Introducción al Análisis Clínico

Escuela Nacional Preparatoria, UNAM

Opción Técnica Auxiliar Laboratorista Químico

Introducción al Análisis Clínico

Manual de Prácticas

Autores

Ana Ma. Gurrola Togasi Fernando Vidal Saucedo

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Introducción al Análisis Clínicos

CONTENIDO

Práctica No. 1 Determinación de grupo sanguíneo Práctica No. 2 Toma de muestra sanguínea Práctica No. 3 Tinción de Wrigth Práctica No. 4 Determinación de glucosa Práctica No. 5 Examen general de orina Práctica No. 6 Coproparasitoscópico

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Práctica No.1

Determinación de grupo sanguíneo Propósitos:

• Realizar la toma de sangre capilar en condiciones adecuadas de seguridad

e higiene. • Determinar el grupo sanguíneo en muestras problema.

Fundamento: En 1901, Landsteiner observó que los eritrocitos humanos eran aglutinados cuando se ponían en contacto con sueros humanos, actualmente sabemos que los eritrocitos o glóbulos rojos poseen en su membrana glucoproteínas que se conocen como antígenos de superficie. Los antígenos son sustancias capaces de despertar una respuesta inmunológica cuando son inoculados en un ser vivo. Una de las respuestas inmunológicas más importantes es la formación de anticuerpos. Los anticuerpos son proteínas que reconocen con gran especificidad al antígeno que le dio origen. Existen dos tipos de antígenos de superficie : A y B que determinan el grupo sanguíneo. Las personas con grupo sanguíneo A tienen en el antígeno A y anticuerpos anti - B, las personas de grupo sanguíneo B poseen el antígeno B y anticuerpos anti –A y el grupo sanguíneo O carece de ambos antígenos y presenta anticuerpos anti –A y anti -B. Existe un cuarto grupo sanguíneo el AB, cuyos eritrocitos tienen ambos antígenos y no tiene anticuerpos contra ellos. En el año 1940, se detectó la existencia de un nuevo antígeno en la membrana de los eritrocitos de la mayoría de la población. Este nuevo antígeno fue denominado con las iniciales Rh, ya que fue identificado por primera vez en la superficie de los glóbulos rojos del simio Macaccus Rhessus. Se denominan Rh positivos a las personas cuyos glóbulos rojos son aglutinados por este anticuerpo y tienen, por tanto, el antígeno Rh en su superficie. Se denominan Rh negativos los que no son aglutinados y que, por tanto, no poseen el antígeno Rh en su superficie. Al suero que se utiliza para su determinación se le llama suero anti – D. E Para la determinación práctica del grupo sanguíneo se utilizan sueros que poseen anticuerpos en contra de los antígenos de superficie mencionados. Estos sueros se obtienen mediante la inoculación de un ser vivo ( por ejemplo un caballo) con eritrocitos de un tipo sanguíneo específico. Después de seguir un esquema de

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inoculación apropiado, el organismo desarrolla anticuerpos en contra del antígeno inoculado. Finalmente, se extrae un volumen determinado de sangre y se obtiene el suero con los anticuerpos deseados. En la siguiente tabla se muestra el antígeno de cada grupo sanguíneo y el patrón de reacción con los sueros.

Tabla No. 1 Determinación de Grupo sanguíneo

Tipo sanguíneo Antígeno Anticuerpo Reacción de aglutinación

A A Anti- B Aglutina el tipo B

B B Anti – A Aglutina el tipo A

O Ninguno Anti – A Anti –B

Aglutina el tipo A Aglutina el tipo B

Rh+ Rh Ninguno Aglutina el tipo Rh+

Rh- Ninguno Ninguno No aglutina el el tipo Rh+

Los grupos sanguíneos que pueden existir en el sistema ABO, son los siguientes.

Tabla No. 2 Grupos sanguíneos en el sistema ABO

A Rh+ A Rh- B Rh+ B Rh- O Rh+ O Rh-

AB Rh+ AB Rh-

Existen otros grupos sanguíneos, que se clasifican por letras como, por ejemplo M, N, S y P y otros conocidos por el nombre de las personas en las que se identificaron los anticuerpos por primera vez (Kell, Duffy, etc.). Sin embargo, el más usado es el sistema ABO.

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Material Reactivos Plantilla Porta acetatos transparente Algodón Lancetas estériles Guantes de latex Palillos

Suero Anti – A Suero Anti – B Suero Anti – D Alcohol Cloro comercial

Procedimiento:

• Colocar la plantilla que se presenta a continuación sobre un porta acetatos transparente.

Obtención de la muestra: PRECAUCIÓN: Toda muestra de sangre debe ser tratada como potencialmente infecciosa. No se debe manipular sin guantes. Se debe tener mucho cuidado de no contaminar con sangre las mesas e instalaciones del laboratorio.

• La muestra se obtiene de la yema de algún dedo de la mano. Una vez elegido el dedo, se da masaje suavemente para favorecer la hemoconcentración en la yema del dedo.

• Desinfectar la zona con un algodón empapado en alcohol. Se debe dar tiempo para que el exceso de alcohol se evapore.

• Utilizando una lanceta estéril, punzar el dedo. Determinación del grupo sanguíneo:

• Se colocan tres gotas de sangre en las zonas marcadas en la plantilla. Se debe colocar suficiente cantidad de sangre de manera que no se seque rapidamente.

• Inmediatamente se agrega una gota de suero según se indica en la plantilla. Ver figura No. 1.

• Utilizando un palillo, se homogeniza la mezcla de sangre y suero. Se debe utilizar un palillo para cada gota de sangre y evitar así la contaminación de las muestras.

• La prueba será positiva si se observa la formación de grumos. • Limpiar la superficie del porta acetato con un algodón empapado con cloro

comercial. Tratamiento de desechos:

Todos los desechos (algodones, palillos y lancetas) se colocan en una bolsa de plástico etiquetada con el símbolo de riesgo biológico.

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Bibliografía • Stites, Inmunología Clínica, El Manual Moderno, México, 1990. • Guyton. Manual de Fisiología Médica. Madrid, 2000. • http://www.bstib.com/Sangre/Sangre.htm. • García Tamayo Fernando. Fundamentos de Inmunobiología, Facultad de

Química, UNAM, 1997.

Figura No. 1

Determinación de grupo sanguíneo

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PLANTILLA PARA DETERMINAR GRUPO SANGUÍNEO

SUERO ANTI – A ANTI – B ANTI -D

AGLUTINACIÓN _______________ _______________ ______________

TIPO SANGUÍNEO:________________________________

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Evaluación Para verificar que se trabaja en el laboratorio siguiendo el procedimiento establecido para la toma de una muestra de sangre capilar y la determinación del grupo sanguíneo, el profesor responsable deberá llenar la siguiente guía de observación para cada uno de los estudiantes.

El alumno: nunca rara

vez frecuente-

mente siempre

1.- Verifica el nombre del paciente 2.- Sienta al paciente de una forma cómoda y segura.

3.- Trata al paciente de forma considerada y amable.

4.- Tiene el material necesario en la mesa de trabajo.

5.- Desinfecta correctamente la yema del dedo.

6.- Manipula la lanceta sin contaminar la punta estéril.

7.- Punciona correctamente. 8.- Recolecta las muestras en el portaobjetos en cantidad adecuada.

9.- Coloca las muestras en el portaobjetos con una distancia adecuada entre ellas.

10.- Detiene el sangrado adecuadamente.

11.- Coloca la gota de anti-suero sin contaminar el gotero.

12.- Usa un aplicador diferente para agitar cada muestra.

13.- Realiza la determinación dentro de los primeros 3 minutos después de extraer la muestra.

14.- Interpreta correctamente el resultado de la prueba.

15.- Anota los resultados de la prueba.

16.- Trabaja colaborativamente con sus compañeros de equipo.

17.- Su lugar está limpio y ordenado 18.- Trata los residuos como lo indica el diagrama ecológico.

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Práctica No.2

Toma de muestra sanguínea Propósitos:

• Llevar a cabo en condiciones óptimas de seguridad e higiene la toma de sangre periférica.

• Introducir al alumno en la toma correcta de muestras para pruebas clínicas. Fundamento:

El sitio más frecuente para extraer una muestra de sangre periférica es la vena de la parte interior del codo. Se limpia el sitio de la punción con un antiséptico y se coloca un torniquete o banda elástica alrededor del antebrazo para aplicar presión y limitar el flujo sanguíneo a través de la vena. La muestra se puede tomar utilizando una jeringa o un tubo vacutainer. Estos últimos son tubos de ensayo cerrados al vacío con un tapón de hule en el que se adapta una aguja. En el momento de la punción, la presión sanguínea causa que el tubo se llene de sangre. Durante el procedimiento, se retira el torniquete para restablecer la circulación. Una vez que se ha recolectado la sangre, se retira la aguja y se cubre el sitio de punción para detener cualquier sangrado.

En el caso de haber utilizado jeringa, se retira la aguja y la muestra se desliza lentamente por las paredes del tubo de ensayo. Las pruebas clínicas se pueden realizar en sangre completa, plasma o suero. Si la muestra sanguínea fue recolectada sin usar anticoagulante entonces se separará el suero. El suero tiene la misma composición química del plasma excepto el fibrinógeno, que es una proteína que participa en la coagulación de la sangre. Para obtener el suero de una muestra, basta con dejarla en reposo aproximadamente 20 minutos, una vez formado el coagulo se desprende de las paredes utilizando un aplicador de madera y se centrifuga a 2000 rpm durante 2 o 3 minutos. Para la obtención de plasma, la sangre con anticoagulante se centrifuga en las mismas condiciones.

Algunas pruebas clínicas requieren de sangre completa, para ello es necesario agregar previamente al tubo en el que se vierte la muestra un anticoagulante y agitarla suavemente y de forma frecuente.

A excepción de la heparina que actúa inhibiendo la acción de la trombina, los restantes anticoagulantes utilizados actúan fijando el calcio, evitando así la coagulación sanguínea.

El anticoagulante debe cumplir con los siguientes requisitos:

• ser fácilmente soluble en la sangre. • no alterar el tamaño de los glóbulos rojos. • no producir hemólisis (ruptura de eritrocitos).

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• evitar al máximo la agregación de las plaquetas. • no alterar la morfología de los leucocitos.

El ácido etilen amino tetrasódico o EDTA es uno de los anticoagulantes más usados debido a que además de cumplir con los requisitos básicos de un anticoagulante, asegura la conservación de las células sanguíneas durante 24 horas si la sangre se conserva a 4 grados Celsius.

Es indispensable que los tubos que contienen las muestras sanguíneas se etiqueten con los datos personales del paciente y la fecha en que se tomó la muestra.

Se recomienda que el paciente se encuentre en ayunas y que no haya realizado ejercicios físicos extenuantes.

Material Reactivos Jeringa de 5 mL Algodón Torniquete Guantes de látex

Anticoagulante (solución de EDTA) Alcohol

Procedimiento: PRECAUCIÓN: La sangre es un fluido biológico potencialmente infeccioso, debe manipularse con guantes de látex y teniendo extremo cuidado en su manejo. Se debe evitar contaminar las mesas y equipo de laboratorio, así como la piel y ropa.

• Se rotula el tubo que contendrá la muestra con los datos personales del paciente y la fecha de toma.

• Se elige el brazo en el cuál las venas del pliegue del codo sean más notorias.

• Se coloca la ligadura en el antebrazo del paciente, sin aplicar presión excesiva. Ver figura No. 1

• Se limpia la zona de punción usando un algodón empapado en alcohol. La dirección recomendada es de arriba hacia bajo.

• Se introduce la aguja hasta la mitad de su longitud en la vena y siguiendo la orientación natural de la misma. Ver figura No. 2

• Se sujeta la jeringa con una mano y se jala lentamente el émbolo hasta que la jeringa se llene. Es muy importante que la succión se haga suavemente y así evitar el colapso de las venas.

• Se retira la ligadura. • Se coloca un algodón ligeramente mojado en alcohol sobre la aguja, se

retira firmemente la jeringa. • Se aplica una ligera presión sobre el punto de punción, se debe asegurar

que el sangrado se detenga. Obtención de sangre total.

• Se retira la aguja de la jeringa y se vierte la sangre lentamente por las paredes del tubo que debe contener un anticoagulante.

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• Se tapa el tupo con un tapón de hule y se agita suavemente para mezclar la sangre y el anticoagulante. Ver figura No. 3.

Obtención de plasma. • Se retira la aguja de la jeringa y se vierte la sangre lentamente por las

paredes del tubo que debe contener un anticoagulante. • Dejar reposar la muestra por 20 minutos. • Nivelar los tubos antes de centrifugarlos. • Centrifugar los tubos a 2000 rpm durante 2 o 3 minutos. • Separar el plasma del paquete celular usando una pipeta Pasteur. • Colocar el plasma en un tubo limpio, seco y correctamente etiquetado.

Obtención de suero. • Se retira la aguja de la jeringa y se vierte la sangre lentamente por las

paredes del tubo sin anticoagulante. • Dejar reposar la muestra por 20 minutos. • Desprender el coagulo de las paredes del tubo usando un aplicador de

madera. • Nivelar los tubos antes de centrifugarlos. • Centrifugar los tubos a 2000 rpm durante 2 o 3 minutos. Ver figura No. 4 • Separar el suero del paquete celular usando una pipeta Pasteur. • Colocar el suero en un tubo limpio, seco y correctamente etiquetado.

Tratamiento de residuos: Los materiales desechables contaminados con sangre (jeringas, agujas, algodones, guantes) deben ser colocados en una bolsa de plástico marcada con el símbolo de riesgo biológico. Los tubos contaminados con sangre deben ponerse por 24 horas en una solución de cloro comercial.

Figura No. 1

Colocación de la ligadura

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Figura No. 2

Introducción de la aguja en la vena

Figura No. 3

Agitación suave de la muestra

Figura No. 4 Centrifuga

Bibliografía

• Carrasco, R. Et al. Manual de Prácticas de Hematología, Facultad de Química, UNAM, Noviembre de 1991.

• García Tamayo Fernando. Fundamentos de Inmunobiología, Facultad de Química, UNAM, 1997.

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Evaluación Para comprobar que se cumple con la metodología requerida para la toma de una muestra sanguínea venosa, llenar la siguiente lista de cotejo. El alumno:

Sí No 1.- ¿Verifica el nombre del paciente?

2.-¿ Sienta al paciente de una forma cómoda y segura?

3.- ¿Trata al paciente de forma considerada y amable?

4.- ¿Tiene el material necesario en la mesa de trabajo?

5.- ¿Coloca el torniquete de forma adecuada?

5.- ¿Desinfecta correctamente la zona antecubital del brazo?

6.- ¿Manipula la jeringa sin contaminar la aguja estéril?

7.- ¿Punciona correctamente?

8.- ¿Retira la ligadura antes de retirar la jeringa?

9.- ¿Retira la jeringa causando el menor daño posible al paciente?

10.- ¿Detiene el sangrado adecuadamente?

11.- ¿Vierte la sangre en el tubo de ensaye sin hemolisar la muestra?

12.- ¿Mantiene la muestra en condiciones adecuadas para su tratamiento?

13.- ¿Trabaja colaborativamente con sus compañeros de equipo?

14.- ¿Su lugar de trabajo está limpio y ordenado? 14.- ¿Trata los residuos como lo indica manual?

Recomendaciones:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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Práctica No.3

Tinción de Wright Propósitos:

• Realizar correctamente un frotis de sangre periférica, utilizando la tinción de Wright.

• Identificar y describir los diferentes elementos celulares (tamaño, forma, color) del frotis de sangre observados al microscopio.

• Realizar un recuento diferencial de células blancas (expresado en porcentaje) del extendido en lámina.

Fundamento: Un frotis o extendido sanguíneo se hace con la finalidad de teñir las células sanguíneas con colorantes policromatófilos y poder detectar alteraciones morfológicas de los eritrocitos. De igual manera es posible identificar leucocitos (glóbulos blancos) con base a afinidades tintoriales o morfológicas. Los colorantes policromatófilos son mezclas de compuestos básicos como el azul de metileno y ácidos como la eosina. La tinción dependerá de la afinidad ácido – base que tengan los diferentes estructuras celulares. Los componentes ácidos, como el núcleo se tiñen con el colorante básico, por lo que reciben el nombre de basófilos mientras que los componentes básicos se tiñen con el colorante ácido (eosinófilos). Algunas estructuras celulares se tiñen con ambos colorantes y se conocen como neutrófilos. En la siguiente tabla se resume la información anterior.

Tabla No. 1 Tinción policromatófila

Colorante Carácter de la estructura celular que tiñe Tipo celular

Color

Ácido Básico Eosinófilos

Rojo

Básico Ácido Basófilo

Azul

Ácido y Básico Neutro Nuetrófilo Violeta

A continuación se presenta una breve descripción de las células (elementos formes) que debe observar en el frotis de sangre periférica:

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Eritrocitos.

Los eritrocitos, también conocidos como glóbulos rojos ó hematíes, son células sin núcleo que miden aproximadamente 7µ, tienen forma biconcava con un área central pálida. Mediante la observación de una tinción es posible identificar anormalidades morfológicas en los eritrocitos, como la presencia de formas elípticas o esféricas, punteados en el citoplasma, parásitos intracelulares, eritrocitos fragmentados y cuerpos extraños incluidos en el citoplasma.

Su principal función es la de llevar el oxígeno desde los pulmones a los diferentes tejidos gracias a un transportador llamado hemoglobina (oxihemoglobina), y a su vez eliminar el CO2 producido por el metabolismo de estas al pulmón gracias al mismo transportador (carbaminohemoglobina)

Leucocitos

Conocidos también como glóbulos blancos. Su principal función es de defensa contra agentes externos mediante dos tipos de respuesta: celular y humoral. Normalmente hay entre 6000 y 10000 leucocitos por mm3 y se habla de leucopenia cuando se encuentran disminuidos y de leucocitosis cuando están aumentados.

De acuerdo a la presencia o ausencia de gránulos específicos, los leucocitos pueden ser clasificados como granulocitos (neutrófilos, eosinófilos, y basófilos) y agranulocitos (linfocitos y monocitos).

Existen valores normales de los diferentes tipos de leucocitos en proporción porcentual y en valores absolutos. Este parámetro se denomina recuento diferencial y permite orientar las causas fisiopatológicas de una leucopenia o una leucocitosis Las principales características de los diferentes tipos de leucocitos se pueden resumir en la siguiente tabla:

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Leucocitos (Granulocitos y Agranulocitos)

Micrografía Nombre % Normal Características principales

Neutrófilos 55-65

Poseen un núcleo multilobulado (3-5 lobulaciones), y gránulos azurófilos lisosomas) en su citoplasma que contienen enzimas hidrolíticas, lisozyma y mieloperoxidasa las cuales le permiten actuar en la fase aguda de la inflamación.

Eosinófilos 0.5-4

Tienen un núcleo bilobulado y poseen granulaciones acidofílicas que contienen enzimas hidrolíticas y peroxidasa que son liberadas en las vacuolas fagocíticas. Aumentan en infecciones parasitarias y procesos alérgicos principalmente.

Basófilos 0.5

Poseen un núcleo bilobulado y grandes gránulos esféricos basofílicos y metacromáticos dados por heparina e histamina. Liberan además aminas vasoactivas y sustancia de reacción lenta de la anafilaxia.

Linfocitos 25-35

Generalmente son células pequeñas que contienen un núcleo circular oscuro y un escaso citoplasma azul claro. Existen dos tipos: Linfocitos T: Se diferencian en el timo y circulan en la sangre periférica, donde ellos son los principales artífices de la inmunidad celular. Poseen funciones como ayudadores (CD4) ó supresores (CD8), modulando la respuesta a través de sus efectos sobre otras células. Linfocitos B: se diferencian en la médula ósea y son los principales encargados de la respuesta humoral a través de la producción de

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anticuerpos. Una vez se colocan en contacto con un antígeno se diferencian en células plasmáticas que sintetizan anticuerpos.

Monocitos 4-8

Son las células circulantes de mayor tamaño. Poseen un núcleo excéntrico en forma de U ó en forma “arriñonada”. Son los precursores del sistema mononuclear fagocítico, que incluye macrófagos (histiocitos), osteoclastos, macrófagos alveolares, células de Kupfer en el hígado y la microglia en el sistema nervioso central.

Plaquetas Son fragmentos citoplasmáticos anucleados de células gigantes llamadas megacariocitos, originados en la médula ósea. Se observan en el frotis de sangre periférica como agregados basofílicos. Su principal función es la creación y propagación del coágulo.

Material Reactivos

Microscopio Porta y cubreobjetos Guantes de látex

Sangre anticoagulada Metanol Colorante de Wright Solución amortiguadora de fosfatos pH = 7 Aceite de inmersión

Metodología: PRECAUCIÓN: La sangre es un fluido biológico potencialmente infeccioso, debe manipularse con guantes de látex y teniendo extremo cuidado en su manejo. Se debe evitar contaminar las mesas y equipo de laboratorio, así como la piel y ropa. Preparación del Frotis: Se coloca una gota de sangre anticoagulada en uno de los extremos de un portaobjetos y con la ayuda de otro portaobjetos se extiende la sangre por toda la superficie como se muestra en la siguiente figura.

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Figura No. 1 Preparación de frotis sanguíneo

Tinción: PRECAUCIÓN: El colorante de Wright se prepara con metanol, que es una sustancia muy tóxica que puede causar daño al nervio óptico. Se debe evitar la ingesta y exposición por vía cutánea.

• Se colocan dos varillas de vidrio en forma paralela una a la otra sobre la tarja del laboratorio o una charola.

• Se colocan los frotis sobre las varillas. • Se agrega el colorante de Wrigth de manera que el frotis quede

completamente cubierto, se deja reposar por 5 minutos como se muestra en la figura No. 2

Figura No. 2 Charola para la tinción de Wrigth

• Se agrega, mediante una piseta, solución amortiguadora de manera que se

forme una capa metálica. Se debe tener cuidado de no derramar el colorante fuera del frotis. Se deja reposar durante 10 minutos.

• Durante el tiempo de reposo, utilizando una pipeta se sopla suavemente dos o tres veces sobre la superficie del frotis para mezclar el colorante y la solución amortiguadora.

• Se lava el frotis con agua corriente hasta el eliminar el exceso de colorante. • Se deja secar la preparación al aire. • Se examina el frotis al microscopio utilizando primero el objetivo de 40 X

con la finalidad de observar la distribución de células en la superficie. Se

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selecciona un área en la que exista una capa sencilla de células y los eritrocitos estén separados unos de otros.

• Se coloca una gota de aceite de inmersión en la zona elegida y empleando el objetivo 100 X se observa la preparación.

• Se observa el tamaño, forma, color y presencia de inclusiones en los eritrocitos.

• Utilizando la guía de observaciones que se muestra a continuación ,es posible distinguir otras células sanguíneas en la preparación.

Tratamiento de residuos: Todo el material que haya estado en contacto con sangre, debe colocarse en una cubeta que contenga una solución concentrada de cloro comercial y dejarse por 24 horas. Preparación de reactivos: Colorante de Wright : se pesan 2g de colorante de Wright Stain, Sigma W –0625 y se disuelven en 1 L de metanol. Filtrar usando papel filtro de poro cerrado. Para favorecer la “madurez” del colorante se debe prepara con un mes de anticipación a ser usado y colocarse en un frasco ámbar. Antes de usarse debe agitarse perfectamente. Solución amortiguadora de fosfatos: Fosfato dibásico de sodio 1.14 g Fosfato monobásico de potasio 0.49g Agua destilada 900 mL Ajustar el pH a 7.2 Agua destilada c.b.p. 1000 mL Si no se cuenta con las sales, es posible utilizar agua con pH de 7.0 Solución anticoagulante de EDTA EDTA sal di sódica 0.30 g Agua destilada c.b.p. 100 g Bibliografía Carrasco, R. Et al. (1991) Manual de Prácticas de Hematología, Facultad de Química, UNAM. México. García Tamayo F. (1997). Fundamentos de Inmunobiología, Facultad de Química, UNAM, México. http://www.udl.es/dept/medicina/citoweb/hemato/tecnica/imagsp.htm http://www.arrakis.es

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Guía de Observación de Células Sanguíneas

Eritrocitos de morfología normal. Los puntos pequeños son plaquetas.

Linfocito. Células pequeñas con núcleo circular oscuro y escaso citoplasma de color azul.

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Neutrófilo: tienen núcleo fragmentado, con 3 o 5 lóbulos. En el citoplasma poseen gránulos teñidos de azul. Monocitos: células circulares de mayor tamaño. Tienen un núcleo en forma de “U” o de frijol.

Sangre periférica con tres neutrófilos

Monocito

Neutrófilo

Monocito

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Eosinófilo: células con núcleo bilobulado y numerosas granulaciones intra citoplásmicas de color azul.

Basófilo: células con abundantes granulaciones intra citoplásmicas.

Fuente: Modificado de http://www.udl.es/dept/medicina/citoweb/hemato/tecnica/imagsp.htm

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Evaluación Para comprobar que se cumple con la metodología requerida para la realización de una tinción de Wrigth, llenar la siguiente lista de cotejo. El alumno:

Sí No 1.- ¿Toma la muestra sanguínea de acuerdo al procedimiento establecido?

2.-¿ Vierte la sangre sin hemolisarla en el tubo de ensaye con anticoagulante?

3.- ¿Evita que la muestra se coagule?

4.- ¿Mantiene la muestra en condiciones óptimas hasta su procesamiento?

5.- ¿Realiza el frotis de forma adecuada?

5.- ¿Evita la contaminación de mobiliario, manos y ropa durante la realización del frotis?

6.- ¿Agrega el colorante de Wrigth hasta cubrir totalmente el frotis?

7.- ¿Agrega la solución amortiguadora sin derramar el colorante?

8.- ¿Guarda los tiempos establecidos para que el colorante actúe?

9.- ¿Elimina correctamente el exceso de colorante?

10.- ¿Coloca aceite de inmersión en la preparación antes de usar el objetivo 100 X?

11.- ¿Observa al microscopio la mayor superficie del frotis?

12.- ¿Identifica correctamente las células sanguíneas?

13.- ¿Anota los resultados de forma limpia y ordenada? 14.- ¿Limpia el aceite de inmersión de la lente del microscopio? 15.- ¿Apaga y desconecta el microscopio? 13.- ¿Trabaja colaborativamente con sus compañeros de equipo?

14.- ¿Su lugar de trabajo está limpio y orednado? 14.- ¿Trata los residuos como lo indica el diagrama ecológico?

Recomendaciones:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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Práctica No.4

Determinación de glucosa en suero por el método de Hultman Propósitos: Que el alumno:

• Realice la determinación de glucosa en suero por medio del método de Hultman, (o-toluidina).

• Desarrolle habilidad para trabajar con seguridad e higiene en el laboratorio clínico.

Fundamento El mantenimiento de la glucemia, o concentración plasmática de glucosa, en los organismos superiores es fundamental para el funcionamiento de todos los órganos. La ingestión de glucosa o sustancias que la produzcan (almidón, fructosa, galactosa) produce un aumento de la glucosa en sangre. Este aumento origina la secreción de insulina que es una hormona pancreática responsable de regular la concentración de glucosa en sangre. En el caso de que la producción de insulina esté disminuida, la glucosa no puede ser utilizada por las células, lo cual ocasiona niveles elevados de glucosa en sangre (hiperglucemia); así ocurre en las personas que sufren diabetes del tipo denominado "dependiente de insulina" o "tipo I". El diagnóstico de la diabetes dependiente de insulina es sencillo y se basa en antecedentes, síntomas clínicos y comprobación de una hiperglucemia significativa. La determinación de glucosa sanguínea es una prueba diagnóstica muy frecuente en los laboratorios clínicos. El número de métodos de ensayo que se utilizan es muy elevado, y aunque los niveles que se consideran como nórmales varian según la técnica utilizada, casi todos se encuentran alrededor de 100 mg/dL para un adulto. Una hiperglucemia superior a 140 mg/dL detectada en más de una ocasión en ayunas es un índice de posible diabetes, diagnóstico que debe confirmarse con otras pruebas. Para la determinación de glucosa se distinguen principalmente tres tipos de métodos: 1. Métodos que se basan en el poder reductor de la glucosa pare reducir a otro compuesto:

a. Sales mercúricas a sales mercuriosas y mercurio b. Sales cúpricas a oxido cuproso c. Sales férricas, especialmente ferricianuro, a sales ferrosas

2. Métodos basados en la formación de derivados del furfural. El principal inconveniente de estos dos grupos de técnicas es que cualquier otra sustancia reductora presente puede interferir con el ensayo de la glucosa.

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3. Métodos enzimáticos. Se basan en la transformación de la glucosa por una enzima (por ejemplo glucosa oxidasa), que específicamente la transforma, acoplándose esta reacción enzimática a una reacción de color fácilmente detectable. Método de Hultman Hultman en 1959, empleó la o-toluidina en ácido acético glacial para la cuantificación de glucosa. Este método sólo requiere un periodo de calentamiento de 8 minutos y es posible utilizar para el análisis suero o plasma sin necesidad de precipitar previamente las proteínas. La determinación de glucosa con el reactivo de o-toluidina es un método basado en la formación de derivados del furfural. Pese a la posibilidad de interferencias este es un método ampliamente utilizado. La glucosa y otras aldosas se condensan con aminas aromáticas en soluciones de ácido acético caliente dando lugar a una glucosamina. En la reacción, la glucosa en medio ácido caliente, se transforma en furfural que posteriormente se condensa con una amina aromática (o- toluidina) formando un producto de color verde que se puede medir por en el espectrofotómetro a 630 nm.

glucosa hidroximetilfurfural agua

hidroximetilfurfural o-toluidina glucosamina cíclica (color verde)

Según la Ley de Lambert-Beer existe una relación directa entre absorbancia y concentración de glucosa, por lo que es posible obtener una curva patrón que relacione la absorbancia frente a la concentración de glucosa a partir de un patrón de concentración conocida. Si se determina la absorbancia de la muestra del paciente

ACIDO CONCENTRADO

+

CH3

NHH

+

O-HH

O

H H

CH2OHO=CH

O

O

O

O

OO

HH

H

H

H

3

O

HH

CH2OH

C=OH

O

H H

C=NCH2OHCH3H

CALOR

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226

bajo las mismas condiciones que la disolución patrón, se puede conocer su concentración con la ayuda de la curva patrón. La muestra de elección es suero o plasma libre de hemólisis. También pueden utilizarse otros líquidos orgánicos, como el cefalorraquideo y la orina. Para evitar que la concentración de glucosa cambie con el tiempo, la muestra debe centrifugarse separando el coágulo o células lo más pronto posible. En el suero o plasma, en ausencia de las células sanguíneas, la glucosa es estable hasta 3 días a una temperatura de 2ºC a 8ºC.

Material Reactivos 6 tubos de ensaye de 13 x 100 Pipeta graduada de 1 mL Guantes de látex Baño María Espectrofotómetro Celdas para espectrofotómetro

Suero sanguíneo Agua destilada Solución patrón de glucosa. Reactivo de o-toluidina

Metodología:

1. Etiquetar los tubos de ensaye como se muestra en la siguiente tabla. 2. Agregar las sustancias como se muestra en la siguiente tabla.

No. de tubo 1 2 3 4 5 6 Agua destilada 0.1 mL --- --- --- --- --- Solución patrón 50 mg/dL --- 0.1 mL --- --- --- --- Solución patrón 100 mg/dL --- --- 0.1 mL --- --- --- Solución patrón 200 mg/dL --- --- --- 0.1 mL --- --- Solución patrón 300 mg/dL --- --- --- --- 0.1 mL --- Problema --- --- --- --- --- 0.1 mL Reactivo de o-toluidina 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL

3. Mezclar los tubos y colocar en baño maría a ebullición durante 8 minutos. 4. Enfriar en agua corriente. 5. Leer la absorbancia en el espectrofotómetro a 630 nm antes de 30 minutos de

haber mezclado las sustancias. 6. Construir una tabla para registrar los datos experimentales. 7. Construir una gráfica de absorbancia vs. Concentración (curva patrón)

Nota: Si la absorbancia del problema es muy alta (0.7) deberá diluirse el suero previamente.

Análisis clínicos

227

Valores de referencia: Los valores normales para sangre total del adulto en ayunas y para suero o plasma, con el método de la o-toluidina, son de 60 mg/dL a 100 mg/dL y de 70 mg/dL a 110 mg/dL respectivamente.

Bibliografía:

1. G.D. Crandall. (1983) Biochemistry Laboratory. Oxford University Press, London.

2. A.T. Hugget. (1957) Use of glucose oxidase, peroxidase and o-dianisidine in determination of blood and urinary glucose. Lancet, agoust 24 G.

3. Rendina, T. (19749. Técnicas de Bioquímica Aplicada. Interamericana, México.

Tratamiento de residuos: El material de laboratorio contaminado con sangre se debe ponerse por 24 horas en una solución de cloro comercial.

Análisis clínicos

228

Evaluación Para comprobar que se cumple con la metodología requerida para la determinación de glucosa en sangre por el método de Hultman, llenar la siguiente lista de cotejo. El alumno:

Sí No 1.- ¿Toma la muestra sanguínea de acuerdo al procedimiento establecido?

2.- ¿Vierte la sangre sin hemolisarla en el tubo de ensaye?

3.- ¿Desprende el coagulo de las paredes del tubo?

4.- ¿Nivela los tubos antes de centrifugarlos?

5.- ¿Centrifuga los tubos sin perder la muestra?

5.- ¿Separa el suero del paquete celular de forma adecuada?

6.- ¿Rotula los tubos de forma correcta?

7.- ¿Agrega las cantidades de reactivos y muestra indicadas?

8.- ¿Incuba los tubos el tiempo indicado?

9.- ¿Prende el espectrofotómetro 15 minutos antes de realizar la lectura?

10.- ¿Ajusta la longitud de onda indicada?

11.- ¿Ajusta a 0 % de transmitancia usando el blanco?

12.- ¿Mantiene la celda limpia y libre de huellas dactilares?

13.- ¿Enjuaga la celda antes de realizar una lectura? 14.- ¿Anota los resultados de forma limpia y ordenada? 15.- ¿ Construye correctamente la curva patrón? 15.- ¿Realiza correctamente los cálculos para encontrar la concentración?

16.- ¿Limpia, apaga y desconecta el espectrofotómetro? 17.- ¿Trabaja colaborativamente con sus compañeros de equipo?

18.- ¿Su lugar de trabajo está limpio y ordenado? 19.- ¿Trata los residuos como lo indica el diagrama ecológico?

Análisis clínicos

229

Recomendaciones:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Análisis clínicos

230

Práctica No.5

Determinación de glucosa en suero por el método de glucosa oxidasa

Propósitos: Que el alumno:

• Realice la determinación de glucosa en suero por medio del método de glucosa oxidasa.

• Desarrolle habilidad para trabajar con seguridad e higiene en el laboratorio clínico.

Fundamento: Como se mencionó anteriormente, existen varios métodos para determinar la concentración de glucosa en sangre. Los métodos modernos se basan en la actividad de enzimas que catalizan reacciones del analito de interés. Acopladas a estas reacciones, se llevan a cabo reacciones secundarias cuyos productos son coloridos y susceptibles de cuantificar por medio del espectrofotómetro. En el caso de la glucosa, un método común es el que emplea el complejo de enzimas glucosa oxidasa / peroxidasa. La enzima glucosa oxidasa cataliza la oxidación de la glucosa en presencia de agua y oxígeno, dando como productos agua oxigenada y ácido D-glucónico. Reacción No. 1 D- Glucosa + H2O + O2 Glucosa oxidasa H2O2 + D- ácido glucónico. El peróxido de hidrógeno obtenido reacciona con los reactivos 4- aminoantipirina y el p – HBS en presencia de la enzima peroxidasa, para dar un producto de color rojo que puede ser cuantificado usando el espectrofotómetro a 500 nm. Reacción No. 2 H2O2 + 4- aminoantipirina + p – HBS Peroxidasa producto rojo + H2O

Material Reactivos 3 tubos de ensaye de 13x100. 1 pipeta de 5mL 1 pipeta automática de volumen variable. Espectrofotómetro Celdas para espectrofotómetro Baño María

Suero sanguíneo Agua destilada Solución patrón de glucosa 200 mg/dL

Análisis clínicos

231

Metodología: PRECAUCIÓN: Toda muestra de sangre debe ser tratada como potencialmente infecciosa. No se debe manipular sin guantes. Se debe tener mucho cuidado de no contaminar con sangre las mesas e instalaciones del laboratorio.

1. Rotular los tubos de la siguiente manera: Blanco (b), Estándar (e) y Muestra (m).

2. Se agrega a cada tubo las sustancias indicadas en la tabla Blanco Estándar Muestra

Reactivo de glucosa

3.0 mL 3.0 mL 3.0 mL

Agua destilada 10 μL

Estándar 10 μL

Muestra 10 μL

3. Mezclar cuidadosamente los tubos e incubar durante 10 minutos en Baño María.

4. Leer la muestra y estándar a 500 nm. 5. Construir una tabla para registrar los datos.

Cálculos: Concentración de glucosa = Absorbancia de la muestra x concentración del estándar Absorbancia del estándar Valores Normales: 70 a 105 mg/dL Bibliografía: Instructivo de uso de Glucosa Oxidasa Hycel N. 70408 Tratamiento de residuos: El material de laboratorio contaminado con sangre deben ponerse por 24 horas en una solución de cloro comercial.

Análisis clínicos

232

Evaluación Para comprobar que se cumple con la metodología requerida para la determinación de glucosa en sangre por el método de glucosa oxidasa, llenar la siguiente lista de cotejo. El alumno:

Sí No 1.- ¿Toma la muestra sanguínea de acuerdo al procedimiento establecido?

2.- ¿Vierte la sangre sin hemolisarla en el tubo de ensaye?

3.- ¿Desprende el coagulo de las paredes del tubo?

4.- ¿Nivela los tubos antes de centrifugarlos?

5.- ¿Centrifuga los tubos sin perder la muestra?

5.- ¿Separa el suero del paquete celular de forma adecuada?

6.- ¿Rotula los tubos de forma correcta?

7.- ¿Agrega las cantidades de reactivos y muestra indicadas?

8.- ¿Incuba los tubos el tiempo indicado?

9.- ¿Prende el espectrofotómetro 15 minutos antes de realizar la lectura?

10.- ¿Ajusta la longitud de onda indicada?

11.- ¿Ajusta a 0 % de transmitancia usando el blanco?

12.- ¿Mantiene la celda limpia y libre de huellas dactilares?

13.- ¿Enjuaga la celda antes de realizar una lectura? 14.- ¿Anota los resultados de forma limpia y ordenada? 15.- ¿Realiza correctamente los cálculos para encontrar la concentración ¿

15.- ¿Limpia, apaga y desconecta el espectrofotómetro? 16.- ¿Trabaja colaborativamente con sus compañeros de equipo?

17.- ¿Su lugar de trabajo está limpio y ordenado? 18.- ¿Trata los residuos como lo indica el diagrama ecológico?

Análisis clínicos

233

Recomendaciones:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Análisis clínicos

234

Práctica No.6

Determinación de urea por el método enzimático Propósitos: Que el alumno:

• Realice la determinación de urea en sangre por el método enzimático. • Desarrolle habilidad para trabajar con seguridad e higiene en el laboratorio

clínico. Fundamento:

La urea es el resultado final del metabolismo de las proteínas, durante la digestión las proteínas son separadas en aminoácidos. Los aminoácidos contienen nitrógeno que se libera como ión amonio el cual es muy tóxico, por lo que el organismo lo convierte en urea en el hígado y se excreta en la orina.

Si el riñón no funciona bien la urea se acumula en la sangre y se eleva su concentración. En general, el nivel de urea en sangre es un parámetro que indica la función renal, aunque también puede estar alterado en enfermedades del hígado o en la deshidratación.

A los altos niveles de urea en sangre se le conoce como uremia y puede presentarse en los siguientes trastornos: dietas con exceso de proteínas, enfermedades renales, fallo cardiaco, hemorragias gastrointestinales, hipovolemia (quemaduras, deshidratación), inanición, y obstrucciones renales (piedras, tumores). El caso contrario, niveles bajos de urea, se pueden presentar en los siguientes casos: Dieta pobre en proteínas, fallo hepático, embarazo, exceso de hidratación y malnutrición

La determinación de urea en sangre, se puede llevar a cabo de dos formas, el método químico se basa en la reacción que esta tiene con el ortoftalaldehído en medio ácido para dar un producto que se lee a 510 nm y el enzimático. Este último se mide a 340 nm, a continuación se muestran las reacciones.

Reacciones:

Metodología: PRECAUCIÓN: Toda muestra de sangre debe ser tratada como potencialmente infecciosa. No se debe manipular sin guantes. Se debe tener mucho cuidado de no contaminar con sangre las mesas e instalaciones del laboratorio.

Urea + H2O Ureasa 2NH3 + CO2 2-ά – cetoglutarato + 2 NH3 + 2 NADH glutamato deshidrogenasa 2 glutamato + 2 DAD+ + 2 H2O

Análisis clínicos

235

1. Rotular los tubos de la siguiente manera: Blanco (b), Estándar (e) y Muestra (m).

2. Se agrega a cada tubo las sustancias indicadas en la tabla Blanco Estándar Muestra

Reactivo No. 1 2.0 mL 2.0 mL 2.0 mL

Estándar 50 μL

Muestra 50 μL

Mezclar y añadir lo siguiente

Reactivo No. 2 2.0 mL 2.0 mL 2.0 mL

3. Mezclar cuidadosamente los tubos e incubar durante 15 minutos en Baño

María. 4. Leer la muestra y estándar a 510 nm. 5. Construir una tabla para registrar los datos.

Cálculos: Concentración de glucosa = Absorbancia de la muestra x concentración del estándar Absorbancia del estándar Valores Normales: 20 a 50 mg/dL Bibliografía: Instructivo de uso de urea Spinreact Tratamiento de residuos: El material de laboratorio contaminado con sangre se debe poner por 24 horas en una solución de cloro comercial.

Análisis clínicos

236

Evaluación Para comprobar que se cumple con la metodología requerida para la determinación de urea en sangre, llenar la siguiente lista de cotejo. El alumno:

Sí No 1.- ¿Toma la muestra sanguínea de acuerdo al procedimiento establecido?

2.- ¿Vierte la sangre sin hemolisarla en el tubo de ensaye?

3.- ¿Desprende el coagulo de las paredes del tubo?

4.- ¿Nivela los tubos antes de centrifugarlos?

5.- ¿Centrifuga los tubos sin perder la muestra?

5.- ¿Separa el suero del paquete celular de forma adecuada?

6.- ¿Rotula los tubos de forma correcta?

7.- ¿Agrega las cantidades de reactivos y muestra indicadas?

8.- ¿Incuba los tubos el tiempo indicado?

9.- ¿Prende el espectrofotómetro 15 minutos antes de realizar la lectura?

10.- ¿Ajusta la longitud de onda indicada?

11.- ¿Ajusta a 0 % de transmitancia usando el blanco?

12.- ¿Mantiene la celda limpia y libre de huellas dactilares?

13.- ¿Enjuaga la celda antes de realizar una lectura? 14.- ¿Anota los resultados de forma limpia y ordenada? 15.- ¿Realiza correctamente los cálculos para encontrar la concentración ¿

15.- ¿Limpia, apaga y desconecta el espectrofotómetro? 16.- ¿Trabaja colaborativamente con sus compañeros de equipo? 17.- ¿Su lugar de trabajo está limpio y ordenado? 18.- ¿Trata los residuos como lo indica el diagrama ecológico?

Recomendaciones:_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Análisis clínicos

237

Práctica No.7

Determinación de creatinina por el método de Jaffe Propósitos: Que el alumno:

• Realice la determinación de creatinina en sangre por el método de Jaffe. • Desarrolle habilidad para trabajar con seguridad e higiene en el laboratorio

clínico. Fundamento: La creatina, y más precisamente su forma fosforilada o fosfocreatina, proporciona energía al organismo. La creatinina se forma en los músculos a partir del fosfato de creatina. Su nivel sanguíneo es muy constante ya que depende de la modificación de la masa muscular, que varía muy poco en la mayoría de las personas. La determinación de creatinina en suero se utiliza para evaluar la función renal. Cuando los riñones no están funcionando adecuadamente, los niveles de creatinina en sangre aumentan debido a la disminución en la excreción de ésta en la orina. Los niveles de creatinina pueden variar de acuerdo con la talla y masa muscular de la persona.Los valores superiores al nivel normal pueden ser indicio de: nefrosis, deshidratación, glomerulonefritis, pre clampsia, reducción del flujo renal, obstrucción de vías urinaria e insuficiencia renal, entre otros padecimientos.

Los valores inferiores al nivel normal pueden ser indicio de: distrofia muscular (etapa avanzada) y miastenia grave.La creatinina en sangre se determina de acuerdo con la reacción de Jaffe, que es un método enzimático en la cual la creatinina reacciona con ácido picrico en condiciones alcalinas para formar un producto de color rojo que se lee a 510 nm.

Reacciones:

Creatinina + H2O creatininasa creatina Creatina + H2O creatinasa sarcosina + urea Sarcosina + H2O sarcosina oxidasa glicina + HCOH + H2O2

H2O2 + cromógeno peroxidasa color

Análisis clínicos

238

Se efectúan dos mediciones, la segunda a los 30 segundos inmediatos a la primera. El cambio en la intensidad del color rojo es directamente proporcional a la concentración de creatinina.

Material Reactivos 3 tubos de ensaye de 13x100. 1 pipeta de 5mL 1 pipeta automática de volumen variable. Espectrofotómetro Celdas para espectrofotómetro Baño María

Suero sanguíneo Agua destilada Reactivo de trabajo Solución patrón de creatinina de 2 mg/dL

Metodología: PRECAUCIÓN: Toda muestra de sangre debe ser tratada como potencialmente infecciosa. No se debe manipular sin guantes. Se debe tener mucho cuidado de no contaminar con sangre las mesas e instalaciones del laboratorio.

3. Rotular los tubos de la siguiente manera: Blanco (b), Estándar (e) y Muestra (m).

4. Se agrega a cada tubo las sustancias indicadas en la tabla Blanco Estándar Muestra

Reactivo de trabajo

2.0 mL 2.0 mL 2.0 mL

Estándar ------- 200 μL -------

Muestra

------- ------- 200 μL

5. Mezclar cuidadosamente los tubos y poner en marcha el cronómetro. 6. Leer la muestra al cabo de 30 segundos (A1) a 492 nm. 7. Registrar los datos. 8. Leer la muestra y el estándar al cabo de 60 segundos. 9. Registra los datos.

Resultados:

Tubo Absorbancia (A1)

Absorbancia (A2)

Estándar Muestra

Análisis clínicos

239

Cálculos: Af = A2 – A1 Af de la muestra x 2 (concentración del estándar = mg/dL Af del estándar Valores Normales: Mujeres: 0.57 – 0.9 mg/dL Hombres: 0.64 – 0.9 mg/dL Bibliografía: Instructivo de uso de creatinina Spinreact Tratamiento de residuos: El material de laboratorio contaminado con sangre se debe poner por 24 horas en una solución de cloro comercial.

Análisis clínicos

240

Para comprobar que se cumple con la metodología requerida para la determinación de creatinina en sangre, llenar la siguiente lista de cotejo. El alumno:

Sí No 1.- ¿Toma la muestra sanguínea de acuerdo al procedimiento establecido?

2.- ¿Vierte la sangre sin hemolisarla en el tubo de ensaye?

3.- ¿Desprende el coagulo de las paredes del tubo?

4.- ¿Nivela los tubos antes de centrifugarlos?

5.- ¿Centrifuga los tubos sin perder la muestra?

5.- ¿Separa el suero del paquete celular de forma adecuada?

6.- ¿Rotula los tubos de forma correcta?

7.- ¿Agrega las cantidades de reactivos y muestra indicadas?

8.- ¿Realiza las lecturas en los tiempos especificados?

9.- ¿Prende el espectrofotómetro 15 minutos antes de realizar la lectura?

10.- ¿Ajusta la longitud de onda indicada?

11.- ¿Ajusta a 0 % de transmitancia usando el blanco?

12.- ¿Mantiene la celda limpia y libre de huellas dactilares?

13.- ¿Enjuaga la celda antes de realizar una lectura? 14.- ¿Anota los resultados de forma limpia y ordenada? 15.- ¿Realiza correctamente los cálculos para encontrar la concentración ¿

15.- ¿Limpia, apaga y desconecta el espectrofotómetro? 16.- ¿Trabaja colaborativamente con sus compañeros de equipo? 17.- ¿Su lugar de trabajo está limpio y ordenado? 18.- ¿Trata los residuos como lo indica el diagrama ecológico?

Recomendaciones:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Análisis clínicos

241

Práctica No.6

Examen general de orina

Propósitos: • Desarrollar en óptimas condiciones de higiene y seguridad un análisis de

orina usando tiras reactivas. • Identificar al microscopio los principales elementos del sedimento urinario

Fundamento: El análisis general de orina consta de varias etapas, la primera consiste en la observación de las características macroscópicas de la muestra. El color normal de la orina es desde el amarillo pálido hasta el ámbar oscuro. Un color más oscuro indica que la orina está concentrada y puede deberse a deshidratación o mal funcionamiento renal. Un color pálido se observa en muestras de pacientes que orinan frecuentemente debido a ciertos padecimientos como la diabetes. El característico olor de la orina se debe a ácidos volátiles, un olor desagradable es causado por infección urinaria. Las muestras turbias se asocian a enfermedades renales en las que la orina está concentrada debido a la presencia de células y sustancias que en condiciones normales no se encuentran. Una forma fácil de identificar sustancias en la orina es mediante el uso de las tiras reactivas. Estas tiras fabricadas en un material plástico permeable al agua, están impregnadas de sustancias químicas que permiten la determinación rápida de los siguientes parámetros: pH, proteínas, glucosa, cuerpos cetónicos, bilirrubina, hemoglobina, nitritos, esterasa de leucocitos y urobilinógeno. Las sustancias impregnadas en la tira se encuentran separadas unas de otras y reaccionan con las sustancias de la orina produciendo compuestos coloridos. La intensidad del color desarrollado es proporcional a la concentración de la sustancia en la orina. Los fabricantes de tiras reactivas, proporcionan un estándar de colores con el que se puede comparar la tira usada en un ensayo. A continuación se detalla la información que proporciona una tira reactiva. Densidad relativa: se compara la densidad de la orina con la densidad del agua pura que tiene un valor de 1.0 g/mL., es de esperar que la densidad de la orina sea mayor al del agua pura. La diferencia relativa entre la densidad del agua y la de la orina refleja el grado de concentración de la orina. Los pacientes con diabetes, suelen orinara frecuentemente (poliuria) ya que su organismo trata de eliminar la cantidad excesiva de glucosa que hay en la sangre, por lo que su orina tiende a ser menos concentrada. pH: el rango de pH que se considera normal está entre 4.6 a 8, siendo el valor promedio entre 6. Una alteración del pH de la orina se asocia con la aparición de cálculos renales.

Análisis clínicos

242

Glucosa: normalmente existen pequeñas cantidades de glucosa en la orina, cuando hay un exceso se llama glucosuria. La medición de la glucosa en orina es una forma de diagnosticar la diabetes. Cuerpos cetónicos: principalmente son tres compuestos: acetona, ácido beta hidroxibutírico y ácido acetoacético, el exceso de cuerpos cetónicos es un indicio de diabetes. Nitritos: Cuando se detectan nitritos y se observan bacterias en el examen microscópico el paciente suele tener infección urinaria. Bilirrubina: La bilirrubina es un producto de la degradación de la hemoglobina, es común encontrarla en exceso en obstrucción de los conductos biliares o algún proceso patológico en el hígado. Urobilinógeno: también es un producto de la degradación de la hemoglobina, cuando hay disfunción hepática los niveles de urobilinógeno en la orina se elevan. Enzima leucocitoesterasa: los leucocitos de la orina producen la enzima leucocitoesterasa, de manera que su presencia en la orina indica infección urinaria. El análisis del sedimento urinario ayuda a revelar diferentes padecimientos. En condicione normales, existen muy pocos eritrocitos en la orina. Su morfología puede revelar si el daño se encuentra en el glomérulo o en una zona posterior. Los eritrocitos que atraviesan el canal glomerular , se desforman, fragmentan y tienen muescas. Cuando se encuentran abundantes leucocitos, principalmente granulocitos, indican la presencia de procesos inflamatorios del riñón y la vía urinaria. En la mujer debe tenerse en cuenta que los leucocitos hallados pueden ser de origen vaginal, sobre todo si se acompañan de una gran cantidad de células de epitelio plano. Los cilindros son estructuras longitudinales que tienen la forma de los túbulos renales. Se originan por el espesamiento de las proteínas o su precipitación sobre los túbulos renales. Su presencia generalmente indica una enfermedad renal, aunque la evidencia de alguno de ellos pueden encontrarse en personas sanas tras grandes esfuerzos físicos. Existen diferentes tipos de cilindros:

• Cilindros hialinos: son homogéneos, incoloros, transparentes y poco refringentes, por lo que son fáciles de omitir

• Cilindros granulosos Suelen ser más grandes que los hialinos y presentar inclusiones granulares.

• Cilindros céreos: Suelen ser más anchos que los hialinos, muestran una refringencia mucho mayor y no son fáciles de omitir.

• Cilindros epiteliales: Están compuestos de epitelio tubular descamado

Análisis clínicos

243

• Cilindros con inclusiones lipídicas: inclusión de gotas de grasa en las células tubulares.

• Cilindros eritrocitarios: Se componen de eritrocitos hinchados que se adhieren a una sustancia fundamental hialina.

• Cilindros leucocitarios: formados por leucocitos. Los cristales pueden adoptar múltiples formas dependiendo del compuesto químico y del pH del medio. sólo poseen significado diagnóstico en muy pocos casos. Los cristales más comunes se enlistan a continuación: • Uratos: Se encuentran en forma amorfa en orinas ácidas o conformando un

cilindro • Urato diamónico: Aparece en orinas ligeramente alcalinas como pequeñas

esferas de color amarillo pardo. • Ácido úrico: En la orina ácida pueden adoptar múltiples formas (cuadros

romboidales, rosetas, pesas, barriles, bastones). • Oxalato de calcio: Es incoloro y muy birrefringente. • Sulfato de calcio: Se observan como agujas largas y finas. • Fosfato amónico-magnésico: Se aprecian como formas incoloras en "tapa

de ataúd" en la orina alcalina • Cistina: Se detectan en orinas ácidas como cuadros hexagonales incoloros.

Material Reactivos Centrífuga Microscopio Porta y cubre objetos Pipetas Pasteur

Tiras reactivas

Procedimiento: PRECUACIUÓN: La orina es una fluido biológico potencialmente infeccioso. Se debe manipular con extremo cuidado, usando guantes de látex y evitando contaminar las instalaciones del laboratorio, la ropa y la piel. Recolección de la muestra:

• Se pide al paciente que orine directamente en un recipiente limpio y seco evitando la contaminación de la muestra con fluidos vaginales y sangre menstrual.

• La muestra se etiqueta con los datos personales del paciente y la fecha de recolección.

• Se observa el color, olor y turbidez de la muestra. Se anotan los resultados. Análisis con tira reactiva:

• Humedecer la tira reactiva en la muestra de orina el tiempo señalado por el fabricante. No se debe dejar más tiempo del indicado.

• Retirar la tira, eliminar el exceso de orina y comparar la tira con el estándar de colores del fabricante. La lectura debe hacerse inmediatamente con la tira reactiva húmeda.

• Registra los resultados obtenidos.

Análisis clínicos

244

Análisis Microscópico: • Colocar en un tubo de ensayo 10ml de orina . • Colocar el tubo en la centrífuga. Se debe tener cuidado que los tubos estén

equilibrados para evitar que se rompan dentro de la centrífuga. • Centrifugar 7 minutos a una velocidad de 2000 rpm. • Una vez detenida la centrífuga, retirar el tubo. Desechar el sobre nadante y

con una pipeta Pastuer tomar una pequeña porción del sedimento. Como se muestra en la figura No. 1

Figura No. 1

• Colocarlo en un porta objetos y cubrirlo con un cubre objetos. • Observa la muestra al microscopio con el objetivo 100 X. • A continuación se muestra una guía de observación para la identificar los

cristales, células y cilindros más comunes. Resultados

Análisis Macroscópico

Color Olor Turbidez

Análisis con Tira Reactiva

Parámetro Resultado Observaciones

Análisis del sedimento Elemento (cristal o célula) Resultado Observaciones

Análisis clínicos

245

Guía de Observación:

Cristales de Fosfatos de Amonio y Magnesio

Placas y prismas de calcio

Análisis clínicos

246

Urato amónico

Cristales de Carbonato de calcio

Cristales de Oxalato de calcio

Análisis clínicos

247

Células epiteliales

Células epiteliales

Análisis clínicos

248

Células epiteliales

Análisis clínicos

249

Cristales de ácido úrico

Análisis Clínicos

250

Células Rojas (eritrocitos)

Células Blancas o Leucocitos.

Análisis Clínicos

251

Cilindro hialino

Cilindro granuloso

Análisis Clínicos

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Cilindro céreo

Cilindro hemático Fuente de imágenes: http://orbita.starmedia.com/~forobioq/a_s_celulas. http://www.renal.com.ar/monografias/sedimento/sto_6diag.htm#Cilindro hialino

Bibliografía 1. Guyton. A.C. (2000) Manual de Fisiología Médica. McGraw-Hill, Madrid. 2. Krupp, M.A. et al. (1986) Diagnóstico clínico y de laboratorio. Manual

moderno, México.

Análisis Clínicos

253

Evaluación Para comprobar que se cumple con la metodología requerida para la realización de un examen general de orina, llenar la siguiente lista de cotejo. El alumno:

Sí No 1.- ¿Da las indicaciones correctas al paciente para recolectar la muestra de orina?

2.- ¿Verifica que el paciente comprenda las indicaciones? 3.- ¿Etiqueta correctamente las muestras? 4.- ¿Observa detenidamente las características físicas de la muestra?

5.- ¿Registra las observaciones de forma limpia y ordenada? 6.- ¿Introduce la tira reactiva en la muestra durante el tiempo indicado por el fabricante?

7.- ¿Compara la tira reactiva con el estándar de colores inmediatamente después de ser humedecida?

8.- ¿Anota los resultados de forma limpia y ordenada? 9.- ¿Interpreta adecuadamente los resultados obtenidos? 10.- ¿Nivela los tubos con orina antes de centrifugarlos? 11.- ¿Centrifuga los tubos sin perder la muestra? 12.- ¿Toma adecuadamente el sedimento? 13.- ¿Coloca aceite de inmersión en la preparación antes de usar el objetivo 100 X?

14.- ¿Observa al microscopio la mayor superficie de la preparación?

15.- ¿Identifica correctamente los cristales que observa? 16.- ¿Anota los resultados de forma limpia y ordenada? 17.- ¿Limpia el aceite de inmersión de la lente del microscopio? 18.- ¿Apaga y desconecta el microscopio? 19.- ¿Trabaja colaborativamente con sus compañeros de equipo? 20.- ¿Su lugar de trabajo está limpio y ordenado? 21.- ¿Trata los residuos como lo indica el diagrama ecológico?

Recomendaciones:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Análisis Clínicos

254

Práctica No.6

Coproparasitoscópico Propósitos:

Que el alumno: • Realice el estudio coproparasitoscópico seriado mediante la técnica de

flotación de Faust. • Desarrolle habilidad para trabajar con seguridad e higiene en el laboratorio clínico.

Fundamento: Las enfermedades parasitarias constituyen uno de los principales problemas de salud a nivel mundial representando un enorme gasto económico en particular para los países en vías de desarrollo, el número de pacientes que padecen o mueren por enfermedades parasitarias se incrementa de manera proporcional con el crecimiento de la población mundial. Una clasificación sencilla divide a los parásitos del hombre en unicelulares (protozoarios) y multicelulares (metazoarios). Cuatro clases de protozoarios incluyen parásitos del hombre: 1. Sarcodina (ejemplo: amibas) 2. Mastigosphora (ejemplos: tripanosoma, tricomonas y giardias) 3. Sporozoa (ejemplo: isospora, plasmodios y toxoplasma) 4. Ciliata (ejemplo: balantidium) Los metazoarios (lombrices) con importancia en gastroenterología, pertenecen a 2 ramas: 1. Platelmintos:

a) Tremátodos (ejemplo: fasciola y esquistosoma) b) Cestodos (ejemplo: tenias, equinococus)

2. Nematelmintos: a) Nematodos (ejemplo: ascaris, oxiuros strongiloides)

Estadísticas oficiales de 1995 indican que la amibiosis, la ascariosis y otras parasitosis intestinales ocuparon el 3º, 5º, y 7º lugar respectivamente, entre todas las causas de enfermedad en México. (ver tabla No. 1).

Análisis Clínicos

255

Tabla 1. Prevalecía de parasitosis en México durante 1995.

PARASITOSIS TOTAL DE CASOS TASA X 100,000 HABITANTES

amibiosis intestinal 1,106,364 1,274.98 absceso hepático amibiano 3,074 3.54

Ascariosis 469,951 527.22 Giardosis 76,577 88.22 oxiuriosis 152,499 175.74 Teniosis 9,495 10.94

Cisticercosis 691 0.70 Trichuriosis 10,463 11.83

otras parasitosis intestinales 123,308 142.10

Material Reactivos Embudo de tallo corto. Gasa Abatelenguas

Reactivo de Faust: Solución de sulfato de zinc ZnSO4

al 33 % (densidad 1.18 g/mL) Lugol parasitológico. Agua

Metodología: Toma de muestra de heces fecales (seriado de tres): Instrucciones de la toma de muestra: 1. La muestra debe recolectarse en un frasco limpio y seco con tapa. 2. La toma debe realizarse de la siguiente manera:

a) De la primera evacuación del día, tomar con un abate lenguas o cuchara desechable un poco de muestra, observar si las heces presenta moco y/o sangre, si es así tomar de esta zona; la muestra debe ser del tamaño de una nuez (aproximadamente 1g).

b) La muestra debe ser depositada en el frasco limpio y seco. c) Cerrar bien el frasco y etiquetarlo con los datos del paciente. d) Colocar el frasco en el interior de una bolsa de plástico y mantenerla en

refrigeración; se debe colocar en la parte baja del refrigerador, alejada del congelador.

e) Mantener así el frasco hasta el siguiente día para la recolección de una nueva muestra

f) Para la recolección de los días dos y tres se sigue el procedimiento anterior, colocándose las tres muestras en el mismo frasco.

Método de concentración de Faust: 1. Preparar una suspensión de materia fecal en agua en una proporción 1:10. 2. Tamizar a través de un embudo de filtración, utilizando como medio poroso

gasa. 3. Colocar la suspensión en un tubo de ensayo 13x100 y centrifugar a 1500 rpm

durante 1minuto.

Análisis Clínicos

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4. Desechar el sobrenadante y repetir el lavado si es necesario. 5. Agregar al ultimo sedimento 1 mL de reactivo de Faust y mezclar. 6. Llenar el tubo con reactivo de Faust y centrifugar a 1500 rpm durante 1 minuto. 7. Agregar cuidadosamente con una pipeta pasteur el reactivo de Faust hasta

formar un menisco y dejar reposar un minuto. 8. Con un cubre objetos tomar por oposición la película formada en la superficie

del menisco y colocarlo sobre un porta objetos, en el cual previamente se a colocado una gota de lugol.

9. Observar al microscopio con objetivos 10X y 40X, realizando un barrido en zig-zag para identificar quistes y huevecillos.

Bibliografía:

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