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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA AISLAMIENTO IDENTIFICACIÓN Y PRUEBAS DE FERMENTACIÓN EN CULTIVO PURO Y MIXTO DE LEVADURAS DEL TEPACHE TESIS PROFESIONAL QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERO EN ALIMENTOS PRESENTA: GENARO IVÁN CERÓN MONTES DIRECTOR: JOSÉ ABRAHAM BALDERAS LÓPEZ CO-DIRECTOR: SAMUEL SUAZO ABARCA México, D. F. Septiembre de 2007
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
AISLAMIENTO IDENTIFICACIÓN Y PRUEBAS DE
FERMENTACIÓN EN CULTIVO PURO Y MIXTO DE LEVADURAS DEL TEPACHE
TESIS PROFESIONAL
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERO EN ALIMENTOS
PRESENTA: GENARO IVÁN CERÓN MONTES
DIRECTOR: JOSÉ ABRAHAM BALDERAS LÓPEZ CO-DIRECTOR: SAMUEL SUAZO ABARCA
México, D. F. Septiembre de 2007
AGRADECIMIENTOS A mis padres, por brindarme como herencia mi educación, enseñándome a ser libre, a tener confianza en mí y a creer en Dios. Por cada esfuerzo realizado para que ésta meta haya llegado a ser realidad. A mi padre, quien me enseño que en la vida existe el bien y el mal y que solo con fe, trabajo continuo, responsabilidad y esfuerzo diario, podría ser algún día un buen hombre. A mi madre, quien me dio la más cálida bienvenida a este mundo y quien en mi vida ha sido fuente de ternura, comprensión y amor. A mis hermanos, Gerardo, Augusto, Adrián y Sergio, quienes me han motivado a dar siempre un paso al frente lo mejor posible y servir de ejemplo. Por darme su afecto, cariño y confianza. A Esmeralda, mi esposa, que es quien le da sentido a mi vida, quien la llena de emoción. Por quien tengo la certeza de que no volveré a sentir frías mis manos y mucho menos mi corazón, por ser como es y compartir su vida a mi lado. A Daniel Hernández Tecpa, mi mejor amigo, por brindarme su amistad, apoyo incondicional y comprensión. Por ofrecer otras perspectivas a mi vida y darme su franco punto de vista. A mí estimado director de tesis el Doctor José Abraham Banderas López, quien es mi primer acercamiento a un hombre de ciencia, quien me dio su amistad sincera y me mostró el camino para descubrir las respuestas a mis inquietudes. A los matrimonios Vargas Cerón y Cerón Luna por brindarme un espació en su hogar, por su apoyo, confianza, por haberme motivado a ser mejor. Por haberme enseñado a tener ilusiones y la convicción en hacerlas realidad. A mi amiga M. en C. Mónica Jaime Fonseca, que siempre estuvo, está y seguirá estando brindándome afecto y soporte. Y quien, por cierto, me brindo un valioso espacio en el laboratorio del CICATA – Legaría para efectuar mis experimentos. A la profesora M. en C. María Eugenia R. O., mi maestra, quien me ha ayudado a ordenar mis ideas en el laberinto del conocimiento y en mi tesis. A mi co-asesor, el M. en C. Samuel Suazo Abarca y a los revisores de mi trabajo: Dr. Juan Silvestre Aranda Barradas, M. en C. Leobardo Ordaz Contreras y M. en C. Carlos Orozco Alvarez, por el valioso tiempo invertido en revisar mi tesis y por sus atinadas sugerencias para mejorar la presentación de la misma. Investigar es ver lo que todo el mundo ha visto, y pensar lo que nadie más ha pensado. Albert
Szent-Györgi (1893-1986)
CONTENIDO PÁG. ÍNDICE DE TABLAS
ÍNDICE DE FIGURAS
1 RESUMEN 1
2 INTRODUCCIÓN 2
3 ANTECEDENTES 3
3.1 Tecnología actual de elaboración del tepache: Investigación de campo 4
3.2 Microorganismos del tepache 5 3.3 Procesos de fermentación de alimentos tradicionales fermentados con
cultivo y sustrato mixto. 6
3.3.1 Ventajas del empleo de cultivos mixtos 6
3.3.2 Desventajas del empleo de cultivos mixtos 8
3.4 Crecimiento microbiano 9
3.5 Adaptación a cambios de concentración de nutriente 13
3.6 Sistemas de fermentación con substrato y cultivo mixto 14
3.6.1 Utilización de fuentes de carbono mixtas 15
3.6.2 Fermentación con cultivo mixto 16
3.7 Métodos comúnmente empleados en la identificación microbiana 17
4 OBJETIVOS 20
4.1 OBJETIVO GENERALE 20
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 20
5 MATERIALES Y MÉTODOS 21
5.1 Aislamiento e identificación de levaduras del tepache 21
5.1.1 Muestreo y transporte de muestra 22
5.1.2 Conteo en placa 22
5.1.3 Tinción de Gram 22
5.1.4 Preparación de inóculo en medio líquido 22
5.1.5 Preparación de inóculo en medio sólido 22
5.1.6 Aislamiento de levaduras y conservación 24
5.1.7 Identificación de las levaduras aisladas 24
5.2 Métodos analíticos 24
5.2.1 Determinación de peso seco 24
5.2.2 Determinación de cenizas 25
5.2.3 Determinación de densidad 25
5.2.4 Determinación de sólidos disueltos 25
5.2.5 Medición de pH 25
5.2.6 Determinación de acidez 25
5.2.7 Determinación de azúcares reductores directos 26
5.3 Pruebas de fermentación 26
5.3.1 Preparación del sustrato 26
5.3.2 Sistema de fermentación 26
5.3.3 Muestreo durante la fermentación 27
5.3.4 Experimentos planteados para realizar las pruebas de fermentación 28
6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 30
6.1 Selección de las muestras de tepache 30
6.2 Determinaciones realizadas al tepache 30
6.3 Aislamiento de levaduras 31
6.4 Identificación presuntiva de levaduras del tepache 33
6.5 Pruebas de fermentación 37
6.5.1 Pruebas de fermentación en cultivo puro 37
6.5.2 Pruebas de fermentación en cultivo mixto LVB-LVC 42
6.5.3 Pruebas de fermentación en cultivo mixto LVB-LVR 47
7 CONCLUSIONES 52
8 PERSPECTIVAS 53
9 BIBLIOGRAFÍA 54
ANEXO 1 57
ANEXO 2 70
ÍNDICE DE FIGURAS Figura Título Pág.
1 Curva típica del crecimiento microbiano 10
2 Secuencia experimental para llevar a cabo el aislamiento e identificación de las levaduras del tepache. 21
3 Secuencia experimental en las determinaciones efectuadas durante el seguimiento de la fermentación. 27
4 Sembrado por extensión con varilla en medio PDA y AMS de diferentes muestras de tepache; A) Zocalo, PDA; B) Zocalo, AMS; C)Hidalgo, PDA ; D) Hidalgo, AMS; E) Huehuetoca, PDA; Huehuetoca, AMS.
58
5 Sembrado por extensión con varilla en medio PDA y AMS de diferentes muestras de tepache; A) Tecamac, PDA; B) Tecamac, AMS; C)Tulpetlac, PDA ; D) Tulpetlac, AMS.
59
6 Morfología de levaduras en medio liquido (GELP); LVB; LVC; LVR; Comparación de la morfología desarrollada. 60
7 Aislamiento de unidades viables de levadura por estría cruzada en medio PDA: A1:A2) LVB; B1:B2) LVC; C1:C2) LVR. 61
8 Asimilación de carbohidratos en sistema de identificación API 20C AUX. 62
9 Asimilación de carbohidratos en medio de cultivo sólido, técnica de vaciado en placa; manitol, glicerol, sorbitol. Mt: Manitol, Gy: Glicerol, So: Sorbitol, R: levadura LVR, B: levadura LVB, C: levadura LVC.
63
10 Asimilación de carbohidratos en medio de cultivo sólido, técnica de vaciado en placa; sacarosa, maltosa, galactosa. Ma: Maltosa, Ga: Galactosa, Sa: Sacarosa, R: levadura LVR, B: levadura LVB, C: levadura LVC.
64
11 Crecimiento en medio sólido de alta presión osmótica del (GELPA-NaCl), técnica extensión con varilla. R: levadura LVR, B: levadura LVB, C: levadura LVC. 65
12 Crecimiento en medio sólido de alta presión osmótica (GELPA-NaCl), técnica vaciado en placa. R: levadura LVR, B: levadura LVB, C: levadura LVC. 66
13 Crecimiento en medio sólido de alta acidez (GELPA - ácido tartárico), 0.14-0.28% ác tartárico, técnica vaciado en placa. R: levadura LVR, B: levadura LVB, C: levadura LVC.
67
14 Crecimiento en medio sólido de alta acidez (GELPA - ácido tartárico), 0.35-0.5% ác. tartárico, técnica vaciado en placa. R: levadura LVR, B: levadura LVB, C: levadura LVC.
68
15
Crecimiento en medio de solidó de alta acidez (GELPA - ácido tartárico), 0.6-0.9% ác. tartárico, técnica vaciado en placa. R: levadura LVR, B: levadura LVB, C: levadura LVC.
69
16 Biomasa vs tiempo; LVB, LVC, LVR. 38
17 Biomasa vs tiempo; LVC, LVR. 38
CONTINUACIÓN
Figura Título Pág.
18 LN(Biomasa) vs tiempo; LVB, LVC, LVR 38
19 Acidez vs tiempo; LVB, LVC, LVR. 39
20 pH vs tiempo; LVB, LVC, LVR. 39
21 Sólidos disueltos vs tiempo; LVB, LVC, LVR 40
22 Carbohidratos Reductores vs tiempo; LVB, LVC, LVR. 41
23 Carbohidratos Reductores vs tiempo; LVC, LVR. 41
24 Evolución de la biomasa de LVB – “conjunto experimental LVB vs LVC” 42
25 Evolución de la biomasa de LVB escala Ln – “conjunto experimental LVB vs LVC” 43
26 Evolución de la biomasa de LVC – “conjunto experimental LVB vs LVC” 43
27 Evolución de la biomasa de LVC escala Ln – “conjunto experimental LVB vs LVC” 44
28 Evolución de la acidez – “conjunto experimental LVB vs LVC” 44
29 Evolución del pH – “conjunto experimental LVB vs LVC” 45
30 Evolución de la concentración de los sólidos disueltos – “conjunto experimental LVB vs LVC” 45
31 Evolución de la concentración de los carbohidratos reductores – “conjunto experimental LVB vs LVC” 46
32 Evolución de la biomasa de LVB – “conjunto experimental LVB vs LVR” 47
33 Evolución de la biomasa de LVB escala Ln – “conjunto experimental LVB vs LVR” 48
34 Evolución de la acidez – “conjunto experimental LVB vs LVR” 48
35 Evolución del pH – “conjunto experimental LVB vs LVR” 49
36 Evolución de la biomasa de LVR – “conjunto experimental LVB vs LVR” 49
37 Evolución de la concentración de carbohidratos reductores – “conjunto experimental LVB vs LVR” 50
38 Evolución de la concentración de sólidos disueltos – “conjunto experimental LVB vs LVR” 51
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla Título Pág.
1 Metodología empleada en la determinación de las características morfológicas y fisiológicas consideradas para el estudio de las levaduras. 23
2 Conjunto experimental LVB – LVC. 28
3 Conjunto experimental LVB-LVR. 29
4 Origen de las muestras de tepache. 30
5 Resultados de determinaciones analíticas realizadas en el tepache. 30
6 Proporción de las diferentes morfologías observadas en el aislamiento. 31
7 Características morfológicas. 32
8 Asimilación de compuestos de carbono, características fisiológicas y bioquímicas de las levaduras estudiadas. 34
9 Crecimiento en medio sólido de alta presión osmótica, características fisiológicas y bioquímicas de las levaduras estudiadas. 36
10 Crecimiento en medio sólido de alta acidez, características fisiológicas y bioquímicas de las levaduras estudiadas. 36
11 Densidad de biomasa en medio líquido (GELP) de LVR, LVC, LVB. 37
12 Datos del seguimiento de la fermentación de cultivos puros de levaduras. 71
13 Datos del seguimiento de la fermentación del conjunto experimental LVB vs LVC. 72
14 Datos del seguimiento de la fermentación del conjunto experimental LVB vs LVR. 73
1 RESUMEN El objetivo fundamental del presente trabajo fue el de llevar a cabo el estudio de algunos
de los microorganismos responsables de la elaboración del tepache, así como algunas de sus
interrelaciones, con el objeto de que el conocimiento obtenido ayude en futuras investigaciones
tendientes a buscar mejoras en el proceso de producción de ésta bebida, originaría de nuestro
país y por tanto de alto valor cultural y potencial económico. En la actualidad ésta bebida se
elabora mediante métodos y técnicas rudimentarias debido al escaso conocimiento científico y
tecnológico, lo que trae como consecuencia escasa reproducibilidad en su elaboración,
resultando en un producto con una baja relación costo-beneficio de su producción lo cual
reduce su oferta a un mercado local. El estudio se centró específicamente en tres de las
levaduras que están presentes en mayor número durante el proceso de fermentación de esta
bebida. Para éste fin, este trabajo se llevó en varias etapas, la primera de las cuales involucró
un muestreo de esta bebida en diferentes zonas del Distrito Federal, Estado de México e
Hidalgo, en la segunda etapa se seleccionaron algunas de estas muestras en base a sus
propiedades sensoriales para llevar a cabo cultivos microbianos y diversas determinaciones
analíticas (pH, acidez, etc.). De éstas determinaciones se reveló que el tepache es una bebida
ácida cuyo néctar tiene un pH próximo a 3.4, con una acidez cercana a 0.18% expresada como
ácido acético, con un porcentaje medio de sólidos disueltos de 13% y una densidad de
levadura suspendida del orden de 4x105 UFC/ml. De los cultivos realizados se pudo observar
que existe una amplia variabilidad, entre una bebida y otra respecto a la proporción de las
morfologías de los microorganismos presentes. De los mismos cultivos se efectuó un
aislamiento de tres tipos de morfología de levaduras que exhibieron características particulares
para su posterior identificación, para esto último se empleó el sistema de identificación API 20C
AUX de Biomeireux. Estas especies de levaduras se identificaron como: Saccharomyces
cerevisiae, Rhodotorula mucilaginosa y Candida guilliermondii. La última etapa consistió en la
realización de diversas pruebas de fermentación de éstas levaduras en cultivo puro y mixto a fin
de establecer posibles interacciones entre ellas. Los resultados mostraron una nula interacción
de C. guilliermondii para S. cerevisiae, ya que esta ultima no vio afectada su producción de
biomasa ni acidez respecto a su cultivo puro; en contraste con el cultivo de R. mucilaginosa y S.
cerevisiae en el cual la acidez fue menor respecto al cultivo puro de esta última, además a esta
situación se adjudica la mayor concentración de biomasa final observada. Por último C.
guilliermondii y R. mucilaginosa mostraron una relación negativa respecto a S. cerevisiae ya
que disminuyen su población de manera drástica una vez que S. cerevisiae inicia su fase de
crecimiento exponencial.
1
2 INTRODUCCIÓN
La fermentación es uno de los métodos de conservación más antiguos empleados en los
alimentos alrededor del mundo, en el pasado los indígenas utilizaron la fermentación durante
cientos de años en la preparación de diversos alimentos y bebidas (4). Las culturas
mesoamericanas no estuvieron exentas del desarrollo de productos fermentados con el fin de
mejorar su posibilidad de almacenamiento y/o diversificar su gastronomía, en la actualidad
México tiene más de 70 grupos étnicos, la mayoría de los cuales utilizan el proceso de
fermentación para elaborar tanto alimentos como bebidas que son consumidos con diversos
fines, ya sean nutricionales, estimulantes, medicinales y para rituales. Dentro de las bebidas
tradicionales fermentadas mexicanas se encuentra el pozol, el tesgüino, el pulque, el colonche y
el tepache, esta última de consumo generalizado en nuestro país (34, 58).
El tepache es una bebida tradicional fermentada que tiene sus orígenes en México, se
cree que su nombre es de etimología náhuatl, ya que algunos autores consideran que deriva de
“tépiatl” o de su diminutivo “tepiatzin” que significa agua o bebida (del vocablo “atl”) de una
variedad de maíz llamada “tepiatl”, en tanto que otros autores indican que deriva de “tepachoa”
que significa aprensar o moler algo con una piedra (11). En la actualidad el tepache se elabora
principalmente de piña, pero pueden emplearse otras frutas, es de color moreno amarillento,
con sabor dulce y agradable. Es una bebida muy refrescante, de bajo contenido alcohólico, que
se consume principalmente durante las épocas cálidas del año, de amplia aceptación popular
sobre todo entre estratos sociales pobres y de clase media. En épocas precortesianas el
tepache se elaborada en México con granos de maíz disueltos en el jugo de la caña de azúcar y
rara vez con pulque, desde entonces se conocía que cuando la fermentación se prolonga por
más tiempo el tepache presentaba un sabor agrio y avinagrado, convirtiéndose en una bebida
embriagante debido a su considerable contenido alcohólico, en ocasiones el líquido
deliberadamente se dejaba fermentar hasta obtener vinagre. La elaboración del tepache de un
lugar a otro tenía y a la fecha tiene, considerables variantes en los ingredientes empleados y
condiciones de preparación, dependiendo de la región y los gustos de los consumidores, por lo
cual el tipo de flora microbiana y las características del producto son difícilmente similares (2,
14, 55).
Como se apuntó antes el tepache se elabora en la actualidad de manera rudimentaria,
con poco o nulo control, de manera que es difícil obtener reproducibilidad en sus características
2
sensoriales. Esto no es permitido en la industria de los alimentos ya que no se puede depender
de métodos rudimentarios no caracterizados en la elaboración de productos para el consumo
humano, pues involucran un riesgo para la salud aparte de no representar una opción de
procesamiento rentable para su venta y al no existir una estabilización del producto su vida de
anaquel es corta. Es entonces indispensable una amplia investigación para determinar factores
tecnológicos en la preparación de los alimentos tradicionales fermentados, en particular del
tepache, que permitan caracterizar la acción sobre el sustrato, de la diversidad de
microorganismos involucrados y se estudie su interacción de manera que se amplíe el
conocimiento del proceso (4, 33).
3 ANTECEDENTES
Del tepache se han aislado y reportado las siguientes especies de levaduras:
Tourulopsis inconspicua y Saccharomyces cerevisiae (14); Candida queretana (57); Pichia
membranaefaciens (59); Brettanomyces intermedius (11); Candida valida y Candida famata (3);
Candida guilliermondii, C. valida, Rhodotorula rubra, Cryptococcus albidus y Brettanomyces
claussenii (32). Sin embargo, hasta ahora no se han reportado investigaciones que tengan por
objeto estudiar las posibles interrelaciones entre estos microorganismos y en específico
respecto a Saccharomyces cerevisiae, la cual se ha mencionado como la levadura con mayor
participación en la elaboración de esta bebida. Tales investigaciones contribuirían en el
entendimiento del proceso de fermentación y con ello en la futura formulación de un inóculo
para la elaboración de esta bebida. Respecto a pruebas de fermentación, las investigaciones
hasta ahora efectuadas se han orientado principalmente a evaluar la producción de tibicos del
tepache (masas gelatinosas compactas donde se encuentran embebidos varios
microorganismos, también conocidas con el nombre de zoogleas ), como una posible fuente de
proteína y carbohidratos, este es el caso del trabajo de tesis profesional de Lizárraga L. D.
(1986)26, quien evaluó la producción de tibicos en diferentes sustratos azucarados a diferentes
concentraciones y temperaturas de incubación, encontrando que las melazas favorecen el
desarrollo de los tibicos con un buen rendimiento en la producción de biomasa, además que es
uno de los sustratos más económicos, por otro lado, su investigación revela que los tibicos
están constituidos principalmente por carbohidratos por lo cual no representan una fuente real
de proteína, en comparación con otras opciones. Armijo de Vega (1990)3, también en su tesis
profesional, estudió como afecta la aireación, el pH, el tipo de sustrato y la temperatura en la
producción de biomasa de los tibicos, a la vez que llevó a cabo el seguimiento de producción de
3
etanol y ácido acético; como resultado de su trabajo recomienda el uso de melazas y menciona
que el empleo de la aireación y modificación del pH no influyen positivamente en la producción
de biomasa. Monroy T. R. (1991)32, llevó a cabo pruebas de fermentación empleando como
inóculo tibicos del tepache en soluciones de piloncillo al 5%, en condiciones microaerofílicas, en
sus estudios encontró que durante las primeras horas de fermentación las bacterias lácticas
predominan, posteriormente las poblaciones de las levaduras se incrementan y disminuyen las
de bacterias lácticas, alcanzando en 24 h un pH de 3,4. Por último Terrazas R. y col. (2001)54,
llevaron a cabo una evaluación sensorial de cuatro muestras de tepache de diferentes fuentes
obtenidas por distintos procesos de fermentación, encontrando que las bebidas obtenidas por
un proceso de doble fermentación presentaron mejor evolución sensorial.
3.1 Tecnología actual de elaboración del tepache: Investigación de campo
El tepache se obtiene mediante un proceso de fermentación en el cual se emplea como
sustrato una solución que contiene entre 10 y 35% de fruta madura, principalmente se emplea
la piña aunque también puede emplearse naranja, manzana, guayaba, entre otras, en algunos
casos se le adiciona canela (Cinnamomum zeylanicum) y clavos (Syzygium aromaticum) con el
fin de brindarle otros sabores. La fruta debe seleccionarse cuidadosamente evitando aquella
que presenta, en parte o en su totalidad, putrefacción o signos de evidente descomposición
debido a microorganismos o larvas, en todos los casos los frutos deben ser adecuadamente
lavados removiendo las partículas de tierra y parásitos. En el caso de la piña y la naranja
pueden emplear las cáscaras, aunque esta práctica no es recomendada ya que la probabilidad
de que la fermentación concluya con éxito es baja al igual que la calidad en las propiedades
sensoriales del producto, que en general carecen de sabor a fruta. Para promover la
fermentación es común el uso de 1 a 7% (p/v) de una fuente de carbohidrato, entre los más
empleados se encuentra el azúcar, el mascabado, el piloncillo y las melazas. Esta práctica es
más frecuente en épocas de frío, que es cuando el tiempo del proceso de fermentación
aumenta y eventualmente, por la temperatura, las levaduras presentan mayor actividad que las
bacterias generando sabores fuertes e indeseables.
El inóculo está constituido por la flora que contiene la fruta con la que se prepara el
sustrato, aunque también puede emplearse entre 5 a 15% de tibicos o de fermentado obtenido
en procesos anteriores. El proceso de fermentación puede durar de 5 a 12 días y una vez que
se concluye el producto es diluido y endulzado al gusto para su comercialización. Los
4
parámetros para establecer que se ha completado el proceso de fermentación son de
naturaleza empírica y consisten principalmente en la consistencia del fermentado, su sabor, y
olor. Estos últimos son característicos de la bebida, en el caso de la consistencia se toma una
cuchara de madera y se observa la formación de un hilo fino de fermentado cuando se deja
caer, este debe ser consistente con un diámetro entre 6 a 10 veces menor que para el caso del
pulque. Para mejorar el aspecto del tepache es común el empleo de sustancias colorantes entre
las cuales las más empleadas son el azúcar quemada y colorantes naturales. Los contenedores
empleados en la fermentación pueden ser de plástico o madera con una capacidad de 80 a 200
litros, dependiendo de la producción, los cuales se tapan con tela de manta de cielo o un
material similar para impedir la entrada de insectos y al mismo tiempo permitir el escape del gas
generado durante la fermentación.
3.2 Microorganismos del tepache
Los microorganismos del tepache forman estructuras gelatinosas compactas llamadas
tibicos, estas zoogleas poseen color blanquecino o amarillento y son translúcidas u
opalescentes, atravesadas irregularmente por betas muy finas de forma irregular y de tamaño
variable desde unos pocos milímetros hasta unos dos centímetros. Los granos de tibicos están
compuestos por bacterias y levaduras, cuya asociación ha sido interpretada como una simbiosis
mutualista. Esta asociación es muy estable y al fermentar no permite o al menos no favorece el
crecimiento de otros microorganismos en los diversos sustratos donde se desarrolla. Los tibicos
se forman en productos de nopal, jugos de fruta (piña) y en agua endulzada. En sustratos
azucarados como el jugo de piña, los tibicos se forman al dejar el líquido en reposo y a la
intemperie, formando una nata blanca y delgada en la superficie, que al engrosarse, durante el
transcurso de la fermentación, se sedimenta y forma en el fondo los granos. Cuando el líquido
azucarado se deja fermentar por unos días se obtiene el llamado tepache pero si se deja
prolongar el tiempo de fermentación, la bebida se vuelve alcohólica y después acética, auque
de una concentración menor que la que se obtiene con bacterias acéticas (59).
La estructura de los granos de tibicos fue elucidada mediante microscopia óptica de
transmisión y de barrido establecieron que los granos están constituidos de una capa externa
compacta y de una estructura interna esponjosa. La capa externa, constituida por dextrana, está
densamente poblada por Lactobacilos, Streptococos y levaduras. La dextrana además está
constituida principalmente por D (1-6) glucopiranosilo, generado por Lactobacilos brevis. El
5
análisis por medio de un método especial de tinción, durante el proceso de formación de un
grano de tibico, mostró que las dextranas son más abundantes en la capa interna. La
compactación del grano está determinada por la presión interior de CO2 que se presenta
durante la fermentación y cuya presencia en el interior ahueca los granos (18, 31).
3.3 Procesos de fermentación de alimentos tradicionales fermentados con cultivo y sustrato mixto.
Las fermentaciones que se llevan a cabo en un laboratorio se realizan bajo condiciones
controladas, utilizando medios de crecimiento sintéticos o semi-sintéticos y con especies de
microorganismos bien conocidas, en contraste, en la naturaleza y en muchos procesos
tradicionales la fermentación se lleva a cabo bajo condiciones de escaso o nulo control con
“cultivo y sustrato mixto”. Por estas circunstancias se tiene poco conocimiento sobre estos
sistemas. En las fermentaciones con cultivo y sustrato mixto están presentes dos o más
microorganismos y el sustrato contiene múltiples fuentes que pueden cubrir el mismo
requerimiento nutricional. El cultivo mixto puede estar conformado de especies conocidas o no,
a la vez puede estar constituido por especies de un mismo grupo de microorganismos o varios,
ya sean mohos, levaduras o bacterias, todas las combinaciones posibles pueden ser
encontradas en los diversos alimentos tradicionales fermentados, algunos de ellos se
mencionan en los siguientes párrafos (33, 43).
3.3.1 Ventajas del empleo de cultivos mixtos
Las fermentaciones en cultivo mixto ofrecen algunas ventajas sobre una fermentación que
emplea solo un microorganismo, entre las ventajas se encuentran (4, 33):
• El rendimiento puede ser mayor. El yogurt se elabora mediante la fermentación de la
leche con Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus, Driessen demostró que
cuando estas especies crecen en cultivo individual producen, respectivamente, 24 mmol
y 20 mmol de ácido, en contraste con su producción de 74 mmol en cultivo mixto con la
misma proporción de inóculo, además de que el número de células de S. thermophilus
se incrementa de 500x106 UFC/ml a 880x106 UFC/ml en cultivo mixto con L. Bulgaricus.
• La velocidad de crecimiento puede ser más alta. En cultivo mixto un microorganismo
puede producir factores de crecimiento o componentes esenciales que beneficien a
6
otros microorganismos, puede también alterar el pH del medio y de ese modo, mejorar la
actividad de una o más enzimas, aun cuando la temperatura sea elevada, promoviendo
el crecimiento.
• Los cultivos mixtos son capaces de llevar a cabo transformaciones en múltiples pasos
que serían imposibles de realizar por medio de un único microorganismo. Por ejemplo
en la fermentación para elaborar miso y shoyu se emplea Aspergillus oryzae para hacer
primero el koji. El koji produce amilasa y proteasas, las cuales rompen el almidón del
arroz y las proteínas de la soya, estos componentes son empleados como sustrato por
bacterias ácido lácticas en la elaboración de miso y shoyu, con el objeto de producir
compuestos aromáticos y alcohol.
• En algunos cultivos mixtos se puede establecer una asociación marcadamente estable
de microorganismos. Aun cuando los cultivos sean preparados por individuos inexpertos
trabajando en condiciones no sanitarias, como ocurre en el ragi, en el cual se emplea
una mezcla de hongos, levaduras y bacterias que coexisten incluso aun después de
años de subcultivo. Probablemente la elaboración del primer cultivo iniciador (starter) se
establece por intento y error, y las condiciones de proceso son tales que la mezcla
puede competir contra otros contaminantes comunes.
• La mezcla de microorganismos puede propiciar la generación de compuestos que los
complemente entre sí a la vez que excluyan a microorganismos indeseables. Por
ejemplo, en algunos alimentos fermentados las levaduras pueden producir alcohol y las
bacterias lácticas, acido láctico y otros ácidos orgánicos cambiando las condiciones en
el sustrato, con lo cual se logra excluir la mayoría de las bacterias y mohos indeseables.
• El cultivo mixto permite una mejor utilización del sustrato. El sustrato para alimentos
fermentados está constituido siempre por una compleja mezcla de carbohidratos, lípidos
y proteínas. Los cultivos mixtos poseen un amplio espectro de enzimas y por esta
situación son capaces de atacar una amplia variedad de sustratos. Con la adecuada
selección de especies se puede mejorar la capacidad de cambiar o destruir
componentes tóxicos o nocivos que pueden estar presentes en el sustrato.
• El cultivo puede ser mantenido indefinidamente por gente no especializada con un
mínimo de entrenamiento, si las condiciones ambientales pueden ser mantenidas (por
ejemplo, la temperatura, cantidad de sustrato, tiempo de fermentación y tipo de
sustrato), por tanto es fácil mantener un inóculo mixto por largos periodos de tiempo y
llevar a cabo fermentaciones sucesivas con éxito.
7
• Ofrecen mayor protección contra la contaminación. En fermentaciones con cultivo mixto
las infecciones fágicas son pocas. En cultivos puros comerciales de fermentación,
incluidas las bacterias y actinomicetos, invariablemente ocurren infecciones fágicas y
pueden detener por completo la producción. Los cultivos mixtos por otro lado poseen
una amplia base genética de resistencia fágica, las fallas no ocurren frecuentemente, ya
que si una especie es infectada habrá otras especies que serán resistentes que puedan
continuar con la fermentación. En tales procesos, especialmente con una alta
concentración de inóculo inicial la contaminación no ocurre aún cuando las
fermentaciones son llevadas a cabo en contenedores y tanques abiertos.
• Mediante el empleo de cultivos mixtos es posible utilizar sustratos impuros y baratos. En
la práctica algunos productos fermentados siempre se obtienen de sustratos baratos y
estos son frecuentemente una mezcla de diversos materiales.
• Pueden proveer nutrientes necesarios para una mejor elaboración. Algunos
microorganismos como las bacterias del queso, son adecuadas para la producción del
producto fermentado, ya que además de participar en la formación del producto proveen
factores de crecimiento para lograr una óptima velocidad de elaboración, por otro lado el
empleo de vitaminas es costoso y dificulta el proceso. Así la adición de especies
simbióticas que provean factores de crecimiento es definitivamente una ventaja.
• La fermentación mediante el cultivo mixto puede mejorar el nivel de vitaminas en el
producto final, por ejemplo: En el pulque, por cada 100 g de producto tras la
fermentación se incrementa de 5 a 29 mg de tiamina, 54 a 515 mg de niacina y 18 a 33
mg de riboflavina; En el idli de la india (que es un producto de la fermentación ácida de
leguminosas, principalmente de los granos de la judía Vigna mungo), se mejora el
contenido de tiamina y riboflavina.
3.3.2 Desventajas del empleo cultivos mixtos
Algunas de las desventajas de emplear cultivos mixtos son (4, 33);
• El estudio científico de los cultivos mixtos es más difícil, debido a que más de un
microorganismo está involucrado, por ello es usual que los estudios bioquímicos se
lleven a cabo en cultivos con una sola especie y una fuente de carbono simple, con lo
que se tienen menos variables.
8
• En el proceso para patentar es más difícil definir el producto y los microorganismos
empleados.
• La contaminación de una fermentación es más difícil de detectar y controlar.
• Cuando dos o tres cultivos puros son mezclados, es posible que se requiere más tiempo
y espacio, en comparación a un cultivo con una sola especie.
• Uno de los grandes problemas en las fermentaciones con cultivo mixto es el control del
balance de la cantidad de los microorganismos involucrados. Sin embargo, esto puede
ser superado si el comportamiento de los microorganismos es entendido y esta
información es aplicada en el control.
• El balance de los microorganismos trae el problema del almacenamiento y el
mantenimiento de los cultivos. La liofilización presenta dificultades, por que en el
proceso las células de las diferentes especies mueren en diferente proporción, por lo
que el inóculo puede sufrir cambios radicales en su población. Hasta ahora se ha
establecido que el mejor camino para preservar un cultivo mixto es almacenar el liquido
completo en nitrógeno a -180 ºC. El cultivo almacenado para su utilización debe ser
puesto a prueba en una cantidad pequeña de medio y garantizar que el producto con las
características deseadas pueda ser obtenido en el tiempo esperado.
• Llevar a cabo el escalamiento de la producción puede ser bastante difícil, ya que las
condiciones fisicoquímicas en pequeña escala pueden variar considerablemente tras el
escalamiento, lo cual provoca que el metabolismo y subsecuentemente la participación
de las diferentes especies en el proceso de fermentación se vea afectada, como
solución en el caso de algunas salsas fermentadas se emplean un gran número de
fermentadores pequeños, aunque esto implica en general un gasto mayor.
3.4 Crecimiento microbiano
Desde los comienzos de la microbiología como ciencia ha habido mucha investigación
tendiente a entender los mecanismos del crecimiento microbiano, así como al desarrollo de
modelos que describan dichos mecanismos. Esta información brinda fundamentos y experiencia
que debe ser tomada en cuenta cuando se inician trabajos en este campo. En el estudio del
crecimiento microbiano se han empleado principalmente dos sistemas, el sistema por lote y el
sistema continuo. En el sistema por lote, al inicio se suministra al biorreactor todo el sustrato
que será consumido por los microorganismos, posteriormente se adiciona el inóculo
(microorganismos) y como resultado de esta acción el sustrato va siendo consumido por los
9
microorganismos a diferente velocidad conforme estos van creciendo, por tanto es implícito el
consumo del sustrato y el incremento de la concentración de la biomasa como una función del
tiempo; es necesario hacer énfasis en que en tal situación la composición del medio de cultivo y
la fisiología celular cambian durante el experimento. En contraste, en un sistema de
fermentación continuo la concentración del sustrato y la biomasa son independientes del
tiempo, esto se logra agregando sustrato fresco y removiendo parte del fermentado, permitiendo
que el cultivo crezca en las condiciones pre-establecidas, manteniendo su estado fisiológico. Si
se analiza el crecimiento microbiano en el tiempo en un sistema por lote se observa una típica
curva de crecimiento que puede ser dividida en fases distinguibles (ver figura 1). La curva de
crecimiento puede dividirse en las siguientes fases: fase lag, fase exponencial, fase estacionaria
y fase de muerte, las cuales se describen a continuación (6, 19, 20, 46).
Tiempo
Logaritmo de organismos viables por unidad de volumen.
Figura 1.- Curva típica del crecimiento microbiano: a) fase lag, b) fase exponencial, c) fase estacionaria, d) fase de muerte.
a. Fase lag o de retraso: esta es una fase donde las células se adaptan al medio y lo
adecuan para su crecimiento, por lo que éste no principia de inmediato sino después de
un cierto tiempo que puede ser breve o largo dependiendo de las condiciones del medio,
como son los parámetros fisicoquímicos y el estado fisiológico de las células vivas. De
esta manera si se toma una alícuota de un cultivo que crece exponencialmente y se
emplea como inóculo en medio fresco la fase lag no se observa y el crecimiento
exponencial continúa a la misma velocidad. Sin embargo, si el inóculo se toma de un
cultivo viejo (fase estacionaria) y se inocula en medio fresco generalmente se presenta la
fase lag, aún cuando las células del inóculo estén vivas. Esto se debe a que las células
generalmente agotan diferentes coenzimas esenciales u otros constituyentes celulares y
10
se requiere de cierto tiempo para su síntesis. La fase lag también se presenta cuando el
inóculo está formado por células dañadas (por tratamiento térmico, radiación o sustancias
químicas), en éste caso este tiempo es necesario para que las células puedan reparar el
daño. También se observa cuando una población se transfiere de un medio de cultivo rico
a uno pobre ya que para que continúe el crecimiento en un medio de cultivo en particular,
es indispensable que las células tengan un complemento íntegro de enzimas para la
síntesis de los metabolitos esenciales que no están presentes en dicho medio.
b. Fase exponencial: una vez alcanzadas las condiciones favorables para el crecimiento
cada célula se divide para formar dos células, cada una de las cuales también se divide
para formar dos células más y así sucesivamente, como consecuencia se observa un
crecimiento exponencial. La velocidad de crecimiento exponencial varía mucho de un
organismo a otro, por ejemplo, Salmonella typhi crece muy rápidamente con un tiempo de
generación de 20 – 30 minutos, mientras que Mycobacterium tuberculosis, crece muy
lentamente, con sólo una o dos duplicaciones por día. Aspectos que afectan la velocidad
de crecimiento pueden ser diversos, los que se manipulan habitualmente son la
temperatura y la composición del medio de cultivo. En general las bacterias crecen con
mayor rapidez que los organismos eucariotas y entre éstos últimos, los pequeños se
desarrollan más aprisa que los grandes.
c. Fase estacionaría: El crecimiento exponencial se detiene si los nutrientes indispensables
se agotan y/o la concentración de sustancias tóxicas, producto del metabolismo, presenta
niveles no tolerables por el micro-organismo, como resultado no hay incremento o
decremento en el número de células vivas. En esta fase aunque no hay cambios tan
apreciables como en la fase exponencial los microorganismos son fisiológicamente activos
y viables. De aquí se deduce que en un sistema cerrado no se puede llevar a cabo
indefinidamente el crecimiento exponencial.
d. Fase de muerte: Si la incubación continúa después de que una población alcanza la fase
estacionaria, las células pueden seguir vivas y continuar metabolizando, pero lo más
probable es que mueran, si esto último sucede la población se encuentra en la fase de
muerte. Durante esta fase la viabilidad disminuye lentamente y en algunos casos, la
muerte se acompaña por lisis celular.
En el proceso de implementación de modelos que tienen por objeto describir el
crecimiento microbiano también se han definido varios conceptos de importancia, uno de ellos
es el término de “Nutriente de control de crecimiento” el cual fue introducido en el modelo de
11
Monod que es uno de los mas ampliamente conocidos, este término no se debe confundir con
el de “nutriente limitante” usado en microbiología para describir un fenómeno de crecimiento
diferente. El término “nutriente limitante” se usa en el sentido estequiométrico para indicar que
cierta cantidad de biomasa puede ser producida con cierta cantidad de nutriente, es decir que la
disponibilidad de este nutriente en el medio delimita la densidad de biomasa que puede ser
alcanzada; mientras que el término “nutriente de control de crecimiento”, se usa para indicar
que la velocidad de crecimiento actual en cierto momento durante la fermentación es regida por
la concentración de un sustrato particular en ese mismo instante. Ambos términos han sido
frecuentemente comentados en la bibliografía (42, 52, 53), sin embargo el empleo de estos
modelos y sus términos en un basto número de casos no predice los resultados observados,
debido en principio a que los sustratos usualmente son mixtos, existiendo mas de una fuente de
nutriente de la cual depende el crecimiento microbiano, situación a la cual corresponden los
alimentos tradicionales fermentados (7, 35, 37, 47). Así por ejemplo, existe una gran
inconsistencia en los datos reportados para el modelo de Monod, incluso para un mismo
microorganismo en sustratos específicos (por diferencias que son hasta de dos órdenes de
magnitud) estas diferencias no pueden ser explicadas por el tipo de especie o algunas
deficiencias, pero es muy probable que dependan en gran parte del historial del cultivo, es decir
de como éste ha ido variando en el pasado, de ahí que durante un experimento cinético la
fisiología del cultivo cambie y pueda exhibir las propiedades llamadas “intrínsecas” y las
“extrinsecas”. Los parámetros “intrínsecos” dependen únicamente de la naturaleza del sustrato,
del tipo de cultivo de microorganismos y de las condiciones fisicoquímicas del medio, por lo cual
son independientes del historial del cultivo y son reproducibles. En contraste “los parámetros
extrínsecos” son un reflejo del historial de las células, de las características propias del
microorganismo y de las condiciones presentes en el medio, de aquí que son difíciles de
reproducir. Por ejemplo, cuando se inocula de manera recurrente un sistema continuo puede
observarse que, tras un período de tiempo, hay una disminución en la velocidad máxima de
crecimiento, mientras que en el sistema por lote es posible observar un aumento en la velocidad
máxima de crecimiento, estas dos situaciones son debidas a que los microorganismos se
adaptan a las condiciones a las cuales se ven expuestos (8, 15, 50).
12
3.5 Adaptación a cambios de concentración de nutriente
Para sobrevivir y competir exitosamente en la naturaleza, la mayoría de los
microorganismos son capaces de ajustar su fisiología celular respecto a su estructura y función
metabólica para superar los retos que les impone el medio (45). Es lógico pensar que esto
afectará las propiedades de crecimiento o degradación exhibidas para una célula, a pesar de
que estos cambios de adaptación ocurran a nivel del fenotipo, del genotipo o ambos. Por
ejemplo, los microorganismos son capaces de adaptar su crecimiento a diferentes
concentraciones extracelulares de sustrato por un ajuste drástico de sus propiedades de
consumo, las rutas estratégicas que han sido reportadas para microorganismos Gram negativos
y Gram positivos incluyen las siguientes: (i) un solo sistema de consumo exhibe diferentes
propiedades cinéticas dependiendo la concentración del sustrato utilizado, (ii) los
microorganismos utilizan dos o más sistemas de transporte de diferente afinidad, para
diferentes nutrientes, tales cambios pueden incluir modificaciones de los componentes de las
membranas, y (iii) otros cambios menos estudiados pueden presentarse, como la variación de
la capacidad catabólica y/o anabólica. Estas formas de adaptación, difieren considerablemente
en el tiempo con que se llevan a cabo. Si un sistema multifásico reacciona instantáneamente, el
cambio entre los diferentes sistemas de transporte puede ocurrir relativamente rápido, es decir
de minutos a horas, sin embargo la adaptación a nivel de la población se lleva a cabo en un
largo periodo de tiempo. Dos situaciones principales son usadas para llevar a cabo el estudio de
los cambios fisiológicos que toman lugar en los microorganismos cuando la accesibilidad a
sustrato particular es restringido: (i) el comportamiento en la ausencia de un nutriente particular,
y (ii) el crecimiento a bajas concentraciones de nutriente (52).
Por ejemplo, para diversas especies de bacterias se ha observado, que tras el cultivo
durante un largo periodo de tiempo en un sistema continuo, la densidad celular permanece sin
cambio y la concentración del sustrato residual decrece. Un estudio sistemático de este
fenómeno se realizó para el crecimiento de Escherichia coli en un cultivo empleando glucosa
como sustrato limitante, a diferentes velocidades de crecimiento, el experimento mostró que el
proceso de adaptación es reproducible y que procede más rápido cuando se emplean bajas
velocidades de crecimiento (29). El aumento de la capacidad de asimilación de la glucosa
muestra que el proceso es muy complejo, lo cual sugiere que existen cambios en las proteínas
de las membranas, inducidos por genes. La observación anterior particularmente sugiere que
durante el crecimiento en un sistema continuo con bajas concentraciones de glucosa, ésta es
13
absorbida por el sistema de transporte proteico maltosa/lactosa, más que por el sistema de
transporte de glucosa fosfotransferasa, el cual anteriormente había sido considerado el único
transporte relevante de glucosa en Escherichia coli en tales condiciones. Además se ha
observado que los sistemas de transporte de otros azúcares aumentan y se expresan en
concentraciones nanomolares de glucosa, con lo cual aumenta la capacidad de asimilación de
otros carbohidratos (13, 16). El proceso de adaptación de altas a bajas concentraciones de
sustrato y viceversa es reversible, este fenómeno ha sido reportado que sucede con bacterias
aisladas del agua de mar, cuando las bacterias son transferidas a sistemas que tienen altas
cantidades de sustrato, se observa que su capacidad de asimilación del sustrato disminuye.
Resulta por tanto evidente que un microorganismo puede competir exitosamente en diferentes
ambientes si modifica sus propiedades de asimilación de nutrientes, esto sugiere que estas
propiedades no pueden ser constantes como se ha descrito en un gran número de
investigaciones (21). De esta manera cuando se desea emplear microorganismos provenientes
de productos de la fermentación no controlada (como lo son los productos tradicionales
fermentados), no se debe perder de vista que tales microorganismos están siendo colocados en
ambientes diferentes y por ello se deberán tener en cuenta las variaciones resultantes para
ajustar al producto final esperado (4, 33).
3.6 Sistemas de fermentación con sustrato y cultivo mixto
Diversos aspectos de los sistemas de sustrato y cultivo mixto son en esencia
desconocidos por lo que desde el punto de vista práctico se pueden ver como una caja-negra y
por tanto son difíciles de interpretar. A la fecha diversos autores concuerdan que es prematuro
el esfuerzo por modelar sistemas de tal complejidad en términos cinéticos. Ello se ve reflejado
en los estudios de crecimiento en sistemas de cultivos y sustratos mixtos, de los cuales es
virtualmente imposible tener información individual de la densidad de biomasa de las diferentes
especies y sustratos debido a las técnicas con las que se cuenta usualmente y a los insumos
que implican. Por tanto es importante que cuando se investiga el crecimiento de un cultivo mixto
en un sustrato mixto, llevar a cabo experimentos que permitan obtener aproximaciones a tales
sistemas, de esta manera se pueden elucidar los aspectos del crecimiento microbiano y
describirlos en términos cuantitativos respecto a los diferentes factores. El problema puede ser
abordado empezando por experimentos de cultivos puros sobre un sustrato mixto y en
posteriores trabajos plantear condiciones más complejas (52).
14
3.6.1 Utilización de fuentes de carbono mixtas
Las cinéticas tradicionales se llevan a cabo bajo condiciones que permiten a un único
componente ser el responsable de controlar el crecimiento celular. Estas condiciones han sido
investigadas, probadas y confirmadas para cultivos bajo condiciones definidas en un laboratorio,
mediante el empleo de un medio sintético el cual cubre cada requerimiento fisiológico mediante
compuestos simples de alta biodisponibilidad. En contraste a las condiciones establecidas en un
laboratorio, el crecimiento en un ecosistema ocurre bajo condiciones más complejas, donde los
microorganismos tienen contacto con una gran variedad de componentes que pueden satisfacer
cada una de sus necesidades nutricionales (24, 52). En tales condiciones se ha observado un
comportamiento de crecimiento particular llamado “comportamiento diauxico”, en el cual un
microorganismo consume primero el nutriente por el que tiene más afinidad y al comenzar a
agotarse regula la expresión de sus genes y la actividad de enzimas con el objeto de poder
asimilar otro nutriente o nutrientes sustituibles, en una gráfica de crecimiento este
comportamiento se observa como dos fases de crecimiento exponencial (23, 28, 30, 36). El
fenómeno de crecimiento diauxico no sólo es causado por la fuente de carbono
(multicomponente), por ejemplo Streptococcus thermophillus muestra este comportamiento
cuando se cultiva en leche, debido a que el requerimiento de aminoácidos esenciales
(metionina 60 mg/l y ác. glutámico 200mg/l) no es cubierto, la leche tiene un contenido de
metionina y ác. glutámico de <1 y 45 mg/l respectivamente, de este modo S. thermophilus se ve
obligado a modificar aspectos de su metabolismo para asimilar los aminoácidos de la caseína y
cubrir su requerimiento nutricional (22). En las ultimas dos décadas, algunos estudios
publicados por diferentes grupos de investigación, han aportado evidencia de que en
condiciones de baja concentración de sustrato los microorganismos heterotróficos no se
restringen a consumir una sola fuente de nutriente, si no diversas simultáneamente, este es el
caso de Pseudomona aeruginosa, la cual se ha reportado, crece cuando se inocula en un medio
que posee una mezcla de 45 fuentes de carbono, cada una en una concentración de 1 μg por
litro, sin embargo ninguna de estas fuentes de carbono soporta sola el crecimiento microbiano a
esa concentración (57, 60).
En los sistemas de cultivo de sustrato mixto por lote se emplean generalmente
concentraciones de gramos por litro de fuentes de carbono, por ello la utilización secuencial de
las fuentes de carbono (comportamiento diauxico) son comúnmente consideradas más una
regla que una excepción. Sorprendentemente, los datos experimentales presentados
15
recientemente demuestran que en presencia de altas concentraciones de sustrato mixto, la
asimilación simultánea de más de una fuente de carbono ocurre en bacterias y levaduras,
independientemente de las condiciones, ya sean aerobias, anaerobias, termofílicas o
mesofílicas. Aún las combinaciones incompatibles de sustrato (por ejemplo galactosa y glucosa
en Escherichia coli), permiten el crecimiento con comportamiento diauxico cuando sus
concentraciones son del orden de miligramos por litro, menores concentraciones promoverán el
consumo de las dos fuentes simultáneamente (1, 49, 57).
Frecuentemente se ha observado que cuando un microorganismo se expone a fuentes
de carbono mixto este aumenta su velocidad especifica de crecimiento respecto a la alcanzada
con un único sustrato. Esto permite suponer que en tales casos los caminos de asimilación y
rutas metabólicas se saturan si se emplea una sola fuente de carbono, a diferencia de los
sustratos mixtos donde es posible emplear dos o más caminos distintos permitiendo una mayor
asimilación del nutriente, con lo cual la velocidad de crecimiento aumenta (22).
3.6.2 Fermentación con cultivo mixto
En las fermentaciones con cultivo mixto se emplea más de una especie de
microorganismos, estas especies pueden exhibir durante su crecimiento los diferentes
comportamientos de consumo que ya se han descrito, adicionalmente los microorganismos
establecen diferente relación entre sí describiendo interacciones que van desde la simbiosis
hasta el antagonismo, dentro de ellas las principales se encuentran (9, 10, 25):
• Comensalismo: asociación donde un microorganismo es beneficiado por otro
microorganismo sin que este último se vea beneficiado o afectado. Por ejemplo en
cultivo mixto, de Proteus vulgaris con Saccharomyces cerevisiae en un sistema continuo
con un medio libre de niacina, se observa la dependencia de Proteus vulgaris respecto a
Saccharomyces cerevisiae, que produce un factor para la formación de niacina. Por ello
en cultivo puro Proteus vulgaris no crece, mientras que Saccharomyces cerevisiae crece
en igual magnitud en cultivo puro y mixto con Proteus vulgaris ( 51).
• Amensalismo: asociación que es perjudicial para una especie y neutral para otra. En el
amensalismo, la especie no afectada libera agentes tales como antibióticos que pueden
restringir el crecimiento de otra población. Por ejemplo en el caso del cultivo de
Zymomonas mobilis y Saccharomyces cerevisiae en condiciones aerobias, donde el
16
crecimiento de S. cerevisiae es inhibido por el acetaldehído producido por Z. mobilis
(49).
• Mutualismo: se establece una relación obligatoria de los microorganismos para
sobrevivir y todos se benefician de ella. Un caso de mutualismo se observa entre
Lactobacillus arabinosus y Streptococcus faecali, los cuales producen fenilalanina y
acido fólico respectivamente, aminoácidos necesarios para su crecimiento (17).
• Sinergismo: Dos microorganismos se benefician de su relación pero su asociación no
es obligatoria. El sinergismo puede verse reflejado en su crecimiento o en la producción
de algún metabolito. Este es el caso de Streptococcus thermophilus y Lactobacillus
bulgaricus, que cuando se cultivan juntos en leche aumentan su producción de ácido en
32% (33).
• Competición: se establece una asociación interactiva entre dos o más especies, las
cuales requieren algunos nutrientes limitados para su crecimiento, de manera que
crecen a velocidades inferiores debido a que comparten el sustrato. Y solo aquellos para
los cuales las condiciones sean más favorables y muestren mejor actividad metabólica
harán un mayor uso del sustrato. Los microorganismos que establecen esta interacción
no son eliminados, y pueden establecer una coexistencia estable (5).
3.7 Métodos comúnmente empleados en la identificación microbiana
En la mayoría de los casos la identificación no se realiza con base a un solo método,
sino a la combinación de más de uno, por ejemplo: identificación de bacterias con base a
criterios morfológicos, tinción diferencial, pruebas bioquímicas y serológicas. Los métodos más
utilizados para la identificación microbiana los podemos clasificar en (28, 45, 47, 48, 49):
I. Métodos basados en criterios morfológicos: Los rasgos morfológicos (estructurales)
han ayudado a los taxonomistas por muchos años a clasificar organismos. Los
organismos superiores tienen rasgos anatómicos tan diferentes que pueden ser fácilmente
utilizados en su clasificación, sin embargo los microorganismos lucen bajo el microscopio
tan similares que se dificulta ésta. Sin embargo, aun cuando la morfología celular brinda
poca información sigue siendo útil para la identificación bacteriana. Aún cuando los
microorganismos son tan similares bajo el microscopio, pueden diferir en propiedades
bioquímicas, fisiológicas y/o serológicas.
17
II. Métodos basados en tinción diferencial: Es posible sacar conclusiones en relación con
la morfología de un microorganismo examinando una lámina con éstos que ha sido
sometida a un proceso de tinción diferencial. Estos criterios morfológicos encabezan las
primeras etapas del proceso de identificación microbiana. Por ejemplo la mayor parte de
las bacterias, teñidas con la tinción de Gram, las podemos clasificar como gram positivas
o gram negativas, de acuerdo al color final del microorganismo (Violeta-gran positivo ó
Rojo-gram negativo). Existen otras tinciones diferenciales que permiten evidenciar otras
características de los microorganismos, tales como la presencia de esporas, componentes
estructurales de la pared celular, o si éste esta vivo ó muerto.
III. Métodos basados en pruebas bioquímicas: Las pruebas bioquímicas han sido
ampliamente utilizadas para diferenciar microorganismos. Estas pruebas se fundamentan
en la capacidad diferencial que tienen los microorganismos para asimilar determinadas
fuente de carbono, degradar compuestos, producir compuestos coloreados, o bien
manifestar la presencia de enzimas, por citar algunas. Aún microorganismos fuertemente
relacionados pueden separarse en diferentes especies con base a pruebas bioquímicas,
para ello una vez efectuados los ensayos respectivos se emplean flujogramas que poseen
los resultados presuntivos para la identificación de un gran número de microorganismos
que ya han sido estudiados. Se denominan resultados presuntivos debido a que cuando
se elaboran los flujogramas de 100 repeticiones para una prueba, es común que las 100
no sean positivas. Los procedimientos a seguir para la identificación de los
microorganismos por éstos método, se resumen en procedimientos de enriquecimiento,
aislamiento y pruebas bioquímicas para su identificación final. Una limitación de éstos
método de identificación es la aparición de cepas mutantes que puedan dar origen a
cepas con características diferentes.
Las pruebas bioquímicas pueden ser en medio líquido, semisólido o sólido, que
tienen una formulación que permite evaluar alguna o algunas características. Existen
varias metodologías para elaborar las pruebas bioquímicas una de ellas, que en la
actualidad sigue siendo empleada, es la propuesta por Van Der Walt, que esta descrita en
el tratado “The Yeast” de Lodder (1970), y que ha sido empleada en trabajos referentes al
aislamiento e identificación de levaduras de diferentes alimentos tradicionales
fermentados de origen mexicano. Desafortunadamente este método es tedioso, ya que
requiere de un tiempo considerable para la preparación de las pruebas, por otro lado para
18
los casos en que se desea efectuar pruebas o estudios pequeños no repetitivos esta
opción es bastante costosa ya que una sola fuente de carbono puede llegar a costar entre
$ 1000 y $ 1500 M.N., sin mencionar el considerable espacio y cantidad de material que
se requiere. Una opción más versátil es hacer uso de sistemas comerciales miniaturizados
de pruebas bioquímicas. Estos sistemas han sido diseñados para realizar varias pruebas
bioquímicas de manera simultánea y permitir la identificación en un tiempo más corto
empleando menos material y espacio. Cada uno de los ensayos consta de tubos
miniaturizados que contienen el medio de cultivo, el cual se hidrata al ser inoculado con la
suspensión bacteriana pura. Las pruebas se clasifican en grupos en los cuales, a cada
uno de resultados positivos de los ensayos se le asigna un determinado valor numérico,
obteniéndose un código que corresponde a un determinado género o especie en la base
de datos. Existen muchas casas comerciales que producen sistemas miniaturizados para
diferentes tipos de microorganismos y cada casa fabricante tiene su propia presentación,
algoritmos de identificación, manuales, etc. Biomerieux S.A. de C.V. es una empresa que
elabora este tipo de sistemas de identificación, para el caso de levaduras ofrece el
sistema API 20 AUX, el paquete de este sistema incluye 25 galerías y cada galería evalúa
la capacidad de asimilación de 19 fuentes de carbono en un lapso de tres días de
incubación.
IV. Métodos basados en tipificación con fagos: La interacción entre un virus bacteriano
(fago) y su microorganismo sensible es sumamente específica, ya que el proceso de
adsorción se encuentra mediado por receptores específicos tanto en el virus como en la
célula. Para ello a una placa con medio de cultivo sólido, inoculado con un cultivo puro de
un determinado microorganismo, se le añade una alícuota de un fago específico; éste
puede ocasionar la lisis de los microorganismos, hecho que se evidencia en el cultivo
como zonas claras definidas, denominadas placas, que indican que hubo infección y lisis
celular. El uso de fagos específicos permite identificar y subclasificar microorganismos
dentro de una misma especie.
V. Métodos basados en ensayos serológicos: Los métodos serológicos, implican la
utilización de preparaciones de inmunoglobulinas específicas provenientes del suero o de
un reactivo, y que pueden ser de gran utilidad en la identificación microbiana en muestras
puras o en muestras biológicas. Cada uno de los métodos tiene su fundamento particular
pero, en líneas generales, todos se basan en la reacción de un antígeno presente en el
19
agente microbiano con su anticuerpo correspondiente. La solución que contiene los
anticuerpos se denomina antisuero, el anticuerpo puede ir marcado mediante alguna
sustancia fluorescente.
VI. Métodos basados en biología molecular: En la actualidad adquiere más importancia el
uso de métodos basados en biología molecular, los cuales pueden detectar determinadas
secuencias de ADN que son propias de un determinado agente microbiano. El método
que se está utilizando ampliamente en los laboratorios de diagnóstico es el PCR
(Polymerase Chain Reaction), que se aplica generalmente para la identificación de-
microorganismos que no pueden ser cultivados por los métodos convencionales. A través
de este método, puede aumentarse la cantidad de ADN hasta niveles detectables
mediante electroforesis o mediante sondas de ADN.
4 OBJETIVOS 4.1 OBJETIVO GENERAL
Contribuir en el desarrollo de un inóculo para la elaboración, fiable y reproducible, de
una bebida tipo tepache, mediante la realización de pruebas de fermentación en cultivo puro y
mixto de levaduras aisladas e identificadas de manera presuntiva en esta bebida.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Llevar a cabo una investigación de campo sobre las diversas materias primas utilizadas
y acerca de los métodos de fermentación empleados para la elaboración de tepache.
• Llevar a cabo un aislamiento de levaduras del tepache e identificarlas de manera
presuntiva mediante el sistema API 20 C AUX de Biomeireux.
• Realizar pruebas de fermentación en cultivo puro de las cepas de levadura aisladas y
en cultivo mixto con Saccharomyces cerevisiae.
20
5 MATERIALES Y MÉTODOS 5.1 Aislamiento e identificación de levaduras del tepache Con el objeto de aislar e identificar levaduras del tepache se llevó a cabo la siguiente
secuencia experimental; se colectaron muestras de diferentes lugares, las cuales fueron
degustadas seleccionando las que presentaron mejor sabor a un producto fermentado, a estas
muestras se les llevó a cabo varias determinaciones analíticas, posteriormente se cuantificó las
levaduras de las muestras por vaciado en placa y de los cultivos obtenidos se realizó el
aislamiento por estría múltiple. Las levaduras aisladas, fueron propagadas con el fin de obtener
suficiente cepa para posteriores análisis y para su mantenimiento. Finalmente se procedió a
realizar la identificación mediante el estudio de sus características fisiológicas, morfológicas y
bioquímicas. La secuencia experimental descrita se muestra esquemáticamente en la figura 2.
Muestreo de tepache (Mercados de Hidalgo, Estado de México y
Distrito Federal)
Selección (Degustación)
Determinaciones analíticas (pH, Acidez, Peso seco,
Cenizas, Sólidos disueltos)
Aislamiento (Estría múltiple en
medio PDA)
Propagación (Extensión con varilla
en tubo inclinado)
Identificación de levaduras (Características fisiológicas, morfológicas y bioquímicas)
Conteo en placa de levaduras (Medio papa dextrosa agar)
10-n… 10-n2 10-1
Figura 2.- Secuencia experimental seguida para llevar a cabo el aislamiento e identificación de las levaduras del tepache.
21
5.1.1 Muestreo y transporte de la muestra Se consideraron los lineamientos descritos en la NOM-109-SSA1-1994. Las muestras
fueron compradas en la presentación más grande disponible. Cuando fue posible se solicitó que
el producto fuera néctar de tepache (fermentado no diluido). En todos los casos, el vendedor
hizo la toma de muestra y retiro el hielo, posteriormente el producto se etiquetó y se introdujo en
una hielera, se transportó al laboratorio y se mantuvo en refrigeración a 4ºC hasta realizar las
determinaciones analíticas previstas (no más de 48 horas).
5.1.2 Conteo en placa
Para una muestra dada, previamente homogeneizada mediante agitación, se tomó 1,0
ml, del cual se realizaron las diluciones necesarias en tubos con solución estéril de peptona al
0.1% siguiendo las recomendaciones indicadas en la NOM-110-SSA1-1994. De la dilución
seleccionada se tomó 1,0 ml y se inoculó por el método de vaciado en placa, de acuerdo a la
norma NOM-111-SSA1-1994, con la variante de que el medio empleado para el conteo en
pruebas de fermentación con cultivos mixtos fue un medio constituido. El medio una vez
inoculado se mantuvo a temperatura ambiente por 5 días, después de este tiempo se realizó el
conteo en las placas que presentaron entre 10-150 colonias.
5.1.3 Tinción de Gram
De una placa de agar dada se tomó una colonia y se extendió en un porta objetos, se
secó a temperatura ambiente y flameó para la fijación; para la tinción se adicionó: cristal violeta
(1 min), lugol (1 min), alcohol (20 seg), y finalmente se empleó safranina durante 30 segundos.
Entre cada adición se utilizó agua destilada para enjuagar (12).
5.1.4 Preparación del inóculo en medio líquido
Para la preparación del inóculo se utilizaron 75 ml del medio de cultivo líquido glucosa-
extracto de levadura peptona (GELP) contenidos en un matraz de 250 ml (ver tabla 1), el cual
se inoculó mediante una asada de una cepa pura y se mantuvo a temperatura ambiente por 72
horas.
5.1.5 Preparación de inóculo en medio sólido Para la preparación del inóculo, se empleó un medio de cultivo glucosa-extracto de
levadura peptona agar (GELPA-ver tabla 1) el cual fue inoculado con una cepa pura mediante
estría múltiple y fue mantenido a temperatura ambiente por 5 días.
22
Tabla 1.- Metodología empleada en la determinación de las características morfológicas y fisiológicas consideradas para el estudio de las levaduras.
I.- CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS
A) Macromorfología o características
culturales Descripción
1. Crecimiento en medio líquido (GELP) Inóculo: cultivo líquido
Medio: Glucosa-extracto de levadura peptona (GELP): glucosa, 20g; extracto de levadura, 5g; peptona, 10g; agua destilada 1000 ml. Incubación: Temperatura ambiente, 5 días
2. Crecimiento en medio sólido (PDA) Inóculo: asada de un cultivo en medio sólido
Medio: Glucosa-extracto de levadura peptona agar (GELPA): glucosa, 20g; extracto de levadura, 5g; peptona, 10g; agar, 20g, agua destilada 1000 ml. Incubación: Temperatura ambiente, 5 días
B) Micromorfología 1. Características de la reproducción sexual o vegetativa.
Medio: GELPA Inóculo: asada de un cultivo en medio sólido Incubación: Temperatura ambiente, 5 días
2. Micromorfología en medio sólido de las células (GELPA).
Medio: GELPA Inóculo: asada de un cultivo en medio sólido Incubación: Temperatura ambiente, 5 días
II.- CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS Y BIOQUÍMICAS
A) Utilización de compuestos de carbono
1. Asimilación en sistema de identificación API 20C AUX
Inoculación: se disolvió 100 μl en medio API C , de una suspensión de levaduras 2 McF provenientes de cultivos en medio sólido, y se inocularon las cúpulas de la galería API 20C. Incubación: Se mantuvo a 29ºC +- 2ºC, durante 3 días, en la cámara de incubación API 20C.
3. Asimilación en medio de cultivo sólido
Inóculo: dilución de cultivo líquido.
Medio: X_ELPA, X: Sorbitol, manitol, glicerol, sacarosa, maltosa, galactosa, glucosa. Incubación: Temperatura ambiente, 10 días
B) Crecimiento en medio de cultivo de alta presión osmótica (GELPA-NaCl) Inóculo: dilución de cultivo líquido.
Medio: GELPA-NaCl (1 - 1 -10% p/v) Incubación: Temperatura ambiente, 5 días
C) Crecimiento en medio de cultivo de alta acidez (GELPA - ácido tartárico)
Inóculo: dilución de cultivo líquido.
Medio: GELPA-Ácido Tartárico (0.14 – 0.7 - 0.42% p/v) Incubación: Temperatura ambiente, 5 días Medio: GELPA-Ácido Tartárico (0.5- 1 -0.9% p/v) Incubación: Temperatura ambiente, 10 días.
D) Densidad de biomasa en medio líquido (GELP)
Inóculo: dilución de cultivo líquido.
Medio: Glucosa-extracto de levadura peptona (GELP): glucosa, 20g; extracto de levadura, 5g; peptona, 10g; agua destilada 1000 ml. Incubación: Temperatura ambiente, 5 días.
Nota: En todos los casos se empleó un inoculo de cultivos jóvenes.
23
5.1.6 Aislamiento y conservación de las levaduras
El aislamiento de las levaduras para cada una de las muestras de tepache se llevó a
cabo mediante el uso de la técnica de sembrado por extensión con varilla y estría múltiple en
medio papa dextrosa agar (PDA). De las diferentes siembras realizadas se observaron las
diversas morfologías de levaduras y se seleccionaron de cada morfología 10 colonias las
cuales, para su mantenimiento, se resembraron en medio PDA en tubo inclinado. Las cepas
puras así obtenidas se resembraron en medio PDA por estría simple con el fin de obtener un
cultivo joven para ser observado en fresco y mediante la tinción de Gram, utilizando un
microscopio a 100X. A partir de estas observaciones se seleccionaron cinco cepas con
morfología similar y se sembraron en tubo inclinado para análisis posteriores. Todos los cultivos
se hicieron por duplicado y se conservaron en refrigeración a 4 ºC.
5.1.7 Identificación de las levaduras aisladas
Para la identificación de las levaduras se tomaron en cuenta los criterios y métodos
reportados en investigaciones previas del tepache (3, 11, 27, 32, 54, 55, 56), en los cuales se
ha empleado el método de identificación propuesto por Van Der Walt, en este trabajo solo se
emplearon algunas de estas pruebas y el sistema de identificación API 20 AUX (ver cuadro 1),
para poder identificar las cepas previamente aisladas con las correspondientes reportadas en
trabajos anteriores. Con el objeto de formular medios selectivos para poder llevar a cabo la
cuantificación en las pruebas de fermentación en cultivo mixto de una de las levaduras
individuales, se efectuaron algunas pruebas en medio sólido que, originalmente, en el método
propuesto por Van Der Walt se llevan a cabo en medio líquido (medios de alta acidez - “ácido
tartárico”, alta presión osmótica – “NaCl” y asimilación de carbohidratos).
5.2 Métodos analíticos
El seguimiento de la fermentación y las determinaciones fisicoquímicas de la bebida de
tepache se llevaron a cabo empleando las siguientes metodologías:
5.2.1 Determinación de peso seco Se pesaron 25g de la muestra (sólida o líquida) en una cápsula de porcelana a peso
constante. La cápsula con muestra se colocó en una estufa (Thermolyne OV19200) a 100 ºC
por 24 h, después de este tiempo se atemperó en un desecador por un lapso de 30 minutos e
inmediatamente se pesó y se registró el valor obtenido.
24
5.2.2 Determinación de cenizas La muestra que resultó de la determinación de peso seco se colocó dentro de una mufla
(Raypa HM-9) a 600 ºC por 3 horas, transcurrido este tiempo se disminuyó la temperatura a 100
ºC para sacar la muestra y colocarla posteriormente en un desecador por 30 minutos,
finalmente se pesó y registró este valor.
5.2.3 Determinación de densidad En esta determinación se utilizó un picnómetro lavado previamente con agua destilada y
secado perfectamente; seguidamente éste se llenó con la muestra hasta el enrase, entonces se
pesó y se registró el valor obtenido, finalmente se reportó el valor de la densidad a la
temperatura indicada por el termómetro.
5.2.4 Determinación de sólidos disueltos
Se tomaron 0.3 ml del sobrenadante de una muestra centrifugada (SolBat M-25) a 13000
rpm y se colocaron en el refractómetro (Atago HSR-500). Las determinaciones se hicieron por
triplicado y se registró el promedio.
5.2.5 Medición de pH
En un vaso de precipitados de 50 ml se vaciaron 25 ml del sobrenadante de una muestra
centrifugada (Internacional Centrifuge 1S) durante 30 minutos a 3500 revoluciones por minuto
(rpm), posteriormente el electrodo del potenciómetro (Corning ion meter 450) se colocó dentro
de la muestra en agitación y una vez alcanzado el equilibrio se registró el valor de pH. El
potenciómetro se calibró utilizando los buffers de referencia de pH 4, 7 y 10.
5.2.6 Determinación de acidez
La determinación de acidez se llevó a cabo a través de la segunda derivada de la curva
de equilibrio (pH vs Gasto en ml), mediante la cual se obtuvo el gasto en el punto de equilibrio,
trazada por medio de una solución 0.05 N de NaOH, con la ayuda de un potenciómetro
(Corning ion meter 450). Para esta determinación se emplearon 25 ml de muestra y la acidez
fue expresada en porcentaje peso-volumen de ácido acético empleando la siguiente relación:
% deácidoacético=
100 ml 0.05 N Gastoenlitros 60 gr molácidoacéico
25 ml
25
5.2.7 Determinación de azúcares reductores directos Se colocaron en un tubo de ensaye 0,5 ml de muestra con una concentración de entre
0,1-1,0 g de glucosa por litro, a cada tubo se le agregaron 0,5 ml de DNS (solución de ácido 3-
5-dinitrosalicílico). Los tubos se colocaron en un baño a ebullición durante cinco minutos,
depuse se enfriaron en un baño con agua a 4ºC, se homogenizaron con la adición 5 ml de agua
destilada y se registraron las lecturas de absorbancia obtenidas mediante un espectrofotómetro
(Globe C5-200PC) a 540 nm. Para realizar la curva tipo se empleó una solución de glucosa de
1,0 g/l, de la cual se hicieron diluciones para obtener diez puntos de referencia de muestras que
tuvieran concentraciones entre 0,1 g y 1,0 g/l (13).
5.3 Pruebas de fermentación
Se llevaron a cabo pruebas de fermentación de las levaduras individuales y de
Saccharomyces cerevisiae en cultivo mixto con las otras levaduras aisladas, de acuerdo a la
siguiente metodología:
5.3.1 Preparación del sustrato Como sustrato se empleó una solución de piloncillo o panela (marca chedraui), esta se
preparó mediante la disolución de piloncillo en agua hasta una concentración de 50% (p/p), la
solución obtenida se centrifugó (Internacional Centrifuge 1S) a 3500 FGR por 30 minutos y el
sobrenadante se almacenó a -7°C. Para cada prueba de fermentación el sustrato almacenado
se diluyo hasta alcanzar una concentración de 16% (p/p) de sólidos disueltos. La solución
obtenida se esterilizo a 121 libras por pulgada cuadrada (psi) de presión durante 15 minutos,
para ello se empleo el esterilizador modelo C2250 de la marca Barnstead.
5.3.2 Sistema de fermentación Para llevar a acabo las pruebas de fermentación se emplearon contenedores de vidrio
de 3.9 l con boca ancha. Antes de cada prueba, los contenedores se lavaron, se cubrió la boca
con papel aluminio y se colocaron en una estufa a 200ºC por 4 h. A las tapas metálicas se les
acopló un papel filtro (Whatman número 4), y se esterilizaron junto con una manta sintética
(120ºC, 15 min.). Para llevar a cabo las pruebas de fermentación se empleó 1,0 kg de sustrato
el cual se deposito dentro del contenedor en condiciones estériles para su inoculación.
Posteriormente se colocó la tapa y se cubrió con la manta sintética.
26
5.3.3 Muestreo durante la fermentación
Las determinaciones de biomasa, pH, y acidez se llevaron a cabo inmediatamente
después de cada muestreo mientras que las de carbohidratos y azucares reductores de las
muestras colectadas durante una prueba fermentación se efectuaron al finalizar cada respectiva
prueba, para ello, se congeló 2,0 ml del sobrenadante de una muestra centrifugada (SolBat M-
25) a 13000 rpm durante 15 minutos. En la figura 3, se muestra el diagrama de la secuencia
experimental seguida en las determinaciones efectuadas durante una prueba de fermentación.
FERMENTADOR
Dilución y Sembrado en placa
MEDICIÓN DE
DETERMINACIÓN DE ACIDEZ
PH 25 ml de muestra
10-1 10-2 10-3 10-4
CONTEO DE UFC
1 ml / tubo
Centrifugación 13000 rpm, 15 min.
10-n1 10-n2
Dilución
MétodoDNS
0.6 ml/ tubo
1 ml 40 ml
MUESTREO
Centrifugación 3500 rpm, 30 min.
CARBOHIDRATOS REDUCTORES
SÓLIDOS DISUELTOS
Figura 3.- Secuencia experimental en las determinaciones efectuadas durante el seguimiento de la fermentación.
1.2 ml/ tubo
27
Las pruebas de fermentación tuvieron una duración de 8 días, para el caso de las
pruebas de fermentación en cultivo mixto entre las levaduras Saccharomyces cerevisiae con
Rhodotorula mucilaginosa y Saccharomyces cerevisiae con Candida guilliermondii, se tomo
una muestra diaria del primero al quito día y una al final de la prueba. En el caso de las pruebas
de fermentación de los cultivos puros, se llevaron a cabo de la misma manera que los cultivos
mixtos sólo que se hizo un muestreo adicional de la biomasa los días 1, 2, 6 y 7.
5.3.4 Experimentos planteados para realizar las pruebas de fermentación
Como se apuntó antes se realizaron pruebas de fermentación en cultivo puro y mixto. En
el caso de los cultivos mixtos se plantearon dos conjuntos experimentales, el objeto de estos
fue elucidar el efecto en las variables monitoreadas durante el proceso de fermentación cuando
se emplean cultivos mixtos y se modifica la proporción de una levadura respecto a la otra en el
inóculo inicial, específicamente cuando se varía la proporción de Saccharomyces cerevisiae
respecto a Candida guilliermondii ó Rhodotorula mucilaginosa. La concentración inicial de UFC/
ml de cada una de las cepas y su proporción para cada prueba de fermentación, se muestran
en las tablas 2 y 3 para los conjuntos de experimentos correspondientes a LVB-LVC y LVB-
LVR, respectivamente. De manera que para trazar la superficie de respuesta se emplean como
variables independientes la concentración de LVB en el inóculo inicial y el tiempo. En el caso de
las pruebas de fermentación en cultivo puro se tomó una alícuota de un cultivo líquido joven y
se inoculó en el respectivo fermentador, estas corresponden a las pruebas de fermentación 1, 2
y 3.
Tabla 2.- Diseño experimental LVB - LVC
Proporción Prueba de fermentación LVB UFC/ml LCV UFC/ml UFC/ml
Totales LVC LVB
4 1,35x101 2,78x104 2,78x104 206250 1
5 2,03x100 5,57x103 5,57x103 2750 1
6 1,15x102 2,19 x102 3,34x102 2 1
7 1,46x103 1,17x101 1,47x103 1 125
8 3,87x105 1,46x101 3,87x105 1 26481
9 3,87x105 6,50x102 3,87x105 1 5958173
28
Tabla 3.- Diseño experimental LVB-LVR
Proporción Prueba de fermentación
LVB UFC/ml LVR UFC/ml UFC/ml
Totales LVR LVB
10 1,25x102 2,25x105 2,25x105 18022500 1
11 1,88x101 1,13x105 1,13x105 600750 1
12 7,57x100 9,37x103 9,37x103 1237 1
13 1,14x102 9,37x103 9,48x103 82 1
14 5,70x103 1,50x103 7,20x103 1 4
15 5,70x103 1,00x102 5,80x103 1 57
Para realizar los conteos de UFC de las pruebas en cultivo mixto se emplearon para
cada diseño dos medios de cultivo en cada uno de los cuales creció solo una de las levaduras
de las dos implicadas, esto con el propósito de que no hubiera interferencia en los conteos
individuales de las levaduras. En el diseño experimental LVB – LVC se empleo los medios
SELPA (Sorbitol extracto de carne levadura peptona agar) para el conteo de LVC y GELPA
(Glucosa extracto de carne levadura peptona agar) con NaCl al 5% p/v para el conteo de LVB,
en el caso del diseño experimental LVB – LVR se empleo los medios SELPA para el conteo de
LVC y GELPA con ácido tartárico al 0.9% p/v para el conteo de LVB.
29
6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1.1 Selección de las muestras de tepache
El muestreo de las bebidas de tepache se llevó a cabo en algunos mercados del Distrito
Federal, Estado de México e Hidalgo, las muestras colectadas fueron degustadas con el
objetivo de seleccionar aquellas que fueron producto de la fermentación y no de una
formulación con ácido acético. Se colectaron 13 muestras de las cuales se seleccionaron 5,
estas se etiquetaron como: M1, M2, M3, M4 y M5. El origen de las muestras objeto del presente
estudio se presenta en la tabla 4.
Tabla 4.- Origen de las muestras de tepache.
Muestra Origen
M1 Edo. de México, Municipio de Tecamac, Colonia San Martín, “Mercado – néctar”
M2 Edo. de México, Municipio de Ecatepec, Colonia Tulpetlac, “Mercado – bebida”
M3 México D.F., Delegación Cuauhtémoc, Zócalo, “Centro Histórico - bebida”
M4 Edo. de Hidalgo, Ciudad Pachuca, “Puesto establecido de tacos - bebida”
M5 Edo. de México, Municipio de Huehuetoca, Colonia Santa Maria, “Mercado – néctar”
Tabla 5.- Resultados de determinaciones analíticas realizadas en el tepache.
Origen pH % de ácido
acético
Peso seco (% p/v)
Cenizas (% p/v)
Sólidos disueltos (% p/p)
Conteo de Levaduras (UFC/ml)
M1 - Néctar 3,42 0,1896 16,568 0,1159 16,7 4,70E+05
M2 - Bebida 3,96 0,0924 12,813 0,0376 12,8 5,60E+04
M3 - Bebida 4,14 0,0732 10,584 0,0157 10.6 4,20E+05
M4 - Bebida 3,77 0,0876 9,645 0,0188 9,7 6,90E+05
M5 - Néctar 3,44 0,1752 11,438 0,0548 11,5 9,00E+05
6.2 Determinaciones analíticas realizadas al tepache
Las determinaciones realizadas en las diferentes muestras de tepache se muestran en la
tabla 5. Estas determinaciones revelan en primer lugar que el tepache es una bebida ácida cuyo
néctar tiene un pH próximo a 3.4, con una acidez cercana a 0.18 % de ácido acético y una
30
densidad de levadura suspendida del orden de 4x105 UFC/ml. Se observa también una gran
variabilidad entre los diferentes parámetros medidos de las diferentes muestras, lo cual era de
esperarse en virtud de la diversidad de materias primas y procedimientos de preparación de
esta bebida. La amplia diferencia en el peso seco de las muestras (entre 9,6% a 16,5%) se
atribuye a la proporción de edulcorante empleado en la bebida, lo cual se ve corroborado por la
determinación de sólidos disueltos (por refractometría). La diferencia en el contenido de cenizas
entre las muestras M1 y M5 (néctares) se debe posiblemente a la diferencia en fuentes de
carbono empleados en cada caso para la elaboración de la bebida.
Tabla 6. –Proporción de las diferentes morfologías observadas en el aislamiento.
Morfología Muestra
R1 (UFC) R2 (UFC) R3 (UFC)
M1 20 7 0
M2 20 60 20
M3 20 0 300
M4 20 3 2
M5 20 55 0
**Ver anexo 1, figura 4 y 5
6.3 Aislamiento de levaduras
Los aislamientos realizados a las cinco muestras dieron por resultado, para el caso de
levaduras, tres morfologías bien diferenciadas, etiquetadas como R1, R2 y R3. Una de ellas
(R1), concordó con la morfología descrita para Saccharomyces cerevisiae, otra correspondió a
colonias mate de color café y elevación plana (R2) y la última a colonias semi-brillantes de color
rosa-coral (R3). Los conteos por extensión con varilla realizados a las muestras mostraron
aspectos interesantes referentes las proporciones de las diversas macromorfologías de
levaduras antes mencionadas (ver tabla 6). Las muestras M2 y M5 presentaron, por ejemplo, 60
y 55 UFC de R2, respectivamente, por cada 20 UFC/ml de R1, en contraste con 7 y 3 UFC/ml
para M1 y M4 y más aun con M3 en la cual no se observó la presencia de R2. Las levaduras
con morfología R3 solo estuvieron presentes en tres de las muestras y su proporción respecto
a R1 fue bastante amplia al igual que para R2. Es pertinente aclarar que estos valores solo son
cualitativos y no cuantitativos en virtud de que las diferentes morfologías no se encontraron en
31
todos los casos dentro del rango recomendado en las Normas Oficiales Mexicanas para ser
cuantificadas y que para tal objetivo sería mejor emplear medios selectivos que evitaran
interferencias en el crecimiento de unas levaduras con otras, o bien determinar la densidad de
las poblaciones individuales mediante el empleo de citometría de flujo y sondas de 16S RNA,
que permiten mediciones precisas y rápidas (36, 44).
Tabla 7.- Características morfológicas. Macromorfología
LVR LVC LVB Crecimiento en medio líquido (GELP) Abundante sedimento, el medio se observó turbio con presencia de biomasa en la superficie. Cuando se agitó el medio aumentó la viscosidad y la biomasa sedimentada no fue fácil de suspender.
Poco sedimento en comparación con LVB, el medio se observó turbio y presentó la formación de una película de biomasa en la superficie. Cuando se agitó el medio la biomasa fue fácil de suspender.
Sedimento abundante, el medio permaneció semi-cristalino. Cuando este se agitó se observó la formación de abundante espuma, la suspensión de la biomasa sedimentada fue fácil de lograr.
Crecimiento en medio sólido (PDA) Colonias circulares de consistencia suave, elevación convexa, color rosa-coral, semi-brillantes y de 3-4 mm de diámetro.
Colonias circulares de consistencia suave, elevación plana, color café claro, mate, borde entero, de 3-4 mm de diámetro.
Colonias circulares de consistencia butirosa, borde entero, color blanco-crema, semi-brillantes y 2-4 mm de diámetro.
Micromorfología
Reproducción sexual o vegetativa (GELPA)
Gemación multilateral Gemación multilateral Gemación multilateral Morfología en medio sólido (GELPA) Células esferoidales o globosas, las ascas jóvenes son esferoidales o elípticas.
Células ovoides, esferoidales, elipsoidales o alongadas, cadenas simples o ramificadas.
Células esféricas u ovales, las ascas jóvenes son esferoidales o elípticas.
**Ver anexo 1, figura 6 y 7
32
6.4 Identificación presuntiva de levaduras del tepache
Las tres morfologías de levaduras obtenidas de los aislamientos antes mencionados
correspondieron, como se muestra en los resultados de las tablas 7-11, a tres cepas que ya han
sido reportadas en otros estudios del tepache. Los resultados obtenidos permitieron identificar
de manera presuntiva a las cepas como, Saccharomyces cerevisiae (LVB) que fue aislada del
tepache y reportada por Herrera y Ulloa (1982)59, Candida guilliermondii (LVC) y Rhodotorula
mucilaginosa (LCR) que fueron aisladas por primera vez de tibicos del tepache por Monroy
(1991) 32. La tabla 7 resume los resultados de las características morfológicas. Monroy (1991)32,
reporta para la morfología colonial de LVC tiene un color blanco en medio GELPA, en el
presente aislamiento se observó una coloración café claro en medio agar papa dextrosa (PDA),
aunque también se ha observado ligeramente amarilla en agar dextrosa de Sabouraud (46),
por otro lado se debe tener en cuenta que la morfología colonial se puede ver modificada
severamente debido a la adaptación de la condiciones favorables del laboratorio (43) por lo
demás las características morfológicas para las diferentes cepas concuerdan con las
reportadas.
En la tabla 8 se muestran los resultados de la asimilación de carbohidratos, en el
sistema de identificación API 20CH AUX y en medio sólido de cultivo X_ELP. Para el caso de
LVR, estos resultados se apegaron a la “probabilidad de reacciones positivas” (biocódigo)
reportadas para Rhodotorula mucilaginosa, dando positivo en la asimilación de los
carbohidratos con más del 80% de probabilidad. Tras estas pruebas bioquímicas LVB se
identificó presuntamente como Saccharomyces cerevisiae, pues dio positivo para D-glucosa,
para el cual el biocódigo indica 100 %, pero negativa para D-sacarosa (90 %), tras esta
incertidumbre se realizaron pruebas de fermentación en condiciones anaerobias las cuales
revelaron la producción de etanol y CO2, características de Saccharomyces cerevisiae,
reforzando esta identificación, por otro lado cuando se realizaron medios sólidos con los
carbohidratos sacarosa, galactosa y maltosa, en los tres casos fue capaz de crecer,
reafirmando características correspondientes de Saccharomyces. LVC se identificó
presuntamente como Candida guilliermondii pues dio positivo en todos los carbohidratos de
esta especie, reportados con una probabilidad mayor de 70% a excepción de D-sorbitol y Metil-
αD-Glucopiranosido. Esta levadura tiene similar biocódigo de reacciones positivas que Candida
famata, e incluso ambas especies de Candida, según se ha reportado, han sido aisladas a partir
de tibicos del tepache y en el manual Wadsworth Center 2003 (47) se menciona que estas
33
especies han sido frecuentemente confundidas. En este trabajo se tomó como criterio para
reportar a LVC como Candida guilliermondii, con base a que Candida famata tiene 100% en la
asimilación de D-sorbitol, en el cual LVC dio negativo.
Tabla 8.- Asimilación de compuestos de carbono, características fisiológicas y bioquímicas de las levaduras estudiadas.
A) Asimilación en sistema de identificación API 20C AUX LVR LVB LVC
Carbohidrato Resultados API Resultados API Resultados API
Ninguno (Blanco) - 0 - 0 - 0 D-glucosa + 100 + 100 + 100 Glicerol - 60 - 8 + 99 2-ceto-Gluconato cálcico - 1 - 0 + 97 L-arabinosa + 80 - 0 + 79 D-xilosa + 80 - 0 + 85 Adonitol - 64 - 0 + 97 Xilitol - 52 - 0 + 92 D-Galactosa + 80 - 78 + 99 Inositol - 0 - 0 - 0 D-sorbitol - 60 - 1 - 97 Metil-aD-Glucopiranosida - 1 - 13 - 88 N-acetil-glucosamina - 0 - 0 + 99 D-celobiosa - 1 - 0 + 95 D-lactosa - 0 - 0 - 0 D-maltosa + 98 - 75 + 94 D-sacarosa + 100 - 90 + 100 D-Trehalosa + 95 - 2 + 99 D-Melezitosa + 86 - 1 + 90 D-Rafinosa + 98 - 62 + 95
B) Asimilación en medio de cultivo sólido (X_ELPA) Sacarosa + +(F) + Galactosa + +(F) + Maltosa + +(dd) + Manitol + - +(dd) Glicerol + - +(d) Sorbitol + - +(d) Glucosa + + +
API: % de reacciones positivas después de 48-72 horas, indicadas en el sistema API 20 C AUX por Biomeireux F: fuerte; dd: muy débil; d: débil **Ver anexo 1, figura 8,9 y 10
34
Los resultados de asimilación esperados del sistema API 20C AUX, para las diferentes
especies estudiadas, no concuerdan en todos los casos con los obtenidos siguiendo los
métodos propuestos por Van Der Walt, los cuales están descritos en el tratado “The Yeast” de
Lodder (1970) y empleados en la bibliografía consultada referente al aislamiento e identificación
de levaduras del tepache. Esto se debe en general a las diferencias entre la formulación de los
medios y las técnicas empleadas, por ejemplo el porcentaje de carbohidratos presente en el
sistema API es de 0.5% y en el de Van Der Walt 5%, por otro lado las fuentes de nitrógeno,
vitaminas, minerales y el sistema de incubación empleado difieren entre ellos. Además de lo
mencionado, la variabilidad en la asimilación de un carbohidrato se ve influenciada por las
condiciones a las que se somete usualmente a los microorganismos, por ejemplo cuando se
cultivan continuamente durante un largo periodo en concentraciones abundantes de una
determinada fuente de carbono aumenta la posibilidad de que el microorganismo disminuya su
capacidad de consumir el sustrato, con lo cual aumenta el tiempo necesario para poder
asimilarlo e incluso pierda su capacidad de asimilación de otra fuente de carbohidrato a la que
usualmente no se ve expuesto (30).
Los resultados obtenidos para la asimilación en medio sólido se muestran al final de la
tabla 8, estos concuerdan para las tres especies estudiadas con los resultados reportados del
estudio de levaduras del tepache. De estas pruebas se obtuvo que tanto LVR y LVC crecen
mejor en la superficie del medio que dentro de él, enfatizando el carácter aerobio de estas
levaduras, en contraste con LVB la cual creció bien en ambas situaciones e incluso algunas
colonias alcanzaron mayor tamaño dentro del medio.
En la tabla 9 se muestran los resultados de crecimiento en medio sólido de alta presión
osmótica (NaCl-GELP), llevada a cabo mediante la técnica por extensión con varilla. La
levadura que mostró mayor susceptibilidad a la concentración de NaCl fue LVC, la cual creció
débilmente a 2% de NaCl pero no a 3%; LVB creció bien hasta 4%, débilmente a 5% y no creció
a concentraciones mayores; LVR creció bien hasta 7% y en 8% débilmente. En la última parte
de la tabla se muestran los resultados correspondientes por la técnica de vaciado en placa, los
cuales verifican que las concentraciones empleadas para extensión con varilla dan los mismos
resultados. Por otro lado en la tabla 10 se muestran los resultados del crecimiento en medio
sólido de alta acidez (ácido tartárico - GELPA). La única prueba en la cual hubo ausencia de
crecimiento correspondió a LVR a 0.9% mientras que LVB y LVC presentaron crecimiento en
35
todo el intervalo de concentraciones de ácido empleadas, esto de manifiesto su adaptación al
medio ácido, que es una característica del tepache.
Tabla 9.- Crecimiento en medio sólido de alta presión osmótica, características fisiológicas y bioquímicas de las levaduras estudiadas.
Extensión con varilla -crecimiento en medio GELPA-NaCl
%NaCl (P/V) LVR LVC LVB 1% + + + 2% + +(d) + 3% + - + 4% + - + 5% + - +(d) 6% + - - 7% + - - 8% +(d) - - 9% - - -
10% - - - Vaciado en placa -crecimiento en medio GELPA-NaCl
% NaCl (P/V) LVR LVC LVB 2% + + + 3% + - + 5% + - + 6% + - -
**Ver anexo 1, figura 11 y 12 d: débil Tabla 10.- Crecimiento en medio sólido de alta acidez, características fisiológicas y bioquímicas de las levaduras estudiadas. Crecimiento en medio de cultivo de alta acidez (GELPA - ácido tartárico)
% Ácido tartárico LVR LVC LVB 0.14* + + + 0.21* + + + 0.28* + + + 0.35* +(d) + + 0.42* +(d) + + 0.5 + + + 0.6 + + + 0.7 +(d) + + 0.8 +(dd) + + 0.9 - + +
**Ver anexo 1, figura 13, 14 y 15 d: débil dd: muy débil
36
Tabla 11.- Densidad de biomasa en medio líquido (GELP) de LVR, LVC, LVB.
Turbidimetría Levadura Peso seco
(g/50ml) Absorbancia Dilución UFC/ml (x106) pH
LVR 0,0046 0,370 1 8,85 6,577
LVC 0,0054 0,345 1 8,5 5,285
LVB 0,0945 0,371 0,05 134,4 4,800
En la tabla 11 se presentan los resultados del cultivo en medio líquido GELP. Se puede
observar que LVC y LVR alcanzaron una densidad de biomasa 15 y 16 veces menor a la de
LVB (columna 5), lo cual, complementado con las otras determinaciones indirectas para
medición de biomasa, sirvieron de base en el planteamiento de los conjuntos experimentales de
las pruebas de fermentación.
6.5 Pruebas de fermentación De las diversas pruebas que se llevaron a cabo se obtuvieron resultados que son
interpretados en los siguientes párrafos.
6.5.1 Pruebas de fermentación en cultivo puro
Los resultados de las pruebas de fermentación de las cepas individuales se muestran en
la tabla 12, anexo 2 y en las figuras 16-23. Con base en esta información se llevó a cabo la
discusión que se describe en los siguientes párrafos.
Los comportamientos de la biomasa durante las pruebas de fermentación para los
cultivos puros se muestran en las figuras 16, 17 y 18. Las figuras 16 y 17 muestran, en escala
lineal, la producción de biomasa como función del tiempo, expresada como UFC/ml, para las
tres especies de levaduras estudiadas (figura 16) y para dos de las mismas (LVC y LVR) en el
caso de la figura 17. De la misma forma, en la figura 18, con el objeto de hacer más claro el
comportamiento de la fase de adaptación, la fase estacionaria y la velocidad de crecimiento, se
muestra para las tres especies de levaduras la misma variable en escala logarítmica.
37
Figura 16.- Biomasa vs tiempo; LVB, LVC, LVR.
0E+00
2E+07
4E+07
6E+07
8E+07
1E+08
1E+08
0 50 100 150Tiempo (h)
Bio
mas
a (U
FC/m
l)
.
LVB
LVC
LVR
Figura 17.- Biomasa vs tiempo; LVC, LVR.
0,0E+00
2,0E+06
4,0E+06
6,0E+06
8,0E+06
1,0E+07
1,2E+07
1,4E+07
0 50 100 150Tiempo (h)
Bio
mas
a (U
FC/m
l) .
LVCLVR
Figura 18.- LN(Biomasa) vs tiempo; LVB, LVC, LVR
3
5
7
9
11
13
15
17
19
0 50 100 150Tiempo (h)
LN(U
FC/m
l).
LVBLVCLVR
1
2
3
Primeras tres lecturas
realizadas
El comportamiento del crecimiento de LVB durante la prueba de fermentación,
observado en la figura 18, muestra que después de las 21 h de fermentación la velocidad de
crecimiento comienza a decrecer notoriamente y a las 50 h se reduce severamente, alcanzando
la fase estacionaria entre las 96 y 120 h, tiempo después del cual la densidad de biomasa
permanece constante (en el orden de 1x108 UFC/ml). La fase de adaptación (aumento de la
pendiente en el inicio de la fermentación) no se observa para la curva de LVB en la figura 18
debido a que el tiempo de esta fase es pequeño y por tanto no es posible observarlo con los
intervalos de tiempo utilizados en este muestreo. En comparación con LVB, tanto LVR como
38
LVC tienen una densidad, en UFC/ml, 12 y 8 veces menor, respectivamente, en el conteo
realizado al final de la prueba de fermentación (ver tabla 12 anexo 2). El comportamiento del
crecimiento de LVR presenta un punto de inflexión adicional al esperado (ver figura 17),
indicando un posible comportamiento diauxico, este no se apreció la figura 18, de hecho el
comportamiento de la velocidad de crecimiento de LVB fue parecido al de LVR, con la diferencia
de que LVR no alcanzó la fase estacionaria durante el tiempo de muestreo y la fase de
adaptación tuvo más duración, esto se aprecia con un aumento en la pendiente del segundo al
tercer punto de muestreo. En la figura 17 se observa que LVC tiene un crecimiento lento y a
diferencia de LVB, duplica su densidad de biomasa en las últimas 53 h de la prueba de
fermentación, mientras que LVR tan solo aumenta en este tiempo 16% su densidad de
biomasa. En la figura 18 se puede apreciar que LVC tiene el tiempo de adaptación más grande,
mostrando un aumento en la pendiente del segundo al tercer muestreo, en la misma figura se
puede observar que tras las primeras 50 h de fermentación la velocidad de crecimiento de LVC
se reduce de manera significativa aún con ello se mantiene en el mismo orden de magnitud, la
cual sufre una disminución notoria a partir de las 136 h, en las siguientes horas el cultivo no
alcanzó a la fase estacionaria.
En las figuras 19 y 20 se muestran respectivamente, los comportamientos de acidez y
pH como función del tiempo.
Figura 20.- pH vs tiempo; LVB, LVC, LVR.
3,80
4,00
4,20
4,40
4,60
4,80
5,00
5,20
5,40
5,60
0 50 100 150Tiempo (h)
pH
LVBLVCLVR
Figura 19.- Acidez vs tiempo; LVB, LVC, LVR.
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0 50 100 150Tiempo (h)
Acid
ez (%
de
ácid
o ac
étic
o) .
LVBLVCLVR
39
El aumento de la acidez en la prueba de fermentación de LVB (figura 19), muestra a
manera poco aproximada que durante las primeras 21 h (ver tabla 12, anexo 2), la producción
de acidez es baja (5.4x10-3 g/100 ml) y que en las siguientes 28 h se generó el 42,6% de la
acidez total (70x10-3 g/100ml), después de este tiempo la velocidad de producción de acidez
disminuye en un 78,5%, de manera tal que al finalizar la prueba se han producido 166.2 x10-3
g/100ml, en contraste LVC y LVR tan solo producen 19.8x10-3 y 35.4x10-3 g/100ml de acidez
respectivamente. Estos comportamientos se ven corroborados con los cambios en pH,
mostrados en la figura 20, los cuales presentan similitudes con los de la acidez, con algunas
desviaciones debidas al amortiguamiento de las diferentes sustancias que también se están
metabolizando. El pH para las pruebas de fermentación de LVB, LVR y LVC al final del proceso
de fermentación fue 3,95, 4,849 y 4,904, respectivamente.
El comportamiento de la disminución de la “concentración de sólidos disueltos” (CSD),
que se relaciona con el consumo de los carbohidratos, se muestra en la figura 21. Para el caso
de LVB, la disminución de la CSD es lenta hasta las 21 h, después de este tiempo la tasa de
disminución aumenta 4 veces de manera que tras 75,8 h de fermentación, se reduce en 2,8%.
En las siguientes horas la tasa de disminución decrece en 40% y permanece cerca de esta
magnitud hasta concluir la fermentación, el valor final de CSD es de 10,3%. Por otro lado LVR y
LVC no muestran una disminución en la CSD. De hecho tras las 172 h de fermentación se
observa un aumento de 0,4 y 0,3%, respectivamente, en la CSD para estas, lo cual puede
atribuirse a la producción de sustancias que presentan un mayor efecto sobre la dispersión de
la luz.
Figura 21.- Sólidos disueltos vs tiempo; LVB, LVC, LVR.
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
0 50 100 150Tiempo (h)
Sólid
os d
isue
ltos
(% p
/p)
,
LVBLVCLVR
40
La figura 22 muestra, por otra parte, la evolución de los “carbohidratos reductores”
(CHR) durante el proceso de fermentación. En el caso de LVB la concentración de CHR
aumentó 2,7 g/l en 21 h de fermentación, llegando a una concentración de 29 g/l, en las
siguientes 75 h el comportamiento de esta variable fue ascendente alcanzando a las 96 h una
concentración de 132,2 g/l. Los valores de las pendientes obtenidas en las tres mediciones
realizadas durante este intervalo de tiempo fueron en orden sucesivo 1,29; 1,36; y 1,50 g/lh,
esta inversión de la sacarosa fue favorecida por el aumento de acidez que también tuvo un gran
aumento en este intervalo de tiempo (ver figura 19). En la medición realizada a las 170,2 h la
concentración de CHR disminuyó a 69,0 g/l, lo cual indica el consumo de los monosacáridos
(los cuales son en este caso reductores). En la prueba de fermentación de LVC (figura 23), los
CHR permanecieron prácticamente sin cambio hasta las 75,8 h, en las posteriores mediciones
efectuadas se observó un incremento, alcanzando al final de la prueba una concentración de
31,48g/l, en comparación con LVB el valor final fue 2,2 veces menor. El comportamiento de la
concentración de los CHR en la prueba de LVR presentó entre las 25 y 90 h un comportamiento
que al parecer está relacionado con el exhibido en la evolución de la biomasa (comportamiento
diauxico) mostrado en la figura 17, al finalizar la prueba la concentración de CHR fue 31.7 g/l
valor cercano al obtenido para LVC.
Figura 23.- Carbohidratos Reductores vs tiempo; LVC, LVR.
20
22
24
26
28
30
32
34
0 50 100 150Tiempo (h)
Glu
cosa
(g/l
)
.
LVCLVR
Figura 22.- Carbohidratos Reductores vs tiempo; LVB, LVC, LVR.
0
20
40
60
80
100
120
140
0 50 100 150Tiempo (h)
Glu
cosa
(g/l)
.
LVBLVCLVR
41
6.5.2 Pruebas de fermentación en cultivo mixto LVB-LVC Los resultados de las pruebas de fermentación en cultivo mixto de LVB con LVC se
muestran en la tabla 13 anexo 2 y en las figuras 24-31. En la figura 24 se muestra la evolución
de biomasa del cultivo mixto de LVB con LVC, si se compara el comportamiento del crecimiento
de LVB en cultivo puro con el cultivo mixto para la misma proporción de inóculo inicial de LVB
(tabla 12, PF1 vs tabla 13 PF6), se observa que el comportamiento de esta variable y la
densidad final de biomasa son parecidas, en el caso de LVB en cultivo puro la biomasa final es
1,04x108 UFC/ml, mientras que en cultivo mixto es de 1,14x108 UFC/ml. En la figura 25 se
observa que con el aumento del inóculo inicial de LVB se disminuye el tiempo en llegar a la fase
estacionaria, de esta manera a esta levadura, en la prueba PF8, le toma 44 h alcanzar una
densidad de 1.03x108 UFC/ml, y en la prueba PF4 le toma más de 94,3 h (ver tabla 13 anexo
2), en la misma figura se observa que la fase de adaptación tuvo más duración conforme
disminuyó la proporción de inóculo inicial, por ejemplo comparando el aumento en la pendiente
entre el segmento trazado por el segundo y tercer punto de muestreo, se encontró que en la
prueba PF4 la pendiente aumenta 2,86 veces su valor mientras que en la prueba PF7 es 1,54
veces. Estos resultados indican que LVC no tiene influencia significativa sobre LVB.
Figura 24.- Evolución de la biomasa de LVB – “conjunto experimental LVB vs LVC”
En la figura 26 se muestra el comportamiento del crecimiento de LVC en cultivo mixto
con LVB. Es evidente en este caso que LVB tiene una influencia significativa en el
comportamiento de LVC, ya que, aunque esta crece en presencia de LVB hasta alcanzar un
42
máximo este disminuye a medida que aumenta la concentración de biomasa de LVB. Se puede
entonces inferir que el metabolismo de LVB produce cambios en las condiciones del medio, ya
que el valor más alto de biomasa de LVC se obtuvo en la prueba que empleó la menor cantidad
de inóculo inicial de LVB (prueba PF4). El mismo comportamiento se puede ver, aunque con
menor claridad, en la figura 27 que muestra la misma variable en escala del logaritmo natural.
Figura 25.- Evolución de la biomasa de LVB escala Ln – “conjunto experimental LVB vs LVC”
Figura 26.- Evolución de la biomasa de LVC – “conjunto experimental LVB vs LVC”
43
Figura 27.- Evolución de la biomasa de LVC escala Ln – “conjunto experimental LVB vs LVC”
Figura 28.- Evolución de la acidez – “conjunto experimental LVB vs LVC”
La superficie de respuesta para la producción de acidez se muestra en la figura 28. Como
se puede observar, a medida que la proporción de inóculo inicial de LVB aumenta, a un tiempo
dado, la acidez del medio es también mayor, de manera similar al comportamiento de la misma
levadura en cultivo puro. De las figuras 24 y 28 se puede inferir también que la
producción de acidez está directamente relacionada con la densidad de biomasa lo cual se ve
44
más evidente en las pruebas de fermentación PF4 y PF8. En la figura 29 se observa que el pH
sigue una evolución similar al de la acidez, con algunas desviaciones debidas a otras
sustancias que también se están metabolizando, como ya se ha mencionado anteriormente.
Figura 29.- Evolución del pH – “conjunto experimental LVB vs LVC”
Figura 30.- Evolución de la concentración de los sólidos disueltos – “conjunto experimental LVB vs LVC”
En la figura 30 se muestra el comportamiento de la disminución en la concentración de
los sólidos disueltos (CSD) el cual, como se indicó antes, es atribuido al consumo de los
45
carbohidratos. Se observa en general que cuando se tiene una mayor proporción de LVB en el
inóculo inicial la disminución en la CSD es más grande, específicamente durante las primeras
70 h, donde la CSD final es, para las pruebas PF4 y PF8, de 9,80 y 8,95%, respectivamente
(ver tabla 13 anexo 2). La evolución correspondiente para los carbohidratos reductores (CHR) a
través de la prueba de fermentación se muestra en la figura 31. En esta figura se observa que el
comportamiento de esta variable es similar al del cultivo puro correspondiente para todas las
pruebas de fermentación realizadas en este conjunto de experimentos, el máximo en esta
variable se alcanzó en un tiempo menor cuando se empleó mayor inóculo inicial de LVB. Al
igual que para la acidez, el comportamiento en la CSD y de los CHR está relacionado con el
crecimiento de la población de LVB.
Glucosa (g/litro)
Figura 31.- Evolución de la concentración de los carbohidratos reductores – “conjunto experimental LVB vs LVC”
46
6.5.3 Pruebas de fermentación en cultivo mixto LVB-LVR
Los resultados de las pruebas de fermentación en cultivo mixto de LVB con LVR, se
muestran en la tabla 14 anexo 2 y en las figuras 32-38. En los siguientes párrafos se comparan
a la vez los resultados obtenidos de las variables medidas durante el proceso de fermentación
para el conjunto experimental 1 (LVB-LVC) y el conjunto experimental 2 (LVB-LVR).
El crecimiento de LVB de ambos conjuntos experimentales mostró tener
comportamientos similares, en cuanto a la evolución de la biomasa respecto a la concertación
inicial de LVB, observándose la misma dependencia de esta variable respecto al tiempo de la
fase de adaptación y el tiempo en que se alcanza la fase estacionaria (figuras 24, 25, 32 y 33).
Por otro lado el conjunto experimental 2 alcanzó mayor densidad de biomasa final que el
conjunto 1, por ejemplo cuando la densidad de biomasa fue 1,15x102 UFC/ml de LVB en el
inóculo inicial, que corresponde a los casos de las pruebas de fermentación PF13-conjunto 2 y
PF6-conjunto 1, la densidad de biomasa fue respectivamente de 1,39x108 y 1,14x108 UFC/ml al
final de la prueba de fermentación, esta diferencia puede ser debida posiblemente a la acidez,
ya que por ejemplo en el caso del conjunto 2, PF13 esta fue 22 % menor que en el conjunto1,
PF6, de manera que las condiciones en PF13 fueron más favorables para el crecimiento de
biomasa. En general la acidez al final de la prueba de fermentación fue menor para el conjunto
2 respecto al conjunto 1 para las mismas concentraciones iniciales de LVB (figura 34).
Figura 32.- Evolución de la biomasa de LVB – “conjunto experimental LVB vs LVR”
´
47
Figura 34.- Evolución de la acidez – “conjunto experimental LVB vs LVR”
Figura 33.- Evolución de la biomasa de LVB escala Ln – “conjunto experimental LVB vs LVR”
´
48
La evolución del pH se muestra en la figura 35, esta variable en general tuvo una
evolución similar al de la acidez, como ya se ha mencionado anteriormente.
Figura 35.- Evolución del pH – “conjunto experimental LVB vs LVR”
Figura 36.- Evolución de la biomasa de LVR – “conjunto experimental LVB vs LVR”
´
Al igual que en el cultivo mixto de LVC con LVB, LVR creció hasta alcanzar un máximo y
después inició su fase de muerte (ver figura 36). En cultivo mixto con LVB, LVR alcanzó una
mayor población en su máximo que LVC y presentó la mayor proporción de reducción de su
49
población. Comparando para el caso de PF13 y PF6, LVR a las 43,8 h tuvo 5,06x105 UFC/ml y
al finalizar la prueba sus UFC/ml disminuyeron a 4,05x104, esto es una reducción del 92% de la
población, en tanto que LVC a las 70,5 h alcanzó 2,77x105 UFC/ml y al finalizar la prueba
3,38x104, en otras palabras una disminución del 87,8% de la población.
La concentración de los CHR del conjunto de experimentos 2 (ver figura 37) difirió del
conjunto de experimentos 1 (ver figura 31), en que después de alcanzar la máxima
concentración de CHR solo en las pruebas PF14 y PF15 hubo una disminución de los CHR
hacia el final de la prueba, comportamiento que se observó en todos los experimentos del
conjunto 1, al igual que en la prueba de fermentación en cultivo puro de LVB, en el caso del
resto de las pruebas de fermentación del conjunto 2 (PF10, 11, 12 y 13) la concentración de
CHR aumentó posiblemente debido a que en estas pruebas LVR se encuentra en mayor
proporción respecto a LVB en el inóculo inicial, de manera que LVR interfiere de alguna forma,
no sucediendo igual con PF14 y PF15 en las cuales LVR está en una proporción
considerablemente menor a LVB.
Figura 37.- Evolución de la concentración de carbohidratos reductores – “conjunto experimental LVB vs LVR”
50
En el conjunto experimentos de LVB-LVR, el comportamiento de la acidez y la
concentración tanto de CHR y CSD estuvo correlacionado con el crecimiento de la población
de LVB de forma similar al conjunto de experimentos LVB-LVC. En específico en el caso de la
concentración de sólidos disueltos del conjunto de experimentos 2 (ver figura 38), se observó la
disminución de la CSD conforme creció la población de levaduras.
Figura 38.- Evolución de la concentración de sólidos disueltos – “conjunto experimental
LVB vs LVR”
51
7 CONCLUSIONES El análisis de las diversas muestras de tepache hizo evidente la gran variabilidad en
densidad de levaduras y la proporción de las mismas. En cuanto a la identificación se demostró
que, mediante el sistema API 20C AUX de Biomeireux, es posible llevar a cabo una
diferenciación entre el conjunto de levaduras presentes en el tepache, que han sido reportadas
e identificadas por los métodos convencionales (“The Yeast” de Lodder (1970)). Al llevar a
cabo las pruebas morfológicas en cultivo líquido se observó un carácter aerobio de las especies
Candida guilliermondii y Rhodotorula mucilaginosa, en contraste con Saccharomyces cerevisiae
la cual mostró un carácter anaerobio, aunque se sabe que en condiciones aerobias esta última
se desarrolla favorablemente, de aquí se puede inferir que el tepache es una bebida que tiene
la participación de levaduras que emplean la fermentación aerobia o que dadas las
circunstancias pueden hacer uso de esta condición como es el caso de Saccharomyces
cerevisiae. En las pruebas de fermentación en cultivo mixto (conjunto experimental 1) se
observa que Candida guilliermondii muestra una relación de neutralismo respecto a
Saccharomyces cerevisiae ya que esta última no se ve afectada su producción de acidez ni
biomasa respecto a su cultivo puro, en contraste, la presencia de Rhodotorula mucilaginosa
(conjunto experimental 2) muestra una interacción con Saccharomyces cerevisiae, causando
una disminución en su producción de acidez, lo cual promueve una mayor densidad de biomasa
final de esta última. Por otro lado tanto Candida guilliermondii y Rhodotorula mucilaginosa
muestran una relación negativa respecto a Saccharomyces cerevisiae exhibiendo una tasa de
muerte no observada en el cultivo puro, lo anterior se puede adjudicar al crecimiento y
subsiguiente metabolismo de Saccharomyces cerevisiae, esto parece contradecir las
proporciones de estas levaduras observadas en algunas muestras de tepache donde, por
ejemplo, Rhodotorula mucilaginosa estuvo presente en mayor cantidad respecto a las demás
levaduras, sin embargo, debe tenerse en cuenta que en la bebida están presentes también
otros microorganismos, los cuales pueden favorecer las proporciones de levaduras observadas.
De la información hasta aquí recabada no es posible la formulación de un inóculo para la
producción de una bebida estandarizada tipo tepache, en virtud de que se requiere una mayor
investigación sobre los demás microorganismos involucrados, incluyendo las bacterias. Una
importante contribución de este trabajo consistió en demostrar la factibilidad del uso del sistema
API 20C de Biomeireux como un buen sistema que permite ahorrar tiempos e insumos en la
difícil tarea de llevar a cabo la identificación de microorganismos.
52
8 PERSPECTIVAS
En una etapa posterior se recomienda que, una vez llevada a cabo la identificación de
los microorganismos de interés, estos se siembren sucesivamente en el sustrato en el cual se
llevara a cabo el estudio al menos por cinco ocasiones, con el objeto de alcanzar una
estabilidad en sus parámetros cinéticos y de esta manera los resultados obtenidos sean
reproducibles. También se sugiere emplear sustratos mixtos que presenten mejor
biodisponibilidad y de los cuales se posea más información, por ejemplo, una mezcla de
peptona, sacarosa y glucosa en proporciones similares a los sustratos que frecuentemente son
empleados en la elaboración de tepache, en lugar por ejemplo de piloncillo o zumo de fruta
endulzado ya que pueden contener cantidades variables tanto de sustancias nocivas como
nutrimentos para el crecimiento celular lo cual pueden eventualmente llevar a la obtención de
datos no significativos. Finalmente se recomienda el uso de técnicas de cuantificación más
exactas y específicas como la cromatografía de líquidos de alta resolución y de gases, para la
cuantificación de carbohidratos y ácidos orgánicos respectivamente. Por último se sugiere
llevar a cabo pruebas similares en otro conjunto más amplio de microorganismos (bacterias) a
fin de poder abordar la problemática de formular un inóculo con las características deseables
para una bebida tipo tepache, respaldada por las pruebas sensoriales correspondientes.
53
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55
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56
ANEXO 1
57
E) F)
D)
B)
Figura 4.- Sembrado por extensión con varilla en medio PDA y AMS de diferentes muestras de tepache; A) Zocalo, PDA; B) Zocalo, AMS; C)Hidalgo, PDA ; D) Hidalgo, AMS; E) Huehuetoca, PDA; Huehuetoca, AMS.
A)
C)
58
G) H)
I) J)
Figura 5.- Sembrado por extensión con varilla en medio PDA y AMS de diferentes muestras de tepache; A) Tecamac, PDA; B) Tecamac, AMS; C)Tulpetlac, PDA ; D) Tulpetlac, AMS.
59
Figura 6.- Morfología de levaduras en medio liquido (GELP); LVB; LVC; LVR; Comparación de la morfología desarrollada.
LVB LVC
Comparación de la morfología desarrollada
LVR
60
Figura 7.- Aislamiento de unidades viables de levadura por estría
61
cruzada en medio PDA. A1:A2) LVB B1:B2) LVC C1:C2) LVR
A1) A2)
B1) B2)
C1) C2)
Figura 8.- Asimilación de carbohidratos en sistema de identificación API 20C AUX.
LVR
LVB
LVC
62
Mt_C) Mt_B) Mt_R)
Gy_C) Gy_C) Gy_R)
So_C) So_B) So_R)
Figura 9.- Asimilación de carbohidratos en medio de cultivo sólido, técnica de vaciado en placa; manitol, glicerol, sorbitol. Mt: Manitol R: levadura LVR Gy: Glicerol B: levadura LVB So: Sorbitol C: levadura LVC
63
64
Ga_C ) Ga_R ) Ga_B )
Ma_C ) Ma_R ) Ma_B )
Sa_C ) Sa_R ) Sa_B )
Figura 10.- Asimilación de carbohidratos en medio de cultivo sólido, técnica de vaciado en placa; sacarosa, maltosa, galactosa. Ma: Maltosa R: levadura LVR Ga: Galactosa B: levadura LVB Sa: Sacarosa C: levadura LVC
1% NaCl 2% NaCl 3% NaCl
4% NaCl 5% NaCl 6% NaCl
Figura 11.- Crecimiento en medio sólido de alta presión osmótica del (GELPA-NaCl), técnica extensión con varilla.
R: levadura LVR B: levadura LVB C: levadura LVC
7% NaCl 8% NaCl 9% NaCl
65
3% NaCl C
6% NaCl C
3% NaCl B
6% NaCl B
3% NaCl R
Figura 12.- Crecimiento en medio sólido de alta presión osmótica (GELPA-NaCl), técnica vaciado en placa.
R: levadura LVR B: levadura LVB C: levadura LVC
6% NaCl R
66
0.28% ác. tartárico C
0.28% ác. tartárico R
0.28% ác. Tartárico B
0.21% ác. tartárico C
0.21% ác. tartárico R
0.21% ác. tartárico B
0.14% ác. tartárico C
0.14% ác. tartárico R
0.14% ác. tartárico B
Figura 13.- Crecimiento en medio sólido de alta acidez (GELPA - ácido tartárico), 0.14-0.28% ác tartárico, técnica vaciado en placa.
R: levadura LVR B: levadura LVB C: levadura LVC
67
0.42% ác. tartárico C
0.42% ác. tartárico R
0.42% ác. tartárico B
0.35% ác. tartárico C
0.35% ác. tartárico R
0.35% ác. tartárico B
0.5% ác. tartárico C
0.5% ác. tartárico R
0.5% ác. tartárico B
Figura 14.- Crecimiento en medio sólido de alta acidez (GELPA - ácido tartárico), 0.35-0.5% ác. tartárico, técnica vaciado en placa.
R: levadura LVR B: levadura LVB C: levadura LVC
68
Figura 15.- Crecimiento en medio de solidó de alta acidez (GELPA - ácido tartárico), 0.6-0.9% ác. tartárico, técnica vaciado en placa.
R: levadura LVR B: levadura LVB C: levadura LVC
0.6% ác. tartárico R
0.6% ác. tartárico C
0.9% ác. tartárico C
0.7% ác. tartárico R
0.7% ác. tartárico C
0.9% ác. tartárico R
0.8% ác. tartárico R
0.8% ác. tartárico C
0.9% ác. tartárico B
69
ANEXO 2
70
Tabla 12.- Datos del seguimiento de la fermentación de cultivos puros de levaduras. Levadura: Prueba de
fermentación Tiempo
(h) % de Ácido
acético pH Sólidos
(%p/p) CHR
Reductores (g/l)
(UFC/ml) LN (UFC/ml)
0,0 0,0282 5,330 16,0 26,35 9,11E+01 4,512
7,1 -- -- -- -- 2,16E+04 9,980
21,0 0,0336 5,220 15,7 29,10 3,54E+06 15,081
32,7 -- -- -- -- 3,22E+07 17,287
49,8 0,1044 4,329 14,5 66,40 6,30E+07 17,959
75,8 0,1182 4,153 13,2 101,84 9,42E+07 18,361
96,0 0,1272 4,100 12,6 132,26 1,00E+08 18,423
120,6 -- -- -- -- 1,03E+08 18,446
146,6 -- -- -- -- 1,01E+08 18,431
LVB : PF1
170,2 0,1944 3,952 10,3 69,04 1,04E+08 18,460
0,0 0,0276 5,330 16,0 26,45 2,08E+03 7,642 7,1 -- -- -- -- 3,15E+03 8,055
21,0 0,0282 5,367 16,0 26,72 2,13E+05 12,267
32,7 -- -- -- -- 8,17E+05 13,613
49,8 0,0288 5,237 16,0 26,72 1,22E+06 14,010
75,8 0,0324 5,186 16,0 26,72 2,33E+06 14,661
96,0 0,0354 5,143 16,1 27,78 3,39E+06 15,037
122,1 -- -- -- -- 5,57E+06 15,533
135,6 -- -- -- - 8,61E+06 15,968
LVC : PF2
172,8 0,0474 4,904 16,3 31,48 1,30E+07 16,381
0,0 0,0252 5,330 16,0 26,19 1,02E+03 6,928 7,1 -- -- -- -- 4,73E+03 8,461
20,9 0,0276 5,267 16,0 28,57 7,66E+05 13,549
32,7 -- -- -- -- 2,89E+06 14,875
49,8 0,0276 5,265 16,0 26,98 3,29E+06 15,007
75,7 0,0294 5,232 16,0 23,81 4,00E+06 15,202
96,2 0,033 5,209 16,1 29,89 5,87E+06 15,586
120,9 -- -- -- -- 7,19E+06 15,788
136,4 -- -- -- -- 7,70E+06 15,856
LVR : PF3
172,7 0,0606 4,849 16,4 31,74 8,56E+06 15,962 CHR: Carbohidratos reductores UFC: unidades formadoras de colonias
71
Tabla 13.- Datos del seguimiento de la fermentación del conjunto experimental LVB vs LVC.
Prueba ferm.
Tiempo (h)
% de ácido
acético pH
Sólidos Disueltos
(% p/p)
CHR Reductores
(g/l) LVB
(UFC/ml) LN
(LVB) LVC
(UFC/ml) LN
(LVC)
0,0 0,0306 5,502 16,50 16,13 1,35E-01 0,00 2,78E+04 10,23
24,4 0,0252 5,627 16,1 16,67 3,00E+01 3,40 3,71E+04 10,52
43,0 0,0354 5,512 15,80 18,52 5,69E+04 10,95 4,15E+05 12,94
67,0 0,0888 4,865 14,95 47,62 2,13E+07 16,87 1,79E+05 12,09
94,3 0,1404 4,329 13,20 82,00 6,38E+07 17,97 1,38E+05 11,84
4
167,0 0,2064 3,946 9,80 50,26 1,05E+08 18,47 8,71E+04 11,37
0,0 0,0306 5,502 16,50 16,13 2,03E+00 0,71 5,57E+03 8,62
24,3 0,0252 5,587 15,95 16,67 2,85E+02 5,65 3,74E+04 10,53
43,0 0,0324 5,470 15,70 21,96 7,80E+05 13,57 4,35E+05 12,98
67,0 0,1092 4,697 14,00 47,62 5,85E+07 17,88 1,35E+05 11,81
94,0 0,153 4,190 13,25 84,65 7,97E+07 18,19 1,05E+05 11,56
5
167,0 0,1884 3,885 10,00 68,78 1,10E+08 18,52 7,43E+04 11,22
0,0 0,0306 5,502 16,50 16,13 1,15E+02 4,74 2,19E+02 5,39
20,0 0,0336 5,373 16,10 17,19 8,78E+03 9,08 1,89E+05 12,15
43,8 0,075 4,743 15,80 25,39 1,75E+07 16,68 2,26E+05 12,33
70,5 0,1368 4,161 14,05 55,82 6,38E+07 17,97 2,77E+05 12,53
93,3 0,1782 3,872 13,00 82,00 8,43E+07 18,25 1,25E+05 11,74
6
173,8 0,1956 3,856 9,50 66,13 1,14E+08 18,55 3,38E+04 10,43
0,0 0,0306 5,502 16,50 16,13 1,46E+03 7,29 1,17E+01 2,46
19,9 0,0342 5,353 16,0 16,14 4,93E+04 10,81 2,00E+04 9,90
43,9 0,0822 4,641 15,35 33,46 3,42E+07 17,35 5,38E+04 10,89
70,4 0,1362 4,071 13,95 61,37 7,06E+07 18,07 6,62E+04 11,10
93,4 0,1758 3,916 12,50 84,65 8,05E+07 18,20 1,96E+04 9,88
7
173,7 0,1962 3,854 9,60 62,96 1,08E+08 18,50 1,95E+04 9,88
0,0 0,0306 5,502 16,50 16,13 3,87E+05 12,87 1,46E+01 2,68
19,9 0,117 4,774 15,70 16,93 4,10E+07 17,53 3,75E+02 5,93
44,0 0,1284 4,198 14,35 62,96 1,03E+08 18,45 3,93E+02 5,97
70,6 0,1572 4,008 13,15 93,64 1,28E+08 18,66 5,25E+02 6,26
93,1 0,1968 3,868 11,95 80,95 1,39E+08 18,75 6,60E+02 6,49
8
173,5 0,2484 3,823 8,95 55,29 1,53E+08 18,84 2,28E+03 7,73
0,0 0,0306 5,502 16,50 16,13 3,87E+05 12,87 6,50E-02 -2,73
19,6 0,129 4,766 15,45 15,87 3,11E+07 17,25 2,00E+00 0,69
43,8 0,1386 4,320 14,40 59,52 8,96E+07 18,31 3,00E+00 1,10
70,3 0,1614 3,990 13,00 95,23 1,18E+08 18,59 3,00E+00 1,10
93,1 0,1986 3,856 11,65 72,75 1,36E+08 18,73 3,00E+00 1,10
9
173,3 0,2574 3,813 8,95 48,94 1,50E+08 18,82 2,10E+01 3,04
CHR: Carbohidratos reductores UFC: unidades formadoras de colonias
72
Tabla 14.- Datos del seguimiento de la fermentación del conjunto experimental LVB vs LVR.
Prueba ferm. Tiempo (h)
% de ácido
acético pH
Sólidos Disueltos
(% p/p)
CHR Reductores
(g/l) LVB
(UFC/ml) LN
(LVB) LVC
(UFC/ml) LN
(LVC)
0,0 0,0252 5,502 16,50 16,13 1,25E-02 -4,38 2,25E+05 12,33
19,9 0,0234 5,543 15,75 17,46 2,60E+00 0,96 7,63E+05 13,54
43,9 0,0288 5,624 15,45 17,99 3,40E+03 8,13 1,57E+06 14,27
70,4 0,0738 4,999 14,85 34,92 3,04E+06 14,93 1,22E+06 14,01
93,4 0,0906 4,649 14,70 61,37 6,99E+07 18,06 9,11E+05 13,72
10
161,7 0,1464 4,035 9,65 86,77 1,17E+08 18,58 7,76E+04 11,26
0,0 0,0252 5,502 16,50 16,13 1,88E-01 -1,67 1,13E+05 11,63
20,0 0,0228 5,552 15,40 17,19 3,90E+01 3,66 5,50E+05 13,22
43,8 0,03 5,583 14,85 18,25 5,06E+04 10,83 9,11E+05 13,72
70,5 0,0834 4,917 14,75 39,15 1,06E+07 16,18 1,00E+06 13,82
93,3 0,093 4,589 13,80 65,07 8,43E+07 18,25 8,44E+05 13,65
11
161,8 0,1458 4,070 10,00 92,59 1,24E+08 18,63 6,41E+04 11,07
0,0 0,0252 5,502 16,00 16,13 7,57E+00 2,02 9,37E+03 9,14
19,9 0,0264 5,513 15,30 16,93 4,50E+03 8,41 3,11E+05 12,65
44,0 0,0486 5,469 14,30 23,28 1,62E+06 14,30 6,58E+05 13,40
70,6 0,0912 4,774 13,60 53,96 5,24E+07 17,77 6,75E+05 13,42
93,1 0,1092 4,493 12,60 75,66 1,02E+08 18,44 4,05E+05 12,91
12
161,5 0,1488 4,044 10,00 80,95 1,32E+08 18,70 6,08E+04 11,01
0,0 0,0252 5,502 16,50 16,13 1,14E+02 4,74 9,37E+03 9,14
19,6 0,0252 5,496 15,10 16,40 3,26E+04 10,39 2,57E+05 12,45
43,8 0,0546 5,261 14,10 25,92 4,96E+06 15,42 5,06E+05 13,13
70,3 0,0984 4,641 13,40 51,85 7,29E+07 18,10 4,29E+05 12,97
93,1 0,1212 4,283 12,20 72,75 1,20E+08 18,60 2,90E+05 12,58
13
161,3 0,1518 3,976 9,40 76,71 1,40E+08 18,76 4,05E+04 10,61
0,0 0,0252 5,502 16,50 16,13 5,70E+03 8,65 1,50E+03 7,31
24,3 0,0294 5,452 16,00 19,58 2,40E+05 12,39 5,06E+04 10,83
54,0 0,0984 4,865 15,05 29,10 3,72E+07 17,43 3,34E+05 12,72
78,0 0,1278 4,319 13,95 76,18 9,72E+07 18,39 1,35E+05 11,81
93,0 0,1374 4,130 12,25 85,71 1,28E+08 18,66 1,05E+05 11,56
14
166,0 0,1608 3,990 9,05 79,09 1,39E+08 18,75 5,40E+04 10,90
0,0 0,0252 5,502 16,50 16,13 5,70E+03 8,65 1,00E+02 4,61
24,4 0,0288 5,458 15,75 18,25 2,28E+05 12,34 8,55E+03 9,05
54,0 0,1032 4,770 14,40 29,89 3,42E+07 17,35 2,88E+04 10,27
78,0 0,1332 4,239 13,15 74,07 1,00E+08 18,42 2,23E+04 10,01
93,3 0,1404 4,070 12,65 86,77 1,30E+08 18,68 1,73E+04 9,76
15
166,0 0,1692 3,922 9,10 80,68 1,41E+08 18,77 7,88E+03 8,97
CHR: Carbohidratos reductores UFC: unidades formadoras de colonias
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