Bol. San. Veg. Plagas, 31: 277-285, 2005

Inventario fúngico asociado a las semillas de cultivares de cardo(Cynara cardunculus L.)

D. PALMERO, C. IGLESIAS, J. SINOBAS

Se caracterizó la micoflora presente en las semillas de 54 cultivares de cardo cose-chados entre las campañas 1992-93 y 1997-98,10 muestras procedentes del Servicio deInvestigación Agraria, finca "La Orden" (Badajoz) y 44 muestras de la Unidad Docentede Botánica de la Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos de Madrid. Seanalizaron un total de 4400 semillas, identificándose 15 géneros fungicos diferentes. Lapresencia de los diferentes géneros varió en función de las localidades y los años decosecha, entre la microbiota fúngica aislada cabe destacar por su potencial patogenici-dad especies de los géneros Fusarium, Aspergillus y Alternaría.

D. PALMERO: Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria(INIA) Dirección Técnica de Evaluación de Variedades y Laboratorios, Ctra de la Coru-ña Km 7,5 (28400) Madrid, email: palmero@inia.es)C. IGLESIAS, J. SINOBAS (Fallecido en Madrid el 26 de julio de 2004): U.D. Genética yFitopatología. E.U.I.T.A. Universidad Politécnica de Madrid. Ciudad Universitaria,28400 Madrid.

Palabras clave: Semilla, cardo, Cynara cardunculus, microbiota fúngica

INTRODUCCIÓN

Entre las especies herbáceas productorasde biomasa ligno-celulósica con fines agroe-nergéticos cabe destacar el cardo (Cynaracardunculus L.) (Fig. 1), conocido tambiéncomo cardo lleno, especie típica del áreamediterránea, perfectamente adaptada a suclimatología, y susceptible a ser utilizadacomo materia prima para un aprovechamien-to puramente energético.

Al tratarse de un cultivo perenne (de 10 a15 años) se reducen los costes de implanta-ción, además, la posibilidad de obtener doscosechas al año, implementa las razones eco-nómicas para su aplicación.

Teniendo en cuenta estos factores, el costede producción de biomasa ligno-celulósicade cardo podría estar en torno a los 16,22euros por tonelada, siendo el precio de la ter-

mia producida (1000 Kcal.) de 4,03 x 10 3

euros . Comparados con los demás combus-tibles, estos costes ofrecen una clara ventaja,haciendo viable su cultivo (HERNÁNDEZ,1996).

En ensayos experimentales en cultivo desecano, se han obtenido producciones totalesde biomasa de 20 a 30 toneladas de materiaseca con 2.000 a 3.000 Kg de semillas ricasen aceite (25%) y proteínas (20%), suscepti-bles a ser empleadas en la producción de bio-carburantes (FERNÁNDEZ, 1994).

Las plagas y enfermedades que afectan ala germinación de las semillas tienen unimportante efecto sobre el rendimiento finaldel cultivo, tanto en el aspecto productivocomo en la concentración de aceite y proteí-nas. La calidad de las semillas es, por tanto,uno de los principales aspectos a tener encuenta en la mejora del cultivo.

Figura 1. Vista general de Ia parcela de cultivo de cardo.

Tradicionalmente se ha observado unaconsiderable variación en la germinación delas semillas en función de su procedencia.En España no conocemos que se hayan rea-lizado trabajos sobre las enfermedades queafectan al cultivo o a la semilla del cardo.Dado el potencial que en un futuro no muylejano puede llegar a alcanzar el cultivo delmismo, esta investigación permitirá conocerlos posibles problemas que aparezcan en los

semilleros y explotaciones del cultivo ennuestro país.

El objetivo del presente estudio es realizarun inventario fúngico asociado a las semillasde cardo de los cultivares disponibles enEspaña. Además, se compararán los inventa-rios fúngicos de las semillas almacenadas enlos bancos de las distintas regiones.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material estudiadoSe analizaron un total de 4400 semillas de

cardo (Fig.2), correspondientes a las mues-tras enviadas desde Badajoz, procedentes delServicio de Investigación Agraria, finca "LaOrden" (Badajoz) y de Madrid, procedentes

Cuadro 1. Muestras de semillas analizadas y locali-dades de procedencia.

Figura 2. Semillas de distintos cultivares de cardo.

Figura 3. Flora fusárica de semillas de cardo en medioselectivo K.

del Departamento de Producción Vegetal deIa Escuela Técnica Superior de IngenierosAgrónomos de Madrid. Constituyendo untotal de 54 muestras (44 muestras de Madrid,10 muestras de Badajoz).

Las localidades de procedencia de cadamuestra, así como el año de cosecha de lasmismas, queda reflejado en el cuadro 1.

Técnicas de análisis y medios de cultivoAnálisis generalesSe realizaron análisis con semillas de

todos los lotes, colocando 10 semillas decada muestra en cajas de Petri con medio deagar de patata glucosado (PDA), cuya prepa-ración se hizo en el laboratorio (ECHANDI,1971), realizándose 10 repeticiones y anali-zando de esta manera al menos 100 semillaspor muestra. Las placas de Petri se incubarona temperatura ambiente entre 6 y 10 días,realizándose lecturas periódicas y anotandoel número de especies presentes en cadasemilla.

Para conocer la presencia del géneroFusarium se realizaron análisis específicoscon todas las muestras, utilizando para elloel medio selectivo para Fusarium (KOMADA,1975) (Fig. 3) y el mismo procedimiento queel indicado con el medio PDA.

Identificación de los micetosLa identificación de los distintos hongos

se llevó a cabo mediante la lectura de sus

características taxonómicas por medio de laobservación directa de las placas y prepara-ciones al microscopio óptico. La taxonomíase realizó sobre los géneros de mayor impor-tancia cuantitativa presentes en el inventarioy, cuando fue necesario, se realizaron medi-ciones del diámetro de las conidias, la longi-tud de los esterigmatos y de la longitud yanchura de los conidioforos.

Para la identificación se siguió la obra deBARNETT y HUNTER (1972) y SINOBAS(1990). En el caso de la taxonomía del géne-ro Alternaria, se siguió la obra de ROTEM(1994) y ELLIS (1971) y, en el caso de Asper-gillus, los criterios adoptados fueron los deTHOM et al. (1945). La identificación de loshongos del género Fusarium se hizo deacuerdo a los criterios expresados por MES-SIAEN y CASSINI (1968) y NELSON et al.(1983). La taxonomía del género Penicilliumse realizó en base a la clave propuesta porRAPERyTHOM (1949).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se analizaron 4400 semillas con medioPDA y K, a partir de las cuales se obtuvieronun total de 15 géneros fúngicos distintos, losresultados de los ensayos muestran como lacarga fúngica de las semillas de cardo anali-zadas se compone casi inalterablemente porhongos comunes en las semillas almacena-das.

Muchos de los géneros detectados estándescritos como patógenos en otras especiescomo en el caso de Aspergillus (HARMAN,1972) o Alternaria (Me LEAN, 1947; GAE-TANy MADIA, 1998).

Por lo general, las semillas contaminadasno mostraron síntomas visibles en el exte-rior, solamente con medios de cultivo y con-diciones de fotoperiodo, temperatura, yhumedad adecuadas se indujo el desarrollode los micetos presentes en las semillas.

Los cuadros 2, 3 y 4 reflejan el porcenta-je de semillas que resultaron infectadas porcada hongo, éstas se calcularon sobre las 100semillas analizadas por muestra y medio decultivo (DÍAZ y TELLO, 1994).

Cuadro 2. Hongos aislados a partir de los lotes de semillas de Cardo (Cynara cardunculus L.) procedentes deMadrid. Se expresa en porcentaje sobre el total de semillas analizadas en PDA.

Los géneros de hongos Bipolaris, Acremonium y Pleurophragmium se aislaron a partir de lotes de semillas proceden-tes de Madrid en porcentajes inferiores al 5% y en una sola muestra en cada caso.

Cuadro 3. Hongos aislados a partir de los lotes de semillas de Cardo {Cynara cardunculus L.) procedentes deBadajoz. Se expresa en porcentaje sobre el total de semillas analizadas en PDA.

Cuadro 4. Microbiota fusárica aislada a partir de semillas de Cardo {Cynara cardunculus L.). Se agrupan lasmuestras según el porcentaje de especies fúngicas aisladas sobre el total de semillas analizadas en medio

selectivo para Fusarium (K)

Entre los hongos aislados a partir de loslotes de semillas cosechados con anteriori-dad al año 1997 (M-l a M-10) se observóuna alta presencia del género Rhizopus que,invadiendo rápidamente las cajas de Petri delos ensayos, impide el desarrollo e incluso laidentificación de ningún otro género en lasmuestras M-4, M-6, M-9 y M-10.

En las 6 muestras no invadidas completa-mente por Rhizopus, cabe destacar el 33% desemillas que albergaban Alternaria en lamuestra M-8, y 2% en la muestra M-l y M-3, en el resto de las muestras no se detectóeste hongo.

El género Cladosporium, sólo aparece enla muestra M-8 en un 13% de semillas afec-tadas, el género Penicillium, también consi-derado como típico hongo de semillas, sólo

se aisla en las muestras M-2 y M-3 en por-centajes del 4%, al igual que Aspergillus,género que sólo se detectó en las muestrasM-7 y M-8.

En cuanto a las semillas cosechadas en1997 procedentes de Madrid (M-ll a M-28)y Badajoz (B-l a B-6) el recuento realizadomostró altos porcentajes de semillas conAlternaria en todas las muestras de Madrid yBadajoz, llegando al 80% en la muestra M-24 Los conidios de Alternaria presentes enlas cubiertas de las semillas sanas podríangerminar, como se ha descrito para las semi-llas de soja (VAUGHAN, 1988), penetrandohasta el embrión a través del endospermo, yocasionando serios daños en plántulas, comomarchitamiento, e incluso haciendo que lassemillas pierdan su viabilidad. También se

ha de tener en cuenta que algunas especiesde Alternaria patógenas para la parte aéreade la planta lo pueden ser, también, para lassemillas. Las esporas pueden ser transporta-das en la cubierta de las mismas, aunque elhecho de que en los ensayos aparezcan altascontaminaciones del hongo, en realidad notiene por que significar una infección efecti-va del mismo.

El género Cladosporium aparece en todaslas muestras excepto en la M-22, las mues-tras de Badajoz cosechadas ese mismo añotienen porcentajes más bajos de presencia deCladosporium que las de Madrid, segura-mente debido a la rápida colonización que,por parte de Rhizopus, se produjo en estamuestra, no permitiendo el desarrollo decolonias de otros hongos. Este intenso ata-que de Rhizopus afecta al 56% de los lotes desemillas de Madrid y al 100% de los lotes desemillas de Badajoz cosechadas en 1997.

Al contrario de lo que era de esperar, ensemillas del año 1997, la presencia de hon-gos de almacén como Aspergillus y Penici-llium tiene lugar en bajos porcentajes, lo queno permitiría pensar que dichos géneros pue-den multiplicarse en las semillas con eltranscurso del almacenaje, y que su presen-cia tiene más relación con el año de cosecha.

Hay que destacar la presencia del géneroNigrospora en 5 muestras de Madrid, aunquelos porcentajes de infección son bajos, apa-recen en demasiadas muestras para pensarque se trata de una infección puntual, abrien-do interesantes interrogantes. Este hongo es,según ELLIS (1971) cosmopolita y puede ais-larse tanto del suelo como del aire. Puedeencontrarse en plantas ocasionando enferme-dades (TV. Oryzae) o en restos vegetales,incluso en alimentos. En las muestras deBadajoz de ese mismo año no se detectó elgénero Nigrospora en ninguna de ellas.

La aparición, aunque en menor medida,de otros géneros como Phialopora en las seismuestras de Badajoz del año 1997, unido alhecho de que en los lotes de semillas proce-dentes de Badajoz del año 1998 no se hayaidentificado este género en ninguna de lasmuestras analizadas nos permiten pensar que

se trata de un hongo cuya aparición ha sidoeventual y está dentro de lo posible. ELLIS(1971) recoge que se aisla del aire, suelo,agua, madera y pulpa de madera. Algunos desus miembros son patógenos de plantascomo el clavel o las raíces de los cereales.

En los hongos aislados a partir de los lotesde semillas cosechados en 1998 de Madrid (M-29 a M-44) y Badajoz (B-7 a B-10) aparece unaumento con relación a 1997 en el porcentajede semillas afectadas por los hongos denomi-nados de almacén, como Penicillium y Asper-gillus, mientras que Alternaria y Cladospo-rium mantienen su frecuencia.

El género Alternaria aparece de maneraconstante en la mayoría de las muestras.Hemos de tener en cuenta que la infección poreste patógeno de las semillas, tiene lugar porvía indirecta, es decir que comienza en la flory se traslada a las diferentes partes del ovarioy de los tejidos del óvulo. No es un procesoestrictamente sistémico, pero algunos hongos,como la Alternaria, pueden ver aumentada sucapacidad para colonizar gracias al polen, queles provee de los nutrientes necesarios parauna rápida germinación ycrecimiento de lasconidias (CHANNON, 1970).

Las semillas de Madrid tienen mayorinfección de Aspergillus que las de Badajoz, enlas muestras M-34 y M-44 se detectan en el 95 y100% de las semillas respectivamente. La eleva-da presencia de los géneros como Aspergillus yAlternaria hace temer por una potencial pro-ducción de toxinas muy elevada, que aumen-ten el efecto nocivo que los hongos puedantener sobre la viabilidad de las semillas.

La producción de toxinas y su efecto enlas plantas y en la germinación de las semillasha sido citado anteriormente por algunos investi-gadores en géneros como Alternaria (TYETSEN etal, 1982; ROTEM, 1994) o Aspergillus (HARMAN,1972;HAGLERé>ía/.,1987)

La presencia del género Rhizopus fue genera-lizada y particularmente importante en las mues-tras M-29, M-38, M-41, M-42 y M- 44,donde el hongo se detectó en el 100% de lasmuestras analizadas.

El género Nigrospora solo aparece en lamuestra B-7 de todos los lotes estudiados, lo

que respalda la creencia de que su presenciaes debida a causas externas al propio cultivodel cardo. Las bacterias siguen teniendo unaimportancia relativa. La aparición de otrosgéneros de hongos como Bipolaris, Acremo-nium y Pleurophragmium en porcentajesinferiores al 5% en una sola muestra deMadrid, Trichothecium en dos muestras oUlocladium, en muestras de las dos localida-des, se deben a contaminaciones puntuales,no teniendo especial relevancia para la eva-luación de la sanidad final de las semillas.

Los ensayos para la determinación de lamicrobiota fusárica a partir de los lotes desemillas cosechadas en años anteriores a1997, sobre medio selectivo K reflejados enel Cuadro 4, muestran altos porcentajes desemillas afectadas por F. moniliforme (sensuNELSON et al., 1983), en las muestras M-6 yM-9. El 70% de las muestras se ven afecta-das por F. moniliforme, aunque el 50% enporcentajes bajos. Las variaciones de unamuestra a otra se deben a los diferentes añosde procedencia de las mismas y puede estarmuy influenciado por el lugar de cultivo ypor cultivos próximos a la parcela de obten-ción de semillas de cardo.

En cuanto a los lotes de semillas de 1997(M-l 1 a M-28), el recuento realizado mues-tra porcentajes de semillas afectadas que lle-gan al 100% en las muestras M-23, M-26 yM-28, y que afectan a todas las muestras deBadajoz (B-l a B-6).

En la microbiota fusárica aislada a partirde los lotes de semillas de 1998, destacatambién F. moniliforme, que aparece conmayor frecuencia en las semillas de Badajoz(B-7 a B-10) que en las de Madrid (M-29 aM-44), aunque en densidades menores a lasde 1997. En las muestras de Madrid, sola-mente se identifica en el 31% de las mues-tras, mientras que en las de Badajoz apareceen tres de los cuatro lotes analizados.

Es importante señalar los porcentajessuperiores de F. moniliforme que presentanlas muestras de Badajoz frente a las deMadrid, influenciadas posiblemente por lastécnicas culturales utilizadas en cada zona yel frecuente cultivo de maíz en la vega delGuadiana, así como a tratarse de un hongodifundido por el viento en campo, muyinfluenciado por cultivos cerealistas próxi-mos a las parcelas de cultivo del cardo, queinfecta los frutos en desarrollo gracias al vín-culo vascular que presenta con la plantamadre, como evidencian RUDOLPH y HARRI-SON, (1945). Otros autores han estudiado laimportancia cada vez mayor de las toxinas(fumonisinas A y B; zearalenona) produci-das por el género Fusarium y sus efectos endiferentes cultivos (COLE et al, 1973; MUTHO-MI el al., 2002). La aparición de éste génerojunto a otros hongos de almacén, puede tam-bién explicarse por el hecho de que la espe-cie aislada es F. moniliforme, que tiene laparticularidad de poder crecer en atmósferas

Figura 4. Conidióforo simple de Penicilliumbiverticillata Symmetrica.

Figura 5. Conidias muriformes y en cadena deAlternaria alternata.

Figura 6. Esterigmato y conidióforo de Aspergillusniger.

con bajos porcentajes de humedad y ocasio-nar fallos de nascencia en maiz.

En lo concerniente a la identificación degéneros y especies, se realizó más detenida-mente sobre aquellos cuyo numero de colo-nias era evidentemente superior al resto, seseleccionaron para ello varios aislados decada hongo a partir de las siguientes muestras:2 aislados de Cladosporium pertenecientes a las

muestras de semillas B-10 y M-38.1 aislado de Rhizopus perteneciente a la mues-

tra M-39.2 aislados de Penicillium pertenecientes a las

muestras de semillas B-2 y M-30.2 aislados de Aspergillus pertenecientes a las

muestras de semillas M-30 y M-l.2 aislados de Alternaria pertenecientes a las

muestras de semillas M-14 y B-6.2 aislados de Fusarium pertenecientes a las

muestras de semillas M-29 y B-6.Los asilados de Penicillium fueron identi-

ficados ambos como Penicillium biverticilla-ta Simétrica (Fig. 4), pertenecientes a laserie Penicillium rugulosum. Las conidias sepresentaban en cadenas de conidias lisas yunidas entre sí, con un diámetro de 4,3 [xm,un diámetro transversal de la vesícula de 25

u,m, una longitud del conidióforo de 302, u,my una anchura del conidióforo de 8,1 \im.

Los dos aislados de Alternaria fueronidentificados como A. alternata (Fig. 5). Losaislados del género Cladosporium fueronidentificados como C. herbarum. Los aisla-dos de Fusarium procedentes de muestras deMadrid y Badajoz, resultaron también seraislados de la misma especie, identificándo-se como F. moniliforme.

En cuanto a los aislados de Aspergillus sudeterminación se realizó por separado, puespresentaban diferencias significativas entreambos. El aislado procedente de la muestraM-30 mostraba colonias de color marrónamarillento, con conidias en cadenas largas(>20 unidades). El diámetro de las conidiasfue de 4,4 \im, con pared no uniforme, lalongitud del esterigmato fue de 19,375 um, yla del conidióforo 425 \xm con una anchurade 9,8 \xm. Todos estos datos permitieronidentificar la especie como A. flavus.

El segundo aislado de Aspergillus, proce-dente de la muestra de semillas M-8 presen-taba sus colonias de color negro. El diámetrode las conidias fue de 3,950 u,m y la longitudy anchura del conidióforo de 480 y 9,375 ¿xmrespectivamente. Características que secorresponden con la especie de Aspergillusde más frecuente aparición en silos de alma-cenamiento; A. niger (Fig. 6).

Del género Rhizopus sólo se purificó unaislado a partir de la muestra M-39, siendoidentificado como R. stolonifer.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo ha sido financiado a travésdel proyecto SC98-007-CB-2 del I.N.I.A.,denominado "El cardo (Cynara cardunculusL.) como cultivo alternativo para la produc-ción de biomasa en tierras de secano", cuyodirector es el Dr. Fernández González.

ABSTRACT

PALMERO D., C. IGLESIAS, J. SINOBAS f. 2005. Analysis of the fungal microbiota asso-ciated with thistle seeds cultivare (Cynara cardunculus L.). Bol. San. Veg. Plagas, 31:277-285.

Fungal population in a total of 54 samples of thistle seeds harvested between 1992-93 and 1997-98 seasons were examined, 10 samples belonged to the Servicio de Investi-gación Agraria (Badajoz), and 44 samples of the Department of Botany of the EscuelaTécnica Superior de Ingenieros Agrónomos (Madrid). The presence of the different spe-cies varied based on the localities and the years of harvest. Among the fungal genus iso-lated we can find a great amount of common saprophytes as: Penicillium, Alternaria, Rhi-zopus and Cladosporium, according to their potential pathogenicity we have to emphasi-ze species of the genus Fusarium or Aspergillus.

Key words: Seeds, thistle, Cynara cardunculus, fungal microbiota.

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(Recepción: 20 septiembre 2004)(Aceptación: 1 abril 2005)