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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS
EVALUACIÓN DE BACTERIAS RIZOSFÉRICAS DE Jatropha curcas L.
CONTRA Fusarium verticillioides Y Leptoglossus zonatus
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRÍA EN CIENCIAS
EN
MANEJO AGROECOLÓGICO DE PLAGAS Y ENFERMEDADES
PRESENTA
HÉCTOR HERNÁNDEZ GUERRA
YAUTEPEC, MORELOS, JULIO DE 2014
El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Fitopatología y Laboratorio de Ecología
Química de Insectos del Departamento de Interacciones Planta-Insecto del Centro de
Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección de la
Dra. Ana Niurka Hernández Lauzardo y del Dr. Víctor Rogelio Castrejón Gómez. Para la
realización de los estudios se contó con becas proporcionadas por el CONACyT (No.
480185) y del Programa Institucional de Formación de Investigadores de la Secretaria de
Investigación y Posgrado (SIP) del IPN. La investigación fue realizada con el
financiamiento otorgado a los proyectos de la SIP (No. 20121269, 20130490).
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Ana Niurka Hernández Lauzardo, Víctor Rogelio Castrejón Gómez por
permitirme ser parte de este proyecto de tesis, por sus enseñanzas, paciencia y apoyo en
todo momento.
Al Dr. Miguel Gerardo Velázquez del Valle por apoyarme y estar en disposición de
ayudarme, por sus enseñanzas y aportes al desarrollo de la tesis.
Al Dr. Rodolfo Figueroa Brito, Dr. Federico Castrejón y al Dr. Francisco Rodríguez
González por formar parte de mi comité tutorial, enseñanzas y aportes para el desarrollo
del trabajo de tesis.
A los Profesores de MAPE Dr. René Arzuffi, Dr. Roberto Montes, y la M. en C. Hilda
Elizabeth Moctezuma por sus enseñanzas impartidas dentro y fuera de las aulas.
A los administrativos del CeProBi, Lic. Elvia, Gabriel, Vanesa y todos aquellos que
siempre estuvieron con la disposición de ayudarme y que esto se prolongó durante toda
la Maestría.
DEDICATORIAS
A Dios por permitirme dar un paso más en mi formación académica y continuar este largo
camino de la vida.
A mi madre por darme todo su apoyo, cariño, amor y guiarme en este camino de la vida
con su paciencia y consejos.
A mi padre querido en paz descanse por enseñarme a trabajar de manera honrada y
esforzarme por todo aquello que vale en la vida.
A mis hermanos Jesús, Hugo y José Nicolás por su apoyo incondicional y a mi sobrina
Mariela.
A mis compañeros y amigos de la Maestría: Angel, Gustavo, José Miguel, Teresa, Valeria,
Erubiel, Humberto, Gilberto, Miguel y a los otros compañeros que hicieron también amena
esta estancia: Mari, Liliana, Cinthia, Monserrat, Itzel, Mitsu y demás personas especiales
que conocí dentro de la Maestría.
CONTENIDO
ÍNDICE DE CUADROS
I
ÍNDICE DE FIGURAS II
RESUMEN V
ABSTRACT VI
1. INTRODUCCIÓN 1
2. REVISIÓN DE LITERATURA 3
2.1 Clasificación taxonómica, características morfológicas y centro de
origen de Jatropha curcas L.
3
2.2 Localización, importancia y principales usos de Jatropha curcas 4
2.3 Problemas de sanidad del cultivo de Jatropha curcas 6
2.4 Principales enfermedades fúngicas en el cultivo de Jatropha curcas 7
2.5 Fusarium verticillioides 9
2.5.1 Características morfológicas 10
2.5.2 Distribución y biología 10
2.5.3 Daños 11
2.6 Plagas 12
2.6.1 Taxonomía y distribución de Leptoglossus zonatus Dallas 13
2.6.2 Importancia económica y ecológica 15
2.6.3 Ciclo biológico 15
2.6.4 Daños 16
2.7 Manejo de plagas y enfermedades en el cultivo de Jatropha curcas 16
2.7.1 Potencial de las bacterias rizosfericas como agentes de control
biológico
17
2.7.1.1 Bacillus subtilis 19
2.7.1.2 Bacillus mojavensis 19
2.7.1.3 Bacillus thuringiensis 20
2.7.1.4 Lysinibacillus sphaericus 21
2.8 Actividad antagonista de las bacterias rizosféricas 21
2.9 Actividad entomopatógena de las bacterias rizosféricas 24
3. OBJETIVOS 29
3.1 Objetivo general 29
3.2 Objetivos específicos 29
4. MATERIALES Y MÉTODOS 30
4.1 Material biológico 30
4.1.1 Cepas bacterianas 30
4.1.2 Cepa fúngica 30
4.1.3 Establecimiento de la cría de Leptoglossus zonatus 30
4.2 Establecimiento de las cinéticas de crecimiento de Bacillus
subtilis, Bacillus mojavensis, B. thuringiensis y Lysnibacillus
sphaericus.
32
4.2.1 Cinética en medio caldo nutritivo 33
4.2.2 Cinética en medio caldo nutritivo más extracto de levadura
suplementado con sales para Bacillus thuringiensis y
Lysinibacillus sphaericus
33
4.3 Observación de cristales de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus
sphaericus
33
4.4 Bioensayos de antagonismo in vitro 34
4.4.1 Cultivo dual de bacterias rizosféricas y Fusarium verticillioides.
Cultivo bacteriano en agar nutritivo
34
4.4.2 Cultivo dual de bacterias rizosféricas y Fusarium verticillioides.
Bacterias crecidas en caldo nutritivo
35
4.5 Evaluación del efecto de bacterias rizosféricas sobre la
morfología hifal de Fusarium verticillioides mediante microscopia
óptica
35
4.6 Evaluación del efecto de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus
sphaericus sobre la mortalidad de la ninfa 4 de Leptoglossus
zonatus
36
4.7 Evaluación del efecto biológico de Bacillus thuringiensis y
Lysinibacillus sphaericus sobre el peso de la ninfa 4 a ninfa 5 de
Leptoglossus zonatus
37
5. RESULTADOS 38
5.1 Cinéticas de crecimiento de Bacillus subtilis, Bacillus mojavensis,
Bacillus thuringiensis y Lysnibacillus sphaericus en medio caldo
nutritivo
38
5.2 Cinéticas de crecimiento y observación de cristales de Bacillus
thuringiensis y Lysnibacillus sphaericus en medio caldo nutritivo
más extracto de levadura suplementado con sales
40
5.3 Evaluación del efecto de bacterias rizosféricas en el crecimiento
micelial de Fusarium verticillioides en cultivo dual (bacteria
crecida en agar nutritivo)
42
5.4 Evaluación del efecto de bacterias rizosféricas en el crecimiento
micelial de Fusarium verticillioides en cultivo dual (bacteria
crecida caldo nutritivo)
45
5.5 Efecto de bacterias rizosféricas sobre la morfología hifal de
Fusarium verticillioides
49
5.6 Evaluación de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus
sobre la mortalidad de Leptoglossus zonatus
55
5.7 Evaluación del efecto biológico de Bacillus thuringiensis y
Lysinibacillus sphaericus en el peso de la ninfa 4 a ninfa 5 de
Leptoglossus zonatus
55
6. DISCUSIÓN 56
7. CONCLUSIONES 61
8. LITERATURA CITADA 62
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Clasificación taxonómica de Jatropha curcas L. 3
Cuadro 2. Reportes de hongos fitopatógenos que afectan a Jatropha curcas L. 8
Cuadro 3. Clasificación taxonómica de Fusarium verticillioides (Sacc.) Nirenberg 9
Cuadro 4. Insectos plaga en el cultivo de Jatropha curcas L. 13
Cuadro 5. Clasificación taxonómica de Leptoglossus zonatus Dallas 14
Cuadro 6. Bacillus spp. utilizados en el biocontrol de fitopatógenos 24
Cuadro 7. Bacillus spp. utilizados en el biocontrol de plagas insectiles 25
Cuadro 8. Efecto antifúngico in vitro de bacterias rizosféricas crecidas en agar
nutritivo sobre el crecimiento micelial de Fusarium verticillioides
42
Cuadro 9. Efecto antifúngico in vitro de bacterias rizosféricas crecida en caldo
nutritivo (12 horas) sobre el crecimiento micelial de Fusarium
verticillioides
46
Cuadro10. Efecto antifúngico in vitro de bacterias rizosféricas crecidas en caldo
nutritivo (24 horas) sobre el crecimiento micelial de Fusarium
verticillioides
46
Cuadro 11. Efecto de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus sobre la
mortalidad y peso (ninfa 4 a ninfa 5) de Leptoglossus zonatus
55
I
II
ÍNDICE DE FIGURAS
Fig. 1. Ninfas de Leptoglossus zonatus alimentándose de los granos de sorgo
en condiciones de campo.
31
Fig. 2. Cría de Leptoglossus zonatus en condiciones de laboratorio a una
temperatura de 28 ± 2 °C.
32
Fig. 3. Ninfa en vaso de plástico en laboratorio de Ecología Química de
Insectos del CEPROBI-IPN.
37
Fig. 4. Cinética de crecimiento Bacillus thuringiensis (a) y Lysinibacillus
sphaericus (b) en caldo nutritivo. Cultivo bacteriano a una temperatura
de 28 ± 2 °C en agitación a 150 rpm
38
Fig. 5. Cinética de crecimiento Bacillus thuringiensis (a) y Lysinibacillus
sphaericus (b) en caldo nutritivo. Cultivo bacteriano a una temperatura
de 28 ± 2 °C en agitación a 150 rpm.
39
Fig. 6. Cinética de Bacillus thuringiensis (a) y Lysinibacillus sphaericus (b) en
medio caldo nutritivo más extracto de levadura y suplementado con
sales. Cultivo bacteriano a una temperatura de 28 ± 2 °C en agitación a
150 rpm.
40
Fig. 7. Observación de cristales de Bacillus thuringiensis mediante tinción con
cristal violeta. (a) 12 h, (b) 16 h, (c) 20 h y Lysinibacillus sphaericus (d)
12 h, (e) 16 h, (f) 20 h. (100X).
41
Fig. 8. Cultivo dual de Bacillus subtilis y Fusarium verticillioides (a) Testigo, (b)
Tratamiento. Incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C.
43
Fig. 9. Cultivo dual de Bacillus mojavensis y Fusarium verticillioides (a)
Testigo, (b) Tratamiento. Incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C
durante siete días.
44
Fig. 10. Cultivo dual de Bacillus thuringiensis y Fusarium verticillioides (a)
Testigo, (b) tratamiento. Incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C
durante siete días.
44
Fig. 11. Cultivo dual de Lysinibacillus sphaericus y Fusarium verticillioides (a)
Testigo, (b) Tratamiento. Incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C
durante siete días.
45
Fig. 12. Bacillus subtilis (a) Testigo, (b) Tratamiento en fase exponencial (12 h), 47
III
(c) Tratamiento en fase estacionaria (24 h). Incubadas a una
temperatura de 28 ± 2 °C durante siete días.
Fig. 13. Bacillus mojavensis (a) Testigo, (b) Tratamiento en fase exponencial
(12 h), (c) Tratamiento en fase estacionaria (24 h). Incubadas a una
temperatura de 28 ± 2 °C durante siete días.
48
Fig. 14. Bacillus thuringiensis (a) Testigo, (b) Tratamiento en fase exponencial
(12 h), (c) Tratamiento en fase estacionaria (24 h). Incubadas a una
temperatura de 28 ± 2 °C durante siete días
48
Fig. 15. Lysinibacillus sphaericus. (a) Testigo, (b) Tratamiento en fase
exponencial (12 h), (c) Tratamiento en fase estacionaria (24 h).
Incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C durante siete días.
49
Fig. 16. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los siete días (40X). (a)
Testigo, (b) Tratamiento Bacillus subtilis en cultivo dual incubado a una
temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición
50
Fig. 17. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (40X). (a)
Testigo, (b) Tratamiento Bacillus subtilis en cultivo dual a una
temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición
50
Fig. 18. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los siete días (40X). (a)
Testigo, (b) Tratamiento Bacillus mojavensis en cultivo dual a una
temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
51
Fig. 19. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (40X). (a)
Testigo a las 14 días (b) Tratamiento Bacillus mojavensis en cultivo
dual a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
51
Fig. 20. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los siete días (40X). (a)
Testigo, (b) Tratamiento Bacillus thuringiensis en cultivo dual a una
temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición
52
Fig. 21. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (40X). (a)
Testigo, (b) Tratamiento Bacillus thuringiensis en cultivo dual a una
temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
52
Fig. 22. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los siete días (40X). (a)
Testigo (b) Tratamiento Lysinibacillus sphaericus en cultivo dual a una
temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
53
IV
Fig. 23. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (40X). (a)
Testigo, (b) Tratamiento Lysinibacillus sphaericus en cultivo dual a una
temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
53
Fig. 24. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (20X). (a)
Testigo, (b) Bacillus subtilis, (c) Bacillus mojavensis, (d) Bacillus
thuringiensis, (e) Lysinibacillus sphaericus. Incubación a una
temperatura de 28 ± 2 °C.
54
V
RESUMEN
El centro de origen y domesticación de Jatropha curcas L. es México. Este arbusto se
distribuye en varios ecosistemas tropicales y tiene gran potencial para la producción
de biodiesel. Sin embargo, este cultivo puede ser afectado por la presencia de
diversos hongos fitopatógenos que causan diferentes enfermedades y disminuyen la
calidad de sus semillas. Además, algunas plagas insectiles causan daños en J.
curcas. El objetivo de este estudio fue evaluar la actividad antagonista y
entomopatógena de bacterias rizosféricas contra Fusarium verticillioides y
Leptoglossus zonatus. La actividad antagonista de Bacillus subtilis, Bacillus
mojavensis, Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus fue evaluada contra
Fusarium verticillioides por la técnica de cultivo dual en medio papa dextrosa agar. Las
variables estudiadas fueron el crecimiento micelial y la morfología hifal. Se realizaron
diferentes cinéticas de crecimiento con las cepas bacterianas y la observación de
cristales proteicos de B. thuringiensis y L. sphaericus. Se estableció la cría de L.
zonatus en condiciones de laboratorio. Se evaluó el efecto de B. thuringiensis y L.
sphaericus en la mortalidad y desarrollo de L. zonatus. Los resultados obtenidos
demostraron que todas las cepas de bacterias rizosféricas inhibieron el crecimiento
micelial y afectaron la morfología hifal de F. verticillioides. Las cepas de bacterias
rizosféricas mostraron actividad antagonista contra F. verticillioides con independencia
del medio de cultivo utilizado y de las fases de crecimiento probadas. En estas
condiciones de estudio, B. thuringiensis y L. sphaericus no afectaron la mortalidad ni
el desarrollo de L. zonatus. En general, las cepas de bacterias rizosféricas
evidenciaron actividad antagonista contra F. verticillioides y no mostraron actividad
entomopatógena contra L. zonatus.
V
VI
ABSTRACT
The center of origin and domestication of Jatropha curcas L. is Mexico. This shrub is
distributed in several tropical ecosystems and has great potential for biodiesel production.
Nonetheless, this crop can be affected by the presence of several phytopathogenic fungi
that cause different diseases and diminished the quality of their seeds. Additionally, some
insect pests cause damage in J. curcas. The aim of this study was to evaluate the
antagonistic and enthomopathogenic activity of rhizospheric bacteria against Fusarium
verticillioides and Leptoglossus zonatus. The antagonistic activity of Bacillus subtilis,
Bacillus mojavensis, Bacillus thuringiensis and Lysinibacillus sphaericus was evaluated
against Fusarium verticillioides by dual culture technique in potato dextrose agar medium.
The variables studied were the mycelial growth and hyphal morphology. Different bacterial
growth kinetics was done and observation of protein crystals of B. thuringiensis and L.
sphaericus. The breeding of L. zonatus was established in laboratory conditions. The
effect of B. thuringiensis and L. sphaericus on the mortality and development of L. zonatus
was evaluated. The obtained results demonstrated that all strains of rhizospheric bacteria
inhibited the mycelial growth and affected the hyphal morphology of F. verticillioides. The
strains of rhizospheric bacteria showed antagonistic activity against F. verticillioides
regardless of the cultured medium used and tested growth phases. In this study conditions
B. thuringiensis and L. sphaericus no affect the mortality neither development of L.
zonatus. In general, the strains of rhizospheric bacteria evidenced antagonistic activity
against F. verticillioides and no showed enthomopathogenic activity against L. zonatus.
1
1. INTRODUCCIÓN
Jatropha curcas L. es una planta originaria de México, que se caracteriza por producir
semillas con alto contenido de aceite y es una alternativa a nivel mundial para la
producción de biocombustible (Martínez-Herrera 2006). Posee gran adaptabilidad a
diversas condiciones climáticas y en particular a zonas con suelos pobres en nutrientes y
baja precipitación pluvial, es de ciclo corto y elevada producción de aceite de alta calidad
industrial (Fairless 2007). Además, de sus diversos usos como recuperador y reparador
de suelos, uso medicinal y alimenticio.
Las plantaciones comerciales alrededor del mundo se ubican en zonas tropicales o
subtropicales de Asia, África y América. En México, se ha establecido este cultivo en los
estados de Michoacán, Chiapas, Puebla, Yucatán, Veracruz, Guerrero, Oaxaca y Morelos
con el objetivo principal de obtener “biodiesel” (Martínez-Herrera 2007).
Las semillas de J. curcas son propensas al ataque de fitopatógenos que afectan el
contenido de aceite, que en condiciones normales va del 20 al 40 % (Augustus et al.
2002). La asociación de hongos con la semilla en la etapa de cosecha y bajo
almacenamiento ocasiona daños y degradación de los constituyentes de la semilla,
haciéndola no apta para la extracción de aceite, consumo o siembra. Hoy en día los
problemas relacionados con hongos han sido los más estudiados en este cultivo, algunos
de ellos son los siguientes: Colletotrichum sp., Fusarium moniliforme, Aspergillus sp.,
Rhizopus sp., Penicillium sp., Curvularia lunata, Fusarium equiseti y Fusarium
verticillioides.
Dentro de estos hongos destaca F. verticillioides que se ha encontrado causando pérdida
en la calidad de las semillas, disminuyendo su contenido de aceite, proteínas y lípidos.
Por otra parte, algunas de las plagas que afectan a frutos y semillas de Jatropha curcas
2
son Leptoglossus zonatus Dallas y Pachycoris klugii Burmeister, es importante señalar
que ambas chinches han sido encontradas en el estado de Morelos en cultivos de J.
curcas (Tepole-García et al. 2012). Sin embargo, L. zonatus es la que en sus estados de
ninfa y adulto causa más problemas en frutos y semillas, su daño mecánico provoca la
infección y colonización por hongos, además de reducir el rendimiento y su cantidad de
aceite.
Para el manejo del hongo Fusarium verticillioides y el insecto Leptoglossus zonatus que
afectan la calidad de las semillas, el empleo de agentes bacterianos es una alternativa
natural como control biológico. Estos agentes bacterianos pertenecen a la familia
Bacillaceae y son conocidos como agentes de control biológico o ACBs, los cuales han
sido ampliamente desarrollados como una alternativa a los plaguicidas químicos en el
control de plagas y enfermedades (Jacobsen et al. 2004).
Dentro del grupo de bacilos que muestran una actividad antagonista en contra de hongos
fitopatógenos se han encontrado algunas rizobacterias como Bacillus subtilis, Bacillus
mojavensis, Lysinibacillus sphaericus y actualmente a Bacillus thuringiensis que ha
mostrado actividad antagonista contra algunos hongos como Rhizoctonia solani
(Montealegre et al. 2003). Por otro lado a excepción las dos primeras, también han
demostrado una actividad entomopatógena por su capacidad de producir toxinas en
contra de varios insectos (Carreras 2011, Berry 2012).
3
2. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1 Clasificación taxonómica, características morfológicas y centro de origen de
Jatropha curcas L.
Jatropha curcas pertenece a la familia Euphorbiaceae, en 1753 fue propuesto su nombre
por Linnaeus y proviene del griego “iatrós” que significa médico, y “trophé” que significa
alimento (Heller 1996). La clasificación identificación taxonómica de esta planta se
observa en el Cuadro 1. El género Jatropha incluye 188 especies (Govaerts et al. 2012)
es un planta caducifolia que ha despertado el interés en todo el trópico como cultivo para
obtener biocombustible (Openshaw 2000). Sin embargo el conocimiento sobre su
taxonomía, la distribución y la etnobotánica es aún incompleto. Su distribución está
relacionada con las variables ambientales tales como elevación, tipo de clima, suelo y
metros sobre el nivel del mar (Fresnedo-Ramírez y Orozco-Ramírez 2013).
Cuadro 1. Clasificación taxonómica de Jatropha curcas L.
Reino Plantae
División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Euphorbiales
Familia Euphorbiaceae
Género Jatropha
Especie Jatropha curcas L.
Heller 1996
Esta planta puede alcanzar de 3 a 5 m de altura (Carels 2009), el diámetro del tronco es
de 15 cm o más en arbustos adultos, la corteza externa es pálida papelosa que se
4
desprende con facilidad y muy delgada con pequeñas lenticelas, la corteza interna lisa
verrugosa de color verde oscuro, látex blanquecino con sabor amargo, ramas robustas,
ascendentes y glabras (Hannan-Jones y Csrhues 2008).
Las hojas adultas miden de 15 a 20 cm de largo y de 14 a 18 cm de ancho, son alternas
con una duración de 7 a 8 meses. Presenta flores monoicas y en ocasiones
hermafroditas. Las flores se encuentran en racimos, cinco sépalos, de hasta 18 mm de
largo. El fruto es una cápsula ovoide, de 4 a 5 cm de largo y 3 a 4 cm de ancho, en estado
inmaduro presenta un color verde y cuando madura se torna de un color amarillo y
después café (Hannan-Jones y Csrhues 2008)
El fruto presenta tres semillas son ovoides de 20 a 24 mm de longitud y 10-12 mm de
ancho y con una línea blanquecina apical, indicando la posición de la carúncula,
endospermo grueso, el embrión con dos cotiledones foliáceos, de 10-13 mm de longitud,
de color blanco crema (Heller 1996).
Investigaciones recientes demuestran que J. curcas es nativa de México y Centroamérica,
aunque su distribución corresponde principalmente a las regiones tropicales de
Sudamérica, África y Asia. Se concluyó que en base a análisis bioquímicos y moleculares
su centro de origen y domesticación se encuentra en el Golfo de (Dias et al. 2012). Dentro
de los nombres comunes que recibe esta planta se encuentran los siguientes: piñón,
piloncillo, jatrofa, nuez negra y skil- te por los mayas en la Península de Yucatán (Jones
1987).
2.2 Localización, importancia y principales usos de Jatropha curcas
Las plantaciones comerciales con mayor superficie sembrada se encuentran en Asía,
donde sobresalen los países de China e India con una superficie sembrada de 2.6
5
millones de hectáreas. En África los países que sobresalen son Magadascar, Zambia,
Mozambique y Tanzania con 120 000 ha. En Latinoamérica la superficie es menor con 21
800 ha, encontrándose a Brasil con el mayor número de hectáreas sembradas con un
total de 15 000 y el resto se encuentran distribuidas en Nicaragua, Colombia Guatemala y
México (Fairless 2007, Gexsi 2008). En el 2011, en México la superficie sembrada de J.
curcas con fines comerciales fue de 2,536 ha de las cuales 2, 450 ha se encuentran
distribuidas en los estados de Yucatán y Quintana Roo (SAGARPA 2011).
En México J. curcas se puede localizar a lo largo de la vertiente del Golfo, desde
Tamaulipas y el Norte de San Luís Potosí pasando por los estados de Hidalgo, Puebla,
Morelos y Veracruz, hasta el Norte de Chiapas. En la vertiente del Pacífico se encuentra
en la Sierra Madre del Sur, Oaxaca y en la Sierra del Soconusco en Chiapas. También se
encuentra en los estados de Tabasco, Yucatán, Michoacán y Guerrero (Reyes-Quintanar
2003). A partir del 2006 se han desarrollado proyectos gubernamentales para establecer
plantaciones comerciales en varios estados de la República Mexicana (Martínez-Herrera
2007).
Actualmente, diversas especies de plantas que pueden ser procesadas para proporcionar
un sustituto al combustible diesel han captado el interés de los científicos siendo una de
ellas J. curcas (Heller 1996). Esta planta es una fuente potencial para la obtención de
biodiesel que demuestra ser una alternativa a la quema de combustibles fósiles (Gubitz et
al. 1999, Fairless 2007, Achten et al. 2008). Se trata de una especie tropical, que tiene un
alcance geográfico más amplio que la palma de aceite ya que se adapta bien a los suelos
pobres en nutrientes y con baja precipitación (King et al. 2009).
6
Dentro de algunos de sus usos se encuentran los siguientes: mejora el control de la
erosión y la infiltración del agua, aportación de materia orgánica al suelo, se utiliza para la
alimentación del ganado, puede ser utilizada en programas de reforestación, base leñosa
para la propagación del cultivo de la vainilla, como barrera de demarcación, leña y uso en
medicina a partir de extractos de diversas partes de la planta, propiedades insecticidas y
moluscocida a partir de extractos de la semilla (Heller 1996).
En México el programa Pro-árbol de la CONAFOR incluyó a J. curcas como un arbusto
forestal no maderable, apoyando con recursos financieros para el establecimiento de
predios con este cultivo (Martínez-Herrera et al. 2010).
2.3 Problemas de sanidad del cultivo de Jatropha curcas
El cultivo de J. curcas en grandes extensiones bajo un sistema de monocultivo presenta
varios problemas relacionados a plagas y enfermedades que pueden dañar cualquier
parte de la planta como raíz, tallo, hoja, inflorescencia fruto y semillas, que no solo afectan
ó disminuyen el rendimiento de semilla, sino también su calidad en condiciones de
almacenamiento, siendo diversos los agentes causales.
Los agentes causales reportados son hongos, bacterias virus, ácaros y diversas plagas
insectiles. Algunos de los problemas que causan son disminución en la germinación de la
semilla, pudrición de raíces en plántulas y en planta adulta la pudrición en tallo provoca la
muerte de ésta, manchas necróticas, royas, cenicillas en hojas y pudrición de
inflorescencias. Ácaros y larvas de insectos se alimentan de hojas. El aborto de frutos es
provocado por insectos. En condiciones de almacenamiento hongos fitopatógenos afectan
la calidad de aceite de la semilla o bien afectan la viabilidad de ésta cuando es utilizada
para la producción de plántula. Hasta el 2012 se han reportado más de 35 especies de
7
hongos, 4 virus, 4 bacterias, 6 nematodos y alrededor de 60 especies de insectos que
afectan el cultivo de Jatropha curcas (Anitha y Varapasrad 2012).
2.4 Principales enfermedades fúngicas en el cultivo de Jatropha curcas
En los últimos años se ha informado sobre la susceptibilidad de J. curcas a diferentes
enfermedades, alrededor del mundo se ha determinado que J. curcas es atacada por
diversos hongos fitopatógenos estudiados hasta ahora en Asia, África y América. La
calidad de la semilla de J. curcas debe mantenerse durante la producción, cosecha y
almacenamiento, ya sea como semillas para la producción de plántulas o para producción
de biodiesel. La semillas se ven afectadas por poblaciones fúngicas que disminuyen la
cantidad de lípidos, contenido de ácidos grasos libres y la viabilidad de las mismas
(Dharmaputra et al. 2009).
Algunos Ommicetes tales como Phythophora sp. Pythium sp. (Valdés et al 2011) y el
hongo Fusarium moniliforme causan pudrición de la raíz (Kaushik et al. 2001). Los
géneros causantes de pudrición de manchas foliares son Helminthosporium,
Pestalotiopsis, Cercospora (Garcete et al. 2009). Mientras que las enfermedades en raíz
y tallo son causadas por Lasiodiplodia teobramae (Pereira et al. 2009).
Recientemente, en México se ha reportado al hongo Alternaria alternata que afectan al
cultivo de J. curcas provocando manchas necróticas de color café en plantaciones
localizadas en parcelas experimentales en Sinaloa, México (Espinoza-Verduzco et al.
2012). Otro más es Phakopsora arthuriana causante de una roya en las hojas que fue
encontrada en Puebla, México en 2011 y 2012 (Nolasco-Guzmán et al. 2013).
Diversos hongos causan pérdidas y disminución de la viabilidad de semillas de J. curcas
en condiciones de almacenamiento, la concentración de ácidos grasos y la concentración
8
proteica y por ende una disminución en la producción de biodiesel (Worang et al. 2008).
Dentro de los géneros involucrados se encuentran a Fusarium, Curvularia, Aspergillus,
Penicilium (Worang et al. 2008, Dharmaputra et al. 2009). Se hace referencia a los
hongos reportados en el cultivo de J. curcas en sus diversas partes vegetativas en el
Cuadro 2.
Cuadro 2. Reportes de hongos fitopatógenos que afectan a Jatropha curcas L.
Agente causal Parte vegetativa
que afecta
Daño o síntoma Referencia
Fusarium moniliforme Raíz Pudrición Kaushik et al. 2001
Lasiodiplodia
theobromae
Pudrición de raíz
y cuello
Latha et al. 2009,
Pereira et al. 2009
Cercospora sp. Hoja Mancha
necrótica
Garcete et al. 2009
Phakopsora jatrophicola
Alternaría sp.
Phakopsora arthuriana
Collectotrichum
gloeporoides
Roya
Roya
Necrosis
Nolasco-Guzmán et
al. 2013
Kwon et al. 2012
Alternaria alternata Inflorescencia Manchas
necróticas
Espinoza-Verduzco
et al. 2012
Cladosporium sp.,
Fusarium verticillioides.
Curvularia lunata y
Fusarium equiseti
Semillas
Disminuyen
germinación
Worang et al. 2008
Pabón-Baquero
2013
9
2.5 Fusarium verticillioides
El género Fusarium es el anamorfo de varios hongos de Ascomicetes que pertenecen al
orden Hypocreales y a la famila Nectriaceae (Cuadro 3). El estado sexual o teleomorfo
pertenece a los géneros Nectria y Giberella. Es el agente causal de pudrición de raíz,
hoja, fruto y semillas en diversos cultivos. Fusarium verticillioides es uno de los principales
hongos que generan problemas en granos almacenados de cereales (De León 2004)
también se ha encontrado afectando bulbos de ajo (Ochoa-Fuentes et al. 2012), además
de causar daños a la salud humana (Desjardins 2006). Recientemente, F. verticillioides
se ha encontrado afectando semillas almacenadas de J. curcas (Dharmaputra et al.
2009).
Cuadro 3. Clasificación taxonómica de Fusarium verticillioides (Sacc.) Nirenberg
Reino Fungi
Phylum Ascomycota
Clase Deutoromycete
Orden Hypocreales
Familia Hypocreaceae
Género Fusarium
Especie Fusarium verticillioides
Díaz de Castro et al. 2007
10
2.5.1 Características morfológicas
Se caracteriza por poseer conidióforos abundantes y microconidios fusiformes a ovoides,
formando largas cadenas. Los microconidios se producen en monofialides. Los
macroconidios son rectos a ligeramente curvados, de paredes delgadas y poseen la
célula basal con forma de pie, se producen en bajo número. Fusarium verticillioides es
miembro de la sección Liseola, en la que sus integrantes no forman clamidosporas, sino
hinchamientos de hifas que ocasionalmente son confundidas con pseudoclamidosporas.
Inicialmente, aislamientos de este hongo en medio PDA tienen un crecimiento micelial de
color blanco, posteriormente naranja y finalmente morado (Leslie y Summerell 2006). Se
considera que los aislamientos de F. verticillioides que producen pigmentos en medio de
cultivo PDA, son más virulentos (Kimura et al. 1981, Visconti et al. 1983). No obstante, su
efecto como factor de virulencia aún no está bien definido (Medentsev et al. 2005).
2.5.2 Distribución y biología
F. verticillioides presenta una distribución mundial se encuentra en zonas de clima
templado, extendiéndose a zonas de clima tropical y subtropical. Raramente se presenta
en zonas de temperaturas frías, aunque ha sido encontrado en Rusia (Bacon y Nelson
1994). Es un hongo que se encuentra en el suelo, causando pudriciones de raíz en
plántula, marchitamientos vasculares, manchas necróticas y tizones en hojas. Causa
pérdida en la calidad de semillas disminución de la viabilidad en condiciones de campo y
almacenamiento (Bai y Shaner 2004, Dharmaputra et al. 2009).
F. verticillioides puede permanecer en el suelo dentro de fragmentos de tallos enterrados
a 30 cm de la superficie, con humedad de 5 a 35%, y temperatura de 5 a l0°C durante
doce meses. En condiciones de laboratorio la temperatura óptima para el crecimiento de
11
es de 22.5 a 27. 5 °C con un máximo de 32 a 35 °C y una temperatura mínima de -5 °C a
2.5 °C. (Bacon y Nelson 1994). Llega a infectar raíces de la planta a partir de su presencia
en residuos de plantas y suelo. Los microconidios funcionan como propágulos
produciendo infecciones secundarias en diversos cultivos (Sanabria et al. 2002). Tiene la
capacidad de desarrollar la enfermedad en plantas procedentes de semillas. Llega a
causar un declinamiento o muerte de las plantas antes de que alcancen su estado
reproductivo.
2.5.3 Daños
La calidad de las semillas de J. curcas depende del grado de madurez del fruto,
contenido de humedad, condiciones de almacenamiento, duración del almacenamiento,
buena viabilidad y vigor de las semillas, sin embargo está sujeta al deterioro que causan
los microorganismos que colonizan granos y semillas, dentro de ellos encontramos a los
hongos ya que son los más tolerantes a la baja disponibilidad de agua en condiciones de
almacenamiento.
Durante el almacenamiento de granos o semillas, éstas pueden ser infectadas por hongos
que causan una disminución de la viabilidad, decoloración, pérdida de peso, cambios
químicos y nutricionales, calentamiento, apelmazamiento y contaminación por
micotóxinas. Chelkowski en 1991 informó, que en muchos de los casos, los hongos que
infectan granos provienen de la semilla, esta juega un papel importante en la transmisión
de numerosas especies de hongos patógenos para plántulas e infección del suelo. F.
verticillioides afecta la semilla de J. curcas en condición de almacenamiento disminuyendo
la cantidad de lípidos, contenido de ácidos grasos libres y la viabilidad de las semillas
(Dharmaputra et al. 2009).
12
2.6 Plagas
Al establecer plantaciones de J. curcas bajo condiciones de monocultivo, es posible que
muchos organismos, representen un problema debido a que son plagas potenciales si se
presentan las condiciones ambientales adecuadas (Heller 1996). En los últimos años, a
nivel mundial, se han reportado organismos que representan un problema fitosanitario en
el cultivo de J. curcas. Diversos estudios registran que cultivos de J. curcas de forma
comercial reportan plagas insectiles que afectan a la raíz, hojas, tallos, inflorescencias y
frutos (Cuadro 4). Hasta 2012 se han reportado alrededor de 60 especies de insectos
(Anitha y Varaprasad 2012).
Dentro de los insectos que afectan la raíz se encuentran algunos gusanos de alambre,
gallinas ciegas, las hojas se ven dañadas por grillos, gusanos y ácaros. El tallo es
barrenado por un escarabajo de la familia Cerambicidae. Los frutos se ven afectados por
dos insectos que pueden afectar su desarrollo o provocar aborto de éstos, P. klugii y L.
zonatus, ambos especímenes reportados en México en el estado de Morelos (Tepole-
García et al. 2012). La inflorescencia también se ve afectada por el polinizador
Hypselonotus intermedius cuando se encuentra en altas densidades (Grimm 1999).
13
Cuadro 4. Insectos plaga en el cultivo de Jatropha curcas L.
Insecto Daño Referencia
Pempelia
morosalis
Se alimenta de flores y
frutos
Shanker y Dhyani 2006
Scutellera nobilis
Caída de flores, aborto de
frutos, malformaciones en
semilla
Shanker y Dhyani 2006
Oxycetonia versicolor Se alimenta de flores
Shanker y Dhyani 2006
Pachycoris klugii
Provoca aborto y
malformaciones de frutos
Grimm 1999
Leptoglossus zonatus
Afecta frutos inmaduros y
provoca aborto
Grimm 1999
Tepole-Garcia et al. 2012
Lagocherius undatus,
Maconellicoccus
hirsutus
Barrenador del tallo
Caída de Hojas
Garcete et al. 2009
Kumar y Singh 2013
Polyphagotarsonemus
latus
Stomphastis thraustica
Deformación de flor y hoja
Minador de tallo y hoja
Almeida et al. 2010
Terren et al. 2012
2.6.1 Taxonomía y distribución de Leptoglossus zonatus Dallas
L. zonatus pertenece a la familia Coreidae (Cuadro 5) y es conocida como “chinche pata
de hoja”, caracterizada por la dilatación de la tibia posterior. Después del tercer segmento
14
antenal muestran una foliación similar, especialmente las ninfas. En algunas especies el
fémur en uno o ambos sexos se encuentran adornados con espinas (Schaefer y Panizzi
2000).
Cuadro 5. Clasificación taxonómica de Leptoglossus zonatus Dallas
Reino Animal
División Arthropoda
Clase Insecta
Orden Heteroptera
Suborden Hemiptera
Familia Coreidae
Subfamilia Coreinae
Género Leptoglossus
Especie Leptoglossus zonatus Dallas
Brailovsky y Barrera 1998
Esta especie se encuentra distribuida desde el sureste de Estados Unidos, pasando por
México y América Central, hasta Brasil. El color de los adultos es de tonalidades cafés
presentando usualmente bandas anchas en forma de zigzag a través del coreo, dos
grandes manchas blanco-amarillentas en el pronoto. Las dilataciones en las tibias
posteriores son externamente filiformes, y las tibias delgadas son lanceoladas en la parte
interna (Schaefer y Panizzi 2000).
15
2.6.2 Importancia económica y ecológica
Las chinches generalmente poseen un hábito alimenticio fitófago. Estos insectos dañan el
cultivo al succionar los jugos de los granos de sorgo en desarrollo y otras partes de la
panícula. El daño mecánico de las semillas provocada por los insectos permite la
infección y colonización por hongos, bacterias y virus, además de reducir el rendimiento y
la germinación de la semilla; puede ser portador de fitopatógenos como: Claviceps
africana, Colletotrichum sp., Fusarium sp., Alternaria sp., Curvularia sp., Bipolaris sp.,
Trichothecium sp., Aspergillus sp. y Rhizopus sp. (Prom y Perumal 2008).
Leptoglossus zonatus es un insecto generalista que se alimenta de cultivos importantes
alrededor del mundo como sorgo, algodón, pitahaya y J. curcas entre otros (Grimm y
Maes 1997). En sorgo provoca daños desde la floración hasta la maduración del grano.
En J. curcas provoca un menor desarrollo de frutos y semillas (Grimm 1999) ya que el
tejido vascular cuando es dañado causa disminución del vigor de la planta o interfiere con
el desarrollo de la semilla debido a que daña el fruto. En este caso el tipo de daño
depende del ambiente y del estado de maduración del fruto.
2.6.3 Ciclo biológico
Su ciclo de vida se divide en tres fases que son huevo, ninfa y adulto (Davis 1991).
Huevo. La hembra oviposita de 20 a más huevos en hileras o cadenas pegados unos con
otros casi siempre cerca de los tallos u hojas (cerca de la vena de la hoja) (Mead 1999),
recién ovipositados son de color verde y con el transcurso de los días tienden a un color
café cobrizo. Son cilíndricos, con la base plana, con abundantes poros en el corión
(Tarango et al. 2007).
16
Ninfa. Presenta cinco estadios, ninfa 1, 2, 3, 4 y 5, miden en promedio 2.78, 5.07, 7.11,
11.25 y 15.79 mm de longitud, respectivamente (Grimm y Somarriba 1999). En los
primeros estadios son de color naranja y a partir del quinto estadio hasta adulto se tornan
a una coloración café obscuro. Las ninfas tienden a ser gregarias en sus primeros
estadios (Mead 1999), encontrándose en el mismo ambiente que los adultos (Xiao y
Fadamiro 2009).
Adultos. La especie presenta como característica distintiva en la parte anterior al pronoto,
dos manchas amarillas redondas, con puntos negros, ocupando más allá del disco
anterior. También presenta una banda amarilla en forma de zigzag como se describe en
el punto 2.6.1.
2.6.4 Daños
Se ha determinado que los adultos y ninfas de L. zonatus se alimentan de pedúnculos y
frutos de J. curcas (Grimm y Maes 1997). El mayor porcentaje de aborto de frutos es
cuando alcanzan un tamaño de 20-25 mm de diámetro, no así para frutos menores a 15
mm, lo cual indica que el adulto prefiere alimentarse de frutos con cierto grado de
madurez, (por el menor contenido de látex). La frecuencia de malformación de semillas de
J. curcas es mayor cuando el daño es causado por adultos de L. zonatus en comparación
con las ninfas. Ocasionalmente la chiche pata de hoja se alimenta de tejido vegetal
posiblemente por la necesidad de absorción de humedad (Grimm 1999). La baja
incidencia de huevos y ninfas en el cultivo comparadas con los adultos indican que el fruto
de J. curcas no es el sitio preferido para la reproducción de dicha chinche (Grimm y
Führer 1998).
2.7 Manejo de plagas y enfermedades en el cultivo de Jatropha curcas
17
La pérdida de rendimiento en los cultivos en general es causada por plagas insectiles
suma alrededor del 10 a 30 % mundialmente. Otras plagas no insectiles como ácaros,
nematodos, moluscos, fitopatógenos, malezas y otros organismos aumentan el daño en la
producción mundial que va del 40 a 48 %. Las pérdidas en postcosecha son del orden
del 10 al 20 % (Helmuth 2000).
En la actualidad el manejo de plagas y enfermedades trata de mantener los niveles que
no causen daño económico, utilizando diversas estrategias, preferentemente aquellas
relacionadas a factores naturales, tales como el uso de agentes de control biológico
(Jacobsen et al. 2004) que incluye a microorganismos antagonistas (Köhl et al. 2011) y
entomopatógenos que no permiten el crecimiento de las poblaciones a niveles que
afectan a los cultivos, disminuyendo así el uso de plaguicidas sintéticos, ya que deben ser
recomendados como una medida de emergencia (Cisneros 1992).
En J. curcas el manejo de plagas y enfermedades ha sido mediante el uso de productos
químicos sintéticos (Kumar et al. 2011). Sin embargo, en la actualidad esa idea se ha ido
cambiando por el uso de agentes de control biológico que pueden suprimir a poblaciones
de fitopatógenos o insectos plaga (Kamal y McSpadden 2006). Latha et al. (2011)
utilizaron dos especies de bacterias aisladas de la rizosfera de J. curcas identificadas
como Pseudomonas fluorecens y Bacillus subtilis combinadas con algunas enmiendas
orgánicas para suprimir a Lasiodiplodia teobromae agente causal de la pudrición de raíz y
cuello de J. curcas en condiciones de campo, mostrando resultados significativos en la
reducción del crecimiento micelial.
2.7.1 Potencial de las bacterias rizosfericas como agentes de control biológico
18
La rizosfera es la región de suelo más cercana a la raíz de la planta, la cual está poblada
por varios microorganismos benéficos y se piensa que es una región de primera línea de
defensa de las raíces contra el ataque de hongos patógenos (Weller et al. 2002). El
término rizosfera se le atribuye al alemán Lorenz Hiltner quien en 1904 lo propuso
(Bringhurst et al. 2001).
Las rizobacterias son consideradas como microrganismos competitivos en la zona de la
raíz, por lo tanto éstas poseen un mayor potencial como agentes de control biológico y
son promotoras del crecimiento vegetal también llamadas Bacterias Promotoras del
Crecimiento Vegetal o PGPR (por sus siglas en inglés) (Kloepper et al. 2004). Las PGPR
son un grupo de microorganismos bacterianos saprófitos de vida libre que viven en la
rizosfera de las plantas que colonizan el sistema de raíces (Saravanakumar et al. 2007).
Tanto las bacterias Gram negativas y Gram positivas han sido previamente aisladas y
probadas para ser eficazes contra enfermedades causadas por diversas especies de
patógenos en varios cultivos. Muchos géneros de bacterias han sido introducidos en
suelos, semillas, raíces tubérculos y otros partes vegetativas para promover el crecimiento
vegetal de las plantas. Éstas bacterias incluyen géneros como Acinetibacter,
Agrobacterium, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Thiobacillus y
otros más. Por otro lado los géneros de bacterias que han sido utilizados en el control
biológico son Pseudomonas, Bacillus, Burkholderia, Lysinibacillus y Serratia.
El control biológico de las enfermedades originadas en el suelo está relacionado a las
PGPR por un fenómeno bien establecido entre los antibióticos que producen y la
supresión de varios patógenos de las plantas. Estas ejercen su actividad de control
biológico directamente a través de la producción de metabolitos tales como antibióticos,
19
cianuro de hidrógeno, sideróforos y degradación de la pared celular por medio de enzimas
(Choudhary y Johri 2009, Kloepper et al. 2004) e indirectamente mediante la inducción de
la resistencia sistémica inducida (ISR por sus siglas en inglés) contra varias
enfermedades de las plantas (Jetiyanon y Kloepper 2002).
2.7.1.1 Bacillus subtilis
Microorganismo cuyo hábitat natural es el suelo, se encuentra ampliamente distribuido en
la naturaleza. Entre sus principales características se encuentra su capacidad para formar
esporas en diversas condiciones de estrés, crecer en un intervalo amplio de temperaturas
(desde 15 hasta 55 ºC). Presenta motilidad, aerotaxis y velocidades de crecimiento
altas/bajas, puede sobrevivir en altas concentraciones salinas (hasta el 7% de NaCl).
Produce una amplia variedad de antibióticos y enzimas hidrolíticas extracelulares
(Nakamura et al. 1999).
El ciclo de vida de B. subtilis en laboratorio, comprende una fase vegetativa muy similar al
crecimiento de otras bacterias, sin embargo bajo condiciones de limitación de nutrientes,
de densidad de población o de respuesta a condiciones de estrés, se generan una serie
de señales que modulan el inicio de la esporulación (Lazazzera 2000). El primer evento
morfológico del proceso de esporulación que puede observarse con el microscopio, es la
formación de un septo asimétrico en uno de los polos de la célula. Este estadio se
observa dos horas después de terminado el crecimiento exponencial.
2.7.1.2 Bacillus mojavensis
Es una bacteria endófita y rizosférica (Bacon et al. 2012, Toledo 2013). Fue aislada por
primera vez en el desierto de Mojave, California, se distingue del complejo de B. subtilis
en base a su composición de ácidos grasos, divergencia en la secuencia de ADN y la
20
resistencia a la transformación genética (Roberts et al. 1994). Pertenece a la familia
Bacillaceae es una bacteria Gram positiva, con forma de bacilo con un tamaño de 0.7-0.8
por 2-3 micras, que no se encuentra en cadenas, sin flagelos, se caracteriza por formar
endosporas elípticas con un tamaño que va de 0.8 micras de ancho por 1.5 a 1.8 micras
de largo (Bergey’s 1994), cuando se cultiva en agar nutritivo, las colonias son redondas o
irregulares con superficies de color crema y arrugada.
Todas las cepas de esta especie se han reportado como antagonista a diversos hongos
fitopatógenos. Esta especie sobresale como un agente de biocontrol de endófitos como
Fusarium verticillioides. B. mojavensis es capaz de producir surfactinas que actúan contra
el hongo (Bacon y Hinton 2002).
2.7.1.3 Bacillus thuringiensis
Es una bacteria del suelo, anaerobia facultativa, móvil y esporogénica, perteneciente al
grupo de bacterias Gram positivas (Lecadet 1970). Se caracteriza porque después de la
fase de crecimiento exponencial, las células producen tanto una espora subapical como
uno o varios cuerpos parasporales: inclusiones compuestas de una o más proteínas
cristalinas (Lecadet 1970, Schnepf et al. 1998).
En la mayoría de las subespecies de B. thuringiensis la producción de inclusiones
cristalinas está acoplada a la esporulación (Schnepf et al. 1998, Sedlak et al. 2000). Las
toxinas cristalinas existen en una diversidad de formas: bipiramidal, esférica, romboidal,
cuboidal e irregular, entre otras (Crickmore et al. 2008). El cristal proteínico está
constituido por proteínas denominadas d-endotoxinas también conocidas como proteínas
Cry ó Cyt (Sauka y Benintende 2008). La definición proteína Cry es cualquier proteína
paraesporal de Bt que muestre un efecto tóxico hacia algún organismo, verificable por
21
medio de bioensayos o cualquier proteína que muestre similitud con las proteínas Cry
(Bravo et al. 2011).
2.7.1.4 Lysinibacillus sphaericus
Anteriormente conocido como Bacillus sphaericus fue reasignado al nuevo género
Lysinibacillus por su producción de peptidoglicanos que contienen lisina y ácido aspártico
(Ahmed et al. 2007). Es una bacteria aeróbica, Gram-positiva, con espora circular
terminal, la cual está ampliamente distribuida en el suelo y en ambientes acuáticos. Es un
bacilo que mide 1.5 a 5 micras de largo, con bordes redondos; macroscópicamente puede
observarse que forma colonias beta hemolíticas, color blanco crema traslucido y bordes
regulares (Realpe et al. 2002).
Este microorganismo tiene metabolismo aerobio, se desarrolla en amplios rangos de
temperatura; máxima entre 30 °C y 45 °C y mínima de 5 °C a 15 °C, es catalasa positiva,
no fermenta la glucosa, no reduce nitratos, es fenilalanina positivo sensible a bajas
concentraciones de penicilina y tetraciclina y presenta resistencia al cloranfenicol y a la
estreptomicina (Brock et al. 2000). Es un alcalofilo obligado que produce gran cantidad de
proteasa alcalina extracelular (Singh et al. 2001, 2004). Algunas de las cepas producen
bacteriocinas, antibióticos proteicos que son efectivos en contra de otras cepas de la
misma especie (Cetinkaya et al. 2003) y que pueden ser vistas como toxinas
antibacteriales. Otras toxinas producidas por L. sphaericus son la esferilicosina, toxina
binaria, capa S, y mosquitocidas vegetativas también llamadas Mtx1, Mtx2 y Mtx3 que son
producidas durante la fase de crecimiento.
2.8 Actividad antagonista de las bacterias rizosféricas
22
En los últimos años el uso de herramientas biológicas como el uso de rizobacterias
promotoras del crecimiento ha recibido cada vez más atención por solventar el problema
sobre el crecimiento de la planta. Además de su capacidad de suprimir las enfermedades
a través del antagonismo entre la bacteria y los patógenos del suelo de forma directa e
indirectamente, también inducen la resistencia en la planta contra de patógenos de raíz y
hoja (Leendert et al. 2004) (Cuadro 6).
El antagonismo entre los microorganismos es un fenómeno común; hongos y bacterias
patógenas de las plantas también pueden verse afectados por los antagonistas de hongos
y bacterianas (Cook y Baker 1983). Una inferencia de este tipo que ocurre naturalmente
entre los microorganismos beneficiosos y patógenos de plantas contribuye al regulador
natural de los sistemas de cultivo, lo que impide o limita el desarrollo de la enfermedad.
Esto es más evidente en suelos supresores donde un potencial antagónico se ha
acumulado en la presencia de la población del patógeno (Weller et al. 2002).
El control biológico puede resultar de diferentes tipos de interacciones entre organismos,
los investigadores han caracterizado los mecanismos en diferentes situaciones
experimentales y en todos los casos son actividades antagonistas por la presencia de otro
organismo. Entre los mecanismos de control biológico mediados por rizobacterias
ampliamente reconocidos se encuentran: la competencia por un nicho ecológico o
sustrato, la síntesis de compuestos inhibitorios como sideróforos, antibióticos, enzimas
líticas y detoxificadoras (Bais et al. 2004), así como la inducción de resistencia sistémica
en la planta (Matiru y Dakora 2004, Ryu et al. 2004).
El control de hongos fitopatógenos por agentes de biocontrol depende de una amplia
variedad de características, tales como la producción de metabolitos antifúngicos y
23
enzimas líticas, la inducción de la resistencia sistémica, y de alto mantenimiento
competitivo en la rizosfera, lo que se considera que son requisitos importantes para el
óptimo desempeño de rizobacterias promotoras del crecimiento de plantas (PGPR) hacia
patógenos que atacan a ésta (Haas y Defago 2005). Los metabolitos secundarios
producidos por las bacterias beneficiosas previenen la infección alterarando el medio
ambiente y mejorar de la capacidad de la bacteria para competir con los patógenos,
mediante la inhibición de la actividad de los agentes patógenos, o mediante la activación
de las defensas del huésped (Bloemberg y Lugtenberg 2001, Raaijmakers et al. 2002).
Las bacterias de los géneros Pseudomonas Burkholderia y Bacillus son de los grupos
más estudiados porque tienen la capacidad de producir reguladores del crecimiento
vegetal y otros metabolitos con efecto antagónico y represivo del crecimiento de
patógenos en la rizosfera (Choudhary y Johri 2009). Por lo que resulta de gran
importancia la caracterización y selección de cepas autóctonas de estos géneros, los
cuales muestran efecto antagónico ante patógenos que atacan a cultivos de importancia
económica, de forma tal que se puedan aprovechar sus potencialidades como agentes de
control biológico. Algunos de los bacilos utilizados en el control de hongos fitopatógenos
se muestran en el Cuadro 6.
24
Cuadro 6. Bacillus spp. utilizados en el biocontrol de fitopatógenos
Especie de
Bacillus
Fitopatógeno Efecto Referencia
B. pumilis
B. mycoides
Cercospora beticola inducción de la
resistencia a la
enfermedad
Bargabus et al.
2002, 2004
B. pasteurii
B pumilis
Peronospora
tabacina
menor severidad en
la enfermedad
Zhang et al. 2001,
2004
B. sphaericus Cronartium
quercuum
Induce resistencia a
la enfermedad
Eneback et al. 1998
B. mojavensis F. verticillioides Inhibición en el
crecimiento micelial
Bacon et al. 2012
El biocontrol de fitopatógenos es realizado por diferentes mecanismos de acción que
ejercen las bacterias tales como la inducción de la resistencia sistémica de la planta y en
otras ocasiones por la producción de diversos metabolitos que no permiten el crecimiento
del fitopatógeno (Choudhary y Johri 2009).
2.9 Actividad entomopatógena de las bacterias rizosféricas
Actualmente se han descrito alrededor de 300 bacterias entomopatógenas, la más
importante desde el punto de vista comercial pertenece al género Bacillus que incluye 51
especies. Cuatro especies de este género han sido estudiadas como insecticidas
microbianos: Bacillus popilliae, Bacillus moritai, Lysinibacillus sphaericus, Bacillus
thuringiensis (Bt) (Cuadro 7), ésta última representa el entomopatógeno de mayor
producción en el mundo, debido a su rápida acción y a la posibilidad de producirlo in vitro
25
en forma industrial. Las células esporuladas y cristales de Bt pueden producirse con
métodos convencionales haciéndolas competitivas en costo con relación a los insecticidas
químicos (Gallegos 2003).
Cuadro 7. Bacillus spp. utilizados en el biocontrol de plagas insectiles
Especie de Bacillus Insecto Daño Referencia
B. cereus,
Paenibacillus
Tylopili
Brahmina coriacea Se alimenta de
tubérculos de papa
Sharma et al. 2013
Lysinibacillus
sphaericus
Culex
quinquimafaciatus,
Blatella germanica,
spodoptera litura
Problemas a la
salud humana
Defoliador
Lozano et al. 2011
Nishiwaki et al. 2007
Bacillus thuringiensis Aedes aegypti Problemas a la
salud humana
Ochoa y
Arrivillaga 2009
El modo de acción de Bacillus thuringiensis depende de la actividad de la protoxina que
debe ser ingerida por el insecto susceptible, cuyo intestino posee un pH alcalino superior
a 9,5 lo cual es esencial para la disolución de las protoxinas, su activación se da gracias a
la proteólisis causada por las enzimas digestivas del insecto. La especificidad de la δ-
endotoxina a un tipo de insecto en particular implica la presencia de receptores celulares
específicos, la toxina se inserta de forma irreversible a la membrana plasmática de las
células intestinales creando poros o lesiones que conduce a una variación en la
permeabilidad celular, alterando el transporte de iones potasio destruyéndola, causando
26
así la disrupción de la integridad del intestino y la muerte del insecto en 24 a 48 horas
posteriores a la ingesta (Ibiza-Palacios et al. 2008).
La acción entomopatógena de Lysinibacillus sphaericus depende de factores como: dosis
de aplicación, ingestión de la toxina por la larva y velocidad de alimentación de la larva.
Desde que se descubrió L. sphaericus en 1965 como entomopatógeno de mosquitos
(Kellen et al. 1965), han surgido nuevos reportes que indican actividad en contra de otras
especies incluyendo efectos letales sobre huevecillos del nematodo Trichostrongus
colubriformis (Bone y Tinelli 1987). Lysinibacillus sphaericus no tiene efectos sobre otros
organismos que incluyan insectos benéficos, como por ejemplo las abejas. Ensayos de
campo han demostrado la ausencia de efectos sobre invertebrados no blanco de este
microorganismo como crustáceos, dípteros, langostinos y escarabajos, además de
algunos vertebrados acuáticos como renacuajos, en lugares donde se ha utilizado como
larvicida (Brown et al. 2004, Lacey 2007).
La proteína Mtx1 es tan tóxica como la proteína cristal y puede ser procesada en el
intestino por proteasas a derivados de 27 y 70 kDa siendo ambos fragmentos necesarios
para una total actividad de la toxina.
La toxina binaria comprende dos proteínas BinA (448 aminoacidos 42 kDa) y BinB (448
aminoacidos de 51 kDa) es depositada en forma de cristal paraesporal y su principal
característica es su alta toxicidad en mosquitos (Baumann et al. 1998, Hindley y Berry
1987). Esta toxina se forma en la fase exponencial y al inicio de la esporulación (Ahmed
et al. 1995). Las cepas bloqueadas en su estado inicial de esporulación no acumulan
cristales de la toxina (Charles et al.1988, El-Bendary et al. 2005). Su sitio de acción es el
intestino del insecto una vez ingerida la toxina ésta se solubiliza y activa uniéndose a las
27
células epiteliales del intestino ciego e intestino posterior en mosquitos de Culex. El
receptor es mediado por la toxina proteica BinB la cual puede ser ligada a distintas
regiones del intestino donde puede dañar los nervios y tejidos musculares (Davidson
1989, Oei et al. 1992).
La esferilicosina es producida por algunas cepas de L. sphaericus la cual muestra un
efecto sobre la cucaracha Blattella germanica y el gusano cortador del tabaco Spodoptera
litura (Nishiwaki et al. 2007). La esferilicosina es una proteína de 53 kDa producida en
medio de cultivo, miembro de la familia de las citolisinas, es un miembro de la familia de
las citolisinas y es capaz de producir poros de aproximadamente 35 nm de diámetro en
los eritrocitos.
La capa S es una estructura proteíca paracristalina sobre la superficie de muchas
bacterias compuesta por monómeros de glicoproteína. Sus funciones están envueltas en
la interacción entre la célula bacteriana y el ambiente, por ejemplo como capa protectora o
tamiz molecular en la adhesión de la célula y reconocimiento de receptores en el control
biológico (Sidhu y Olsen 1997). Esta capa ha sido encontrada en las especies del género
Bacillaceae. La capa S ha mostrado actividad tóxica contra el mosquito Culex
quinquefasciatus vector de la Filariasis (Lozano et al. 2011).
L. sphaericus requiere ser ingerida por el insecto para actuar y así desarrollar la infección
dentro de las larvas de los mosquitos. La evidencia principal con que se cuenta se basa
en histología. Por lo general las cepas afectan la membrana peritrófica del intestino medio
hasta que muere la larva. La mayoría de las larvas de dípteros se alimentan normalmente
de bacterias y algas. Las cepas específicas de L. sphaericus, al ser introducidas en
medios acuáticos, son ingeridas por las larvas. Una vez en el intestino medio, la bacteria
28
comienza a degradar las células de la membrana epitelial. Al mismo tiempo en que la
bacteria crece y esporula se produce una toxina que atraviesa la membrana epitelial de
las células sensibles que se encuentran en el lumen de la larva, lo que da lugar a la
intoxicación de las mismas. Después de la muerte de la larva, las células vegetativas de
L. sphaericus (junto con la flora normal del intestino) crecen hacia afuera de los tejidos
finos de la larva muerta. En consecuencia, la región posterior del intestino medio aparece
inflamada en las larvas infectadas, las que también llegan a manifestar temblores, lentitud
y no pueden mudar (Davidson et al. 1990).
En dípteros la inclusión cristalina denominada toxina binaria A y B es liberada en el
intestino en su fase larvaria y al ser solubilizada por el pH alcalino en el intestino medio,
ésta es activada por las proteasas causando deshidratación y muerte a los vectores.
Provoca daños al sistema nervioso y los tejidos musculares (Singh et al. 2004). En
cucarachas adultas la toxina esfericolisina afecta a los ganglios que son el sistema
nervioso de estos insectos (Nishiwaki et al. 2007).
29
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo general
Evaluar la actividad de bacterias rizosféricas de Jatropha curcas contra Fusarium
verticillioides y Leptoglossus zonatus.
3.2 Objetivos específicos
Establecer las cinéticas de crecimiento de las bacterias rizosféricas Bacillus
subtilis, Bacillus mojavensis, Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus.
Evaluar el efecto de bacterias rizosféricas en el crecimiento micelial de Fusarium
verticillioides.
Determinar el efecto de bacterias rizosféricas sobre la morfología hifal de Fusarium
verticillioides.
Evaluar la actividad tóxica de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus
sobre la mortalidad de Leptoglossus zonatus.
Evaluar el efecto de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus sobre el peso
de Leptoglossus zonatus.
30
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 Material biológico
El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Fitopatología y en el Laboratorio de
Ecología Química de Insectos del Departamento de Interacciones Planta-Insecto del
Centro de Desarrollo de Productos Bióticos (CeProBi-IPN).
4.1.1 Cepas bacterianas
La cepas de las bacterias Bacillus subtilis, Bacillus mojavensis, Bacillus thuringiensis y
Lysinibacillus sphaericus fueron provistas por la colección de hongos y bacterias del
Laboratorio de Fitopatología del CEPROBI. Las bacterias fueron conservadas en medio
agar nutritivo (AN) a una temperatura de 4 °C. Posteriormente se realizaron resiembras
periódicas.
4.1.2 Cepa fúngica
La cepa de Fusarium verticillioides fue provista de la colección de hongos del Laboratorio
de Fitopatología del CEPROBI. El hongo fue resembrado en medio Papa Dextrosa Agar
(PDA). Posteriormente se realizaron resiembras periódicas para conservar la cepa a una
temperatura de 28 ± 2 °C.
4.1.3 Establecimiento de la cría de Leptoglossus zonatus
Las ninfas y adultos de Leptoglossus zonatus fueron colectados manualmente en un
cultivo de sorgo ubicado en la colonia Diego Ruíz, municipio de Yautepec, Morelos
(18°49´22.85 N y 99°06´13.68 O) (Fig. 1) y de una plantación experimental de piñón
mexicano en el CeProBi-IPN (18°49´45.48 N y 99°05´35.73 O). Los insectos colectados
fueron depositados en jaulas de acrílico (27 x 23 x 25 cm) cuyas entradas estuvieron
31
cubiertas con tela de organza y se llevaron al Laboratorio de Ecología Química del Centro
de Desarrollo de Productos Bióticos del I. P. N.
En el laboratorio tanto los adultos como las ninfas se alimentaron con vainas tiernas de
frijol (ejote) y elote (Grimm 1999) y se les adicionó miel diluida en agua al 10 % en tubos
Eppendorf perforados en la base para que los insectos se alimentaran. Todos los días se
revisaron las jaulas con la finalidad de eliminar el material vegetal descompuesto y los
desechos producidos por los insectos. El alimento se cambió cada tercer día, el pie de
cría se mantuvo de forma permanente para tener los diferentes estados ninfales y adultos
para asegurar su conservación en condiciones de laboratorio.
Figura 1. Ninfas de Leptoglossus zonatus alimentándose de los granos de sorgo en condiciones de campo.
32
Para su apareamiento se colocaron parejas de machos y hembras en jaulas de vidrio de
15x15x15 cm. Las hembras que lograron aparearse se aislaron en otras jaulas similares a
las descritas para la obtención de los huevecillos, los cuales se contaron y separaron en
jaulas similares hasta la emergencia de las ninfas. Las ninfas obtenidas se separaron de
acuerdo a su estado de desarrollo y se alimentaron como se describió anteriormente
hasta que alcanzaron el grado de desarrollo deseado (ninfa 4) para realizar los
bioensayos. La limpieza de las jaulas fue la misma que en el caso de los insectos
colectados en campo (Fig. 2).
4.2 Establecimiento de las cinéticas de crecimiento de Bacillus subtilis, Bacillus
mojavensis, B. thuringiensis y Lysnibacillus sphaericus.
Se preparó un inóculo de 50 mL de caldo nutritivo a partir de una asada de cada cepa
bacteriana (B. subtilis, B. mojavensis, B. thuringiensis y L. sphaericus) crecidas en medio
agar nutritivo y se dejó incubar durante 12 horas en agitación a 150 rpm a una
temperatura de 28 ± 2°C.
Figura 2. Cría de Leptoglossus zonatus en condiciones de laboratorio a una temperatura de 28 ± 2 °C.
33
4.2.1 Cinética en medio caldo nutritivo
Para conocer las fases de crecimiento bacteriano se procedió a preparar un inóculo de la
forma mencionada en el punto anterior y se tomó una alícuota de 0.5 mL para inocular un
total de 18 matraces que contenían 50 mL de caldo nutritivo (8 g/ L). El cultivo bacteriano
se dejó crecer durante 32 h en agitación a 150 rpm a 28 ± 2°C. Se tomaron muestras de
1 mL del cultivo bacteriano cada cuatro horas de dos matraces y se llevaron al
espectrofotómetro (Shimadzu UV-160) en donde se midió la absorbancia a una densidad
óptica a 590 nm. Con los datos obtenidos se realizaron las gráficas de cinética de
crecimiento en SigmaPlot versión 11.0 (2008).
4.2.2 Cinética en medio caldo nutritivo más extracto de levadura suplementado con
sales para Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus
A partir del inóculo en medio caldo nutritivo de B. thuringiensis y L. sphaericus
mencionado en el punto 4.2 se tomó una alícuota de 0.5 mL para inocular cada uno de los
matraces que contenían 50 mL de caldo nutritivo más extracto de levadura (0.05 % o 0.5
g/L) y suplementado con sales (CaCl 7 X10 -4M, MnCl 5X10-5 M y MgCl 10-3 M) (Dussán
2002). El cultivo bacteriano se dejó crecer durante 32 horas en agitación a 150 rpm a una
temperatura de 28 ± 2°C, la toma de muestras y elaboración de graficas de la cinética de
crecimiento se realizaron de igual forma que en el punto anterior.
4.3 Observación de cristales de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus
La observación de los cristales se realizó mediante la técnica de tinción simple con cristal
violeta al 0.5 % para lo cual se tomaron alícuotas de 100 µL y se colocaron sobre un
portaobjetos, posteriormente se colocó una gota de cristal violeta y se dejó por un minuto
para después lavar con agua corriente hasta que no quedaran restos de colorante (Boone
34
et al. 2001). Las muestras se tomaron cada cuatro horas a partir de las ocho horas hasta
las 20 horas de crecimiento bacteriano en los medios de cultivo ya mencionados en los
puntos 4.2.1 y 4.2.2. Las muestras se llevaron al laboratorio de microscopia óptica
ubicado en el CEPROBI para realizar la toma de fotografías digitales en un Microscopio
Óptico Nikon Eclipse 80i (Japón), el cual cuenta con cabezal y zoom digital de 4X, con
cámara de video, controlador e interfase acoplada a PC (Data image DS33, Japón) con un
acercamiento de 100X.
4.4 Bioensayos de antagonismo in vitro
4.4.1 Cultivo dual de bacterias rizosféricas y Fusarium verticillioides. Cultivo
bacteriano en agar nutritivo
Las pruebas de antagonismo se realizaron utilizando el método dual en cajas Petri con
agar nutritivo, mediante una asada de cultivo bacteriano se inocularon cuatro puntos
equidistantes, esparciéndolas en un área de 1 cm2 de cada punto del borde de la caja y
en el centro se colocó un disco de 5 mm de diámetro del hongo fitopatógeno F.
verticillioides. El testigo constó solo de un disco de 5 mm del hongo en medio agar
nutritivo. El experimento se incubó a una temperatura de 28 ± 2 °C hasta que el testigo
llenó la caja con micelio. El diámetro de la colonia fue medido empleando un vernier
digital. Con las medidas obtenidas se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento
micelial mediante la ecuación descrita por Gou et al. (2006):
Porcentaje de inhibición micelial= 1 – (Da /Db) X 100
En donde:
Da: Diámetro de la zona de crecimiento micelial de los tratamientos.
Db: Diámetro de la zona de crecimiento micelial del testigo.
35
Se realizaron 5 repeticiones por tratamiento en un diseño completamente al azar y el
experimento se replicó tres veces.
4.4.2 Cultivo dual de bacterias rizosféricas y Fusarium verticillioides. Bacterias
crecidas en caldo nutritivo
Se preparó un inóculo de 50 mL de caldo nutritivo a partir de una asada de cada cepa
bacteriana (B. subtilis, B. mojavensis, B. thuringiensis y L. sphaericus) crecidas en medio
agar nutritivo y se dejó incubar durante 12 horas en agitación a 150 rpm a una
temperatura de 28 ± 2°C. Posteriormente se tomó una alícuota de 0.5 mL de cada cultivo
bacteriano para inocular ocho matraces de 50 mL de caldo nutritivo, cuatro de ellos fueron
incubados en agitación a 150 rpm a una temperatura de 28 ± 2 °C durante 12 horas y los
otros cuatro fueron incubados durante 24 horas de la misma manera. Utilizando el mismo
método dual mencionado en el punto anterior en cajas Petri con medio AN se utilizó una
micropipeta para colocar cuatro gotas del cultivo bacteriano, cada una de ellas de 5 µL de
la bacteria y en el centro se colocó un disco de 5 mm del hongo F. verticillioides. El testigo
constó solo de un disco de 5 mm del hongo fitopatógeno colocado en el centro de caja
Petri con medio AN. Las cajas Petri se incubaron hasta que el testigo llenó la caja con
micelio a 28 ± 2 °C. Los datos de diámetro micelial al igual que el porcentaje de inhibición
de crecimiento micelial fueron obtenidos de la forma ya mencionada en el punto anterior.
4.5 Evaluación del efecto de bacterias rizosféricas sobre la morfología hifal de
Fusarium verticillioides mediante microscopia óptica
Después de realizar las pruebas de antagonismo mediante la técnica de cultivo dual
descrita en el punto anterior, se cortó un disco de aproximadamente 5 mm de diámetro de
la zona de inhibición entre el hongo y la bacteria, este disco fue colocado sobre un
36
portaobjetos. Posteriormente, se realizó una tinción con azul de algodón a una proporción
de 0.5 g / 100 mL de lactofenol y se le colocó un cubreobjetos, de igual forma se colocó
un disco del hongo sin tratamiento para contrastar las diferencias morfológicas. Una vez
preparada la muestra, ésta se llevó al laboratorio de microscopia óptica del CEPROBI
para realizar la toma de fotografías digitales en el Microscopio Óptico Nikon Eclipse
80i (Japón) con un acercamiento de 20 y 40X.
4.6 Evaluación del efecto de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus
sobre la mortalidad de la ninfa 4 de Leptoglossus zonatus
Las ninfas en su cuarto estadio se colocaron en forma individual dentro de vasos de
plástico del número 4 sin alimento por cuatro horas previo a los bioensayos.
Posteriormente, se les colocó un tubo Eppendorf perforado en la base, en el cual se
depositó 1 mL de la bacteria según correspondiera, crecida en caldo nutritivo más extracto
de levadura suplementado con sales (CaCl, MnCl y MgCl) durante 16 horas, más dos
granos de elotes que fueron cambiados cada dos días (Fig. 3). El número de ninfas por
tratamiento fue de 30. En las ninfas testigo se añadió 1 mL de caldo nutritivo sin la
bacteria. La evaluación de la mortalidad se realizó cada 24 horas durante los cinco días
posteriores de iniciado el experimento. Las observaciones preliminares permitieron
determinar que la duración de este estado ninfal es de cinco días.
37
El efecto de Bacillus thuringiensis y L. sphaericus sobre la mortalidad de L. zonatus fue
analizado usando la prueba estadística Chi cuadrada con el programa estadístico
SigmaPlot versión 11.0 (2008).
4.7 Evaluación del efecto biológico de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus
sphaericus sobre el peso de la ninfa 4 a ninfa 5 de Leptoglossus zonatus
Siguiendo la misma metodología mencionada en el punto 4.6 se tomaron datos de peso
del cuarto y quinto estado ninfal de L. zonatus, además se determinó si había algún
cambio morfológico o retraso en el ciclo biológico.
El efecto de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus sobre el peso de L. zonatus
fue analizado usando la prueba estadística ANOVA de una vía (P=0.349) con el
programa estadístico SigmaPlot versión 11.0 (2008).
Figura 3. Ninfa en vaso de plástico en el
laboratorio de Ecología Química de
Insectos del CEPROBI-IPN.
38
5. RESULTADOS
5.1 Cinéticas de crecimiento de Bacillus subtilis, Bacillus mojavensis, Bacillus
thuringiensis y Lysnibacillus sphaericus en medio caldo nutritivo.
Se obtuvieron las cinéticas de crecimiento de bacterias rizosféricas para conocer las
diferentes fases de crecimiento de cada una de estas cepas bacterianas y determinar la
producción de metabolitos primarios y secundarios, se menciona el tiempo en el que
alcanzan cada una de estas fases de crecimiento en medio caldo nutritivo.
B. subtilis en medio caldo nutritivo inició su fase lag o de adaptación de las cero a cuatro
horas, la fase logarítmica va de las cuatro a 16 horas, la fase estacionaria va de las 16
hasta las 24 horas, su fase de declinación va de las 24 horas en adelante (Fig. 4a).
Bacillus mojavensis en medio caldo nutritivo inició su fase lag o de adaptación de las cero
a cuatro horas, la fase logarítmica va de las cuatro a las 16 horas, la fase estacionaria va
de las 16 hasta las 28 horas, su fase de declinación va de las 28 horas en adelante (Fig.
4b).
Figura 4. Cinética de crecimiento de Bacillus subtilis (a) y Bacillus mojavensis (b) en caldo nutritivo. Cultivo bacteriano a una temperatura de 28 ± 2 °C en agitación a 150 rpm.
b
a b
Tiempo (horas)
0 5 10 15 20 25 30 35
Densid
ad ó
ptica (590 n
m)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
Tiempo (horas)
0 5 10 15 20 25 30 35
Densid
ad ó
ptica (590 n
m)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
a
b
39
Bacillus thuringiensis en medio caldo nutritivo inició su fase lag o de adaptación de las
cero a las cuatro horas, la fase logarítmica va de las cuatro a las 12 horas, la fase
estacionaria va de las 12 hasta las 25 horas, su fase de declinación va de las 25 horas en
adelante (Fig. 5a).
Lysinibacillus sphaericus en medio caldo nutritivo inició su fase lag o de adaptación de las
cero a cuatro horas, la fase logarítmica va de las cuatro a 13 horas, la fase estacionaria va
de los 13 a las 24 horas, su fase de declinación va de las 26 horas en adelante (Fig. 5b).
Figura 5. Cinética de crecimiento Bacillus thuringiensis (a) y Lysinibacillus sphaericus (b) en caldo nutritivo. Cultivo bacteriano a una temperatura de 28 ± 2 °C en agitación a 150 rpm.
Tiempo (horas)
0 5 10 15 20 25 30 35
Densid
ad ó
ptica (590 n
m)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
Tiempo (horas)
0 5 10 15 20 25 30 35
Densid
ad ó
ptica (590 n
m)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
a b
40
5.2 Cinéticas de crecimiento y observación de cristales de Bacillus thuringiensis y
Lysnibacillus sphaericus en medio caldo nutritivo más extracto de levadura
suplementado con sales
Se obtuvieron las cinéticas de crecimiento de los B. thuringiensis y L. sphaericus para
conocer la fases crecimiento y observación de producción de cristales. Bacillus
thuringiensis inicia su fase lag o de adaptación de las cero a las cuatro horas, la fase
logarítmica va de las cuatro a las 13 horas, la fase estacionaria va de las 13 hasta las 26
horas, su fase de declinación va de las 26 horas en adelante (Fig. 6a).
Lysinibacillus sphaericus inicia su fase lag o de adaptación de las cero a las cuatro horas,
la fase logarítmica o exponencial va de las cuatro a las 16 horas, la fase estacionaria va
de las 16 hasta las 32 horas, su fase de declinación va de las 32 horas en adelante (Fig.
6b).
Figura 6. Cinética de Bacillus thuringiensis (a) y Lysinibacillus sphaericus (b) en medio caldo nutritivo más extracto de levadura y suplementado con sales. Cultivo bacteriano a una temperatura de 28 ± 2 °C en agitación a 150 rpm.
a
Tiempo (horas)
0 5 10 15 20 25 30 35
Densid
ad ó
ptica (590 n
m)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
Tiempo (horas)
0 5 10 15 20 25 30 35
Densid
ad ó
ptica (590 n
m)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
a b
41
La producción de cristales en ambas bacterias fue observada en la fase logarítmica, se
apreció una fuerte tinción con cristal violeta en las células bacterianas en la hora 16 de
crecimiento de las bacterias B. thuringiensis y L. sphaericus (Fig. 7).
d
a b
f
c
d e
Figura 7. Observación de cristales de Bacillus thuringiensis mediante tinción con
cristal violeta. (a) 12 h, (b) 16 h, (c) 20 h y Lysinibacillus sphaericus (d) 12 h, (e) 16
h, (f) 20 h. (100X).
42
5.3 Evaluación del efecto de bacterias rizosféricas en el crecimiento micelial de
Fusarium verticillioides en cultivo dual (bacteria crecida en agar nutritivo)
El antagonismo fue observado debido a la capacidad de las cepas bacterianas para
impedir un crecimiento radial normal del hongo hacia la ubicación de la bacteria. La
inhibición del crecimiento del hongo por el efecto antagónico de los bacilos impidió el
crecimiento radial del micelio, por lo que los tratamientos no lograron cubrir la superficie
total de la caja Petri en comparación con el testigo. Dentro de las bacterias rizosféricas en
cultivo dual con el hongo Fusarium verticillioides, fue Lysinibacillus sphaericus el que
causó mayor porcentaje de inhibición de crecimiento micelial (Cuadro 8). Además se
observó que en algunos de los tratamientos el micelio cambió de color con respecto al
testigo (Fig. 8).
Cuadro 8. Efecto antifúngico in vitro de bacterias rizosféricas crecidas en agar nutritivo sobre el crecimiento micelial de Fusarium verticillioides
Tratamiento Crecimiento micelial (mm) % inhibición micelial
Testigo 85.31 ± 0.54 a 0
B. subtilis 43.04 ± 3.46 c 50
B. mojavensis 39.89 ± 1.74 c 54
B. thuringiensis 63.98 ± 3.71 b 26
L. sphaericus 38.79 ± 4.68 c 55
ANOVA de una vía, con una F= 199.65; g.l. 4, 5; P ≤ 0.001. Comparación de medias por el método Holm-Sidak alpha= 0.05. Letras diferentes entre columnas indican diferencias estadísticas significativas.
43
B. subtilis inhibió el crecimiento micelial del hongo F. verticillioides en un 50 % (Cuadro 8).
El crecimiento micelial en el tratamiento fue de forma cuadrada, con aspecto algodonoso y
de color blanquecino en el centro y en menor intensidad hacia los bordes. El testigo
presentó un crecimiento radial micelial y con un color blanquecino y algodonoso uniforme
(Fig. 8).
B. mojavensis inhibió el crecimiento micelial del hongo Fusarium verticillioides en un 54 %
(Cuadro 8). El crecimiento micelial en el tratamiento fue de forma cuadrada, con aspecto
algodonoso en el centro y menos en su periferia, el color del micelio fue más blanquecino
que el testigo (Fig. 9).
a b
Figura 8. Cultivo dual de Bacillus subtilis y Fusarium verticillioides (a)
Testigo, (b) Tratamiento. Incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C.
durante siete días.
44
B. thuringiensis inhibió el crecimiento micelial del hongo Fusarium verticillioides en un 26
% (Cuadro 8). El crecimiento micelial en el tratamiento fue de forma cuadrada, con
aspecto algodonoso en el centro y un poco menos en su periferia y menos denso, el color
fue más blanquecino al del testigo (Fig. 10).
Figura 9. Cultivo dual de Bacillus mojavensis y Fusarium verticillioides
(a) Testigo, (b) Tratamiento. Incubadas a una temperatura de 28 ± 2
°C durante siete días.
b
a
Figura 10. Cultivo dual de Bacillus thuringiensis y Fusarium
verticillioides (a) Testigo, (b) tratamiento. Incubadas a una
temperatura de 28 ± 2 °C durante siete días.
b
a
45
Lysinibacillus sphaericus inhibió el crecimiento micelial del hongo Fusarium verticillioides
del 55 % (Cuadro 8). El crecimiento micelial en el tratamiento fue de forma radial, con
aspecto algodonoso y con una amplia distancia entre la bacteria y con un color
ligeramente menos intenso que el testigo (Fig. 11).
5.4 Evaluación del efecto de bacterias rizosféricas en el crecimiento micelial de
Fusarium verticillioides en cultivo dual (bacteria crecida caldo nutritivo)
El antagonismo fue observado debido a la capacidad de las cepas bacterianas para
impedir un crecimiento radial normal del hongo hacia la ubicación de la bacteria. La
inhibición del crecimiento del hongo por el efecto antagónico de los bacilos impidió el
crecimiento radial del micelio, por lo que los tratamientos no lograron cubrir la superficie
total de la caja Petri en comparación con el testigo. Dentro de las bacterias probadas en
cultivo dual con el hongo Fusarium verticillioides fueron Bacillus mojavensis, Bacillus
subtilis y Lysinibacillus sphaericus los que causaron el mayor porcentaje de inhibición de
Figura 11. Cultivo dual de Lysinibacillus sphaericus y Fusarium verticillioides
(a) Testigo, (b) Tratamiento. Incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C durante
siete días.
b
a
46
crecimiento micelial a las 12 y 24 horas sin presentar diferencia significativa entre ellos
(Cuadros 9 y 10). Además se observó que en algunos de los tratamientos el micelio
cambió de color con respecto al testigo.
Cuadro 9. Efecto antifúngico in vitro de bacterias rizosféricas crecida en caldo nutritivo (12 horas) sobre el crecimiento micelial de Fusarium verticillioides
Tratamiento Crecimiento micelial (mm) % inhibicion micelial
Testigo 85.43 ± 0.74 c 0
Bacillus subtilis 52.57 ± 2.46 a 38.5
Bacillus mojavensis 50.92 ± 2.48 a 40.4
Bacillus thuringiensis 62.03 ± 7.04 b 27.4
Lysinibacillus sphaericus 51.67 ± 4.11 a 39.6
ANOVA de una vía, con una F= 81.021; g.l. 4, 5; P ≤ 0.001. Comparación de medias por el método Holm-Sidak, alpha= 0.05. Letras diferentes entre columnas indican diferencias estadísticas significativas.
Cuadro 10. Efecto antifúngico in vitro de bacterias rizosféricas crecidas en caldo nutritivo (24 horas) sobre el crecimiento micelial de Fusarium verticillioides
Tratamiento Crecimiento micelial (mm) % inhibicion micelial
Testigo 85.43 ± 0.74 a 0
Bacillus subtilis 47.68 ± 3.57 c 44.2
Bacillus mojavensis 48.78 ± 4.58 c 43
Bacillus thuringiensis 61.18 ± 3.15 b 28.4
Lysinibacillus sphaericus 50.08 ± 2.90 c 41.4
ANOVA de una vía, con una F= 144.25; g.l. 4, 5; P ≤ 0.001. Comparación de medias por el método Holm-Sidak, alpha= 0.05. Letras diferentes entre columnas indican diferencias estadísticas significativas.
47
B. subtilis inhibió el crecimiento micelial del hongo F. verticillioides en un 38.5 % en el
tratamiento de cultivo bacteriano de 12 horas (Cuadro 9) y un 44.2 % en el tratamiento de
cultivo bacteriano de 24 horas (Cuadro 10). El crecimiento micelial en ambos tratamientos
fue de forma cuadrada y sin espaciamiento entre este y el crecimiento bacteriano, sin
embargo en el tratamiento de 12 horas el micelio se observó más algodonoso que
tratamiento 24 horas, mientras que el color del micelio fue más blanquecino en ambos
tratamientos y similar al del testigo (Fig. 12).
B. mojavensis inhibió el crecimiento micelial del hongo F. verticillioides en un 40.4 % en el
tratamiento de cultivo bacteriano de 12 horas (Cuadro 9) y un 43 % en el tratamiento de
cultivo bacteriano de 24 horas (Cuadro 10). El crecimiento micelial en ambos tratamientos
fue de forma cuadrada irregular y sin margen de limitación entre el crecimiento bacteriano,
sin embargo en el tratamiento de 24 horas el micelio se observó más algodonoso que el
Figura 12. Bacillus subtilis (a) Testigo, (b) Tratamiento en fase exponencial (12 h), (c)
Tratamiento en fase estacionaria (24 h). Incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C durante
siete días.
a
c
b
48
tratamiento a las 12 horas, mientras que el color del micelio fue blanquecino en ambos
casos muy similares al del testigo (Fig. 13).
B. thuringiensis inhibió el crecimiento micelial del hongo F. verticillioides en un 27.4 % en
el tratamiento de cultivo bacteriano de 12 horas (Cuadro 9) y un 28.4 % en el tratamiento
de cultivo bacteriano de 24 horas (Cuadro 10). El crecimiento micelial en ambos
tratamientos fue de forma casi radial sin espaciamiento entre este y el crecimiento
bacteriano, el aspecto poco algodonoso fue el mismo para ambos casos, mientras que el
color blanquecino de los tratamientos fue similar al del testigo (Fig. 14).
Figura 13. Bacillus mojavensis (a) Testigo, (b) Tratamiento en fase exponencial (12
h), (c) Tratamiento en fase estacionaria (24 h). Incubadas a una temperatura de 28 ±
2 °C durante siete días.
c b a
Figura 14. Bacillus thuringiensis (a) Testigo, (b) Tratamiento en fase exponencial (12
h), (c) Tratamiento en fase estacionaria (24 h). Incubadas a una temperatura de 28 ±
2 °C durante siete días.
c b a
49
L. sphaericus inhibió el crecimiento micelial del hongo F. verticillioides en un 39.6 % en el
tratamiento de cultivo bacteriano de 12 horas (Cuadro 9) y un 41.4 % en el tratamiento de
cultivo bacteriano de 24 horas (Cuadro10). El crecimiento micelial en ambos tratamientos
fue de forma cuadrada, en el tratamiento de 12 horas se observó que el micelio invadió
parte del cultivo bacteriano, el aspecto algodonoso fue el mismo para ambos casos,
mientras que el color blanquecino del micelio de los tratamientos fue muy similar al del
testigo (Fig. 15).
5.5 Efecto de bacterias rizosféricas sobre la morfología hifal de Fusarium
verticillioides
El efecto de los bacterias rizosféricas sobre la morfología hifal de F. verticillioides fue
observada a los siete y 14 días, mostrando que todos los tratamientos causaron
aparentes anormalidades en hinchamientos, rugosidad y cambio en el contenido celular
con respecto a las hifas del testigo.
Figura 15. Lysinibacillus sphaericus. (a) Testigo, (b) Tratamiento en fase exponencial
(12 h), (c) Tratamiento en fase estacionaria (24 h). Incubadas a una temperatura de 28
± 2 °C durante siete días.
c b a
50
B. subtilis provocó anormalidades en las hifas a partir de los siete días, algunas de las
observaciones fueron aparentes hinchamientos y un crecimiento rugoso (Fig. 16), a los 14
días se observó micelio con aparente pérdida de contenido celular e hifas menos
hinchadas (Fig. 17).
b a
Figura 16. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los siete días (40X). (a) Testigo, (b) Tratamiento Bacillus subtilis en cultivo dual incubado a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
b a
Figura 17. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (40X). (a) Testigo, (b) Tratamiento Bacillus subtilis en cultivo dual a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
51
B. mojavensis provocó anormalidades en las hifas con respecto al testigo. A partir de los
siete días se observó aparentemente un mayor grosor y crecimiento ligeramente rugoso
(Fig. 18), a los 14 días se observaron hifas con septos más cortos aparentemente y de
mayor grosor, además de una tinción no uniforme que podría indicar pérdida de contenido
celular (Fig. 19).
Figura 18. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los siete días (40X). (a) Testigo, (b) Tratamiento Bacillus mojavensis en cultivo dual a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
b a
Figura 19. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (40X). (a) Testigo a las 14 días (b) Tratamiento Bacillus mojavensis en cultivo dual a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
a b
52
B. thuringiensis provocó anormalidades en las hifas con respecto al testigo. A partir de
los siete días las observaciones fueron aparentemente septos más cortos, con un mayor
grosor y un crecimiento ligeramente rugoso (Fig. 20), a los 14 días se observaron hifas
aparentemente sin engrosamiento, ligeramente rugosas y sin pérdida de contenido celular
(Fig. 21).
b a
Figura 20. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los siete días (40X). (a) Testigo, (b) Tratamiento Bacillus thuringiensis en cultivo dual a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
Figura 21. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (40X). (a) Testigo, (b) Tratamiento Bacillus thuringiensis en cultivo dual a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
a b
53
L. sphaericus provocó anormalidades en las hifas con respecto al testigo. A partir de los
siete días las observaciones fueron aparente engrosamiento de los septos y con
hinchamientos en la parte central de cada septo, un crecimiento rugoso y con aparente
pérdida de contenido celular (Fig. 22), a los 14 días se observan hifas con una fuerte
deformación, sin septos definidos y con una mayor pérdida de contenido celular (Fig. 23).
b a
Figura 22. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los siete días (40X). (a) Testigo (b) Tratamiento Lysinibacillus sphaericus en cultivo dual a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
b a
Figura 23. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (40X). (a) Testigo, (b) Tratamiento Lysinibacillus sphaericus en cultivo dual a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.
54
De forma general, las observaciones de la morfología hifal de F. verticillioides a los 14
días de incubación por efecto de todas las bacterias rizosféricas estudiadas se muestra en
la Fig. 24. En la que se aprecia una gran cantidad de hifas con anormalidades causadas
por las bacterias rizosféricas tales como aparentes hinchamientos, rugosidad y una tinción
no uniforme que puede deberse a una pérdida en el contenido celular.
Figura 24. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (20X). (a) Testigo, (b) Bacillus subtilis, (c) Bacillus mojavensis, (d) Bacillus thuringiensis, (e) Lysinibacillus sphaericus. Incubación a una temperatura de 28 ± 2 °C.
e d
c
a
b a
55
5.6 Evaluación de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus sobre la
mortalidad de Leptoglossus zonatus
La aplicación de las bacterias B. thuringiensis y L. sphaericus no mostraron tener efecto
sobre la mortalidad de la ninfa 4 de L. zonatus, de acuerdo al análisis estadístico no hay
diferencia significativa entre los tratamientos y el testigo como se muestra en el Cuadro
11.
5.7 Evaluación del efecto biológico de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus
sphaericus en el peso de la ninfa 4 a ninfa 5 de Leptoglossus zonatus
La aplicación de las bacterias B. thuringiensis y L. sphaericus no mostraron tener efecto
sobre el peso de la ninfa 4 a ninfa 5 de L. zonatus. De acuerdo a la comparación de pesos
por grupo de ninfas con los tratamientos y el testigo no hubo diferencias significativas
(Cuadro 11).
Además, se dió seguimiento del ciclo de vida de las ninfas hasta su estado adulto. Éstas
continuaron mudando hasta su estado adulto y se reprodujeron generando huevecillos
fértiles.
Cuadro 11. Efecto de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus sobre la
mortalidad y peso (ninfa 4 a ninfa 5) de Leptoglossus zonatus
Tratamiento €Mortalidad (%) ¥Peso N4 a N5 (mg)
ANOVA
Testigo 33.33 a 50.168 ± 18.807 a
Bacillus thuringiensis 46.66 a 42.612 ± 12.048 a
Lysinibacillus sphaericus 36.66 a 44.021 ± 17.212 a
€ Chi cuadrada. ¥ ANOVA de una vía, con una F= 1.075; g.l. 2, 30; P = 0.349. Comparación de medias por el método Holm-Sidak, alpha= 0.05. Letras iguales en la misma columna indican que no hay diferencias significativas.
56
6. DISCUSIÓN
Se obtuvieron las diferentes fases de crecimiento de las bacterias rizosféricas (Bacillus
subtilis, Bacillus mojavensis, Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus) en medio
caldo nutritivo. Diversos metabolitos son producidos en cada una de las fases de
crecimiento y probablemente están relacionados al control de fitopatógenos e insectos
plaga. Además, se obtuvieron las cinéticas de crecimiento de las bacterias Bacillus
thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus en medio caldo nutritivo más extracto de levadura
suplementado con sales (CaCl, MnCl y MgCl) y se determinó que estas bacterias
producen una gran cantidad de cristales proteicos (toxinas) en su fase logarítmica.
Los resultados obtenidos en este estudio demostraron que B. subtilis, B. mojavensis, B.
thuringiensis y L. sphaericus tienen actividad antagonista contra el hongo Fusarium
verticillioides. Estas especies bacterianas inhibieron el crecimiento micelial y afectaron la
morfología hifal de este hongo fitopatógeno. Se ha demostrado que las semillas de J.
curcas son propensas al ataque de diversos hongos fitopatógenos durante su
almacenamiento, que ocasionan degradación de los ácidos grasos, proteínas y por lo
tanto pérdida de la calidad de las semillas. En particular, F. verticillioides se ha reportado
que disminuye la cantidad de lípidos, contenido de ácidos grasos libres y la viabilidad de
las semillas (Worang et al. 2008, Dharmaputra et al. 2009). Es importante disponer de
antagonistas bacterianos para el manejo de F. verticillioides, en trabajos previos se
demostró que diversas rizobacterias son antagonistas de varios géneros de hongos
fitopatógenos tales como Curvularia, Fusarium, Rizoctonia, entre otros (Liu et al. 2007,
Mojíca-Marín et al. 2009, Bacon et al. 2012, Kadyan 2013). En particular, en la rizosfera
57
de J. curcas se han aislado bacterias del género Enterobacter que producen sideróforos
(Kumar et al. 2011).
Cabe señalar, que las cepas empleadas en esta investigación fueron obtenidas de la
rizosfera de J. curcas en una plantación de Morelos, México. Trabajos previos
demostraron que B. subtilis, B. mojavensis y B. thuringiensis tienen un efecto antifúngico
in vitro en la inhibición del crecimiento micelial de hongos fitopatógenos como Fusarium
equiseti y Curvularia lunata, además se realizaron trabajos para conocer algunos de los
mecanismos de acción dentro de su actividad antagonista, algunos de estos fueron
producción de sideróforos, ácido cianhídrico, enzimas líticas, compuestos difusibles y
volátiles (Toledo 2013).
En algunos estudios realizados en la India se aisló B. subtilis de la rizosfera de J. curcas
y se demostró que en condiciones de campo inhibió al hongo fitopatógeno Lasiodiplodia
theobromae (Latha et al. 2011). Por otra parte, se conoce que B. mojavensis produce
proteasas, sideróforos y compuestos volátiles que inhiben el crecimiento micelial de F.
verticillioides (Bacon y Hinton 2002, Bacon et al. 2012). B. mojavensis posee un
mecanismo antagonista complejo aún no conocido por completo, donde además de
producir los compuestos mencionados anteriormente se relaciona la producción de
surfactinas con la actividad antifúngica de este microorganismo (Bacon et al. 2012).
En el presente estudio se evaluó el efecto de bacterias rizosféricas sobre la morfología
hifal de F. verticillioides. En base a los estudios de microscopía realizados, se observó
que la morfología de las hifas fue afectada aparentemente en grosor, hinchamientos,
rugosidad y probablemente salida de material celular debido a que se observaron algunas
hifas prácticamente vacías. Trabajos realizados con bacterias rizosféricas han
58
demostrado tener efecto en la morfología de C. lunata (Basha y Ulaganathan 2002). En
este trabajo se demostró que Bacillus sp. presentó actividad antagonista contra el hongo
F. verticillioides y que afecta en diferentes grados de daño a su morfología hifal.
Bacillus thuringiensis que también inhibió el crecimiento micelial del hongo F. verticillioides
produce enzimas líticas como proteasas y quitinasas, además de tener la capacidad de
producir compuestos volátiles (Toledo 2013), lo que le proporciona una actividad
antagonista contra algunos hongos fitopatógenos como Rhizoctonia solani y Fusarium
oxysporum (Mojíca-Marín et al. 2009, Reyes-Ramírez et al. 2004, Gomaa 2012). Por otro
lado, esta bacteria ha sido ampliamente utilizada en el control de plagas insectiles debido
a la presencia de genes cry que se relacionan con la producción de cristales y que
particularmente le permiten tener un efecto entomopatógeno (Carreras 2011). De igual
forma se ha demostrado una actividad entomopatógena por un mecanismo similar para L.
sphaericus. En este estudio se observó la presencia de cristales proteicos mediante las
tinciones realizadas.
Reportes anteriores mencionaron que esta especie de bacteria producen sideróforos
(Kadyan et al. 2013). Además de tener la capacidad de producir toxinas que provocan un
efecto entomopatógeno en contra de algunos insectos del orden Diptera, Lepidoptera y
Blattodea (Singh et al. 1999, Centinkaya et al. 2002, Nishiwaki et al. 2007). Este el primer
trabajo en evaluar la actividad entomopatógena de las bacterias B. thuringensis y L.
sphaericus sobre un insecto del orden Hemíptera en este caso particular sobre L. zonatus,
ya que hasta la fecha no existen reportes de trabajos realizados de bacterias
entomopatógenas contra hemípteros.
59
En este trabajo se realizaron pruebas para determinar si las bacterias B. thuringiensis y L.
sphaericus presentan actividad entomopatógena sobre L. zonatus, ya que se ha
demostrado en diversos estudios para especies de insectos de diferente orden que estas
bacterias son capaces de producir toxinas en forma de cristal, por lo que se realizaron
cinéticas de crecimiento en medio específico para la producción de cristales y que tienen
efecto sobre especies de insectos de diversos ordenes tales como Lepidoptera, Diptera y
Coleoptera. Sin embargo, cabe mencionar que no hay una metodología establecida para
aplicaciones de bacterias entomopatógenas contra insectos hemípteros.
En la literatura no existen estudios que reporten el control de chinches mediante la
aplicación de Bacillus thuringiensis. Se considera que las chinches son insectos
chupadores que se alimentan con fluidos internos de los tejidos de las plantas por lo que
las proteínas insecticidas de B. thuringiensis no interaccionan con su tracto digestivo. Sin
embargo, recientemente se ha logrado expresar en plantas transgénicas de algodón, una
proteína insecticida de 35 kDa de B. thuringiensis la cual afecta la sobrevivencia y el
desarrollo de la chinche Lygus hesperus (Baum et al. 2012). Lo anterior significa que
pueden existir proteínas insecticidas contra chinches pero se tiene que investigar la
manera para que estas proteínas puedan interaccionar con el tracto digestivo de las
chinches.
Otra de las razones por las cuales no se obtuvo efecto podría ser porque la mayoría de
las bacterias entomopatógenas invaden a sus hospederos al ser ingeridas las esporas
proteicas tóxicas, éstas se insertan en las membranas del intestino medio, aumentando la
conductividad del potasio de las membranas apicales de las células columnares en donde
se lleva a cabo la ruptura de los gradientes eléctricos de potasio y aumentando el pH. En
la mayoría de los estudios sobre esta actividad entomopatógena de las bacterias han
60
sido probadas sobre insectos con un tipo de metamorfosis completa u holometábola,
corroborándose su efectividad en la etapa larval. Sin embargo, el sistema digestivo de los
hemípteros es inusual entre los insectos en diferentes aspectos: ciertas enzimas
digestivas hidrolíticas, tales como la tripsina, están ausentes además de que el intestino
medio carece de membrana peritrófica. Estas características reflejan el tipo de dieta
líquida y el modo de alimentación por absorción sujeto a restricciones evolutivas y que se
ve reflejada en la diferencia de dieta, modo de alimentación, biología y bioquímica
digestiva de insectos masticadores de hojas y los hemípteros que se alimentan de fluidos
(Stockhoff y Conlan 2003). Por lo tanto es importante incursionar en trabajos posteriores
en buscar la forma de proporcionarles las bacterias a estos insectos de una manera
efectiva.
61
7. CONCLUSIONES
Se establecieron las cinéticas y se determinaron las fases de crecimiento de las
bacterias rizosféricas B. subtilis, B. mojavensis, B. thuringiensis y L. sphaericus.
Las bacterias rizosféricas estudiadas inhibieron el crecimiento micelial de F.
verticillioides; el mayor efecto lo causaron B. subtilis, B. mojavensis y L.
sphaericus.
Todas las bacterias rizosféricas afectaron la morfología de las hifas de F.
verticillioides caracterizada por formas anormales, aparente ensanchamiento y
rugosidad.
Las bacterias rizosféricas presentaron actividad antagonista contra F. verticillioides
con independencia del medio de cultivo empleado y de las fases de crecimiento
probadas.
B. thuringiensis y L. sphaericus no afectaron la mortalidad ni el peso de L.
zonatus.
En general, las bacterias rizosféricas evidenciaron actividad antagonista contra F.
verticillioides y no tuvieron actividad entomopatógena contra L. zonatus.
62
8. LITERATURA CITADA
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