. .

. .

...

I .

. .

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. .

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.

UAM-X JCbc;

/NOMBRE: LEMOLLE ZARCO M A R I O FELIPE.

TELEFONO: 91 595 4 45 64

MATRICULA: 8 0 3 3 0 3 3 8

CARRERA: BIOLOGIA.

L I C .

JAREA DE CONCENTRAC.ION : BIOLOGIA EXPERIMENTAL.

TRIMESTRE: 100 Z d e c r é d i t o s c u r s a d o s .

HORAS SEMANA: 20 h o r a s semanales.

LUGAR DONDE S E EFECTUO: CENTRO INTERNACIONAL DE MEJORAMIENTO DE MAIZ Y TRIGO.

FECHA DE I N I C I O : 6 d e J u l i o de 1 9 8 7 .

/FECHA DE TERMINACION: 6 de E n e r o d e 1 9 9 ' TUTOR EXTERNO: Dr . A . MUJEEB KAZI Jefe de Cruzas A m p l i a s

*. TUTOR INTERNO: B i o l . RAUL ALVA

P r o f e s o r A s o c i a d o B - T i e

<TULO DEL PROYECTO: " I d e n t i f i c a c i ó n d e l cromosoma 1 B / l R de variedades d e t r i g o mediante a n á l i s i s c i t o l ó g j l e c t& o r é t i c o" .

C.. I 1. - TITULO DEL INFOI,:;~: I:rt;ihL.

Identificación del cromosoraia lB/lR de variedades de trigo mediante análisis citológico y electroforético."

11 ."

P

. .~, 2.- INTKODUCCION.

c.,

Dentro de las especies .de trigo cultivadas está T. monococcum, que pertenece al genero Triticum y presenta en sus células somáticac el número de cromosomas más bajo

.__

."

.-_I

P<

.... L.

e..

d e su género (2 juegos de 7 cromosonias, o sea, 14) . Su genoma unitario se representa con las letras A A . A través del proce- so evolutivo, esta especie se cruzó con otra que le agregó el genoma tipo BB, dando lugar a una nueva especie con el doble genoina AABB, llamada T: turgidurn (conocida con el nombre de "duro" y con un juego genético de 28 cromosomas).

La especie T. turgidurn se cruzó con una accesión de otra especie, T. ters'ii, que agreyó el genoma DD, dando lugar a una nueva especie con el triple genoma AABBDD llamada

-... T. aestivuni (conocido con el nombre de "harinero" y con r- un juego genético de 42 cromosomas), ( 1 ). Esta. Última -. . especie incluye unas 20, O00 variedades cultivadas en todo F.. el mundo, que se adaptan a un amplio intervalo de ambientes,

~ . . . ( 2 1. La numeración genética en T. aestivum es :

c .

, 5 ' . ., - ,. C""

... - 't .- b *.,.

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I

1 A 1B 1D 2A 2B 2D 3.4 30 3D

4A 40 4D

5A 5B 5D 6A 6n 6D 7A 7B 7D

. .-

. .

Cl cromosona 1U es el estudiado, ya que, mediante una translocación de brazos cortos del cromosoma IR, de la variedad de centeno Petkus, al cromosoma ID, ciertas variedades de T. a e s t i v u n adquirieron 2 genes que les dan resistencia contra 2 tipos de roya, ( 3 y 4 ).

1R largo 1B largo 1 B largo

3.- OBJETIVO. Identificar el cromosoma 1B/1B en ciertas varieda-

des de trigo T. aestivum.

4 . - f1ATERIALES Y METODOS.

I .- GERMIRACION CE SEIIILLAS. La germinación se llevó a cabo en macetas con tierra y en cajas de Petri, como se explica a continuación: a) .-

b ) . -

Haceta con tierra. L a s semillas se ponen en ia maceta c'on 3 / 4 partes de tierra, después se llena hasta el nivel normal. Una semana después, la germinación conienza y tras transcurrir de 3 a 4 semanas se obtienen raíces apropiadas. Caja 2e Petri. ler. día. 1G:OO hrs. Se toma una caja de Pet.ri,

se colocan 2 papeles' filtro y se ayrega agua en exceso. Las semillas se ponen en fungicida. Con unas pinzas se toma cada ,

semilla, se, sacude el exceso de funcici'da y se pasan a la caja de Petri. Se ordenan,

. y se deja la caja con l a s cer:iillas, a ten p cr u t u ra a !:I h i en t n 1 .

( 3 ) I i

20‘. día. 11:OO hrs. S e verifica el .exceso de azua

y se pone l a caja de Petrl, conteniendo ius semilias, cn refrigeración.

3er. día. 11:OO hrs. Se saca l a caja de Fetri del refrigerador y s e coloca en oscuridad, con exceso de agua. 1G:OO hrs. 111 e x c e s o de agua se quita de l a caja, dejándose otra vez en la oscuridad.

50. día. Si l a raíz presenta un tamario de 1 a

2 cm. de larzo, el Go. día.

se colecta, si no hasta

11.- COLECTA DE RAICES. 1 .- 2.-

3.-

4 . -

Las raíces se cortan y Petri con colchicina . Se ponen en oscuridad durante 3 1/2 horas.

1”

Después, se ponen a teñir 2’ carmín ai 0.2 % .

se ponen en una caja de

a temperatura ambiental,

en una solución de Acetp-

Se meten en el congelador hasta el montaje de prepa- raciones. Esto es para que el acetocarmín no penetre tanto en l o s cromosomas y se puedan observar clara- mente.

111.- NOXTAJC DE PSEPARBCIOXEC DE PAIZ DE TRIGO. 1.- Las raíces contenidas en acetocarmín

pasan a un tubo de ensaye- pequeño Acid0 acético ai 45 %.

al 0.2 5; se que contiene

2.- Se sostiene el tubo con pinzas y se calienta sobre l a llama de una lámpara de alcohol, hasta ebulli- ción. Esto con la finalidad de que las células no estén tan unidas y puedan extenderse sin ronl~er- l a s al efectuarse el squash.

.. ,

r.".

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w-.

.. . e,..

- .

m. "

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r.

-3.- 171 con-tenido d.ei tubo se v a c í a en una cápsu la de

p-orcelana.

4.- Se . toma l a r a í z con p i n z a s de punta f i n a y s e col .oca

s o b r e p a p e l f i l t r o ; con , u n m i n i b i s t u r í s e c o r t a

l a - p u n t a de l a r a í z con cu idado .

5.- Se: Goloca un p o r t a o b j e t o en e l m i c r o s c o p i o e s t e r c o s -

e ó p i c o .

G.- Con- l a s p i n z a s , s e t r a s l a d a l a r a í z a l p o r t a o b j e t o .

7.- Se v e a t r a v é s d e l m i c r o s c o p i o e s t e r e o s c ó p i c o ,

y con e l m in i b i s tu r í se expr ime l a punta de l a

r a í z para s a c a r l a s c é l u l a s . E l m a t e r i a l o b t e n i d o

se d e j a y e l r e s t o de l a r a í z e s desechado.

8.- Sobro e l m a t e r i a l c e l u l a r , se a g r e g a 1 g o t a de

á c i d o a c é t i c o a l 45% y s e cub.re con UI I c u b r e o b j e t o .

9.- Se pone e l p o r t a o b j e t o s o b r e l a f l ama de l a lámpara

de a l c o h o l . E l t i empo de c a l e n t a m i e n t o , debe ser

e l n e c e s a r i o para que a l t o c a r e l p o r t a o b j e t o

' con e l do rso de l a mano se s i e n t a c a l i e n t e . Después

s e g o l p e a sobre e l c u b r e o b j e t o l e v emente con e l

mango d e l m i n i b i s t u r í .

10.- Se dob la un pape l f i l t r o por l a mi tad y se c o l o c a

l a p r e p a r a c i ó n enmedio. Se s u j e t a e l c u b r e o b j e t o

con un dedo para e v i t a r que se c o r r a y con e l .

dedo p u l g a r s e p r e s i o n a moderadamente.

11.- Se obse rva en m i c r o s c o p i o de c o n t r a s t e de f a s e s

en campo c l a r o , .con o b j e t i v o s de 10 X y 40 X . S i l o s croxosomas e s t á n b i e n d i s p e r s o s y con ade-

cuada d i s p o s i c i ó n , l a p r e p a r a c i ó n s e c o l o c a sobre

h i e l o s e c o (C02).

12.- I)espués de 20 c i inutos sobre e l h i e l o s e c o , con

ayuda d e una nava ja s e desprende e l c u b r e o b j e t o

de cada p reparac i ón . P o s t e r i o r n c n t e , l a s prepara-

c i o n e s s e in t roducen e n a i k o i i o i e t í l i c o f r í o y

se ponen en c o n y c l u c i ó n toda una noche.

, . . I > , , I., , , $,,%,:;o 5.' ,:;,.* . . . .

e--

-.

2 0 . d í a .

3 e r . d í a .

1.- Se sacan l a s

e t í i i c o (que se

noche a n t e r i o r )

de d e s e c a c i ó n .

2.- Se prepara

p r e p a r a c i o n e s d e l a l c o h o l

tuvo en c o n g e l a c i ó n l a

y se meten a u n f r a s c o

una s o l u c i ó n sa turada de

y s e pone en r e f r i g e r a c i ó n . 3* Ea( 0 3 )

Luego se prepara una s o l u c i ó n de 2 x SCC . 1.- La s o l u c i ó n de 2 x SCC y l a s o l u c i ó n

de Ba(0H)2 s e vacían. en vasos de Copplin:,

d i f e r e n t e s y s e ponén en baño maría a SO". 2.- Las p r e p a r a c i o n e s se sumergen en Ba(CI!)2

de 5 a 7 minutos.

3.- Se enjuaga.n 3 v e c e s en agua d e s t i l a d a

y d e s i o n i z a d a y después s e sumergen en

2 x SSC durante 1 hora. Se deben a g i t a r

cada 15 minutos para q u i t a r l a s burbujas

que s e forman.

4 . - Se preparan 200 ml. de s o l u c i ó n de

y s e agregan p o s t e r i o r m e n t e G 5* B u f f e r

en v'asos de Copp l ing . Las m l . de Giemsa

p r e p a r a c i o n e s ~ s e meten para t e ñ i r l a s , clie-

candocada 4 minutos l a s p r e p a r a c i o n e s en

e l m i c r o s c o p i o .

5.- S i a l checar l a s p r e p a r a c i o n e s ya e s tán

con t i n c i ó n adecuada, s e en juagan. s i no

s e de j an u n l a p s o de t i empo más l a r g o .

Se e x t r a e n y .enjuagan l a s p reparac i ones :

con e l m i c r o s c o p i o e n campo c l a r o , se l o c a -

l i z a n l a s c é l u l a s y ' s e s e l e c c i o n a n los cromosonas con bandas de t i n c i ó n adecuada.

6.- Las p reparac i ones s e secan a temperatura .

amb ien ta l . ,

4*

6*

c

"

"

I .

" .

- , .

1. ,

L*

7.- Dos días después, S Q pone una jota d r bálsamo sobre el material celular y se cubre con un cubreobjeto. 8.- Tras secar, s e observa al microscopio.

V.- TECNICA DE BA?IDEO h'.

ler. día.

I

.~

20. día. - .

I.

L . .

.._.

I .

... "

_.

Xealizado el squash, las preparaciones se ponen en hielo seco (COZ ) , por l o menos 20 minutos. Después, con ayuda de una navaja se desprenden los cubreobjetos de cada preparación. Estas s e introducen en ácido acético al 45 % a 6 0 ' * C durante 15 minutos. A l sacar l a s preparaciones del Acid& se meten a un desecador. Se prepara una solución de Buffer de fosfato

, y se pone en baño maría a Na3P04 2M

87 .*C. Las preparaciones se sumergen durante 28 minutos y finalmente se trasladan a

. Después una solución stock de giemsa de 10 minutos se verifica la tinción de bandas con el microscopio en campo claro

7 4

8*

de 10 X y 40 Xi Se* re~iir.t!a',~:.~~~.::<paso:s 5 , 6 , 7 y 8 de la técnica de bandeo C.

.. .

r -

...

I I

V I .- SOLlICIOFiCS Y TiP!CIL'?:ES.

1': C0LC:IICISA. Co 1 c fi i c i n a 0.01 gr.

8-11 i d r o x i qu in o 1 e í n a

Din i c t i l s u l f ó x i d o 10 g o t a s .

0.005 g r .

Agua d e s t i l a d a 20 m l .

A s i t a r t o d o durante 3 ho ras , y después r e f r i g e r a r .

2" ACETOCARMIX.

Ac ido a c k t i c o a i 45 x . C a r m í n a i 0.2 %.

H e r v i r 7 u 8 minutos o has ta que e l carmín pase

de c o l o r r o j o a n e g r o , y después r e f r i g e r a r .

34 Ba(OIl)2 Ba(OWI2 8 m l .

Agua d e s t i l a d a 10 m l .

A g i t a r m ien t ras s e c a l i e n t a has ta 80 *C. Qu r -

del c a l o r h a s t a que l a temperatura l l e g u e a 40*C, f i i t f a y , y @ o v e r en r e f r i g e r a c i ó n .

4" 2 x ssc C i t r a t o de s o d i o Na3C6H507. H20 8.63 gr. (0.3FI). N a C l 17.54 gr. (0.3;í),

Agua d e s t i l a d a 1000 n i l .

A g i t a r has ta d i s o l u c i ó n , a j u s t a r e l pi1 a 6.E con 1iCi 0.1 :j y despu f s r e í r i g e r a r .

5* BUFFEX. Buffer ( C D l l Clicnicals 5@0 i n l . de a:na

Toroi ito and destilado por CApsrila f o s f u t o branches). de base

p!I 6 . 8

6* GIEXSA. Glicerina Met ano1 Giemsa

O m .. 50 ml.

1 gr.

Colocar glicerina y giensa en parrilla con agitador magnético durante 3 horas y con temperatura no mayor de 37 *C. Agregar 50 ml. de metano1 y cubrir con papel aluminio; dejar agitando toda la noche, filtrar al' día siguiente y refrigerar .

7" Buffer de fosfato Na3P04 214.

Na3P04 27.59V gr. Agua destilada 100 ml.

8" SOLUCION STOCK DE GIEI.:Sh PARA EANDEO N.. 1 NaI12P04 6 . 8 9 9 gr. en 100 n i l .

de agua destilada. 2 Na*IIP04 7 . 0 9 8 Zr. en 100 n l .

de agua destilada.

-

-

Cuffcr Giemsa Agua destilada

6 ml. de I y 2 . 3 r n l . 87 ml.

( 9 )

- TECKIC'A DE PLECTROSORESIS.

a) .-

b).-

C).-

d).-

Esta técnica incluye. ins siguientes fases:

Encendido del circulator termostático. Llegaiido a l laboratorio se enciende en circulüilor termostático püra que l a temperatura del dispositi- vo se mantenza a 4 *C.

Preparación de las soluciones para electrodos. Para el &nodo se utiliza u n a solución de .H3P04

1 )I '*. Para el cátodo se utiliza una solución de NaOH 1 Pi 1 O"

Colocación del Eel. El gel utilizado es Ampholi,ne PAG plate de PI: 3.5 - 9 .5 en capa fina de poliacrilamida. Se agrega sobre la plataforma (de mármol) kerosene. Después, se coloca el gel. El cual no ,se debe tocar directamente con l o s dedos, y por ello se utilizan guantes. Con tijeras se corta la parte del gel sobrante, y a que debe quedar del tamaño exacto de la plataforma. Se fijan las tiras del electrodo, cuidando que las marcas del gel corres- pondan exactamente a las líneas superior e infe- rior de la plataEorma.

ConecciÓn de l o s electrodos. Los electrodos se alinean con el centro de l a s

tiras de electrodo, mediante desplizamiento a la posición adecuada. Se conectan l o s cables de cada electrodo. El cLtodo (color negro) debe ser conectado al contacto izquierdo y e l ánodo (coior r o j o ) al contacto derecho.

e ) . -

f).-

S I * -

h) .-

( 10 1 e I

Suciinistro d e cnerzía.

Para este gel s e deben utilizar l o s siguientes requerinicntos: voltaje 1500, corriente 50 y poder 30.

Colocación de semillas sobre el ne i .

C o n una navaja, las semillas de trieo se cortan por la mitad a nivel del embrión. Cespués se colo- can sobre el g e l , con la superficie corta¿a en contacto directo con el gel. Se pone l a tapadera que conduce la corriente, se enciende e l dispositi- v o y se deja se quita la Se vuelve a dispositivo

durante 40 minutos. Después se apaga, tapadera y se quitan las semillas. poner la tapadera, se enciende el y se deja durante 2 horas.

11" TinciÓn del ,eel con colorante. Después de realizada la electroforesis. el gel se sumerge en colorante durante 1 hora á 37 'C.

Posteriormente se destiñe e l exceso en solución de ácido acético al 10 Z.

Fijación del 'el. Se pone el gel con glicerol a l . 3 % en oscuridad durante 20 ninutos.

..

r-,

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- .

..

-.._.

VII1.- SOLUCIONES.

9* ::,Po 1 1:. 2 4 I : 3 P 0 4 9 s g r .

Agua d e s t i l a d a 1000 nl. ...

10" NaOIÍ 1 :-l. .. .

...

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....

...

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r.

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,. ..

NaOli 40 g r .

Agua d e s t i l a d a 1000 rnl.

11* COLORANTE PARA GEL.

Tris-HC1 0.1 M 72 m l .

(6.057 g r . Tris/50Dml.

de agua d e s t i l a d a ) .

plI aj ,ustado a 8 con H C 1 I.IgC12 0.25 1.1 3 nl. (5.075 g r . XgC12/100rnl.

de agua d e s t i l a d a ) .

F ruc tosa 6 - f o s f a t o 15 mg.

NADP 1 E l l . e - , I > I.. I y :,,:A,*,::" *: ,:;,:. . .

(D inuc leÓ ' t ido f o s f a t o

aden in n i c o t i n a n i d a

5 mg/ni.). I4TT 1.5 m l .

(3- .(4,5- d i r n e t i l t i a z o l - 2 - i l )

2 , 5- d i f e n i l t e t r a z o l i o

. bronuro 5 m u / r n i . ) .

Glucosa 6- f o s f a t o dcsh idrogcnasa

140 unidadcs/ml. 50 pl. 700 unidades/nl . 10 pl.

: ! e ido iob inn ( 5 r o s / m i . ) 1 ml.

( 12 )

I I

5 .- l:ESULThl)3S.

En i a f o t o g r a f í a sc, muestra e i e s t u d i o c i t o i ó z i c o ,

mediante bandeo c roaosÓuico . i i l cronosoina con l a l e t r a

A cor responde a un cromosoma 1C de t r i g o , el cromosoria

con l e t r a D co r r esponde a 'una v a r i e d a d de T. aes t i v i i i i

lD/lR. E 1 cromosoria con l a l e t r a C co r r esponde a l b razo

l a r y o de t r i g o 113. Los cronosomas con Ins l e t r a s A , B y C fue ron

somet idos a bandeo N . E l cromosoma con l a l e t r a D. co r r esponde a una

v a r i e d a d de T. aes t i vum 1B/lR.' E l cromosoma con l a l - e t r i E c o r r esponde a un t i p o

de c en t eno a p a r t i r d e l c u a l se a d q u i r i ó l a t r a n s l o c a -

c iÓn I R d e s c r i t a e n l a i n t r o d u c c i ó n .

Los cromosomas con l a s l e t r a s D y E fue ron ' l o s

r e s u l t a d o s d e la t é c n i c a de bandeo C.

E l t r i g o se bandea b i e n , sólo con bandeo IT , y a

que con bandeo C no aparecen bandas i n t e r s t i c i a l e s .

E l cromosoma con l a l e t r a B e s 1 C / l R , su b r a z o l a r g o

es i g u a l que e l d e l c roaosona A p e r o corno n o s e a p r e c i a

muy b i e n , s e muestra . e l b r a z o l a r g o en e l cromosoma

C. , v., . ,, .,

7 Ln l a f i su ra D s e muestra que l a t r a n s l o c a c i ó n

1R e s t á p r e s e n t e , y a que l o s b r a z o s c o r t o s de l o s crono-

somas D y E ( l C / I ? y IR) son s i m i l a r e s .

En l a t a b l a que s e muestra después de l a f o t o g r a f í a

se c i t a n l a s v a r i e d a d e s e s t u d i a d a s de T. aest ivuki

que poscen l a t r a n s l o c a c i ó n l B / l R , y e l nÚmero.de l í i ? e a s

de cada v a r i e d a d que l a c o n t i e n e n , d e t e c t a d a s mediantc

e l a n j i i s i s c i t o l ó g i c o y e l c c t r o f o r é t i c o .

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LIFA "S"

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KVZ-JUP x IID2206/SIS ' IS" 1

!lAYA->lOX "S" x KVZ-TRI,: 1

MUS "S'" P:!T x i,lAYA-ALD "S" 1

GOF 'IS" - PXT x XAYA-ALD "SI' 1

K v z - cc:: 1 , : I 1 i. , y <$$v,>,i+' 'e: :;<.,, . ,

KVZ-CNOG7 x P J ' 1

P F 7 O 3 5 4 ->,!US " S " 3

( IAS5S. IAS55 x ALD "S"/;,iR::G)

A L D " S " ISS52.103;~ x A L D 'IS" 1

G . - D 1 S C U C I U ; i .

E n l a f o t o z r a z í a s e muestra e l cromosoma l i ; / l ~ ~ ,

i d e n t i f i c a d o con l a s t&c .n icas de bandeo C y : i . E1 t r i y o

t i e n e un j uego g e n é t i c o de 21 pa res de cromosonas

A A C G DD. El centeno t i e n e un j u e z 0 g e n é t i c o de 14

pa res de cromosomas R X ~ k . ~i croi:iosona de centeno

la, f u e e l t r a n s l o c a d o

( f i g u r a D ) . E s t e cromosoma

v e n t a j a s de l a s v a r i e d a d e s

en l a i n t r o d u c c i ó n .

7 . - C O N C L U S I O ~ .

La i :n t :ac , I d e l

a cabo, encont rándose que 41

a n a l i z a d a s l o presentan .

en e l cror.ioso:na lIi/lR

e s e l r e sponsab l e de l a s

que l o c o n t i e n e n , c i t a d a s

cromo socia a / l R s e i i e v I

l í n e a s de l a s 18 v a r i e d a d e s

8 . - RESUI,IEN.

Las i n v e s t i g a c i o n e s en v a r i e d a d e s de t r i g o han

r e p o r t a d o l a impor tanc ia d e l cromosoma l E / l R p r e s e n t e

en muchas de e l l a s . E s t e cro:iosoma c o n t i e n e genes que

l e dan a l a p l a n t a r e s i s t e n c i a h a c i a c i e r t o s t i p o s

de r o y a , y adap tac i ón a d iverso 's ambientes . Xed ian te

l a a p l i c a c i ó n de t é c n i c a s c i t o l ó g i c a s de b a n d e o C y

Et', y de e l e c t r o f o r e s i s se i d e n t i f i c ó e l crotiosor:ia l I i / l ?

en 41 l í n e a s de 18 v a r i e d a d e s de l a e s p e c i e T.' aes t i vur i

a n a l i z a d a s .

, 5 ' I'

9.- LITERATURA CITAD.1.

. -, I .

.. , ~. ,

._ e--

,-

c

-.

.".

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