INTI-Lácteos PTM-Agosto 20041 LIPÓLISIS Licenciada Mónica Campanaro INTI Lácteos Rafaela Agosto...

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004 1

LIPÓLISISLIPÓLISIS

Licenciada Mónica Campanaro INTI Lácteos Rafaela

Agosto 2004


Hidrólisis enzimática de la materia grasa

que produce acumulación de ácidos grasos libres ( FFA ) y provoca la aparición de rancidez en la leche y en los productos

lácteos.

Sustrato Glóbulo de Grasa

Enzima Lipasas


¿QUÉ SON LAS LIPASAS?¿QUÉ SON LAS LIPASAS?

F

L

A

V

O

R

L

I

P

O

L

I

T

I

C

O


CLASIFICACIÓNCLASIFICACIÓN

1) Naturales: propias de la leche

2) Leucocitarias: secretadas por las células somáticas

3) Microbianas: secretadas por la flora psicrótrofa


LIPASAS NATURALES:LIPASAS NATURALES:

Secretadas por las glándulas mamarias

Son termolábiles

pH óptimo entre 8 y 9

Se inhiben en condiciones a altas concentraciones de: sales, AGL y proteínas

Atacan preferentemente las posiciones extremas del glicerol → AGLs producidos son ricos en AGs de cadena corta


LIPASAS MICROBIANASLIPASAS MICROBIANAS Provienen esencialmente de bacterias psicrótrofas (principalmente P. Fluorescens)

Su producción se ve favorecida por la presencia de caseínas y proteínas del lactosuero

pH óptimo entre 8 y 9, 50% de activiadad al pH de la leche

Temperaturas óptimas de acción entre 30 y 40ºC

Atacan preferentemente los triglicéridos homogéneos, con AG de cadena corta o insaturadas


SUSTRATOSUSTRATO

Glóbulo de Grasa

↓

Triglicéridos protegidos por una

“membrana”


TIPOS DE LIPÓLISISTIPOS DE LIPÓLISIS

1) 1) LIPÓLISIS INDUCIDALIPÓLISIS INDUCIDA

Cuando la leche cruda se somete a tratamientos físicos o químicos que rompen la membrana del glóbulo de grasa y facilitan el acceso de la lipasa a los triglicéridos.

Este tipo de tratamientos se denominan de “Tratamientos de activación” y se producen durante y después del ordeñe.


a) a) Tratamientos de Activación:Tratamientos de Activación:

Agitación y formación de espuma

Cambios de temperatura

Homogenización

Procesos de congelación y derretimiento


b) b) ¿Cómo afecta la temperatura ¿Cómo afecta la temperatura a estos tratamientos?a estos tratamientos?

Durante la activación: a menor temperatura más resistencia a la activación mantener la leche refrigerada

Durante el almacenamiento: una vez activada mantener la leche a bajas temperaturas.


c) c) Problemas en el tamboProblemas en el tambo

Ordeñadoras:diseños inadecuados y poco mantenimiento

Entrada de aire en pezoneras

Juntas que pierden

Agujeros y rajaduras en tubos de goma

Bajos caudales de leche

Favorecen entrada de aire → lipólisis


Cañerías : mayor activación a mayor longitud y número de juntas

Tanque de enfriamiento : formación de espuma, caída de la leche al tanque baja activación⇒

Bombeo: Utilización de bombas centrífugas debajo de su capacidad y admisión de aire a través de juntas defectuosa alta activación⇒



Almacenamiento• la cantidad de lipólisis aumenta con el tiempo y la

temperatura de almacenamiento• La velocidad a la cual ocurre la lipólisis va

disminuyendo pero no se frena completamente hasta la inactivación de la lipasa ( pasteurización ).

• A mayor tiempo de almacenamiento mayor es la posibilidad del crecimiento bacteriano que también contribuye significativamente a la lipólisis



- - no es determinante y está asociada al pasaje de la leche por las bomba

- debe ser refrigerado

d) d) Problemas en el transporteProblemas en el transporte


e) e) Problemas en fábricaProblemas en fábrica

Excesivo bombeo → alta agitación y mezcla con aire

Desnatado → activación por cambios de T↳ daño mecánico

Mezcla de leche cruda con leche homogenizada Refrigeración deficiente Largos tiempos de almacenaje



2) LIPÓLISIS ESPONTÁNEA2) LIPÓLISIS ESPONTÁNEA

• cuando la leche presenta lipólisis en forma natural sin ningún tipo de activación

• Se las denomina “leches naturalmente activas”, “leches susceptibles” o “leches espontáneas”

• Leches “normales” son las que no presentan lipólisis espontánea

• Porcentaje de vacas en un tambo que producen leche espontánea se estima entre 3 y 35%


a) a) Características de leche espontánea:Características de leche espontánea:

Efecto de enfriamiento

Enfriamiento a T < 15 ºC inmediatamente después del ordeñe mayor grado de lipólisis

Mezcla con leches normales

La leche espontánea disminuye su actividad lipolítica

Susceptibilidad a la lipólisis inducida

Es más susceptible a los distintos tipos de activación, probablemente debido a membranas más débiles

Factores bioquímicos

Membranas más débiles

Cantidad de lipasa

Escasa presencia de inhibidores

( presentes en leches normales )

Presencia de activadores de lipasa


b) b) Factores relacionados a la vacaFactores relacionados a la vaca

Estado de lactancia

Alimentación y estado nutritivo

Estación del año

MástitisRaza

Producción de leche y de grasa



3) 3) LIPÓLISIS MICROBIANALIPÓLISIS MICROBIANA

Producida principalmente por bacterias psicrótrofas, cuya característica es crecer a bajas temperaturas ( ej. Pseudomonas )

Las lipasas microbianas pueden atacar al glóbulo de grasa intacto

Muchas de ellas son termorresitentes, no se inactivan por procesos de pasteurización y pasan a los productos lácteos donde producen rancidez


LIPÓLISIS LIPÓLISIS

EN EN

PRODUTOS LÁCTEOSPRODUTOS LÁCTEOS


¿ Por qué nos interesa estudiar la Por qué nos interesa estudiar la lipólisis ?lipólisis ?

La lipólisis produce ácidos grasos libres , que junto a otros compuestos, son los responsables del aroma y sabor de la leche y productos lácteos

Según la naturaleza y la cantidad de estos AGLs se producen defectos del flavor.


Contribución de los sitemas enzimáticos a Contribución de los sitemas enzimáticos a la lipólisis de los productos lácteosla lipólisis de los productos lácteos

AGL en productos lácteos

Lipólisis pre-manufactura:AGL provinientes de la leche Inducida – Espontánea

Lipólisis post-manufactura:AGL desarrollados en los productos.-Crecimiento microbiano.-Pobre Higiene.-Actividad de enzimas termorresitentes


Defectos del flavor:Defectos del flavor:

C4 – C12

responsables del flavor lipolítico

C4 al C8

Sabor rancio

C10 y C12

Sabor jabonoso


Ácidos débiles que se distribuyen en la leche y en los productos lácteos según su solubilidad y la cantidad de agua del producto.

En los procesos tecnológicos:

los AGL de cadena corta siguen la fase acuosa

Los de cadena larga se van con la grasa

Ácidos Grasos Libres:Ácidos Grasos Libres:


Producto Valor (BDI) FFA probables causas de problemas

FFA en rango normal

Leche, leche en polvo 1.5 – 2.0 0.3 – 1.0

Crema 1.7 – 2.1 0.5 – 1.2

Manteca 2.0 0.5 – 1.0


Leche comercialLeche comercial- la lipólisis no parece ser un tema importante

- Aparece sabor rancio en valores de BDI > 1.5

- A bajos niveles la rancidez hidrolítica en estos productos se aprecia organolépticamente como sabor a viejo, sucio o sabor a vaca.

- A altos valores los defectos se perciben como sabor a cabra, amargo, butírico y rancio

- Otros off flavors ( como oxidado ) pueden enmascarar bajos niveles de rancidez.


Crema y MantecaCrema y Manteca- la crema presenta valores de BDI mayores a

los de la leche.- si la leche utilizada en la producción es

rancia, los AGL responsables de la rancidez se van parcialmente con el agua.

- generalmente la lipólisis desarrollada es post-manufactura

- La sal inhibe la acción de las lipasas- Los defectos se perciben como sabor a

sucio, amargo, rancioy aceitoso- Otros off flavors ( como oxidado ) pueden

enmascarar bajos niveles de rancidez.


QuesosQuesos- Los AGL contribuyen en gran parte al

flavor característico de muchos tipos de quesos.

- El grado de “aceptación” de esa lipólisis depende del tipo de quesos

-Generalmente presentan lipólisis de post-manufactura debido al agregado de enzimas lipolíticas o a la adición y crecimiento de microorganismos productores de enzimas lipolíticas


Sin agregado de agentes generadores de lipasas: características organolépticas poco pronunciadas, por ej. quesos blandos y semiduros

Con agregado de lipasas fúngicas: aroma y sabor pronunciados, por ej. Roquefort, Stilton, Camembert

Con agregado de lipasas gástricas o naturales: características organolépticas bien marcadas, por ej. Quesos duros italianos como Parmesano, Romano, Provolone

C

L

A

S

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F

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A

C

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N


Cuándo consideramos rancidez en un Cuándo consideramos rancidez en un queso?queso?

- Dependerá del tipo de queso y se apreciará organolépticamente, estableciéndose una relacíón entre BDI y umbrales de percepción de rancidez.

- Excesivos valores de AGLs dan sabores rancio, sucio o butírico.

- La rancidez será responsabilidad de las lipasas bacterianas ya que las naturales de la leche se inactivan en las condiciones de pH y contenido de sal del queso.


Dificultad en el batido de la cremaPérdida de grasa en el suero de mantecaInhibir las bacterias de starters por FFA (leches fermentadas o cultivadas)Retardar y debilitar acciones del cuajoDisminuye el rendimiento queseroBaja la capacidad del espumado de la leche

CONSECUENCIAS TECNOLÓGICASCONSECUENCIAS TECNOLÓGICAS


MÉTODOS DE MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DETERMINACIÓN

DE AGLsDE AGLs


Generalidades:Generalidades:

No existe un método de Referencia

Los métodos se pueden clasificar en:

Determinan la “acidez global” Métodos ⇒de rutina

Determinan individualmente cada AGL ⇒

métodos cromatográficos.


Expresión de los resultados:mmol/100g de grasa ó mmol/l

⇓Depende del método utilizado

Métodos de aislación de los AGLs:

Desestabilizan la emulsión y separan la

grasa: BDI

Extracción con solventes

orgánicos:métodos cromatográficos, Deeth

Generalidades:Generalidades:


Aspectos a tener en cuenta en el Aspectos a tener en cuenta en el análisis de AGLs:análisis de AGLs:

1)Prevención e inhibición de la lipólisis: Inhibición química → no es la más adecuada, existen ejemplos de uso de Dicromato y H2O2. Inactivación térmica → se inactiva térmicamente la lipasa. Ejemplos: termisar las muestras hasta 72ºC en un baño y dejarlas 15s una vez alcanzada la T. Inhibición físico-química → se mezcla la muestra con la mezcla extractiva. Por ej.:en métodos con extracción con solventes, la grasa y los AGLs se extraen con una mezcla nopolar ácida ( la lipasa se inactiva a bajos pH ).


2) Aislación de los AGLs:

Método de Frankel y Método de Frankel y TarassukTarassuk

Método BDIMétodo BDI

Aislación de la grasa como tal

Método del batidoMétodo del batido

Método de DoleMétodo de Dole

Método de DeethMétodo de Deeth

Uso de ácido SalicílicoUso de ácido Salicílico

Extracción usando solventes orgánicos


3) Determinación de los AGLs:

Determinación Determinación de la acidez de la acidez

globalglobal

Determinación Determinación de los AGL de los AGL individualesindividuales

Titulación

Cambio de color en un indicador

Formación de complejos coloreados

Métodos Cromatográficos:

GLC, HPLC

Análisis de los éstres metílicos

Análisis directo

de los AGL


Método de DeethMétodo de Deeth

Se aplica a leche fluída y leche en polvo

Procedimiento:

3 ml de leche + 10 ml mezcla ( Isopropílico:Epetrólero:H2SO4 4N) + 6 ml EP + 4 ml de H20

Se agita 15 seg y se deja en reposo 4 minutos

se toman 5 ml de la capa superior

Se agrega fenolftaleína

Se titula con KOH metanólico 0.02 N


Cálculos:

ųequivalentes/ml de leche = V tit * N * 1000 P*Val

donde Vtit = Volumen del titulante

N = Normalidad del titulante

P= Volumen alícuota/ Volumen capa supeior

Val = Volumen de leche utilizada


Método del BDIMétodo del BDI

Acidez Titulable de la Grasa: es la

cantidad de álcali requerida para neutralizar

los ácidos grasos libres contenidos en una

masa de grasa presente en la muestra.

Se expresa en:

mmoles de álcali/100 gr. de grasa.


Principio: Una cantidad de muestra (leche, crema, dulce de leche, queso) es mezclada cuidadosamente con una solución conteniendo Tetrafosfato de sodio y un agente tensioactivo, y calentando en un baño de agua hirviendo para separar la grasa.

Una cantidad medida de grasa es disuelta en un solvente orgánico y titulada con álcali alcohólico.

Precisión del método: 0.2-2 mmoles /100 gr. de grasa. Repetibilidad: 0.05 mmoles/100 gr. de grasa.



- En un butirómetro para crema o queso cerrar uno de los extremos y llenar con 16 0.5 ml de leche + 4.5 0.1 ml de reactivo de BDI.

- Cerrar y homogeneizar en ángulos de 180 º por 10 veces.- Ajustar la escala con el tapón inferior.

- Colocar en Baño María a 95 ºC durante 15 minutos hasta separación de la grasa. - El agua debe estar por arriba del nivel de la muestra.

- Pasar a un Baño de 45 ºC hasta que la grasa alcance 45 ºC.

Separación de la grasa



- 0.25 gr. de grasa + 5 ml de Fat solventTitular con sn. valorada de TBHA 0.01 M hasta viraje de amarillo a

verdoso en ausencia de CO2.

BDI = 100 x V x C = mmoles/100 gr. de grasa

masa muestra

Titulación



Método Cromatográfico de DeethMétodo Cromatográfico de Deeth Se aplica a leche y productos lácteos

Se determinan los AGL sin previa esterificación

Se extraen los AGL con mezcla ácida de Eter étílico y Hexano

Se agrega estándar interno ( C5 )

La separación de los AGL se realiza pasando el extracto etéreo en columna de alúmina desactivada, los AGL quedan adsorbidos a la alúmina.

Los AGL se desorben de la columna mediante el agregado de una mezcla de éter isopropílico con 6% de ácido fórmico.

Se inyecta al GLC.


MétodosMétodos parapara determinacióndeterminación de AGLsde AGLs

Obtención de AGL + grasa

Referencia Aislamiento de los AGL

Determinación de los AGL

Por batido

. Método del batido Titulación

Uso de solución de detergente ( BDI )

. Thomas et. Al (1955 )

. Driessen et al. ( 1977 ) Titulación

Extracción por solventes: . etanol + e.etílico . ácido silícico medio ácido medio alcalino . Solvente de Dole . Éter Etílico acidificado . CHM mezcla 49/49/2 Cloroformo/Heptano/ Metanol

. Frankel y Tarassuk( 1955) . Harper et. Al (1956) . Woo & Lindsay (1980) . Heeschenn et al. (1975) . Deeth et al. ( 1975) . Deeth et al. ( 1983 ) . Needs et al ( 1983) . Koops & Koops ( 1977 ) . URCIL (1982)

.Elución con 5% butanol en CHCl3 . Elusión con EE y ácido fórmico . Autoanalizador . Autoanalizador . Adsorción en alúmina . Adsorción en resina . Como sales de Cobre . . Como sales de Cobre

.Titulación . GLC . Titulación . Titulación . GLC .GLC . Colorimétrico . Colorimétrico

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