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Introducción a las columnas
de HPLC
1
En esta clase aprenderá lo
siguiente: Los diferentes usos de las columnas de
HPLC.
Los materiales de relleno de lascolumnas.
Cómo seleccionar el diámetro de partícula adecuado.
Cómo seleccionar el diámetro interno de columna adecuado.
Cómo seleccionar la longitud de columna correcta.
2
Columnas de HPLC
Columna
analítica
Fase móvil
desde la
bomba
PrecolumnaMuestreador
Al detector
Actúa sobre la muestra
para atrapar partículas y
componentes de muestras
retenidos con fuerza.
Las columnas varían en los siguientes aspectos:
• Longitud
• Diámetro interno
• Material de la fase estacionaria
• Tamaño de partícula de la fase estacionaria
La columna
analítica lleva
a cabo la
separación.
3
Columna - Acero inoxidable
estándar
Capilar
Frita de filtro de
acero inoxidable
Tamaño de poro
de 2 um
Relleno de
columna
4
Columna - Columnas de
cartucho
Soporte del cartucho de protección
Frita PEEK/Junta
Cartucho de protección
Columna de cartucho
Conexión del
extremo
5
Materiales de relleno de
columnas - Sílice
Soles de sílice Xerogeles
Esférico
IrregularLas partículas tienen un diámetro de
3 a 10 mm en las columnas estándar.
6
Materiales de relleno de
columnas - Fases enlazadas
SiR1
R2
Si CH3H3C
O
O
Si
O O
OH
Poros
Si-OH + Cl-Si-R Si-O-Si-R + HCl
R1
R2
Fase enlazada monomérica
Cadena de carbono
con forma de cepillo
7
Materiales de relleno de columnas - Fases
enlazadas extensamente utilizadas
CH3
|
-0-Si- R
|
CH3
HPLC de fase inversa
•C18
•C8
•C4
•C1
•Fenilo
Las columnas de HPLC más utilizadas
Separaciones de proteínas
Dipolo débil - dipolo inducido
Interacciones con analitos polares
HPLC de fase normal o inversa
• CN
• NH2
HPLC de fase normal
• Diol Separaciones de compuestos con
polaridades muy diferentes
Polaridad intermedia
Intercambio iónico
DEAE (dietilaminoetanol)
QAE (aminoetilo cuaternario)
Carboximetilo
Exclusión de tamaño
Glicerilpropilo
8
Materiales de relleno de columnas
Rendimiento mejorado de desoxinucleósidos
utilizando fase enlazada óptima
mAU
-4
0
4
8
12
DAD1 A, Sig=254,16 Ref=360,100 (H:\NUKE\NUKE0061.D)
min0 2 4 6 8
mAU
0
10
20
30
40
DAD1 A, Sig=254,16 Ref=360,100 (H:\NUKE\NUKE0056.D)
G
CA
TZorbax SB-C18
92% A : 8% B
6 min
2 min
Zorbax SB-CN97,5% A : 2,5% B
G
C A
T
LC: HP1090
Columnas: 4,6 x 50
mm, 3,5 µM
Flujo: 1,0 ml / min.
A: 0,1% TFA
B: 90% MeOH:
10% H2O (0,1%
TFA)
Temp.: 30 °C
Detec.: 254 nm
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Materiales de relleno de columnas -
Soportes de polímeros
Admiten:
Fase normal e inversa
Intercambiadores iónicos
Cromatografía por exclusión de tamaño
CH = CH 2
+
- CH2 - CH - CH-2 - CH - CHC2 - CH - CH22 - -
Estireno Divinil benceno
- CH2 - CH - CH-2 - CH - CHC2 - CH - CH22 - -
CH = CH 2
CH = CH 2
Estireno-divinilbenceno
10
Tamaño de partícula - Efecto en
la eficacia
Fase móvil, 20% ACN/80% acuosa, 0,1% TFA
Columnas Zorbax SB-C8; d.i. de columna, 4,6 mm; ciprofloxacina; 22 °C
3 -µm
5 -µm
10 -µm
Velocidad de flujo
N
Teórico
Velocidad de flujo de la fase móvil, ml/min
Núm
ero
de p
lato
s/m
etr
o/1
03
11
Tamaño de partícula - Efecto en la
eficacia y la resolución
0 1 3 5 7 92 4 6 8
Tiempo de retención, min.
300SB-C8 (4,6 x 50 mm)
5µm
300SB-C8 (4,6 x 50 mm)
3,5µm
1. Met Encefalina
2. Leu Encefalina
3. Angiotensina II
4. Neurotensina
5. RNasa
6. Insulina
7. Lisozima
8. Calmodulina
9. Mioglobina
10. Anihidrasa carbónica
12
3 4
5
67
8
910
12
Número aproximado de platos (N) y
volumen vacío (Vm) para columnas de 5
mm y 3,5 mmSi se reducen simultáneamente la longitud de la columna (N ) y el tamaño de partícula (N ), se podrá:
◦ Mantener la resolución
◦ Reducir el tiempo de análisis
◦ Reducir el uso de disolventes
Tamaño de lacolumna
Tamaño de partículaNúmero de platos
(N)Volumen vacío
(Vm)
4,6 x 250 mm 5-mm 20.000 2,5 ml
4,6 x 150 mm 5-mm 12.000 1,5 ml
4,6 x 150 mm 3.5-mm Resolución rápida 20.000 1,5 ml
4,6 x 75 mm 3.5-mm Resolución rápida 10.000 0,75 ml
4,6 x 50 mm 3.5-mm Resolución rápida 6.000 0,5 ml
4,6 x 30 mm 3.5-mm Resolución rápida 3.600 0,3 ml
4,6 x 15 mm 3.5-mm Resolución rápida 2.000 0,15 ml
13
Aumentar la velocidad de análisis
mientras se mantiene la resolución
Dimensiones 250 x 4,6 mm 150 x 4,6mm 150 x 4,6 mm 75 x 4,6 mm
Tiempo deanálisis (min)
30 min 18 min 18 min 9 min
Residuo dedisolvente(ml)
30 ml 18 ml 18 ml 9 ml
N 20.000 20.000 12.000 10.000
5 mm 3,5 mm 5 mm 3,5 mm
40%
Reducción
40%
Reducción
Sin modificar 9% de diferencia
50%
Reducción
50%
Reducción
14
Conseguir todo el potencial con
mayor velocidad de flujomAU
0100200300
mAU
0100200300
min0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0.6 0.7 0.8 0,9
mAU
0100200300
0
Velocidad
de flujo
3 ml/min
2 ml/min
4 ml/min
Zorbax SB-C18, 3,5 µm, 4,6 x 30 mm
90 bar
133 bar
181 bar
Presión
30 seg
Rs2,1 = 2,1
Rs2,1 = 2,2
Rs7,6 = 2,2
Rs7,6 = 2,2
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Columnas con diámetro interno pequeño y muy
pequeño
Ventajas:
Consumo reducido de disolvente.
Idóneas para análisis de trazas si la cantidad de muestra es limitado.
Fácil conversión de velocidad de flujo para cambiar el método de columna analítica a columna de diámetro muy pequeño.
Inconvenientes:
La instrumentación debe tener un volumen externo a la columna muy bajo.
Las fritas se deben cambiar con más frecuencia.
Convencional
Diámetro interno
muy pequeño
4,6 mm
4,6 mm
2,1 mm
d = 10 dmmp
0 2 4 6 8 10
1,00 ml/min
0 4 6 8 10
0,01 ml/min
2
o
1,0 mm 100 mm200 mm
d = 5 dmmp
d = 5 dmmp
16
Velocidades de flujo típicasd.i. de columna
(partículas de 5 mm )
Flujo
ml/min
4,6 1 –2
3,0 0,4 - 0,8
2,1 0,2 – 0,4
1,0 0,05 – 0,09
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Separación de alta resolución utilizando
una columna de diámetro interno estrecho
Columna ZORBAX 300SB-C8, 2,1 x 150 mm, 50 pmol BSA
Tryptic Digest en 4M de urea, 50 ºC, 0,2 ml/min., UV-214 nm, A:
0,1% TFA en agua, B: 0,1% TFA en acetonitrilo/20% agua,
Gradiente: 2-62% B en 70 min.
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Longitud de columna - Adaptar la
longitud a la resolución deseada DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0035.D)
DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0032.D)
DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0037.D)
DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0027.D)
DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0038.D)
min0 1 2 3 4 5 6 7 8
Ad
sorb
ance
4,6 x 15 mm
4,6 x 30 mm
4,6 x 50 mm
4,6 x 75 mm
4,6 x 150 mm
Ab
so
rba
nc
ia
SB-C18
Condiciones: LC: Hewlett-Packard HP1100
Columnas: Zorbax SB-C18, 3,5 µm
Fase móvil: 1 mM octano ácido sulfónico, Na sal, pH 2,5: ACN (80:20)
UV: 275 nm; flujo: 2,0 ml / min.; 70 °C
Vol. de inyección: 1 µl
Muestra:
1. Acetoaminofeno (4-acetoamidofenol)
2. Cafeína
3. 2-Ac2-Acetoamidofenol
4. Acetanilida
5. Aspirina (ácido acetilsalicílico)
6. Ácido salicílico
7. Fenacetina (acetofenetidina)
1 23 4
5 6 7
los 7 componentes se descomponen en menos de 1 min
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