INSTITUTO POLITECNICO NACIONALESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS

DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGIA

INFORME FINAL PROYECTO SIP-20070610“La macropinocitosis como vía de entrada de las

micobacterias a las células endoteliales”

DIRECTOR: DRA. BLANCA ESTELA GARCIA PEREZ

RESUMEN

Mycobacterium tuberculosis (MTB) es un patógeno intracelular y es el agente

causal de la tuberculosis, que invade inicialmente a los macrófagos alveolares.

Esto ya es un hecho bien estudiado, sin embargo, cada vez es más evidente

que otras estirpes celulares de tipo no fagocítico tienen una participación

relevante en la etiopatogénesis de la enfermedad. Estudios previos de nuestro

grupo de trabajo han demostrado que diversas líneas celulares de naturaleza

no fagocítica (fibroblastos, células epiteliales, linfocitos B, osteoblastos), se

infectan con diversas especies micobacterianas. Por lo tanto, en este trabajo se

abordó el estudio básico de la infección de tuberculosis en un tipo de células no

fagocíticas (cultivos primarios de células endoteliales de cordón umbilical

humano, HUVEC) con el fin de conocer si las células endoteliales pueden ser

también infectadas con micobacterias y de igual manera analizar uno de los

mecanismos de defensa innata que exhiben estas células como respuesta a la

infección: producción de óxido nítrico (NO). Esto se llevó a cabo infectando a

las HUVEC con tres cepas de micobacterias de diferente virulencia:

Mycobacterium smegmatis (no tuberculosa, no patógena), M. abscessus (no

tuberculosa, patógena) y Mycobacterium tuberculosis H37Rv (patógena),

estudiando las características de la interiorización de las micobacterias y la

capacidad de multiplicación intracelular de las mismas en las HUVEC, así como

la observación in situ de la producción de óxido nítrico (NO) por las HUVEC

por microscopia de fluorescencia y su cuantificación mediante el método

colorimétrico de Greiss. Los ensayos de interiorización y multiplicación

intracelular demostraron que las tres cepas de micobacterias son capaces de

infectar a las HUVEC pero de manera diferencial siendo M. smegmatis la que

mostró la menor capacidad infectiva siendo eliminada eficientemente por las

células; M. abscessus mostró la mayor eficiencia de infección y multiplicación

intracelular y por último la infección por M. tuberculosis no la resuelven ya que

no se multiplicó intracelularmente y tampoco fue eliminada por las HUVEC

manteniéndose viable durante todo el tiempo de observación. Por este último

punto, se podría especular que las HUVEC podrían estar actuando como

hospederas de MTB ya sea creciendo activamente, o como reservorio de estas

bacterias en estado de latencia. En cuanto a la producción de NO por las

HUVEC, se observó que lo producen igualmente de manera diferencial siendo

M. smegmatis la que indujo una producción discreta y sostenida de NO durante

todo el tiempo de infección, M. abscessus indujo la mayor producción de NO la

cual alcanzó un máximo que cesó rápidamente y por último M. tuberculosis

presentó un patrón similar de producción de NO inducido por M. abscessus,

aunque fue más tardío el pico máximo de producción de NO. La inducción

temprana de NO y su pronta disminución parece ser una característica

distintiva de las micobacterias patógenas. Esta evidencia sugiere que la

modulación ejercida por la micobacteria sobre los mecanismos bacterianos de

eliminación exhibidos por las células no fagocíticas repercute en su

sobrevivencia o en su eliminación intracelular y así mismo se podrían entender

algunos de los mecanismos de evasión que la micobacteria exhibe para

modular o interferir con algunos procesos de eliminación bacteriana con los que

cuentan las células no fagocíticas y que a la fecha no han sido bien

reconocidos.

INTRODUCCIÓN

TUBERCULOSIS

La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecto-contagiosa causada por

diversas especies del género Mycobacterium, todas ellas pertenecientes al

Complejo Mycobacterium tuberculosis. La especie más importante y

representativa es Mycobacterium tuberculosis o bacilo de Koch. La TB es la

segunda enfermedad infecciosa mas prevalente en el mundo.

En 1999 la OMS cifró en 3.689.833 nuevos casos de tuberculosis en el

mundo, aunque este organismo cifró en 8.500.000 casos totales con una tasa

global de 141/100.000 habitantes. En el informe de la OMS del año 2003, se

estima en 8 millones (140/100.000) de nuevos casos de TB. La tuberculosis

mantiene una prevalencia de 245/100.000 habitantes, y una tasa de

mortalidad de 28/100.000. En el informe de la OMS del año 2006, se calcula

que 1,6 millones de personas murieron por tuberculosis en 2005. La

tendencia epidemiológica de la incidencia de TB sigue aumentando en el

mundo, pero la tasa de mortalidad y prevalencia están disminuyendo. La

infección ataca preferentemente a los pulmones, pero puede también

enfermar a otros órganos como lo son los riñones, el hígado, la piel,

meninges, etcétera. Es más grave en los niños y ancianos, siendo los

pacientes que mayor mortalidad presentan (OMS, 2006).

La TB se trasmite a través de partículas expelidas con la tos, estornudo,

hablando, etcétera. De esta manera, el bacilo inhalado es fagocitado por los

macrófagos alveolares. En un 30% de los casos, estos macrófagos son

incapaces de destruirlo. Entonces se genera la infección, que se caracteriza

por el crecimiento en el interior de los macrófagos infectados. Ello es debido a

que el bacilo es capaz de frenar la unión fago-lisosoma entre otros mecanismos

de evasión (Comstock, 1994). Histopatológicamente, en el foco de infección se

genera un granuloma, que se caracteriza por la presencia de tejido necrótico

intragranulomatoso y que se estructura finalmente con la adquisición de la

repuesta inmune específica. Con la inmunidad, los macrófagos infectados

pueden activarse y destruir el bacilo, de manera que se controla la infección.

Aunque la mayor parte de la investigación científica relacionada a la

tuberculosis se ha centrado en el estudio de los macrófagos como las células

principales en la respuesta inmune contra M. tuberculosis, reportes recientes

han dado relevancia a otras estirpes celulares como participantes importantes

en la patogénesis de la enfermedad.

CÉLULAS NO FAGOCÍTICAS Y TUBERCULOSIS

Hernández-Pando y col. (Hernández-Pando, 2000), buscando la presencia de

bacterias latentes en tejido pulmonar de individuos que murieron por causas

diferentes a la tuberculosis, describieron la presencia de DNA micobacteriano

en macrófagos alveolares e intersticiales, así mismo encontraron el mismo

material genético en células de tipo no fagocítico como son los neumocitos tipo

II (células epiteliales), células endoteliales y fibroblastos pulmonares;

observaciones similares se encontraron en ratones con tuberculosis latente

(Arriaga et al. 2002).

La interacción de M. tuberculosis con células del epitelio respiratorio fue

descrito primeramente por Bermúdez y Goodman, los cuales utilizando como

modelo la línea celular A549, demostraron la capacidad de la micobacteria para

infectar y replicarse dentro de estas células (Bermúdez, 1996).

De acuerdo con estos hallazgos se puede inferir que en la infección

micobacteriana, las células no fagocíticas (epiteliales, endoteliales, fibroblastos)

colaboran de manera importante en la respuesta inmune, contribuyendo quizá

en el establecimiento de poblaciones bacterianas persistentes o en el estado

de latencia.

MECANISMOS DE DESTRUCCIÓN

Cuando los patógenos invaden al huésped, la primera línea de defensa son

las reacciones de inmunidad innata, seguidas de la respuesta adaptativa

(Oppenheim et al. 2005). La inmunidad innata consiste en un amplio rango de

defensas de movilidad rápida preexistentes del huésped, las cuales incluyen

neutrófilos y macrófagos, células epiteliales, células cebadas, eosinófilos y

células asesinas naturales (Hoffmann et al. 1999; Medzhitov y Janeway,

1997).

Estas células expresan una amplia variedad de receptores de patrones de

reconocimiento, como son los receptores tipo toll (TLRs), receptores tipo

lectina C y receptores scanvenger, los cuales son activados por componentes

de patógenos microbianos. Esto deriva en la liberación y/o activación de

numerosas moléculas efectoras y mediadores de la respuesta del huésped

incluyendo la cascada de complemento, citocinas, quimiocinas, superóxidos,

óxido nítrico (NO), prostaglandinas, proteínas de fase aguda y péptidos

antimicrobianos (Oppenheim et al. 2005).

Destrucción a través de intermediarios reactivos del nitrógenoEl óxido nítrico era considerado un destacado mediador fisiológico, cuando se

demostró que era idéntico al factor de relajación derivado del endotelio, pero

se ha demostrado que ésta es sólo una de sus funciones ya que también

participa en los mecanismos de transducción, neurotransmisión, citotoxicidad y

de defensa (Barnes, 1993). Las diversas funciones del óxido nítrico son de

relevante importancia, sin embargo la presencia de la óxido nítrico sintasa

inducible (iNOS), dentro de la mayoría de las células, sobre todo en

macrófagos y neutrófilos humanos genera un papel de vital importancia como

un poderoso sistema antimicrobiano. La iNOS se expresa después de la

exposición a ciertas citocinas y endotoxinas, esta forma no requiere de la

calmodulina (Kwan, 1997). Los substratos para la producción de óxido nítrico

mediado por la NOS son el aminoácido arginina, el oxígeno molecular y la

NADPH oxidasa. Los cofactores que se requieren para la generación de NO

son la tetrahidrobiopterina, el dinuocleótido flavina adenina y el

mononucleótido flavina.

El mecanismo del NO puede operar contra microorganismos que invaden el

citosol; por lo tanto, no sorprende que la mayoría de las células no fagocíticas

que son infectadas estén dotadas de iNOS. La enzima se asemeja a la

NADPH oxidasa en su estructura y puede ser inhibida por el análogo de

arginina N- monometil- L- arginina (L- NMMA). Se forma por el rompimiento de

la L-arginina para dar NO y L-citrulina, esta reacción es catalizada por la

sintasa del óxido nítrico (NOS). La combinación de NO con anión superóxido

produce el muy tóxico radical peroxinitrito (ONOO), que se escinde al aceptar

un protón y forma moléculas reactivas como el radical hidroxilo (OH) y NO2. El

NO puede formar complejos mononucleares ditioldinitrosos, lo que trae como

consecuencia el agotamiento de los depósitos de hierro y la inhibición de

varias enzimas de los microorganismos (Roitt, 2001).

También el NO puede asociarse a daño de membranas y esta acción se ha

demostrado con el peroxinitrito. Este compuesto media la peroxidación lípidica

de las preparaciones liposomales a través de un mecanismo que no requiere

hierro. Un estudio mostró que el NO ejerce efectos inmunomoduladores sobre

la adherencia y función celular, la proliferación celular y la producción de

citocinas (Wei et al. 1995).

Además de que puede estar en forma inducible (iNOS o NOS2), también

puede estar presente de manera constitutiva (cNOS). La forma constitutiva se

expresa principalmente en células endoteliales (eNOS o NOS3) y en células

neuronales (nNOS) y depende de Ca2+ - Calmodulina. En el caso de la eNOS,

la enzima contiene sitios de unión para el grupo hemo y la calmodulina, que

son elementos indispensables para la actividad enzimática, además contiene

un motivo de unión del Zinc. Cada dímero de eNOS contiene un ión Zinc que

contribuye con la estabilización de la molécula dimérica (Govers and Rabelink,

2001). La eNOS se activa en respuesta a una gran variedad de estímulos, la

estimulación agonista de los receptores de las células endoteliales activa a

una o más isoformas de la Fosfolipasa C, con lo cual se incrementa la

formación del inositol-1,4,5-trifosfato. La elevación de este inositol incrementa

los niveles de Ca2+ intracelular y en consecuencia la activación de la eNOS a

través de interacción con Ca2+- Calmodulina. Sin embargo las interacciones

moleculares que regulan esta actividad son más complejas que una simple

unión reversible del Ca2+ a la calmodulina, ya que por ejemplo, la proteína de

choque térmico 90 (Hsp90) también parece ser un efector alostérico positivo

de la eNOS. Otros factores que contribuyen a la regulación de la actividad

enzimática de la eNOS son los efectores alostéricos negativos como la

caveolina-1, la cual interactúa con la eNOS e inhibe su actividad catalítica

(Govers et al, 2001).

Como se mencionó anteriormente, el NO es una molécula gaseosa que

participa en diferentes fenómenos biológicos, incluyendo la relajación del

músculo liso, la neurotransmisión, la homeostasis de los tejidos, los procesos

de aprendizaje y memoria y la inhibición de la agregación plaquetaria.

Además, ya es bien conocido que durante infecciones microbianas producidas

por casi todos los patógenos, incluyendo bacterias, virus, parásitos y hongos,

se producen grandes cantidades de NO como una medida de defensa (Nathan

et al. 1991, Umezawa et al. 1997, James, 1995).

En el caso de las infecciones ocasionadas por Mycobacterium, diferentes

especies de Mycobacterium han mostrado variaciones en cuanto a su

susceptibilidad al NO y a los intermediarios reactivos del nitrógeno. Se encontró

que la relativa resistencia in vitro de varias cepas de M. tuberculosis al nitrito de

sodio correlacionó con la virulencia de las cepas en los cobayos (O´Brien et al.

1994). También se demostró que el NO puede matar al bacilo de la

tuberculosis en una manera dependiente del tiempo y la concentración,

observándose una reducción de dos logaritmos en las UFC después de la

exposición de M. tuberculosis a 90 ppm de NO durante 48 h en donde la

máxima concentración de NO que se alcanza en la fase acuosa es

aproximadamente de 150 nM (Long et al. 1999). El NO es la única molécula

que puede matar in vitro al bacilo tuberculoso con una potencia molar

comparable a la de los quimioterapéuticos.

En el modelo murino de la tuberculosis, el NO participa importantemente en la

muerte del bacilo por las células mononucleares (Chan et al. 1995). La

administración intratraqueal de la cepa virulenta de M. tuberculosis a ratas

estimula la producción de NO por la activación de la iNOS en los macrófagos

alveolares. El papel protector del NO en la tuberculosis murina fue demostrado

por la cepa de ratones genéticamente modificada (iNOS -/-), en donde la

infección por M. tuberculosis se asoció con un riesgo significativamente

elevado de diseminación y mortalidad comparada con los ratones de la cepa

silvestre (C57BL/6). Comparando in vitro, la capacidad de los macrófagos

B10R (resistente) y B10S (susceptible) para inhibir la cepa H37Rv de M.

tuberculosis y la producción de NO en respuesta a la infección y al INF-γ,

encontraron que los macrófagos B10R produjeron altas cantidades de NO y los

B10S no (Arias et al. 1997).

También se demostró que la inhibición de M. tuberculosis por los macrófagos

B10R revirtió cuando se uso un inhibidor del NO (N(G)-monomethyl-L-arginine

(N(G)MMA) y se incrementó cuando la producción de NO se restauró usando

L-arginina. De esta manera se llegó a la conclusión de que el gene

Bcg/Nramp1 puede regular la resistencia o susceptibilidad a M. tuberculosis

por la capacidad diferencial de estas células para producir NO (Arias et al.

1997).

En un estudio realizado en monocitos de sangre periférica aislados de

pacientes con tuberculosis activa, mostraron un incremento en la expresión de

NOS2 y también un incremento espontáneo en la liberación de NO en el

medio de cultivo (Wang et al. 2001). Esto sugiere dos hipótesis en los

pacientes con tuberculosis activa. Primero, que la producción de NO se puede

incrementar con la finalidad de eliminar la infección, ya que grandes cantidades

de NO e intermediarios reactivos del nitrógeno producidos por los pacientes

pueden inhibir la proliferación de M. tuberculosis. Segundo, que la producción

de NO puede verse disminuida porque estos pacientes no pueden producir

apropiadamente NO en respuesta a la estimulación micobacteriana. Esto

significa que la tuberculosis puede desarrollarse en individuos que no pueden

inducir una respuesta inmune efectiva en respuesta al bacilo tuberculoso.

La mayor parte de los estudios que se han realizado con respecto a la

producción de NO y a su papel en la defensa contra M. tuberculosis, han sido

usando como modelo celular a las células fagocíticas (principalmente

macrófagos). Sin embargo, hay algunos trabajos que reportan que la

producción de NO también puede inducirse en células del epitelio pulmonar

infectadas con M. tuberculosis (Kwon et al. 1998). Otro estudio demostró que

las células A549 infectadas por M. tuberculosis producen niveles significativos

de NO y que expresan el RNAm de la iNOS hasta las 48 h de infección (Roy et

al. 2004).

Otras células en donde se ha estudiado la producción de NO, son las células

dendríticas y los macrófagos de ratones C57BL/6 con leishmaniasis cutánea

aguda en donde hubo un incremento en la actividad de la iNOS (Stenger et al.

1996).

De igual manera se demostró por técnicas histológicas e inmunológicas la alta

expresión de TNF-α, iNOS, IL-2 e INF-γ en los granulomas de animales con

infección experimental latente, y por PCR in situ demostraron que el DNA

micobacteriano se encontró preferentemente en los macrófagos alveolares e

intersticiales de los animales con infección latente, pero también se encontró

señal positiva en las células endoteliales y en los fibroblastos (Arriaga et al.

2002). Aunque se ha documentado de manera abundante la participación del NO

durante la infección micobacteriana en modelos murinos, su papel en la

tuberculosis humana aún es controversial.

Por todo lo mencionado anteriormente, las micobacterias tienen la capacidad

de infectar a células de naturaleza no fagocítica. La infección de estas estirpes

celulares podría favorecer el establecimiento de la infección micobacteriana

favoreciendo el estado de latencia de las micobacterias dentro de las células

epiteliales y esta capacidad podría estar directamente relacionada a la

patogenicidad de la micobacteria. La invasión de las micobacterias a células

epiteliales podría crear un ambiente favorable para la multiplicación bacteriana

y el establecimiento de la infección, evitando así el ambiente hostil de los

macrófagos. La importancia de las células no fagocíticas radica en que juegan

un papel muy importante en la tuberculosis debido a que pueden funcionar

como reservorios permitiendo la latencia de las micobacterias.

En conjunto estos resultados nos han llevado a plantear que las micobacterias

pueden modular los mecanismos de respuesta bactericida con los que cuentan

las células no fagocíticas para favorecer su sobrevida o su muerte intracelular.

Uno de los mecanismos de la respuesta inmune con los que cuentan las

células hospederas para controlar la replicación intracelular micobacteriana

está la producción de óxido nítrico y la producción de citocinas inflamatorias.

JUSTIFICACIÓN

Se ha demostrado que las micobacterias son interiorizadas a células de

naturaleza no fagocítica en líneas celulares por un proceso de macropinocitosis,

pero aun se desconoce el mecanismo de interiorización de las micobacterias en

cultivos primarios de células endoteliales humanas así como los mecanismos de

defensa ante la infección con las micobacterias. Por lo que en este trabajo se

decidió establecer y analizar las características de la infección de células

endoteliales con micobacterias de diferente virulencia así como la participación

de óxido nítrico en la probable eliminación de las mismas.

OBJETIVOS E HIPÓTESIS

Objetivo general

Caracterizar los eventos involucrados en la infección, multiplicación intracelular

y producción de oxido nítrico de cultivos primarios de células endoteliales

humanas infectadas con micobacterias de diferente virulencia.

Objetivos particulares

• Establecer las características de la interiorización de las micobacterias a

las células endoteliales humanas, mediante microscopía óptica.

• Determinar la capacidad de multiplicación intracelular de las

micobacterias en los cultivos primarios de células endoteliales.

• Observación in situ de la producción de óxido nítrico mediante

microscopia de fluorescencia (DAF).

• Cuantificar la producción de óxido nítrico mediante el método

colorimétrico de Greiss.

Hipótesis

Las micobacterias son interiorizadas por las células endoteliales humanas y

dependiendo de la virulencia de la micobacteria las especies patogénicas

sobrevivirán mientras que las no patogénicas serán eliminadas. La producción

de óxido nítrico por las células endoteliales será modulado de igual manera por

las diferentes micobacterias.

MATERIAL

A. Cultivo primario de células endoteliales humanas

Los cultivos primarios de células endoteliales humanas se obtuvieron a partir de

cordones umbilicales desechados de partos normales o cesáreas, los cuales se

colectaron al momento del alumbramiento. Una vez colectados los cordones, se

transportaron en condiciones asépticas y en frío al laboratorio de postgrado de

la Escuela Nacional de Medicina del IPN, en donde fueron procesados por el M.

en C. Israel Ramírez, quien amablemente nos donó las células, las cuales

obtuvo de la siguiente manera: cada cordón se pinzó por ambos extremos

después de agregarle una solución de tripisina al 0.125% en HBSS,

incubándose durante 15 min a 37º C. Una vez transcurrido este tiempo se

colectó el contenido del cordón y se agregó un volumen de 0.1 de suero fetal

bovino (SFB). Las células fueron cosechadas y centrifugadas a 2700 rpm

durante 15 min. Posteriormente el botón celular fue resuspendido en medio M-

199 suplementado con 10% de SFB. Dependiendo del experimento las células

se colocaron directamente en cajas de cultivo de 24 pozos o en cubreobjetos de

vidrio colocados sobre los pozos de dichas cajas, incubándose a 37º C en una

atmósfera con 5% de CO2. Una vez alcanzada la confluencia requerida, las

células se utilizaron en los diferentes ensayos. La pureza del cultivo celular se

estableció evaluando la morfología celular y la expresión del factor von

Willebrand mediante una técnica inmunohistoquímica. (Ramírez-Sánchez,

2005).

B. Cepas micobacterianas

Se utilizaron tres cepas micobacterianas con diferente virulencia, las cuales

fueron cultivadas en los medios convencionales para crecimiento

micobacteriano de la siguiente manera:

• Cepa H37Rv de Mycobacterium tuberculosis (MTB): fue obtenida y

cultivada hasta alcanzar la fase logarítmica en medio Middlebrook 7H9

adicionado con 10% de enriquecimiento OADC (ácido oleico, albúmina,

dextrosa y catalasa) y Tween 80.

• Micobacteria no tuberculosa: Mycobacterium smegmatis obtenida y

cultivada hasta alcanzar la fase logarítmica en medio Middlebrook 7H9

adicionado de Tween 80.

• Cepa de Mycobacterium abscessus: cultivada en medio Middlebrook 7H9

adicionado de Tween 80.

Para todos los ensayos las cepas bacterianas en fase logarítmica fueron

centrifugadas a 10,000 rpm por 5 min, los paquetes bacterianos fueron lavados

dos veces con HBSS. Después del último lavado, las micobacterias fueron

resuspendidas con HBSS y transferidas a tubos de vidrio de 13x100 estériles

para ser ajustadas al tubo No.1 del nefelómetro de Mc Farland. De estas

suspensiones se realizaron diluciones 1:5 para alcanzar una relación

bacteria:célula 10:1 aproximadamente.

MÉTODOS

1.- Ensayo de cinética de infección por microscopía óptica.

Monocapas de células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVEC)

preparadas en placas de 24 pozos con cubreobjetos de vidrio con una

confluencia del 90 al 100%, se lavaron tres veces con HBSS para eliminar las

células no adheridas. Las monocapas se infectaron con las cepas

micobacterianas ajustadas al tubo No. 1 del nefelómetro de Mc Farland y

posteriormente diluidas 1:5 en medio M.199 sin antibióticos y con 1% SFB,

alcanzando una relación bacteria:célula 10:1 aproximadamente. En otros

experimentos se prepararon suspensiones de levaduras de pan muertas por

calor resuspendidas en el medio M-199 adicionando 8 millones de levaduras

por pozo; este ensayo se realizó para establecer la capacidad endocítica de las

células endoteliales. Una vez adicionadas las suspensiones bacterianas (o de

levaduras), las células se incubaron a 37º C en una atmósfera con 5% de CO2,

y se siguió una cinética de 1h, 3h y hasta 6h de infección, continuando con

tiempos de post-infección de 24h, 48h y 72h. Transcurrido el tiempo de

incubación las monocapas se lavaron tres veces con HBSS para eliminar los

microorganismos no interiorizados y se les adicionó medio M-199

suplementado de 1% de SFB con amikacina a una concentración de 20 µg/ml

incubándose durante 1 h. Posteriormente se retiró el medio de cultivo y las

monocapas se lavaron una vez más con HBSS adicionándoles M-199

suplementado de 1% de SFB con amikacina a una concentración de 5 µg/ml,

incubándose nuevamente hasta que concluyera el tiempo post-infección

establecido. Al irse cumpliendo cada uno de los tiempos de post-infección, las

monocapas se lavaron una vez con HBSS y se retiraron los cubreobjetos con

las monocapas infectadas para fijarlas con metanol frío durante 30 min.

Posteriormente se tiñeron por la técnica de Ziehl-Neelsen como se describe en

el apéndice.

2.- Ensayo de multiplicación intracelular determinado por UFC.

Las monocapas de células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVEC)

preparadas en placas de 24 pozos con una confluencia del 90 al 100%, se

lavaron tres veces con HBSS para eliminar las células no adheridas. Las

monocapas se infectaron con las cepas micobacterianas ajustadas al tubo No.

1 del nefelómetro de Mc Farland y diluidas 1:5 en medio M-199 y se incubaron

a 37º C en una atmósfera con 5% de CO2. Se siguió una cinética de 1h, 3h y

hasta 6h de infección, continuando con tiempos de post-infección de 24h, 48h y

72h. Transcurrido el tiempo de incubación las monocapas se lavaron tres

veces con HBSS para eliminar las bacterias extracelulares y se les adicionó M-

199 suplementado de 1% de SFB con amikacina a una concentración de 20 µ

g/ml incubándose durante 1 h; posteriormente se retiró el medio y las

monocapas se lavaron una vez más adicionando 1 ml de medio M-199

suplementado de 1% de SFB con amikacina a una concentración de 5 µg/ml,

incubándose nuevamente hasta que concluyera el tiempo de post-infección

establecido. Al irse cumpliendo cada uno de los tiempos de post-infección, las

células se lavaron una vez con HBSS, posteriormente se lisaron con solución

de SDS al 0.25% por 5 min y se neutralizaron con albúmina sérica bovina

estéril al 5%, los lisados se congelaron hasta su siembra. Para determinar las

unidades formadoras de colonia, los lisados se sembraron en cajas de petri

conteniendo agar Middlebrook 7H11 con enriquecimiento OADC (Apéndice)

para el caso de M. tuberculosis, y sin OADC para el caso de M. smegmatis y

M. abscessus; 100 µl de los lisados diluidos 1:10 o 1:100 en HBSS, se

esparcieron homogéneamente en el agar Middlebrook, permitiendo que se

absorbiera a totalidad. Una vez sucedido esto, las placas se incubaron a 37º C

hasta obtener las unidades formadoras de colonias (UFC).

3.- Ensayo para la observación in situ de la producción de óxido nítrico mediante microscopía de fluorescencia.

Las monocapas de células endoteliales preparadas en placas de 24 pozos con

una confluencia del 70 al 80%, se lavaron tres veces con HBSS para eliminar

las células no adheridas. Las monocapas se refrigeraron durante 30 minutos

para sincronizar el metabolismo celular. Cumplido este tiempo, a cada pozo se

le adiciono 1ml de la solución de DAF (Diacetato de diaminofluoresceína) a

una concentración de 5Mm en HBSS, permitiendo la interiorización del reactivo

durante 1 h a 37º C en una atmósfera con 5% de CO2. Posteriormente las

monocapas se infectaron con las cepas micobacterianas, y se siguió una

cinética de infección de 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 75 min, 90 min, 105

min, 2h, 6h y 24h, observando en cada tiempo la emisión de fluorescencia en

un microscopio de fluorescencia invertido acoplado a una cámara fotográfica.

4.- Ensayo colorimétrico para la cuantificación del óxido nítrico por el método de Greiss.

Monocapas de células endoteliales de cordón umbilical humano preparadas en

placas de 24 pozos con una confluencia del 70 al 80%, se lavaron tres veces

con HBSS para eliminar las células no adheridas, posteriormente se

refrigeraron durante 30 minutos para sincronizar el metabolismo celular.

Cumplido este tiempo, se infectaron con las cepas micobacterianas ajustadas

al tubo No. 1 del nefelómetro de Mc Farland y diluido 1:5 en HBSS, y se realizó

una cinética de infección de 40, 90 y 240 min, al irse cumpliendo cada uno de

los tiempos de infección, se colectaron los sobrenadantes en microtubos de 1.5

ml, congelándolos hasta su ensayo, para lo cual se tomaron 250 µl de los

sobrenadantes y se colocaron en microtubos de 1.5 ml, posteriormente se les

adicionaron 50 µl de una suspensión con 200 unidades klett de Escherichia

coli ATCC 1775 transgénica. Se utilizó esta bacteria ya que es una fuente de

nitrato reductasa que permite que el óxido nítrico producido por las HUVEC sea

reducido a nitritos. (Ramírez–Sánchez, 2005). Una vez adicionada la bacteria,

los sobrenadantes se incubaron en agitación en baño maría a 37º C durante 1

hr a 100 rpm. Cumplido este tiempo se centrifugaron a 3000 rpm por 5 min.

Posteriormente se tomaron 250 µl de los sobrenadantes, se colocaron en

microtubos y a cada uno se les adicionó 50 µl de sulfanilamida y 50 µl de N-

naftil etilendiamina para determinar los nitritos presentes, los microtubos se

agitaron durante 1 min, y se colocaron en celdas para leer su absorbancia a

554 nm, contra un blanco de reactivos. Simultáneamente se realizó la curva de

calibración utilizando una solución de Nitrito de Sodio a las concentraciones de

0.32 µg/ml, 0.16 µg/ml, 0.08 µg/ml, 0.04 µg/ml, 0.02 µg/ml, 0.01µg/ml, 0.005 µ

g/ml y 0.001 µg/ml. Posteriormente se interpolaron las absorbancias de los

sobrenadantes para determinar la concentración de nitritos en cada tiempo de

infección expresando los resultados en µg/ml.

RESULTADOSMeta 1.- Determinar si las micobacterias entran a las células endoteliales

1.1. Cinética de infección de las HUVEC por Mycobacterium smegmatis.

Para comprobar si Mycobacterium smegmatis induce su interiorización a las

HUVEC, se realizó una cinética de infección de 1h, 3 h y 6 h y se evaluó la

sobrevida micobacteriana a las 24 h, 48 h y 72 h post-infección. Durante los

tiempos de 1h y 3 h de infección no se encontraron células infectadas ni

células con bacterias adheridas a la superficie celular. A las 6 h de infección se

observaron pocas células con bacterias interiorizadas y/o adheridas a la

membrana celular. La infección a las 6 h no indujo cambios significativos en la

morfología celular, las monocapas celulares mantuvieron su apariencia

morfológica similar a las células sin infectar. En los tiempos post-infección ya

no se observaron células infectadas (Fig. 1).

1.2. Cinética de infección de las HUVEC por Mycobacterium abscessus.

La capacidad de infección de Mycobacterium abscessus sobre las HUVEC se

evaluó siguiendo la misma cinética que para M. smegmatis. A la hora de

infección no se observaron micobacterias adheridas ni interiorizadas, a las 3 h

de infección ya se observaron algunas células con más de una bacteria

interiorizada, con 6 h de infección se observó una considerable cantidad de

bacilos infectando a las células. A las 24 h de post-infección se observaron

células con una mayor cantidad de bacilos interiorizados, a las 48 h de post-

infección se observó una multiplicación intracelular micobacteriana importante

y se comenzaron a observar cambios morfológicos en las células, a las 72 h

post-infección ya fue más evidente la multiplicación intracelular, se observó una

gran cantidad de bacilos ocupando todo el citoplasma celular, la morfología de

la célula solo fue evidente por la gran cantidad de bacilos en el citoplasma

(Fig.1).

1.3. Cinética de infección de las HUVEC por la cepa H37Rv de Mycobacterium tuberculosis.

Para comprobar la capacidad de interiorización de Mycobacterium tuberculosis

a las HUVEC, se infectaron monocapas de éstas células con la cepa H37Rv,

siguiendo los mismos tiempos de infección y post-infección descritos

previamente. Como se observó en los ensayos de infección de M. smegmatis y

M. abscessus, la infección por 1 h con M. tuberculosis no mostró bacterias

adheridas y/o interiorizadas, a las 3 h de infección se observaron células con 2

ó 3 bacilos presentes contenidos en vacuolas endocíticas en la citoplasmática

de la célula, la infección por 6 h mostró un mayor número de bacilos

interiorizados e igual que lo observado a las 3 h de infección, la presencia de

bacilos contenidos en vacuolas endocíticas fue más evidente en la región

perinuclear. Los tiempos post-infección, mostraron resultados similares, no se

observó multiplicación intracelular, pero la presencia de bacilos dentro de las

células fue evidente hasta el último tiempo de la cinética evaluado. En todos

los tiempos, tanto de infección como en los tiempos post-infección se

observaron a los bacilos contenidos en vacuolas endocíticas y en estrecho

contacto con el núcleo celular, la presencia de éstos no causó cambios

morfológicos en las células (Fig. 1).

Fig. 1. Infección de las HUVEC por Mycobacterium smegmatis, M. abscessus y M. tuberculosis A) HUVEC infectadas por M. smegmatis; B) HUVEC infectadas por M. abscessus; C) HUVEC infectadas por M. tuberculosis.

A

Meta 2.- Determinar la multiplicación o eliminación de las micobacterias

En la figura 2 se muestra el destino intracelular de las tres micobacterias

evaluadas en las HUVEC. Es evidente que el comportamiento de las

micobacterias dentro de las células fue diferente, en la infección por M.

smegmatis se observó claramente una disminución en la carga bacteriana que

culminó con la eliminación total de la bacteria. La infección inducida por M.

abscessus presentó una multiplicación intracelular considerable, estos

resultados correlacionan con lo observado en los ensayos de microscopía

óptica y finalmente, en la infección por M. tuberculosis se observó de manera

clara la permanencia de la micobacteria durante todos los tiempos post-

infección, sin que se presentará eliminación o multiplicación intracelular.

1

10

100

1000

10000

100000

1000000

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

Tiempo (h)

UFC/

ml

M. smegmatis M. tuberculosis M.abscessus

Figura 2. Multiplicación intracelular de diferentes cepas de micobacterias en las HUVEC

2.2. Determinación del porcentaje de infectividad de las tres micobacterias. Para determinar cuál de las tres micobacterias tuvo mayor capacidad para

interiorizarse a las HUVEC, se determinó el porcentaje de infectividad. Para

determinar el porcentaje de infectividad en los ensayos de microscopía óptica

(MO), se contaron 200 células y de estas se cuantificaron las células con

bacilos interiorizados, para cada una de las tres cepas. En el caso de las UFC,

el porcentaje se determinó cuantificando a las UFC de los inóculos

correspondientes y se determinó el porcentaje de entrada de cada una de las

micobacterias. Para ambos ensayos, el porcentaje de infectividad se determinó

a las 6 h de infección (Tabla I). En esta tabla se observa que la bacteria que

tuvo una mayor capacidad infectiva fue M. abscessus, M. tuberculosis tuvo un

menor porcentaje de infectividad que M. abscessus y M. smegmatis fue la

micobacteria que tuvo el menor porcentaje de infectividad.

Micobacteria % Infectividad(MO)

% Infectividad(UFC)

M. abscessus 4.17 4.5

M. tuberculosis 1.28 3.6

M. smegmatis 0.20 1.2Tabla I. Tabla comparativa de los porcentajes de infectividad de las cepas

micobacterianas por UFC y MO

Meta 3.- Ensayo para la observación in situ de la producción de óxido nítrico mediante microscopía de fluorescencia.

3.1. Oxido nítrico producido por las HUVEC infectadas por Mycobacterium smegmatis.

Siguiendo la técnica descrita previamente se determinó por microscopía de

fluorescencia la producción de óxido nítrico, inducida por la infección con M.

smegmatis. De manera constitutiva las células sin infectar no presentaron

producción de óxido nítrico. Cuando las HUVEC se infectaron con la

suspensión de M. smegmatis, a los 15 min de infección se comenzaron a

observar a las células fluorescentes, el mismo nivel de fluorescencia se

mantuvo durante toda la cinética de infección, sin que fuera evidente un

incremento significativo. La producción de óxido nítrico de las HUVEC inducida

por M. smegmatis inició a los 15 min de infección y se mantuvo constante

durante todos los tiempos evaluados (Fig 3).

3.2. Oxido nítrico producido por las HUVEC infectadas por Mycobacterium abscessus.

De la misma manera que el procedimiento mencionado anteriormente, las

monocapas de células endoteliales se infectaron con la cepa de

Mycobacterium abscessus siguiéndose la misma cinética. La producción de

óxido nítrico inició desde los 15 min de infección y en mayor proporción

comparada con M. smegmatis, a los 30 min de infección se observó una célula

con una fluorescencia muy intensa indicando la alta producción de óxido

nítrico. A los 45 min de infección se observó la intensidad de fluorescencia de

manera homogénea en todas las células presentes en la monocapa. El tiempo

en donde se observó la mayor intensidad de fluorescencia fue a los 60 min de

infección, indicando un pico máximo en la producción de óxido nítrico, en este

tiempo también se observaron cambios significativos en la morfología celular,

las células presentaron grandes extensiones citoplasmáticas de manera más

evidente. Después de los 60 min de infección se observó una disminución de la

intensidad de fluorescencia, indicando una disminución también en la

producción del óxido nítrico, misma que no llego a ser nula, ya que hasta el

último tiempo evaluado pudieron observarse células fluorescentes (Fig. 3).

3.3. Oxido nítrico producido por las HUVEC infectadas por la cepa H37Rv de Mycobacterium tuberculosis.

Se siguió el mismo procedimiento, las monocapas de células endoteliales se

infectaron con la cepa de Mycobacterium tuberculosis realizando la misma

cinética. Se observó que a los primeros tiempos de infección que van desde los

15 min hasta la primera hora, hay una baja producción de óxido nítrico con

respecto en lo observado con M. abscessus. Posteriormente a los 75 min se

observó un aumento en la producción de óxido nítrico por las células

endoteliales, las cuales emitieron una gran fluorescencia permitiendo ver

extensiones citoplasmáticas. A los 105 min de infección, la producción de óxido

nítrico disminuyó, manteniéndose constante hasta el final de la cinética (Fig.3).

A

B

C

Figura 3. Producción de NO por las HUVEC inducido por las diferentes micobacterias a 1h de infección. A) M. smegmatis, B) M. abscessus, C) M. tuberculosis. Imágenes tomadas al mismo aumento con el objetivo de 20x en el microscopio invertido de fluorescencia (aumento 200)

Meta 4.- Ensayo colorimétrico para la cuantificación del óxido nítrico por el método de Greiss.

Para cuantificar el óxido nítrico producido por las células endoteliales en

respuesta a la infección con las diferentes cepas micobacterianas, se realizó

una curva de calibración utilizando una solución de Nitrito de Sodio a las

concentraciones de 0.32 µg/ml, 0.16 µg/ml, 0.08 µg/ml, 0.04 µg/ml, 0.02 µg/ml,

0.01µg/ml, 0.005 µg/ml y 0.001 µg/ml. y se midió la absorbancia de cada una a

554 nm.

En la tabla II se muestran las lecturas obtenidas.

Concentraciónµg/ml

Absorbencia(554nm)

0.32 1.87

0.16 1.010

0.08 0.532

0.04 0.326

0.02 0.260

0.01 0.181

0.005 0.098

0.001 0.027

Tabla II. Lecturas de absorbencia para la curva tipo.

Con estos resultados se graficaron las absorbencias de las diluciones contra

las concentraciones, con lo cual se obtuvo la curva tipo (Figura 4)

45 min

y = 5.5949x + 0.0932R2 = 0.9961

00.20.40.60.8

11.21.41.61.8

2

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35

Concentración de nitritos ( µ g/ml)

Abso

rban

cia

Posteriormente se interpolaron las lecturas de las absorbencias de cada uno

de los ensayos realizados con las cepas micobacterianas y de esta manera se

cuantificó la concentración de nitritos que es directamente proporcional a la

cantidad de óxido nítrico que se produjo durante la infección

En la figura 5 se muestra una comparación de la producción de óxido nítrico

por las HUVEC infectadas con las tres cepas micobacterianas a los diferentes

tiempos de infección.

Figura 4. Curva tipo para determinación de la concentración de nitritos por el método de Greiss.

-0.05

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

Control M.smegmatis M.abscessus MTB

40 m in 90 m in 240 m in

Con

cent

raci

ón d

e ni

trito

s(µ

g/m

L)

* **

* *

*

**

* p < 0.05

Figura 5. Producción de óxido nítrico por las HUVEC infectadas con las tres cepas micobacterianas

En donde observamos que las tres cepas micobacterianas inducen la

producción de óxido nítrico de manera diferencial, siendo M. abscessus la que

induce la mayor producción de NO por las HUVEC, seguida por M.

tuberculosis y por último M. smegmatis que es la que induce la menor

producción de NO. En cada uno de los tiempos en los que se cuantificó el NO

se determinó que tienen diferencia significativa con respecto al NO producido

por las células sin infectar, esto se calculó por el valor de p que se obtuvo por

medio de la prueba t de student. Los valores de p en cada uno de los tiempos

de infección con las tres cepas micobacterianas se muestran en la tabla III:

Tiempo (min) M. smegmatisValor p

M. abscessusValor p

M. tuberculosisValor p

40 min 0.026508457 0.026741949 0.03964971

90 min 0.027899137 0.048242126 0.06952771

240 min 0.004994624 0.013516418 0.00539882

Tabla III. Valor de p de cada tiempo de infección con las micobacterias.

DISCUSIÓN Aproximadamente un tercio de la población mundial está infectada por

micobacterias del complejo tuberculosis, sin embargo sólo un porcentaje bajo

de dichos individuos desarrolla la enfermedad; una respuesta inmune íntegra

es responsable de la eliminación y el control eficiente de la dicha carga

bacteriana. Se sabe que el sitio principal de infección de M. tuberculosis es el

pulmón y los macrófagos las células primordiales que albergan a estas

bacterias: dependiendo de su grado de activación, los macrófagos pueden

eliminar eficientemente a las micobacterias, contrariamente, si su activación es

baja, estas células no solo fallan en contener el crecimiento bacteriano, sino

que las alojan permitiéndoles su crecimiento irrestricto. La biología de la

relación macrófago-micobacteria ha sido un hecho ampliamente estudiado, sin

embargo recientemente se ha empezado a reconocer la participación de otras

células, de tipo no macrofágico, en la etiopatogénesis de esta enfermedad,

como son los pneumocitos tipo II, fibroblastos pulmonares y células

endoteliales entre otras (Hernández-Pando, 2000). De igual manera diversos

estudios in vitro han demostrado la capacidad de las micobacterias para

infectar y multiplicarse en fibroblastos o células epiteliales (García-Pérez,

2003), siendo así probables reservorios de micobacterias creciendo

activamente o en estado de latencia. La infección activa es en muchos casos

el resultado de la reactivación de la micobacteria que se encuentra presente

en el individuo en un estado de latencia. Por otro lado, las células no

fagocíticas son fuentes importantes de una variedad de citocinas, dentro de las

que se encuentran: IL-6, IL-8, TNF-alfa, MCP-1, etc., (Ohyama et al. 2002; Makinde et al. 2007). De esta manera la relevancia de estas células se puede

dar por su contribución en el balance global de citocinas producidas durante la

infección micobacteriana, de su posible participación como reservorios de la

bacteria y finalmente para reconocer y entender los mecanismos de defensa

para la eliminación bacteriana desarrollados por las células no fagocíticas.

En este trabajo se abordó el estudio básico de la infección de tuberculosis en

un tipo de células no fagocíticas, siendo estas los cultivos primarios de células

endoteliales de cordón umbilical humano (HUVEC), asimismo analizamos uno

de los mecanismos de defensa innata que estas células pueden exhibir

durante la infección: la producción de óxido nítrico, dentro de nuestro

conocimiento este es el primer trabajo en su tipo (con cultivos primarios),

aunque un trabajo reciente demostró la entrada y replicación intracelular de

Mycobacterium tuberculosis en una línea de células endoteliales

microvasculares humanas (Mehta, 2006).

Lo primero que se hizo fue establecer la capacidad endocítica de las HUVEC,

para lo cual se utilizaron partículas irrelevantes que se sabe que estirpes

fagocíticas interiorizan de manera eficiente, siendo estas las levaduras de pan

muertas por calor, observamos que las HUVEC no son capaces de interiorizar

a dichas levaduras en ninguno de los tiempos de estudio, por lo que podemos

decir que las HUVEC no poseen la capacidad de endocitar de manera

espontánea a partículas. Posteriormente analizamos si las HUVEC se

infectaban con las 3 especies micobacterianas seleccionadas, una de baja

virulencia (M. smegmatis), una no tuberculosa de alta virulencia (M.

abscessus) y la cepa virulenta de M. tuberculosis H37Rv, la interiorización la

evaluamos mediante tinción y observación microscópica (Zielh-Neelsen) y

mediante la cuantificación de unidades formadoras de colonias, encontrando

por ambos métodos que las tres especies micobacterianas eran capaces de

infectar a las HUVEC, pero de manera diferencial dependiendo de la

micobacteria, siendo la más infectiva M. abscessus, seguida de M.

tuberculosis y M. smegmatis. De momento no contamos con evidencias que

permitan suponer cual es el proceso de responsable de la interiorización,

mismo que pudiera ser macropinocitosis, considerando lo observado en otras

células no fagocíticas (García-Pérez, 2003), para probar esta hipótesis es

necesario realizar una serie de ensayos que se encuentran actualmente en

proceso en nuestro laboratorio.

De acuerdo a la primera observación, las HUVEC son infectadas por las

micobacterias de estudio independientemente de su virulencia, sin embargo, la

sobrevivencia intracelular de las micobacterias si correlacionó con dicha

propiedad. Así, la micobacteria no virulenta M. smegmatis fue eliminada rápida

y eficientemente por las células endoteliales, iniciando su eliminación tan

pronto como a las 6 hrs post-infección, y después de las 24 horas la carga

bacteriana disminuyó importantemente para no ser detectada después de las

48 hrs. En comparación, M. abscessus fue la micobacteria que mostró no

sólo la mayor eficiencia de infección, sino la que presentó la mayor

multiplicación y sobrevivencia intracelular, con un crecimiento logarítmico a lo

largo de la cinética de observación, y observándose microscópicamente

células repletas de bacilos al final de tiempo de estudio. M. tuberculosis mostró

un comportamiento diferente a los descritos anteriormente ya que no se

multiplicó intracelularmente y tampoco fue eliminada por las HUVEC,

presentando así un estado similar a la latencia. Es importante resaltar que este

comportamiento no se observó en otros modelos de infección de células no

fagocíticas, como el de la línea celular A549 (neumocitos tipo II) o el de la

línea celular de fibroblastos pulmonares (MLg) (García-Pérez, 2004).

Decidimos estudiar la producción de intermediarios reactivos del nitrógeno,

específicamente el óxido nítrico (NO) como uno de los posibles mecanismos

de defensa a la infección micobacteriana exhibidos por las HUVEC. Existen

diversas variedades de la enzima óxido sintasa expresadas en diferentes

estirpes celulares; así existe la óxido sintasa inducible (iNOS o NOS2),

producida por macrófagos y neutrófilos humanos, otra de las isoformas

producida de manera constitutiva por las células endoteliales es la eNOS o

NOS3 y finalmente las células neuronales producen la denominada nNOS que

es dependiente del complejo Ca2+ - Calmodulina (Govers et al. 2001). De las

isoformas, la de mayor importancia en este trabajo es la eNOS ya que se

encuentra en las células endoteliales de manera constitutiva y se sabe que se

activa en respuesta a una gran variedad de estímulos como el estiramiento

celular (Ramírez-Sánchez, 2007), de tal forma que el NO generado por eNOS

pudiera tener la relevancia que se le ha conferido en diversas infecciones

microbianas siendo este uno de los metabolitos importantes en la defensa

contra dichas infecciones (Nathan et al. 1991; Umezawa et al. 1997; James,

1995). Por otro lado existen diversos estudios que han demostrado que el

óxido nítrico participa de manera importante en infecciones causadas por M.

tuberculosis en modelos celulares de células fagocíticas, y también ya se ha

reportado que el NO puede inducirse en células no fagocíticas como el epitelio

pulmonar (Kwon et al. 1998), y células A549 (Roy et al. 2004), también por la

infección con MTB.

En este trabajo se analizó la producción de NO in situ y en tiempo real

mediante microscopia de fluorescencia y utilizando el reactivo DAF, el cual

fluoresce conforme se produce el NO. Se observó que las tres cepas

micobacterianas modularon de manera diferencial la producción de óxido

nítrico por las HUVEC, siendo M. smegmatis la micobacteria que indujo una

producción discreta y sostenida de NO durante todo el tiempo de observación;

M. abscessus indujo la mayor producción de NO la cual alcanzó un máximo de

producción a los 40-60 min post-infección, esta producción cesó rápidamente

(15 min después del pico máximo). En el caso de M. tuberculosis se observó

un patrón similar de producción de NO al de M. abscessus, aunque el pico de

producción máxima fue más tardío (a los 75 min). Cabe resaltar que la

producción de NO fue tan significativa y evidente que la producción de

fluorescencia llegó a emitir un color blanco en lugar del verde característico del

DAF. La tinción con DAF también permitió observar algunos cambios celulares

sugerentes de que un proceso de interiorización se estaba llevando a cabo,

evidenciando cambios membranales que eventualmente se recuperaron a su

estado original. También fue notable observar que aquellas células que de

manera importante produjeron NO, eventualmente dejaron de producirlo, como

si por efecto de la infección se modulara su producción, siendo esta

observación especialmente importante en el caso de la infección por M.

tuberculosis y M. abscessus.

La última parte del trabajo consistió en cuantificar el óxido nítrico producido

durante la infección temprana con las tres cepas micobacterianas por el

método colorimétrico de Greiss. Los resultados obtenidos corroboraron y

fueron congruentes con las observaciones obtenidas con DAF; de las tres

micobacterias, la que indujo la menor producción de NO, fue M. smegmatis,

sin embargo esta producción fue constante, no encontrándose la inhibición

observada con las otras micobacterias. En el caso de M. abscessus, la

producción de NO fue la más alta llegando a producir hasta 0.25085 µg/ml, sin

embargo, esta producción fue suprimida rápidamente, de manera que los

datos cuantitativos corroboraron las observaciones cualitativas obtenidas con

DAF. En comparación con las otras especies micobacterianas, la infección de

las HUVEC por M. tuberculosis indujo la producción intermedia de óxido

nítrico, y al igual que lo observado con M. abscessus, la infección con M.

tuberculosis alcanzó un pico máximo de producción de NO (0.07355 µg/ml),

que rápidamente disminuyó, de igual manera hubo concordancia entre los

resultados cuantitativos y cualitativos de producción de NO.

Por todo lo anterior, podemos postular que la infección de HUVEC constituye

un modelo interesante de estudio de la patogénesis de la tuberculosis ya que

permite la expresión de un estado de “latencia” debido a que estas células

sólo contienen el crecimiento bacteriano sin llegar a eliminarlo, funcionando

así como un reservorio de la micobacteria y explicando las observaciones

obtenidas por Hernández-Pando y col., quien reconoce la infección de células

endoteliales en humanos y ratones (Hernández-Pando, 2000, Arriaga et al.

2002). Es conveniente reforzar esta observación evidenciando por ejemplo la

expresión de proteínas de latencia características de este estado como por

ejemplo la proteína alfa-cristalina (Yuan et al. 1996). Interesantemente, la

infección micobacteriana con M. tuberculosis, inicialmente despierta una

respuesta “explosiva” de NO, probablemente la producción elevada de este

intermediario despierte a su vez una respuesta micobacteriana que conduzca

al estado de latencia, hecho reportado por diferentes grupos dentro de los

cuales sobresale el de Steyn y col, quien propone que niveles altos de NO

activan a “detectores” micobacterianos como el (WhiB3) o el DosT,

responsables de modificaciones metabólicas de la micobacteria y que permite

su reversión al estado de latencia (Steyn et al. 2007). Curiosamente, M.

abscessus igualmente dispara un “estallido” de producción de óxido nítrico, de

mayor intensidad que el inducido por tuberculosis, y su eficacia se observa ya

que en el lapso de las primeras horas de infección, hay una disminución

significativa del número de bacterias intracelulares (figura 15), misma que se

recupera logaritmicamente hasta invadir completamente a la célula; de esta

forma es probable que M. abscessus no presente ni los detectores de NO, ni la

capacidad de entrar en latencia exhibida por M. tuberculosis (o por lo menos

no en estas condiciones). De esta manera, en nuestro modelo observamos el

comportamiento diferencial de tres patógenos, dos que establecen una

relación hospedero-bacteria destructiva, representada por M. abscessus (en

la que la célula hospedera es destruida) y por M. smegmatis (en la que la

bacteria es destruida), y otro que establece una relación tipo “simbiótica” en

donde M. tuberculosis no destruye a la célula pero tampoco se elimina. La

infección por M. abscessus o M. tuberculosis induce una alta producción de

óxido nítrico que rápidamente es “apagada”, los factores responsables de

dicha modulación pueden ser: a) producidos por las micobacterias; b)

producidos por la misma célula endotelial. Esta última posibilidad es altamente

pausible ya que la HUVEC es una célula con mecanismos de regulación

sofisticados y cuya producción de NO es responsable de múltiples funciones;

probablemente los niveles de NO alcanzados por la infección micobacteriana

constituyen un “peligro” para la integridad celular, hecho que despierta su

pronta inhibición, como sucede en el caso del estiramiento físico (Ramírez-

Sánchez, 2007). Hasta el momento, no se ha descrito con precisión que la

micobacteria sea capaz de inhibir específicamente la actividad de la óxido

nítrico sintasa inducible, únicamente se ha establecido que de manera

indirecta los macrófagos inadecuadamente activados por citocinas tipo TH2 no

producen niveles adecuados del metabolito (Gil et al. 2003) y el papel del NO

es aún controversial en el humano (Jagannath, 1998); sobre la participación y

modulación de la eNOS no hay nada descrito por lo que este trabajo abre una

línea de trabajo muy interesante. El último punto que resalta este trabajo es el

establecer qué tipo de sintasa de óxido nítrico (NOS) es la que se activa por la

infección micobacteriana, nosotros atribuimos la producción del NO por la

activación de la eNOS, que es la que se encuentra en mayor proporción en el

endotelio, además de ser una enzima constitutiva y de que su activación es

más rápida que la de la iNOS (Govers et al. 2001); por esto es necesario

establecer y estudiar el tipo de NOS que las diferentes micobacterias activan

al infectar a las HUVEC, así como otros mecanismos de defensa que pueden

estar involucrados en la misma.

IMPACTO

La realización de este trabajo nos permitió generar nuevos conocimientos

sobre la participación de células no fagocíticas en las infecciones por

micobacterias. Los resultados obtenidos nos permiten proponer que las células

endoteliales pueden funcionar como modelo interesante para la expresión de

latencia ya que pueden estar funcionando como reservorios durante la

infección por M. tuberculosis. En este aspecto, este trabajo fundamenta futuros

estudios encaminados a evidenciar la participación del óxido nítrico como

posible inductor de la latencia observada en la tuberculosis y refuerza la

hipótesis de que otras estirpes celulares (no macrófagos) tienen una

participación importante en los procesos infecciosos.