma T en R. La proporción global deformas R ha aumentado y la unión del ligando que se añadaposteriormente estará facilitada.

últimas hace que la proporción de formas R conligando unido sea mayor que en el caso de T. Aunquelos valores cuantitativos para el número de moléculasrepresentado en la figura —pequeño en comparacióncon el que existe en una disolución aunque sea bas-tante diluida— no se puedan considerar absolutamenteválidos, se ha procurado respetar esa unión propor-cionalmente mayor de ligando a las formas R.Evidentemente, la relación entre formas R y T vacíashabrá disminuido y las leyes del equilibrio hacen que,para que se mantenga la relación, la concentración deformas R no ocupadas por ligando deba aumentar. Enotras palabras, algunas moléculas de forma T habránde convertirse en R. Por ejemplo, la molécula señaladacon una flecha en la figura 17B puede ser una de ellas,con lo que se llegaría a la situación esquematizada enla figura 17C7.

A pesar de la inicial extrañeza que puede causar elcarácter macroscópico del modelo MWC, cuando seconsidera despacio puede deslumbrar su absoluta sen-cillez. Hay que señalar, no obstante, que esta mismasencillez ha pasado inadvertida a más de un autor, quese ha limitado a constatar que las ecuaciones derivadasde ese planteamiento conceptual se ajustan cuantitati-vamente bien al comportamiento experimental dealgunas proteínas. En el artículo original (Monod etal., 1965) los autores proponían la ecuación III paradescribir la unión cooperativa de un ligando a una pro-teína:

en la que es el grado de saturación, es decir, lafracción molar de sitios ocupados por ligando, n es elnúmero de sitios de unión de ligando por molécula deproteína, L la constante alostérica, definida como laconstante del equilibrio entre las formas T y R enausencia de ligandos8 y c es el cociente entre las con-

stantes de disociación para la interacción del ligandocon las formas R y T, respectivamente. No es este ellugar adecuado para presentar una deducción de laecuación III, pero el lector interesado puede acudir a larevisión de Tipton (1979), que es especialmente claraal respecto.

Los datos experimentales de unión de oxígeno a lahemoglobina se ajustan satisfactoriamente a laecuación III; el mejor ajuste se logra para L 9054 yc 0,014.

Conviene hacer hincapié en que la resistenciainicial al modelo MWC se debía a su caráctermacroscópico. Por eso algunos ni siquiera advirtieronla necesidad lógica de admitir el postulado de la con-servación de simetría, es decir, la imposibilidad deencontrar formas híbridas entre T y R. La reacción nose hizo esperar y, poco después de la aparición delartículo de Monod, Wyman y Changeux, se publicóotro con el germen de lo que sería el segundo granmodelo alostérico (Koshland et al., 1966). El artículoestaba firmado también por tres investigadores,Koshland, Némethy y Filmer, y también se conoce fre-cuentemente, de acuerdo con las iniciales de losautores, como el modelo KNF. En ese primer artículo,Koshland y sus colaboradores explicaban la coopera-tividad con un modelo microscópico, según el cualtodas las moléculas de la proteína se encuentran en lamisma conformación en ausencia de ligando y la uniónde este altera exclusivamente la conformación de lasubunidad ocupada. La proteína va así cambiandosecuencialmente de conformación. Esto puede afectara la estabilidad de la estructura cuaternaria, si elcambia conformacional de cada subunidad altera sumodo de interacción con las contiguas. Y como la esta-bilidad puede aumentar o disminuir, puede resultarcooperatividad positiva o negativa9. Los datos experi-mentales de la unión de oxígeno a la hemoglobinatambién se ajustan satisfactoriamente a las ecuacionesobtenidas por el modelo KNF (Koshland et al., 1966).


7 Es preciso insistir en que con un número pequeño de moléculas como el utilizado para construir la figura 17, las leyes del equilibrio quími-co, que son válidas a nivel macroscópico, no tienen por qué cumplirse exactamente. No debe buscarse, pues, que la relación R/T se manten-ga exactamente al comparar las figuras 17A y 17C; solo se pretende mostrar que el déficit de formas R en la figura 17B se compensa con latransición T R que ocurre al pasar a la situación de la figura 17C.8 Esta constante se define como T0/R0, donde el subíndice 0 se refiere a la ausencia de ligandos.9 En la cooperatividad negativa, que se presenta en algunas proteínas, la unión de ligando hace que disminuya la afinidad de los sitios deso-cupados.

[III]

Los años siguientes fueron fecundos, ya que la pu-blicación del modelo KNF inició lo que Changeux(1993) llamó una “controversia creativa” entre las dosconcepciones —macroscópica y microscópica— de lacooperatividad. Es evidente que no basta con que elajuste de las curvas de saturación sea bueno. En defini-tiva, tanto la ecuación III como las del modelo KNFcorresponden a cocientes de polinomios que, como esbien sabido, pueden adoptar las más variadas formasgeométricas. Por ese motivo, los investigadores se lan-zaron pronto a estudiar si, efectivamente, la conductade la hemoglobina quedaba bien definida por elmodelo MWC o se adaptaba mejor al KNF.

Evidentemente, si la hemoglobina se ajusta almodelo KNF, en ausencia de oxígeno todas lasmoléculas de la proteína se encontrarán en la mismaconformación, mientras que si sigue el modelo MWC,en esas condiciones deben coexistir las formas T y R.Surge inmediatamente la pregunta: ¿podría detectarseexperimentalmente esta coexistencia? Está claro que sila respuesta es positiva es posible inclinarse fácilmentepor uno u otro de los modelos. Pero una consideraciónfácil permite contestar negativamente a la preguntaque se acaba de formular. Antes se ha comentado queel ajuste de los datos experimentales a la ecuación delmodelo MWC se logra para L 9054, es decir, admi-tiendo que el proceso de unión siguiera el modeloMWC, en ausencia de oxígeno, aunque coexistirían lasformas T y R, la proporción de las primeras sería casi10 000 veces superior a la de las segundas; la abun-dancia de las formas R sería prácticamente despre-ciable, muy difícil de confirmar experimentalmente.Dicho con otras palabras, la estructura de la desoxihe-moglobina debe corresponder prácticamente a laforma T, en el supuesto de que la hemoglobina siguierael modelo MWC. Por el contrario, la estructura de laoxihemoglobina debería corresponder prácticamente ala de la forma R.

La cristalización de la hemoglobina en diversosestados de unión de ligandos permitió en la década de1960 estudiar mediante difracción de rayos X laestructura terciaria y cuaternaria de la desoxihemo-globina y de la oxihemoglobina10, gracias fundamen-

talmente al trabajo del laboratorio de Max Perutz, queobtuvo en 1962 el premio Nobel de Química por susinvestigaciones. Perutz asumió que la estructuraobtenida para la desoxihemoglobina correspondía a lade la forma T de Monod, Wyman y Changeux,mientras que la de la oxihemoglobina se asimilaba a lade la forma R. En la comparación de ambas estructurasque se da a continuación, se sigue el trabajo de Perutz(1970), mientras no se diga lo contrario.

La principal diferencia entre la forma T y la R se daen la estructura cuaternaria. Si esta puede definirsecomo la unión de dos dímeros , que, en lo sucesivo,se designan como 1 1 y 2 2, la transición T R sedescribe fundamentalmente como la rotación, de unos12-15º, de un dímero sobre otro. En la figura 18 seaprecian las estructuras de las formas T (desoxihemo-globina) y R (oxihemoglobina). Se puede observar larotación y la consiguiente variación de la amplitud delhueco central que existe en la molécula de hemo-globina. Describir el cambio conformacional comouna rotación de un dímero con respecto al otro implicaque, mientras los contactos 1- 1 y 2- 2 cambianpoco como consecuencia de la transición T R, loscontactos 1- 2, 1- 2, 1- 2 y 2- 1, lo hacen demodo importante.


10 Estrictamente hablando, la estructura de la oxihemoglobina no se describió directamente, debido a las dificultades para cristalizarla. Sepudo cristalizar el complejo entre hemoglobina y monóxido de carbono y estudiar su estructura mediante difracción de rayos X.. Al ser estecompuesto un inhibidor competitivo de la unión de oxígeno, la estructura que resulta de su unión es idéntica a la de la oxihemoglobina.

Figura 18. Estructura dde llas fformas TT yy RR dde lla hhemoglobinahumana. (A) Estructura de la desoxihemoglobina. Por lasrazones dadas en el texto, se asimila a la forma T. (B) Estructurade la “oxihemoglobina”. En realidad, la estructura se deter-minó experimentalmente a partir de un complejo hemoglobi-na-monóxido de carbono. Por las razones dadas en el texto, seasimila a la forma R. Las figuras están representadas a partir delos datos de Fermi et al. (1984) para la desoxihemoglobina yde Jenkins et al. (2009) para la oxihemoglobina mediante elprograma RasMol. Las moléculas de hemoglobina se vendesde el eje binario de simetría, pero están giradas 40º en elsentido contrario a las agujas del reloj con respecto a la de lafigura 2.

A nivel de la estructura terciaria de las subunidades,los cambios son sutiles, aunque importantes. Los quetienen lugar en el entorno del grupo hemo se handescrito más arriba y se ha comentado que la unión deoxígeno implica un desplazamiento de 0,6 Å de la his-tidina proximal, que arrastra la hélice F y, en conse-cuencia, la región FG. En las cadenas este cambio,aunque sea pequeño —no llega a 1 Å—, es de graninterés. Afecta a la posición de la histidina C-terminal,cuyo imidazol interacciona con el carboxilo lateral delaspartato FG1. A su vez, en la forma T, el carboxiloterminal de esa histidina establece interaccionesiónicas con la cadena lateral de una lisina de la cadenaa del otro dímero. Todo esto da lugar al cambio en loscontactos 1- 2, que antes se ha mencionado, al pasarde la estructura T a la R (Perutz, 1990).

Pero las consideraciones estructurales que seacaban de hacer no solo explican a nivel molecular lanaturaleza de las diferencias entre las formas T y R,sino que, en buena parte, sirven para explicar la causadel efecto Bohr. Se acaba de indicar que, en las formasT, la histidina C-terminal (HC3) de cada cadena interacciona con el aspartato FG1 de la misma cadena.Pues bien, dado el valor del pKa del imidazol de esashistidinas, proximo al pH fisiológico, una pequeña ele-vación del pH conlleva una importante disminución dela carga positiva de la cadena lateral, con el consi-guiente debilitamiento de su interacción con elaspartato FG1. Como quiera que esta interacción esdecisiva en el mantenimiento de los contactos 1- 2 enla forma T, el resultado es que una elevación del pHdesestabiliza la forma T. Esto explica en parte el efectoBohr, ya que si, al elevar el pH, el equilibrio T R sedesplaza hacia las formas R, al ser estas las de altaafinidad por el oxígeno, es lógico que la unión de esteligando se vea favorecida a pH más alcalino. Unaexplicación exhaustiva del efecto Bohr es, evidente-mente mucho más compleja, pero estaría fuera delugar en este artículo. El lector interesado puede con-sultar la excelente revisión de Perutz et al. (1998) o lamás reciente de Giardina et al. (2004) para obtenermás detalles.

En 1972, se describió, tras experimentos dedifracción de rayos X, la estructura del complejo entrela hemoglobina y el 2,3-BPG (Arnone, 1972). En laproteína existe un único sitio de unión para el efector,que se encuentra exclusivamente en la forma T, pre-

cisamente en el hueco central que, como se ha visto enla figura 18, existe en la molécula lejos de los gruposhemo, lugares de unión del oxígeno. El sitio está flan-queado por los aminoácidos, así como por las hélicesH NA1-NA3 de ambas cadenas . En ese lugar, graciasa sus cargas negativas, el 2,3-BPG interacciona con elgrupo amino terminal de la valina NA1 y con lascadenas laterales de His NA2, lisina EF6 e His H21 decada cadena. El conjunto de estos puentes salinos entrelas cargas negativas del 2,3-BPG y las positivas de los8 aminoácidos implicados proporciona una gran esta-bilidad a la interacción. Como esta interacción hemo-globina-efector tiene lugar exclusivamente en la formaT de la proteína, la presencia del efector desplaza elequilibrio T R hacia la izquierda. Puesto que, segúnlas hipótesis del modelo MWC, las formas T son las debaja afinidad por el oxígeno, está claro que unaumento en la concentración del efector conlleva latransición hacia una forma de baja afinidad por eloxígeno y, por tanto a la disociación de este ligando.

El conocimiento del modo de acción del 2,3-BPGpermitió además solucionar el mecanismo de la trans-ferencia de oxígeno de la madre al feto. La hemo-globina fetal, que se conoce como HbF en contra-


Figura 19. El ssitio dde uunión ddel 22,3-BPG een lla fforma TT dde llahemoglobina. La molécula de hemoglobina se muestra en lamisma orientación que en la figura 18. Las hélices de las cade-nas se muestran como cintas de color azul, mientras en lascadenas , que no intervienen en la unión del 2,3-BPG, semuestra solo el esqueleto en negro. Se identifican, en una uotra de las cadenas , los aminoácidos que interaccionandirectamente con el 2,3-BPG. Estos aminoácidos, así como elefector, están representados en modo de bolas y varillas. Delmismo modo están los grupos hemo de ambas cadenas , quepueden verse en parte a la derecha e izquierda de la figura.

posición a la del adulto, HbA, posee dos cadenas ensustitución de las cadenas . La estructura de la HbF esprácticamente similar a la de la HbA, pero elaminoácido H21 de la cadena es una serina en vez deuna histidina. Al ser neutra la cadena lateral de laserina, la carga positiva aportada por los aminoácidosdel sitio de unión es menor y la interacción HbF-(2,3-BPG) resulta más débil que la que tiene lugar en eladulto. Una unión más débil del 2,3-BPG, al ser este uninhibidor, significa que la HbF tiene una capacidad deligar oxígeno mayor que la HbA y, por tanto, puedepasar oxígeno de la sangre de la madre a la del feto.

Como se recoge en el esquema de la figura 3, elCO2, además de producir bicarbonato que se disuelveen el plasma sanguíneo se transporta de vuelta a lospulmones unido a la hemoglobina. Esta unión tienelugar mediante una reacción química, que al tener unaenergía de activación baja, ocurre sin necesidad decatálisis. Consiste en la formación de un anión car-bamato al reaccionar con el grupo amino libre de lavalina N-terminal (NA1) de las cadenas (Figura 20).La reacción implica un ataque nucleofílico del grupoamino al CO2 y, por tanto, requiere que el nitrógenoamínico posea su par de electrones libre. El pKa de esegrupo amino es menor en la forma R que en la T y, portanto, es más fácil encontrar desprotonado ese grupoen la forma T que en la R. Esto explica la preferenciadel CO2 para formar carbamato con la forma T. Estehecho, además, permite comprender que la unión delCO2 a la hemoglobina es otro factor que permite unaliberación extra de oxígeno: la preferencia por lasformas T hace que la unión del CO2, tanto mayorcuanto mayor sea la actividad metabólica de lostejidos, desplaza el equilibrio T R hacia la izquierda,com la consiguiente pérdida de afinidad por eloxígeno. El desprendimiento de protones que tiene

lugar en la reacción (Figura 20), contribuye adicional-mente, a través del efecto Bohr, a una mayor liberaciónde oxígeno.

En este momento es posible completar el esquemade la figura 3 con unas explicaciones a nivel molecularque, además, sirven de resumen de cuanto se vienediciendo. La hemoglobina sale de los pulmonescargada totalmente de oxígeno y en su forma R. En lostejidos, la menor presión parcial de oxígeno, la mayoracidez (pH 7,2 en condiciones basales) y eldesprendimiento de CO2 hace que, en mayor o menorgrado según los requerimientos, el oxígeno trans-portado se libere y la hemoglobina forme el anión car-bamato. Como consecuencia de todo esto, el equilibrioconformacional se desplaza más o menos hacia laforma T y así retorna la hemoglobina a los pulmones.Al llegar a ellos, la elevada presión parcial de oxígeno,la baja proporción de CO2 en el aire inspirado y elmayor pH (entre 7,4 y 7,5) hace que todos los procesossigan un camino inverso: el carbamato revierte y selibera CO2, la hemoglobina se vuelve a cargar deoxígeno y el equilibrio conformacional se desplaza denuevo hacia la forma R.

En los párrafos precedentes queda patente la sen-cillez con que el modelo MWC, basándose solo en lasleyes del equilibrio químico, puede dar cuenta de lacooperatividad en la unión de oxígeno a la hemo-globina, del efecto Bohr y de la inhibición causada porel 2,3-BPG. Quizá en este momento sea convenienteconsiderar algunos aspectos más a propósito del efectode este inhibidor. En primer lugar, vale la pena advertirque el conjunto de los datos experimentales encaja per-fectamente en el concepto de alosterismo, tal como fuepostulado inicialmente por Monod et al. (1963). Por unlado, el efector se une a un lugar distinto que el ligandoprincipal y, por tanto, la inhibición no se produce porcompetencia. En segundo lugar, la transmisión delefecto del inhibidor —lo que habitualmente se conocecomo efectos heterotrópicos— tiene lugar a través deun cambio conformacional reversible, la transiciónR T. Finalmente, hay que advertir que es posiblegeneralizar el mecanismo de actuación del 2,3-BPGpara que se pueda aplicar a otras proteínas alostéricas.Incluso es posible explicar de un modo análogo elefecto de los activadores alostéricos, aunque este nosea el caso de la hemoglobina. Monod y sus colabo-radores proponen, en general, que los activadores


Figura 20. Reacción dde lla hhemoglobina ccon CCO22. Se detalla laformación de carbamato entre el CO2 y los aminoácidos N-ter-minales de las cadenas .

alostéricos se unen preferentemente a las formas R,mientras que los efectores negativos lo hacen a lasformas T. En ambos casos, la unión es reversible ytiene la consecuencia de alterar, en un sentido u otro, elequilibrio alostérico. De este modo, los efectoresactúan variando la afinidad de la proteína por elligando principal, el sustrato si se trata de una enzima(Monod et al. 1965).

Como se ha comentado anteriormente, las ecua-ciones del modelo KNF también permiten un buenajuste de los datos experimentales de saturación de lahemoglobina (Koshland et al. 1966). La explicacióndel alosterismo, sin embargo, requiere una elaboraciónmás sofisticada, que el propio Koshland hizo más tarde(Koshland, 1970) y no permite una interpretación uni-taria del comportamiento de la hemoglobina, como seacaba de ver que hace el modelo MWC.

De todas formas, al ser simples y generalizadores,como ha de ocurrir con todos los modelos, es ociosodecir que ni la hemoglobina ni prácticamente ningunaotra proteína alostérica se puede definir al 100% poruno u otro de los modelos. Como consecuencia, hansurgido modelos alternativos, modelos integradores,etc. Algunos de ellos, se han revisado recientemente(Ciaccio et al., 2008) pero, en definitiva, cuando hantranscurrido más de 45 años desde la propuesta delprimer modelo alostérico, todos ellos se reducen deuna forma u otra al MWC o al KNF. Algunas proteínasse adaptan más a uno o a otro, pero es forzosoreconocer que son más los sistemas cuyo mecanismopermite una explicación satisfactoria basándose en elmodelo MWC, que los que pueden describirse por elmodelo KNF.

Es preciso insistir en que el modelo MWC tiene elencanto especial de las ideas geniales, que en suaparente sencillez encierran un profundo significado.Tan es así, que el modelo se ha aplicado con éxito nosólo a la hemoglobina y a muchas enzimas alostéricas,sino que también ha servido para explicar el compor-tamiento de represores genéticos o de receptores(Changeux y Edelstein, 2001; Kardos y Nyikos, 2001),el plegamiento de las proteínas (Horovitz et al., 2001;Luque et al., 2002), la contracción muscular(Khaitlina, 2001), la regulación de la coagulación san-guínea (Eigenbrot y Kirchhofer, 2002), etc.

En el caso concreto de la hemoglobina, pronto seadvirtió que algunos de los aspectos del mecanismo deunión de oxígeno no se explicaban totalmente por elmodelo MWC. El valor de las constantes de los 4 equi-librios no se ajusta a los predichos por el tratamientode ese modelo. Partiendo de esa consideración yteniendo en cuenta las diferencias en estructura ter-ciaria de las subunidades entre la desoxi- y la oxihe-moglobina (véase más arriba), el propio Perutz (1990)propuso una posible secuencia de acontecimientos quese esquematiza a continuación. La gran mayoría de lasmoléculas de hemoglobina, en ausencia de oxígeno, seencuentran en forma T. Aunque la unión de oxígenosea preferente a las formas R, dada la abundancia delas formas T, mayoritariamente el oxígeno se unirá aestas formas. La unión a una cadena conlleva loscambios estructurales en el entorno del grupo hemo ylas alteraciones de estructura terciaria que se handetallado antes. Estas alteraciones llegan a afectar los


Figura 21. Un mmodo pposible dde ssaturación dde lla hhemoglobinapor lla mmolécula dde ddioxígeno. Las 8 especies moleculares quese recogen en la figura son posibles, de acuerdo con el mode-lo MWC, pero las más abundantes son las que aparecen sobrefondo rosa, por lo que, a efectos prácticos, se puede asumirque el proceso de unión de dioxígeno sigue la ruta: T0 T1T2 R2 R3 R4.

dominios de unión con las subunidades vecinas, lo queva creando una cierta tensión en la molécula. Aunqueesta siga en el estado T, al irse acumulando estas ten-siones a medida que avanza la saturación, llega unmomento en que la totalidad de la molécula pasa a laforma R. El proceso podría describirse, por ejemplo,por el esquema de la figura 21.

Hay que advertir que el rasgo fundamental delmodelo MWC seguiría conservándose aunque la uniónde oxígeno siguiera el esquema de la figura 21, todavez que el cambio estructural seguiría siendo con-certado. Es cierto que, en parte, la explicaciónmacroscópica de la cooperatividad da paso, en ciertosentido, a una descripción microscópica, pero hay quetener en cuenta que en ese esquema solo se pretendeseñalar que las formas más abundantes son las queocupan la zona sombreada. Al contemplar la presencia,aunque minoritaria, de las formas fuera de esa zona, seconservan también las propiedades macroscópicas delmodelo.

Las investigaciones más recientes sobre la hemo-globina siguen reforzando la aplicabilidad del modeloMWC. En un estudio exhaustivo, se analizaron datoscinéticos muy precisos sobre la disociación de com-plejos hemoglobina-monóxido de carbono para con-cluir que el modelo de dos estados sirve para explicarsatisfactoriamente la cooperatividad en la unión de lig-andos a la hemoglobina (Henry et al.,1997). Porsupuesto, es necesario introducir precisiones matemá-ticas en las ecuaciones simples del tratamiento inicial,pero el rasgo fundamental del modelo, es decir, el quela transición entre dos estados conformacionales seaconcertada, parece resistir los embates del tiempo.

A MODO DE CONCLUSIÓN

En las líneas precedentes se han presentado algunosrasgos fundamentales del comportamiento de la hemo-globina, que permiten descartar la posibilidad,apuntada al principio, de que la hemoglobina fuera unfracaso de la naturaleza. Realmente, aunque sea sólopara transportar cuatro moléculas de dioxígeno, pareceevidentemente necesario ese aparente derroche de uti-lizar una molécula de una masa más de 500 vecessuperior. Sin las propiedades de la molécula de hemo-globina estudiadas en este artículo —cooperatividad,

efecto Bohr, inhibición alostérica por el 2,3-BPG,unión del CO2— sería imposible la fina regulación quese requiere para un transporte que de cuenta de losrequerimientos de cada tejido, de sus necesidadesmetabólicas, de la adaptación a la altura, etc. El lectorhabrá podido comprobar cómo la delicada arquitecturade la molécula de hemoglobina permite el desarrollode todas esas funciones y, si ha contemplado conespíritu abierto sus propiedades, habrá llegado a asom-brarse ante el exquisito comportamiento de esamolécula prodigiosa.

Pero hace falta una observación adicional. Todapersona interesada en las propiedades de la hemo-globina que haya leído este artículo, habrá observadouna cierta diferencia con la presentación que se suelehacer del comportamiento de esa molécula en loslibros de texto habituales. En efecto, en el presenteartículo se han sacrificado muchos detalles particu-lares del mecanismo de la hemoglobina en aras delograr una presentación unitaria, bajo la perspectivadel modelo de Monod, Wyman y Changeux. Como seha advertido, el modelo supone una simplificación,pero, si se es consciente de ello, no se pierde rigorcientífico. Es más, puede ser preferible prescindir dedetalles y de tratamientos cuantitativos —que aquí sehan reducido al mínimo imprescindible— para lograruna visión de conjunto del comportamiento de lahemoglobina. Esa visión de conjunto puede servircomo de cañamazo para que la persona interesadainserte después las precisiones y detalles necesariospara situar adecuadamente a la hemoglobina en elcomplejo mundo de la funcionalidad de las proteínas.Pero si, por el contrario, se hubiera incidido en losdetalles, al faltar ese cañamazo, se podía caer en elextremo que condenaría el dicho popular de que lasramas no dejan ver el bosque. Mi intención ha sidomostrar el bosque. A los lectores que deseen saber mássobre la hemoglobina les resta ahora ir añadiendo lasramas.

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