INTRODUCCION - SCAIT
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INTRODUCCION Los Papilomavirus Humanos (HPV) son virus epiteliotropos pertenecientes a la familia Papilomaviridae (1). El gran impacto de estos virus en el campo sanitario surgió a través de su asociación etiológica con tumores humanos, en particular con el cáncer de cuello uterino (2, 3, 4). Cada año se detectan en el mundo 300 millones de casos nuevos de mujeres infectadas con HPV (enfermedad de transmisión sexual viral más prevalente) y 500.000 casos nuevos de cánceres invasores de cérvix, de los cuales alrededor de la mitad mueren (80% de ellos en países en desarrollo) (5, 6) La Agencia Internacional de Investigación sobre Cáncer (IARC) editó en 1995 un documento estableciendo que los HPV de alto riesgo son carcinogénicos en humanos (2). El principal obstáculo para el diagnóstico de laboratorio de estos virus es la incapacidad de propagarse en cultivos celulares convencionales por ello el laboratorio virológico utiliza diversas técnicas de biología molecular para detectar y/o tipificar el HPV presente en células y tejidos, como la amplificación génica por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la tipificación viral por el análisis de los fragmentos obtenidos mediante endonucleasas de restricción (RFLP) (6). Las muestras de ADN pueden proceder de: células exfoliadas o pequeñas cantidades de tejido. Es deseable aplicar un método de extracción de ADN cómodo y simple, que evite la contaminación de las muestras, siendo el inconveniente de algunos de los métodos corrientemente utilizados. Existen diversas técnicas de extracción de ADN, método de precipitación con fenol-cloroformo (7, 12), incubación con SDS (8), sonicación, las cuales son rápidas y de fácil aplicación pero que requieren grandes cantidades de tejido; también se han utilizado resinas aplicadas para la extracción de ADN de muestras de diversos orígenes, con y sin digestión previa con proteinasa K. Aunque existen estudios previos sobre la utilidad de la extracción de ADN con resinas, los datos reportados sobre la aplicación clínica son escasos. El objetivo de este estudio fue seleccionar un método que permita detectar y tipificar por PCR-RFLP el mayor número de tipos de papilomavirus humano (HPV) a partir de ADN extraídos de células, tejidos frescos y congelados. Cuartas Jornadas de Jóvenes Investigadores UNT - CONICET Tucumán, 22, 23 y 24 de Junio de 2010
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INTRODUCCION
Los Papilomavirus Humanos (HPV) son virus epiteliotropos pertenecientes a la familia
Papilomaviridae (1). El gran impacto de estos virus en el campo sanitario surgió a través de
su asociación etiológica con tumores humanos, en particular con el cáncer de cuello uterino
(2, 3, 4). Cada año se detectan en el mundo 300 millones de casos nuevos de mujeres
infectadas con HPV (enfermedad de transmisión sexual viral más prevalente) y 500.000
casos nuevos de cánceres invasores de cérvix, de los cuales alrededor de la mitad mueren
(80% de ellos en países en desarrollo) (5, 6)
La Agencia Internacional de Investigación sobre Cáncer (IARC) editó en 1995 un
documento estableciendo que los HPV de alto riesgo son carcinogénicos en humanos (2).
El principal obstáculo para el diagnóstico de laboratorio de estos virus es la incapacidad de
propagarse en cultivos celulares convencionales por ello el laboratorio virológico utiliza
diversas técnicas de biología molecular para detectar y/o tipificar el HPV presente en células
y tejidos, como la amplificación génica por medio de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) y la tipificación viral por el análisis de los fragmentos obtenidos mediante
endonucleasas de restricción (RFLP) (6).
Las muestras de ADN pueden proceder de: células exfoliadas o pequeñas cantidades de
tejido. Es deseable aplicar un método de extracción de ADN cómodo y simple, que evite la
contaminación de las muestras, siendo el inconveniente de algunos de los métodos
corrientemente utilizados. Existen diversas técnicas de extracción de ADN, método de
precipitación con fenol-cloroformo (7, 12), incubación con SDS (8), sonicación, las cuales
son rápidas y de fácil aplicación pero que requieren grandes cantidades de tejido; también
se han utilizado resinas aplicadas para la extracción de ADN de muestras de diversos
orígenes, con y sin digestión previa con proteinasa K.
Aunque existen estudios previos sobre la utilidad de la extracción de ADN con resinas, los
datos reportados sobre la aplicación clínica son escasos.
El objetivo de este estudio fue seleccionar un método que permita detectar y tipificar por
PCR-RFLP el mayor número de tipos de papilomavirus humano (HPV) a partir de ADN
extraídos de células, tejidos frescos y congelados.
Cuartas Jornadas de Jóvenes Investigadores UNT - CONICET Tucumán, 22, 23 y 24 de Junio de 2010
MATERIALES Y METODOS
Muestras clínicas
Se estudiaron 16 cepillados endocervicales y 5 biopsias de cervix uterino producto de
conizaciones y LEEPs (loop electrocautery excision procedure) de mujeres que asistieron
por control a los consultorios de ginecología del Instituto de Maternidad y Ginecología Ntra.
Sra. de las Mercedes Tucumán.
Consideraciones éticas: Se requirió el consentimiento individual de las mujeres
participantes, previa información esencial del proyecto a las mismas. Aquellas mujeres que
aceptaron formar parte de la población bajo estudio firmaron un formulario ad hoc que
acreditó su consentimiento informado (9, 10).
Las células cervicales fueron recolectadas empleando un cepillo cónico, obteniéndose dos
muestras, una para análisis citológico convencional (Papanicolaou) y del restante, las
células fueron resuspendidas en 3 ml de solución tamponada fosfato salina (PBS) estéril pH
7,4 y conservadas a 4 °C por no más de 72 h. Las células cervicales fueron centrifugadas,
manteniéndose los precipitados celulares a -20 °C hasta su procesamiento. Las biopsias
fueron transportadas a 4 oC en criotubos y se procesaron inmediatamente o se almacenaron
a -70 oC hasta su procesamiento.
A todas las muestras se les realizó el diagnóstico cito-histológico, aplicando el criterio de
Bethesda 2001 (11).El mismo fue realizado en el Laboratorio de Anatomía Patológica de la
Maternidad Provincial Ntra Sra de las Mercedes de Tucumán.
Se seleccionaron dos protocolos para la recuperación de ADN viral partir de células,
tejidos frescos y congelados para aplicación de PCR y PCR-RFLP.
Extracción del ADN de las muestras clínicas:
A-Protocolo con tampón de extracción con Proteinasa K:
Para la extracción del ADN genómico viral de células cervicales, el precipitado celular se
resuspendió con solución tamponada de extracción la cual contenía 100 ug/ml de Proteinasa
K y se incubó por 4 hs a 56 °C; posteriormente la enzima fue inactivada a 95 °C durante
10min, se conservó a -20 ºC.
Extracción de ADN de los tejidos frescos y congelados endocervicales: los fragmentos de
la pieza de 25-50 mm3 se resuspendieron en 500 µl de tampón buffer lisis (Tris 10 mM pH
8,3;EDTA 10 mM, NaCl 10 mM,Tween-20, 100 µg/ml de Proteinasa K) y se incubaron 4 hs a
56 oC , la enzima fue inactivada a 95 °C durante 10 min. Se conservó a -20 oC.
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B-Protocolo de extracción y purificación comercial: extracción con resina de sílica, reactivo
comercial GENOMIC DNA FROM TISSUE MACHEREY-NAGEL TM que permite extraer y
purificar el ADN. Para las diferentes muestras se procedió según las instrucciones del
fabricante.
Se amplificaron alícuotas del ADN templado obtenido por los dos métodos puro y diluido.
Detección y tipificación de papilomavirus:
La detección genérica del genoma viral fue realizada en primera instancia por reacción de
polimerasa en cadena utilizando el sistema de cebadores consenso MY 09/11 que
amplifican un fragmento de 450 pb del gen viral L1 (12). La genotipificación viral se realizó
por análisis de polimorfismos de fragmentos de restricción (RFLP) de acuerdo a la técnica
descripta por Bernard et al. (13). Los amplificados fueron sometidos a análisis de restricción
con las endonucleasas: (BamHI, HaeIII, HinfI, PstI, RsaI, DdeI, Sau3AI) que permiten
identificar 44 tipos virales (11). La mezcla consistió en: 10 µL del amplificado, 2 µl de
enzima, tampón de reacción 1X y agua estéril para un volumen final de 20 µL. La mezcla se
incubó por 16 horas a 37 ºC. Los patrones de digestión se analizaron en electroforesis en
gel de agarosa al 3 % en tampón TBE previa tinción con colorante Gel red y se observaron
en un transiluminador con luz UV.
RESULTADOS
La extracción de ADN a partir de muestras endocervicales obtenidos por cepillado y
biopsia resultó exitosa empleando las dos metodologías descriptas al obtener un ácido
nucleico con calidad y concentración adecuadas para su empleo óptimo en la reacción de
polimerasa en cadena.
Detección de HPV:
La aplicación de la PCR a la detección del genoma de HPV en células y tejidos frescos y el
posterior análisis de los productos amplificados mediante una electroforesis en gel de
agarosa al 2 %, reveló la presencia de una simple banda con la talla esperada (450 pb).Las
diferencias que existen en la intensidad de las bandas obtenidas se deben a que las
concentraciones de ADN extraído de cada muestra difieren (Fig. 1).
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B407
1/10
B407
1/100 M
450 bp
M B407
450 bp
Fig 1.Electroforesis en gel de agarosa productos amplificados a partir de diluciones de
genoma extraído de biopsias con método A: carril 3 y B: carril 5.La banda amplificada tiene
450 pb. M (Marcador de peso molecular de 100 pb)
Para ambos protocolos se realizaron diluciones para obtener el rango con mejor
amplificación (Fig.2)
Fig. 2. Electroforesis en gel de agarosa productos amplificados a partir de diluciones de
genoma extraído puro y diluido de biopsias. La banda amplificada tiene 450 pb. M (Marcador de peso molecular de 100 pb)
450 bp
B407
1/10
M B395
1/10
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450pb
M B395
1/10
B395
1/100
C(-) T2
1/10
T2
1/100 M
M B407 C(-) B395
1/20
450pb
Fig. 3. Electroforesis en gel de agarosa: aplicación de PCR a la detección de genoma de
HPV a partir de ADN de células y tejidos endocervicales obtenidos de cepillados y biopsia con ambos métodos. M (Marcador de peso molecular de 100 pb).
Tipificación de HPV:
La tipificación viral de las muestras que resultaron PCR positivas se efectuó por restricción enzimática (RFLP) con 7 endonucleasas encontrándose los patrones de restricción esperados.
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Fig. 4. Electroforesis en gel de agarosa: Digestión con las 7 enzimas de restricción. Carriles 2 a 8 fragmentos de restricción correspondientes a HPV-AR, amplicón de 450 bp sin cortar (carril 9 y 18) ,11 a 17 fragmentos de restricción correspondientes a otro tipo de HPV-AR, M (Marcador de peso molecular de 100 pb).
Ambos protocolos permiten amplificar por PCR y PCR-RFLP por lo que
encontramos dos estrategias efectivas para obtener ADN viable para la detección
y tipificación de HPV.
DISCUSION
Los métodos de PCR basados en la amplificación de ADN de VPH poseen una alta
sensibilidad para la detección del virus en muestras cervicovaginales (14).
En este estudio se trató de encontrar la estrategia más efectiva para obtener ADN viable
para la PCR-RFLP a partir de muestras de cuello uterino dado que con la técnica de PCR-
RFLP se pueden determinar más de 40 genotipos virales anogenitales con una única
reacción de amplificación (13)
El ADN extraído amplificó de forma eficiente secuencias de HPV presentes en las
muestras celulares y tejido endocervical donde el mismo puede encontrarse integrado por
completo, parcialmente o en forma episomal.
Para poder establecer una metodología que pueda aplicarse a las diferentes muestras de
cérvix estamos completando nuestro estudio.
M Bam
HI
DdeI Hae
III
Hinf I Pst I Rsa I MboI Sin
Dig M Bam
HI M DdeI Hae
III
Hinf I Pst I Rsa I MboI Sin
Dig
HPV –AR
Biopsia
HPV-AR
Cepillado
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CONCLUSIONES
Se comprobó igual resultado con las dos propuestas de extracción. Siendo uno de ellos de
bajo costo para la extracción de ADN de cepillados, tejidos frescos y congelados.
BIBLIOGRAFIA
1-de Villiers E-M. Taxonomic classification of Papillomaviruses. Papillomavirus Rep. 12:
57-63 (2001).
2-International Agency for Research on Cancer (IARC)- World Health Organization
(WHO). Human Papillomaviruses. Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to
humans. Vol 64 (1995).
3-zur Hausen H. Papillomavirus infection- a major cause of human cancers. Biochim.
Biophys. Acta 1288, F55-F78 (1996).
4-Bosch FX, Lorincz A, Muñoz N, CJLM Meijer, KV Shah. The causal relation between
human papillomavirus and cervical cancer. J. Clin. Pathol. 55: 244-65 (2002).
5-World Health Organization. The current status of development of prophylactic vaccines
against human papillomavirus infection. Report of a technical meeting, Geneva (1999).
6-Iftner T, Villa LL. Human papillomavirus technologies.
J Natl Cancer Inst Monogr. (Chapter 12) 31: 80-8 (2003)
7-Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory
manual, 2ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989: 9.16-9.19 pp.
8-Lench N, Stanier P,Williamson R. Simple non-invasive method to obtain DNA for gene
analysis. Lancet 1988; 8599: 1356-8.
9-IARC Working Group. Human Papillomaviruses. Monographs on the evaluation of
carcinogenic risks to humans. International Agency for Research on Cancer (IARC)- World
Health Organization (WHO); Vol. 64, 1995.
10-Recommendations on ethical issues in obstetrics and gynecology by the FIGO
committee for the ethical aspects of human reproduction and women’s health. November
2003
11-Solomon D, Davey D, Kurman R, Moriarty A, O’Connor D, Prey M, et al. The 2001
Bethesda System: terminology for reporting results of cervical cytology. JAMA2002;
12-Manos M, Ting y, Wright D, Lewis A, Broker T, Wolinsky S. Use of polymerase chain
reaction amplification for the detection of genital human papillomaviruses. Cancer Cells.
1989;7:209-214.
13-Bernard HU, Chan SY, Manos MM, Ong CK, Villa LL, Delius H, et al. Identification and
assessment of known and novel human papillomavirus by polymerase chain reaction am-
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plification, restriction fragment length polymorphisms, nucleotide sequence, and phylogenetic
algorithms. J Infect Dis 1994; 170: 1077-85
14-Gravitt PE, Peyton CL, Alessi TQ, Wheeler CM, Coutlée F, Hildesheim A, et al.
Improved amplification of genital human papillomaviruses. J Clin Microbiol 2000;38:357-361
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