INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL · las balsas lipÍdicas (lipid rafts) modulan el proceso de...

1

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN

LAS BALSAS LIPÍDICAS (LIPID RAFTS) MODULAN EL

PROCESO DE COMUNICACIÓN MACRÓFAGO-

MICOBACTERIA

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

DOCTOR EN CIENCIAS EN INMUNOLOGÍA

P R E S E N T A

MARÍA GUADALUPE MORALES GARCÍA

DIRECTORES DE TESIS

Dr. Francisco Javier Sánchez García.

Dra. María Maximina Moreno Altamirano.

MÉXICO, D.F. 2008

2

El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de

Inmunorregulación de la Escuela Nacional de Ciencias

Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, bajo la

dirección de los Doctores María Maximina Moreno

Altamirano y Francisco Javier Sánchez García.

Los resultados obtenidos generaron la aceptación del

cartel “Maturation of murine macrophages lipid rafts upon

stimulation with M.tuberculosis secreted antigens”, en

“European Congreso of Inmunology”, celebrado en Paris,

Francia en septiembre del 2006 y la aceptación del

artículo “A Flow-Cytometry method for analysing the

composition of membrane rafts” en la Revista Cytometry

2008.

3

INDICE

Abreviaturas………………………………………………………………………………I

Relación de Figuras y Tablas………………………………………………………..III

Resumen…………………………………………………………………………………VI

Abstract………………………………………………………………………………….VII

Introducción………………………………………………………………………………1

I) Receptores de Reconocimiento de Patrones (PRRs)………………………….4

1) PRR endocítico………………………………………………………….5

1.1) Receptores de manosa……………………………………………5

1.1.1) CD206…………………………………………………....6

1.2) Receptores Scavenger……………………………………………6

1.2.1) MARCO…………………………………………………..6

2) PRR señal…………………………………………………………….....7

2.1) CD14………………………………………………………………..7

2.2) TLRs………………………………………………………………..8

4

2.2.1) TLR2………………………………………………………...8

2.2.2)TLR4………………………………………………………...9

II) Receptores de complemento…………………………………………………….11

III) Lectinas…………………………………………………………………………….12

IV) Lipid rafts…………………………………………………………………………..15

Planteamiento del problema…………………………………………………………21

Justificación…………………………………………………………………………….22

Hipótesis………………………………………………………………………………...22

Objetivo general………………………………………………………………………..23

Objetivos particulares…………………………………………………………………23

Materiales y Métodos………………………………………………………………… 24

A) Cultivo de la línea celular de macrófagos murinos J774 y estimulación con

moléculas solubles de M. tuberculosis H37Rv……………………………………….24

B) Purificación de lipid rafts mediante gradiente de sacarosa ………………………24

C) Purificación de lipid rafts mediante una técnica libre de detergentes……………25

D) “Slot blott” anti GM-1………………………………………………………………….25

5

E) Separación de proteínas por SDS-PAGE e identificación de proteínas

fosforiladas…………………………………………………………………………………26

F) Separación de proteínas por SDS-PAGE e identificación de proteinas por

secuenciación……………………………………………………………………………...26

G) Citometría de Flujo…………………………………………………………………….27

H) Microscopía de Fluorescencia y Confocal…………………………………………..27

I) Obtención de los extractos solubles de M. tuberculosis…………………………….28

J) Infección pulmonar en modelos murinos e histopatología……………………….28

Resultados……………………………………………………………………………….30

A) Cambios morfológicos y movilización de lipid rafts en células J774 estimuladas con

moléculas de secreción de M. tuberculosis.........................................................30

B) Análisis de la composición proteica de lipid rafts…………………………………...30

C) Colocalización del receptor de manosa (CD206) con lipid rafts en macrófagos de

pulmón de ratones infectados con M. tuberculosis H37Rv……………………………32

D) Análisis de la expresión de CD14, CD35, CD206 Y TLR2 por citometría de

flujo………………………………………………………………………………………….32

E) Efectos de la modificación de la estructura de los lipid rafts en la expresión de

receptores celulares………………………………………………………………………38

6

F) Inducción de fosforilación de proteínas de lipid rafts en respuesta al estímulo con

moléculas de secreción de M. tuberculosis en células J774………………………...39

G) Identificación de proteínas expresadas diferencialmente en los lipid rafts de células

J774 estimuladas con moléculas de secreción de M. tuberculosis mediante análisis

proteómico……………………………………………………………………….40

H) Análisis de la heterogeneidad en la composición protéica de los lipid rafts….43

Discusión………………………………………………………………………………...46

Conclusiones……………………………………………………………………………50

Perspectivas…………………………………………………………………………….51

Bibliografía………………………………………………………………………………52

Artículo…………………………………………………………………………………...61

7

ABREVIATURAS

ATPasa = Enzima Adeniltrifosfato.

araLAM = Liporarabinomanana arabinosa

BCG = Bacilo de Calmette-Guérin

BCD = Metil-β-ciclo-dextrina

CDRs = Domínios de Reconocimiento de Carbohidratos

CFP10 = Proteína 10 del filtrado de cultivo

DMEM = Medio Eagle modificado por Dulbecco

DTH = Hipersensibilidad retardada

EF-2 = Factor de Elongación 2

ESAT6 = Proteína 6 de secreción temprana

GlnA = Glutamina sintetasa

GM1 = Gangliósido que identifica a los lipid rafts.

GP96 = Antígeno de rechazo al tumor

GPI = Glucosilfosfatidilinositol

GTP = Glucosiltrifosfato

HSP90B1 = Precursor endoplásmico

HSP = Proteína de choque térmico

IL = Interleucina

IFNγ = Interferón gama

IRFs = Factores Reguladores de Interferon

KatG = Peroxidasa-catalasa

LAM = Lipoarabinomanana

LPS = Lipopolisacárido

LDH = Lipoproteínas de alta densidad

manLAM = Lipoarabinomanana manosa

MARCO = Receptor de macrófago con dominio de colágeno

MIRRs = Receptores de reconocimiento inmune multicadena

MHC = Complejo Principal de Histocompatibilidad

M.tuberculosis = Mycobacterium. tuberculosis

PAMPs = Patrones Moleculares Asociados a Patógenos

8

PI = Fosfoinositol

PLA2s = Fosfolipasa A2

PGK1 = Cinasa de Fosfoglicerato 1

PGN = Peptidoglicanos

PRRs = Receptores de Reconocimiento de Patrones

NO = Óxido Nítrico

RE = Receptores Scavenger

RM = Receptor de Manosa

ROI = Intermediarios reactivos del oxígeno

SodA = Superóxido dismutasa

TACO = Proteína de cubierta con Triptofano-Aspartato

TLR = Receptores semejantes a Toll

TNF = Factor de Necrosis Tumoral

9

RELACIÓN DE TABLAS Y FIGURAS

Figuras.

Figura 1.- Interacción de la micobacteria con el macrófago.

Figura 2.- Estructura de las membranas biológicas

Figura 3.- Estructura de los lipid rafts.

Figura 4.- Translocación de los receptores a los lipid rafts.

Figura 5.- Cambios morfológicos y redistribución de los lipid rafts.

Figura 6.- Expresión de la lectina Datura y su translocación a lipid rafts posterior al

estímulo con sobrenadantes de cultivo de M. tuberculosis.

Figura 7.- Expresión de CD206 y su translocación a lipid rafts posterior al estímulo con

extractos solubles de M. tuberculosis.



Figura 9.- Expresión de TLR2 y su translocación a lipid rafts posterior al estímulo con




Figura 11.- Macrófagos murinos fueron incubados sin o con sobrenadantes de cultivo

de M. tuberculosis.

10

Figura 12.-Expresión de lipid rafts en pulmón de ratón infectado por M.tuberculosis.

Figura 13.- Expresión de moléculas expresadas en macrófagos murinos posterior al

estímulo con extractos solubles de M. tuberculosis.

Figura 14.-Inhibición de la expresión de GM1 en macrófagos murinos estímulados en

extractos solubles de M. tuberculosis al alterar la estructura de los lipid rafts.

Figura 15.- Identificación mediante SDS-PAGE de proteínas citoplasmáticas

fosforiladas en células J774 estimuladas con extractos solubles de M. tuberculosis.

Figura 16.- Fracciones membranales correspondientes a los lipid rafts.

Figura 17.-Identificación mediante SDS-PAGE de proteínas membranales

fosforiladas en células J774 estimuladas con extractos solubles de M. tuberculosis .

Figura 18.- Análisis de la expresión de GM1 en las 12 fracciones lipídicas

membranales.

Figura 19.-Expresión de CD14 en fracciones lipídicas membranales

correspondientes a los lipid rafts

11

Tablas.

Tabla 1. Especificidad de las lectinas.

Tabla 2. Patógenos que utilizan a los lipid rafts como puertas de entrada.

Tabla 3. Características de las bandas analizadas para secuenciación.

Tabla 4. Proteínas encontradas en las diferentes bandas y la fracción rafts

correspondiente.

12

RESUMEN El colesterol de la membrana celular es requerida para la viabilidad y proliferación celular. Más del 90% del colesterol celular esta localizado en la membrana plasmática. Varios microoganismos y productos bacterianos se unen a los rafts, los cuales son microdominios de membrana, enriquecidos en colesterol y esfingolípidos y algunas proteínas. El colesterol confinado a los rafts es un componente crucial que es requerido por los micoorganismos, para entrar y salir de los compartimentos intracelulares. La pared de la micobacteria esta enriquecida en glicoplípidos que contienen sitios de unión al colesterol y se ha postulado que el colesterol puede actuar como “puerta de entrada” para la micobacteria. La depleción de colesterol de la membrana plasmática por el tratamiento con filipina, nistatina o metil β ciclodextrina reduce significativamente la fagocitosis de la micobacteria. La unión de los ligandos a sus receptores induce su translocación hacia los lipid rafts, los cuales llegan a formar estructuras alargadas, estables y que presentan altas concentraciones de segundos mensajeros, tal como las proteínas de aclaje a GPI, entre otros, activandose asi las vías de señalización. La micobacteria se une a una gran variedad de receptores que se encuentran sobre la superficie del macrófago, incluyendo a receptores de manosa, complemento, Fc o scavenger. En este trabajo analizamos la compartamentalización en la membrana celular de varios receptores para ligandos micobacterianos, demostrando que la estimulación de los macrófagos murinos con moléculas de secreción de M. Tuberculosis induce a una rápida movilización de los lipid rafts, como se evaluó en microscopia confocal a tiempo real, asi como también la segregación diferencial de CD14, CD35, CD206 y TLR2. Sin embargo, la estimulación de macrófagos murinos con extractos solubles de M. tuberculosis, seguido por el aislamiento de los lipid rafts y su corrimiento en SDS-PAGE mostró una expresión diferencial de varias proteínas que fueron identificadas por micro-secuenciación, entre las que se encontratron la proteína de choque térmico de 70 KDa, moesina, isomerasa disulfido, precursor de la ligasa de glicina-tRNA, nexina 2 y fosfogliceratocinasa 1. Nuestros resultados sugieren que existen cambios dinámicos en la composición de los rafts de la membrana como resultado de la estimulación de los macrófagos con productos de secreción de M. tuberculosis; estos cambios pudieran estar preparando a la célula para la infección, un proceso que nosostros hemos denominado “maduración de lipid rafts”.

13

ABSTRACT

Cell membrane cholesterol is required for viability and cell proliferation. More than 90% of cellular cholesterol is located at the plasma membrane. Several microorganisms and bacterial products target membrane rafts, which are membrane microdomains of eukaryotic cells, enriched in cholesterol, sphingolipids, and certain proteins. Cholesterol confined in membrane rafts is a crucial component required by microorganism, to directly enter or exit the intracellular compartments. The mycobacterial cell wall is rich in glycolipids containing putative high-affinity cholesterol-binding sites and thus it has been postulated that cholesterol may function as a direct “docking site” for mycobacteria. Depletion of plasma membrane

cholesterol by filipin, nystatin or methyl- -.cyclodextrin treatment, significantly reduces phagocytosis of mycobacteria. The cross-linking of receptors embedded in small raft domains results in the coalescence of rafts into large assemblies that bring receptors into proximity with high concentrations of second-messenger molecules, thus initiating signaling cascades. GPI-anchored proteins, cholesterol, and so far unidentified components of membrane rafts may be utilized by several microorganisms as their cellular receptors. Mycobacteria, bind to a variety of cells surface receptors on macrophages, including complement-, mannose- , Fc-, or scavenger- receptors. This work analyzes the cell membrane compartmentalization of several well known receptors for mycobacterial ligands, upon stimulation of murine macrophages with M. tuberculosis-secreted molecules. It is shown that M. tuberculosis secreted molecules induce the rapid mobilization of rafts, as assessed by real time confocal microscopy, as well as a differential segregation of CD14, CD35, CD206, and TLR-2. Moreover, stimulation of murine macrophages with M. tuberculosis-secreted molecules, followed by membrane rafts isolation and SDS-PAGE showed a differential expression of several proteins that were identified, following protein sequencing, as heat shock 70 kDa proteins, moesin (Membrane-organizing extension spike protein), protein disulfide-isomerase, glycine-tRNA ligase, precursor, nexin 2 variant and phosphoglycerate kinase 1 (Primer recognition protein 2) (PRP 2). Taken together our results indicate a rapid change in membrane rafts composition as a result of macrophage stimulation with M. tuberculosis-secreted molecules and which may prepare the host cell, at the level of membrane rafts, for infection, a process we refer to as “membrane rafts maturation”.

14

INTRODUCCION

Se estima que un tercio de la población mundial se encuentra infectada por M.

tuberculosis, causante de un mínimo de 3.0 millones de muertes por año en el

mundo. La respuesta inmune montada, limita la infección, pero no elimina al

patógeno (Chan y Flynn, 2001).

El proceso de fagocitosis es el primer paso en la interacción hospedero-

micobacteria, un paso crítico, ya que la ruta de entrada de un patógeno determina el

tipo de respuesta de las célula huésped. Pocos microorganismos pueden sobrevivir

en el interior del macrófago, debido a la abundancia de vacuolas fagocíticas ácidas y

enzimas hidrolíticas. Es de notar, que el bacilo M. tuberculosis utiliza mecanismos

que le permiten entrar, sobrevivir y multiplicarse en el macrófago, al interaccionar

con receptores bién definidos, iniciando así vías de señalización específicas.

Algunos de estos mecanismos se encuentran en relación a las propiedades

fisicoquímicas de la superficie de la micobacteria (Branes et al, 1989). Armostrong y

colaboradores propusieron que los sulfolípidos micobacterianos participan en la

inhibición de la fusión del fagosoma con el lisosoma, evitando así la maduración del

mismo, permitiendo a la micobacteria sobrevivir dentro del macrófago (Armstrong et

al, 1971). La capacidad restringida de los fagosomas que contienen la micobacteria

para fusionarse con otras vesículas, suguiere que la composición bioquímica de

estos fagosomas está alterada, o que las membranas vacuolares que rodean al

bacilo son deficientes en el proton-ATPasa, la cual es responsable de la

acidificación del fagosoma. Sin embargo, las micobacterias viables en estas

vesículas especializadas, pueden reducir la capacidad de los antígenos

micobacterianos para ser procesados, asociados con el MHC II y transportados a la

superficie celular (Pancholi et al, 1993). Más recientemente, Ferrari y colaboradores

demostraron que la proteína TACO es retenida en los fagosomas que contienen

micobacterias, lo cual evita la fusión fagolisosomal (Ferrari et al, 1999). La vesículas

contienen LAM (y posiblemente otros productos micobacterianos) que fueron

liberados por los fagosomas que contienen la micobacteria ingerida, sugiriendo el

transporte activo de productos de la micobacteria fuera de la célula infectada

15

(Sturgill-Koszycki et al, 1994). La liberación de LAM por los macrófagos infectados

puede actuar de manera parácrina en la modulación de la función de los leucocitos

circundantes. Han sido estudiadas las actividades biológicas de LAMs de diferentes

micobacterias y definido los derivados químicos de LAM. ManLAM es un regulador

crítico en la maduración del fagosoma en macrófagos murínos y en la línea celular

de monocitos humanos. AraLAM es 100 veces más potente en inducir la producción

de TNF por el macrófago que ManLAM. Resultados similares han sido observados

para la IL1, IL-10, NO y la inducción de quimiocinas. Además de que AraLAM

rápidamente activa la translocación del factor de transcipción NF-kB en macrófagos

murínos, siendo esto más potente que el inducido por ManLAM. Tanto AraLAM como

ManLAM induce la acumulación sustancial de KBF1, el cual puede inhibir la

transcripción del NF-kB. Se ha reportado que los grupos acilo asociados a la terminal

fosfatidilinositol de la molécula son esenciales para la actividad biológica de LAM en

células mononucleares. Además AraLAM y ManLAM pueden directamente inducir

la quimiotáxis de células T in vitro. LAM puede unirse a los RM, pero estudios

recientes han reportado que LAM puede insertarse directamente en las membranas

del leucocito y afectar selectivamente la movilidad de las proteínas de la superficie

celular, una propiedad dependiente de la secuencia característica de la cadena acil

(Brown y Taffet, 1995).

Estudios recientes sugieren que M.tuberculosis no solo evade la destrucción por el

macrófago, sino que se multiplica y libera productos micobacterianos que pueden

afectar la respuesta inmune (Nagai et al, 1991). Entre los productos de secreción

de la micobacteria, que han sido focos de interés están:

-ESAT 6 (early secreted antigenic target protein 6); se ha asociado a la respuesta

inmune desencadenada en la infección por M. tuberculosis. Se ha encontrado que

inhibe la activación del factor de transcripción NF-KB y factores reguladores del

interferon (IRFs) posterior a la señalización por TLR (se requiere de la cinasa Akt).

La unión directa de ESAT-6 a TLR2, activa Akt y previene la interacción entre el

adaptador My88 y la cinasa IRAK4 y esto suprime la activación de NF-kB. El residuo

6 de aminoácido carboxiterminal es requerido y es suficiente para mediar este efecto

inhibitorio (Sorensen et al, 1995).

16

-CFP-10 (culture filtrate proteins) al igual que ESAT-6 es crítica para la virulencia de

M. tuberculosis. Induce la proliferación de linfocitos y la producción de IFN (Nagai

et al, 1991).

-HSP70: induce la producción de IL-12 por los macrófagos. Es un potente

estimulador de la respuesta de los linfocitos T antígeno-específico. Se une a TLR2

(Nagai et al, 1991).

-KatG (peroxidasa-catalasa) y SodA (superóxido dismutasa): son enzimas que

degradan ROI y son importantes para la supervivencia de M. tuberculosis en la

infección (Nagai et al, 1991).

-Antígeno de 19 KDa: se une al receptor de manosa. Induce la respuesta inmune,

apoptosis de macrófagos e inhibición de la presentación de antígenos clase II,

induce la respuesta de linfocitos T y macrófagos (secretan NO y TNFα) (Harth et al,

1996; Horwitz et al, 1995; Nagai et al, 1991).

-Entre otras proteínas secretadas por la M. tuberculosis se encuentran la HSP65 (se

une a TLR4), GlnA (glutamina sintetasa), HspX ( se induce bajo condiciones

anóxicas), complejo Ag85 (31 KDa), MTP (2,44,45,51,53,59,63,64,70), complejo

proteico de 88KDa, etc (Harth et al, 1996; Horwitz et al, 1995; Nagai et al, 1991).

La colaboración entre los macrófagos y las células T es esencial para la

erradicación de M. tuberculosis. Inicialmente los macrófagos activados presentan el

antígeno micobacteriano a las células T en asociación con proteínas MHC I y II o

con proteínas semejantes a MHC no polimórficas (CD1). Las citocinas derivadas de

macrófagos juegan un papel crítico como moléculas co-estimuladoras para las

células T específicas del antígeno. Subsecuentemente, las citocinas producidas por

las células T activadas lejos de modular la función de los macrófagos, pueden inhibir

o aumentar el crecimiento de la micobacteria intracelular. La IL-1 e IFNγ pueden

aumentar la presentación de antígeno y estimular la respuesta antimicrobiana en los

propios macrófagos infectados. En modelos murinos de tuberculosis, la respuesta

inicial de citocinas tipo Th1, necesaria para el desarrollo efectivo de DTH es

seguido por la respuesta tipo Th2, la cual limita la inflamación y minimiza el daño al

tejido en el sitio de la infección. La IL-12 puede ser importante para favorecer el

17

desarrollo de la respuesta de DTH al aumentar la producción de IFN γ, facilitando el

desarrollo de células Th1 y aumentando la citotoxicidad de células T y células NK.

En contraste, la respuesta tipo Th2 contribuye frecuentemente a la inmunosupresión

observada en las etapas avanzadas de la enfermedad (Orme et al, 1993).

I) Receptores de Reconocimiento de Patrones (RRP).

El sistema inmune puede reconocer aproximadamente 103 patrones moleculares

asociados a patógenos entre los que se encuentran:

-lipopolisacáridos de las paredes celulares,

-peptidoglicanos que se encuentran en forma abundante en las paredes celulares de

las bacterias Gram-positivas y en menor grado en las Gram-negativas,

-ácidos lipoteicocicos encontrados en las paredes celulares de las bacterias Gram-

positivas,

-glicanos ricos en manosa (comunes en glicoproteínas y glicolípidos microbianos

pero son raros en humanos),

-flagelina encontrado en la flagela de la bacteria, pilin en en pili de la bacteria,

ácidos nucleicos virales y bacterianos,

-N-formilmetionina, un aminoácido común en proteínas bacterianas,

-RNA de doble cadena único en virus,

-ácidos lipoteicocicos, glicolípidos y zimosan de las paredes de las levaduras.

-fosforilcolina y otros lípidos comunes en las membranas microbianas (Akira, 2003).

Para reconocer estas moléculas microbianas, las células de defensa tienen sobre su

superficie una variedad de receptores llamados Receptores de Reconocimiento de

Patrones (PRRs) que son capaces de unirse específicamente a porciones

conservadas de estas moléculas (Akira, 2003).

Existen 2 diferentes clases funcionales de PRRs en la superficie celular: PRR

endocítico y PRR señal.

18

1) RRP endocítico:

Son encontrados en la superficie de los fagocitos y promueven la interacción de los

microorganismos a los fagocitos y su intrenalización y destrucción subsecuente. En

estos se incluyen:

1.1) Receptores de Manosa (RM).

Estos se unen a los grupos de manosa terminal y mucosa sobre las glicoproteínas y

glicolípidos microbianos (las glicoproteínas humanas y glicolípidos típicamente tienen

un grupo N-acetilglucosamina y ácido siálico). Entre estos receptores se incluyen al

RM, lectinas tipo C y moléculas de adhesión intracelular especifica-DC (DC-SIGN).

El bacilo de M. tuberculosis entra al macrófago por unión específica a distintas

moléculas de la superficie celular. Los macrófagos humanos usan los RM, al igual

que receptores del complemento (CD 35, CD11b/CD18, CD11c/CD18) para la

fagocitosis de M. tuberculosis (Sturge et al, 2007).

Estos receptores se distinguen por el hecho de que ellos median la internalización

de los micoorganismos, sin la necesidad de inciar la respuesta proinflamatoria y

quizá, aumenta la sobrevida intracelular del microorganismo.

Los RM participan en la fagocitosis no mediada vía receptores de opsoninas por

reconocimiento de terminales con residuos de manosa sobre partículas blanco. La

fagocitosis de especies virulentas de M.tuberculosis (Erdman y H37Rv) en ausencia

de suero puede ser substancialmente inhibida por manana soluble, albúmina-

manosa, y anticuerpos anti-RM. La unión de la especie atenuada de M. tuberculosis

H37Ra a macrófagos no es bloqueado por estos agentes. La expresión de RM

sobre la superficie celular es regulada por una gran variedad de mediadores que

juegan un papel importante en la patogénesis de la tuberculosis. El IFNγ ha

mostrado ser regulador negativo de la expresión de RM mientras que

concomitantemente se incrementa la capacidad de la célula para matar

microorganismos. En contraste la IL-4 es un potente inductor de la expresión de

RM (Maradi et al, 1993; Scheiber et al, 1993; Stein et al, 1992).

19

La unión de M. tubreculosis virulenta a los RM puede ser mediado por manLAM,

como lo sugiere el hecho de que anticuerpos monoclonales anti-ManLAM reducen

la unión de la micobacteria a los macrófagos hasta en un 49% (Nardell, 1993).

1.1.1) CD206.

La expresión del receptor de manosa de macrófagos CD206, de 163 KDa pertenece

a la familia de lectinas tipo C. Se encuentra expresado principalmente en macrófagos

y células dendríticas inmaduras. No se ha encontrando su expresión en

monocitos, células dendríticas maduras o células epidérmicas de Langerhans,

aunque se ha reportado que CD206 puede expresarse en células dendríticas

epidérmicas bajo condiciones inflamatorias de la piel. En macrófagos humanos, se

ha encontrado que CD206 pueden ser inducidos después de su estimulación.

Dentro de sus funciones se encuentra la unión a oligosacáridos ricos en manosa de

los microorganismos; receptor de reconocimiento de patrón del sistema inmunitario

(Wollenberg et al, 2002).

1.2) Receptores Scavenger (RE).

Se unen a los componentes de las paredes celulares de las bacterias tales como

LPS, peptidoglicanos y ácido teicoico.

1.2.1)MARCO.

MARCO (macrophage receptor with collagenous structure) pertenece a la familia de

receptores scavenger clase A. MARCO se expresan sobre los macrófagos

peritoneales y en una subpoblación de macrófagos de la zona marginal del bazo y

en el cordón medular de nódulos linfoides; jugando un papel importante en la

respuesta inmune contra bacterias al mediar la unión y la fagocitosis (Kraal et al,

2000).

20

MARCO es una proteína trimérica de membrana que contiene un dominio

intracelular N-terminal, un dominio transmembranal y una porción extracelular, un

dominio de colágeno triple hélice y un dominio C-terminal rico en cisterna. Durante la

infección por el bacilo Calmette-Guérin (BCG), la expresión de MARCO es inducido

en forma rápida sobre los macrófagos. En la línea celular J774.2 de macrófagos

murinos, se demostró que la estimulación con LPS estimula la expresión de MARCO

en la superficie de una manera dosis y tiempo dependiente (Arredouani et al, 2005;

Kraal et al, 2000).

2) RRP señal:

Se unen a moléculas microbianas: LPS, peptidoglicanos, ácido teicoico, flagelina,

pilin, DNA y RNA de doble cadena y ciertas proteínas y glicoproteínas de virus. En

estos se incluyen los toll-like receptors (TLR) y CD14. La unión de moléculas

microbianas a sus receptores promueve la síntesis y secreción de moléculas de

regulación intracelular tales como citocinas que son cruciales para iniciar la

inmunidad inata y adaptativa (Brightbill et al, 1999).

2.1) CD14.

CD14 fue el primer PRR identificado, es una glicoproteína de la superficie celular de

53-55 KDa, expresado en monocitos, macrófagos y neutrófilos, aunque también se

ha encontrado una forma soluble y es secretada por monocitos y el hígado. El

CD14 de membrana y en su forma soluble se une a una gran variedad de productos

bactrianos como LPS, ácido lipopoteicoico, glicolípidos micobacterianos y mananas

de levaduras. Se une a complejos de LPS y a proteínas que se unen a LPS;

necesaria para la activación de macrófagos inducida por LPS (Zhengfan et al, 2000;

Wright et al, 1990).

CD14 promueve la habilidad de TL4 de responder a la LPS y proteoglicanos, la

interacción de esas moléculas con CD14 y TLR-4/MD2 induce la regulación de

moléculas coestimuladoras y la síntesis y secreción de citocinas proinflamatorias

21

tales como IL-1, IL-6, IL-8, TNF α y PAF, estas citocinas pueden activar la vía del

complemento y cuagulación. La respuesta de células inflamatorias a concentraciones

subpicomolares de ligandos bacterianos requiere de LBP (proteína de unión a

LPS), una proteína que transporta lípidos, reconoce el lípidos A del LPS y facilita la

unión del LPS a CD14 (Zhengfan et al, 2005; Nagai et al, 2002).

Se ha encontrado que CD14 se encuentra constitutivamente asociado a rafts. FcγRI

(CD64), FcγRII (CD32) y FcγR III (CD16), integrin-associated protein (CD47), y CD81

se asocian con CD14 durante el reconocimiento de LPS. Cada una de esas

moléculas se encuentra en lipid rafts, aunque hay pocas evidencias de que esas

moléculas son funcionalmente importantes en la inducción de agrupamientos de

membrana. Se ha reportado que CD14 puede funcionar como un receptor para M.

tuberculosis en algunos tipos celulares (Schmitz y Orso, 2002; Triantafilou et al,

2002).

2.2) Toll like receptors

Una serie de RRP señal conocidos como TLR juegan un rol principal en la inmunidad

inata y la inducción de la inmunidad adaptativa (Akira et al, 2003)

TLR (Toll-like receptors) juegan un rol crucial en el reconocimiento de patógenos y la

activación de la respuesta inmune subsecuente contra estos. Los TLR reconocen

patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs). La unión de los TLR con sus

ligandos induce la producción de varias citocinas pro-inflamatorias, quimiocinas y

moléculas efectoras, dependiendo del tipo celular (Takeda et al, 2003; Barton y

Medzhitov, 2002; Akira et al, 2003; Underhill y Ozinsky, 2001).

2.2.1) TLR-2

La expresión del RNAm de TLR2 se ha observado en el cerebro, corazón, pulmón,

bazo y en foma elevada en linfocitos de sangre periférica; media la respuesta a

LPS, pero el principal receptor de LPS es TLR4. Se ha demostrado que TLR2 es

22

esencial para la respuesta a PGN, lipopéptidos de los micoplasmas, para transducir

señales (Akira et al, 2003; Brightbill et al, 1999).

Los TLR son mediadores de la activación celular de productos bacterianos. Distintos

productos bacterianos (LPS y LAM) se unen a receptores comunes (CD14) pero

utilizan diferentes TLR (TLR4 y TLR2 respectivamente) (Takeda et al, 2003). TLR2

puede interactuar con LAM, siendo el mayor glicolípido asociada a M. tuberculosis.

TLR2 puede heterodimerizarse con otros TLRs, los cual puede explicar el amplio

rango de PAMPs que TLR2 puede reconocer. TL2 puede formar heterodímeros con

TLR1, TLR6 y posiblemente TLR10. TLR2 /TLR6 en respuesta a PGN y lipopéptidos

diacilados de micoplasma (el 31% de las secuencias de aa de TLR6 son identicos a

TLR2) y se puede asociar al TLR1 para reconocer lipopéptidos triacilados. Sus

ligandos en general de TLR2 son: ácido lipoteicocico, glicopeptidos, zymosan, LAM,

factor soluble de M. tuberculosis, LPS y HSP60 (Takeda et al, 2003; Barton y

Medzhitov, 2002; Akira et al, 2003).

TLR2 puede ser regulado por IL6, TNF α, IL1β, e IL-10. Estudios recientes sugieren

que al igual que TLR4, el complejo TLR2 requiere de CD14 para la detección de

PAMPs y/o señalizar. El complejo TLR2 es también capaz de detectar patrones

propios alterados, tales como células necróticas. Evidencias recientes indican que

TLR2 es reclutado por los fagosomas y puede estar directamente involucrado en la

internalización de productos microbianos por las células (Akira el al, 2003).

2.2.2) TLR-4.

TLR4 es el principal receptor para LPS, el mayor componente de la membrana

externa de las bacterias Gram-negativas. Los LPS pueden inducir una variedad de

respuestas inmunoestimuladoras, por ejemplo, producción de citocinas

proinflamatorias tales como IL-12 y sustancias efectoras proinflamatorias tales

como NO. El lípido A del LPS es el principal responsable de las actividades

biológicas (Lien, 2000).

23

Estudios en donde se utilizaron ratones knockout para TLR4 confirman que TLR4

es crítico para la señalización de LPS. Dentro de los ligandos para TLR4 se

encuentran: LPS (Lipido A), proteína de fusión del VSR, HSP60, dominio A de la

fibronectina y taxol. El complejo TLR4 puede reconocer ligandos exógenos como

proteínas de choque térmico, fibrinógenos, fibronectina, peroteína A sulfactante (SP-

A) y β defensina (Hirschfeld, 2001)..

TLR4 es expresado en altas concentraciones en linfocitos B, linfocitos T, CD,

macrófagos, granulocitos y monocitos. TLR4 forma homodímeros y requiere de la

asociación extracelular de un componente adicional, MD-2. Aunque el complejo

TLR2 es capaz de reconocer LPS, TLR4 es generalmente considerado receptor de

LPS. El MD-2 asociado a los homodímeros TLR4, no se une al LPS directamente; el

LPS primero se une a una proteína de unión soluble (LBP), esta se une a CD14

soluble o CD14 unida a GPI, aunque el mecanismo no es claro, el transporte de LPS

por LBP a CD14 es lo que probablemente activa a TLR4. TLR4 también forma

heterodímeros con TLR5, la cual presumiblemente aumenta su actividad y con

TLR1, inhibiendo su actividad (Hirschfeld, 2001).

TLR4 puede asociarse con otras moléculas de superficie que pueden afectar la

señalización, como moléculas que se asocian a los lípidos rafts y que son ricos en

glicoesfingolípidos y colesterol. Es posible que el reclutamiento de rafts es

requerida para la señalización de TLR4. CD14 es una molécula de superficie unida a

GPI, está constitutivamente asociada a rafts, mientras que parece que TLR4 no. La

activación de macrófagos por LPS induce la translocación de TLR4 en rafts, la

disgregación de rafts con fármacos interfiere en la señalización (Triantafilou et al,

2002)

El papel central de TLR4/MD2/CD14 en la señalización inducida por LPS es claro,

pero varias proteínas de membrana adicionales que se asocian con rafts han sido

implicados en la unión a LPS y la transducción de señales inducidas por LPS y

puede ser importante en la respuesta de las células mieloides a LPS. TLR4 es

regulado por IFNγ e IL-1β (Triantafilou et al, 2002).

24

M. tuberculosis puede inducir a la sobreexpresión de TLR2 y TLR4 en células de

ovario de hamster y macrófagos murinos. Las especies virulenta y atenuada de M.

tuberculosis puede activar a las células de una manera dependiente de TLR,

aunque M. tubreculosis no parece depender de la presencia de CD14 (Chan y

Flynn, 2001).

II) Receptor de complemento (CD35).

Está bién establecido el papel de los receptores del complemento CR1 (CD35), CR3

(CD11b/CD18) y CR4 (CD11c/CD18) en la unión de M. tuberculosis a los

macrófagos. La adherencia y la ingestión de M. tuberculosis ese inhibida (más del

84%) por anticuerpos contra CR1, CR3 y CR4 en presencia y ausencia de suero

fresco. CD35 pertenece a la familia de reguladores del complemento, también

conocido como C3bR, C4bR, receptor del complemento tipo 1 CR1, receptor de

adherencia inmune; es una glicoproteina de membrana de cadena única tipo 1, de

225 KDa, con un dominio extracelular, uno trasnmembranal y una cola

citoplasmática. CD35 induce cambios conformacionales en sus ligandos,

haciéndolos más susceptibles al unión a sitios específicos por la proteasa de serina

del plasma (factor 1). CD35 es expresado en eritrocitos, neutrófilos, monocitos,

esosinófilos, linfocitos B, y en un 10-15% de linfocitos T y células dendríticas.

También ha sido encontrado en podocitos glomerulares, células dendríticas

foliculares y algunos astrocitos. CD35 induce la producción de C3bi, este es un

cofactor necesario para la unión de C3bi a C3c y C3dg. La fagocitosis

frecuentemente requiere la cooperación de CD35 con receptores de complemento

tipo 3 (CD3, CD11b/CD18) y los receptores Fc. El CD35 tiene un papel importante

en remover y procesar los complejos inmunes y facilitar su localización a folículos

linfoides. En resumen, CD35 estimula la fagocitosis de partículas recubiertas por

C3b y C4b y de inmunoclomplejos, además de regular la activación del complemento

(Zabaleta et al, 1998).

25

En la Figura 1 se muestra la interacción de moléculas de superficie de la

micobacteria con los diversos receptores de la superficie del macrófago.

Figura 1. Interacción de la micobacteria con el macrófago. (Velazco-Velazquez MA, 2003)

III) Lectinas

La glicosilación de proteínas determina una importante variedad de procesos

celulares, incluyendo el tráfico de enzimas, “homing” en los tejidos y funciones

inmunes. En la actualidad se ha incrementado el interés en los mecanismos

mediados por carbohidratos llevando a la identificación de nuevos receptores

expresados sobre las células del sistema inmune que reconocen carbohidratos

(Cambi et al, 2005).

Las lectinas son proteínas o glicoproteínas naturales de origen no inmune que

comparten en común la propiedad de enlazarse de forma específica y reversible a

carbohidratos, sin alterar la estructura covalente de los ligandos glicosídicos.

26

Contienen al menos dos sitios de unión, de ahí que pueden enlazarse en primer

lugar a un azúcar específico y en forma secundaria a una molécula glicosilada. Las

lectinas estan compuestas por una cadena polipeptídica en la cual pueden estar

unidos o no a uno o más residuos de carbohidratos, normalmente de 2-15

monosacáridos residuales, que pueden estar constituidos principalmente por 2 o

más azúcares como: D-Manosa, D-galactosa, D-glucosa, L-fucosa. N-acetil-D-

glucosamina, N-acetil-D-galactosamina, ácido salicílico, glucosamina y

galactosamina (Hernandéz-Díaz et al, 1999).

En la Tabla 1 se muestran algunos ejemplos de lectinas y su especificidad. En

nuestro laboratorio, de 7 lectinas probadas, se encontró que solamente Agaricus y

Datura reconocen estructuras de la membrana celular de la línea celular de

macrófagos murinos J774 (Murillo, 2004). La lectinas poseen interesantes

propiedades que convierten a esta clase de proteínas en herramientas invalorables

en laboratorios biológicos, por lo que se utilizan en numerosas investigaciones que

incluyen: estudio de la estructura de las membranas, detección de transformaciones

malignas, purificación de glicoconjugados, estudios citogenéticos, así como también

ensayos histoquímicos, enzimáticos y en el tipaje de grupos sanguineos. Las lectinas

forman parte de conjugados como lectina-lectina, lectina-enzimas y lectina-

anticuerpos, lo que ha permitido el desarrollo de técnicas cromatográficas como la

cromatografía de afinidad para la purificación de glicoproteínas. Las interacciones de

estas proteínas con células pueden ser inhibidas en muchos casos por azúcares, por

lo que se ha llegado a la conclusión de que ellas se enlazan a sacáridos de la

superficie celular, lo que ha provisto a los científicos de útiles marcadores para

emplearlos en técnicas histoquímicas y en la microscopía electrónica para estudiar la

estructura y función de la membrana plasmática. Generalmente se utilizan lectinas

conjugadas con marcadores fluorescentes como la biotina (Kung et al, 1997;

Franceschini et al, 1996).

27

Tabla 1. Especificidad de las lectina.

Nombre de la lectina Afinidad

Agaricus* Fetuina

Bauhinia N-acetil D-galactosamina D-galactosa

Datura* N-acetilglucosamina N-acetil-lactosamina

Glicina max N-acetil-D-galactosamina

Lens culinaris α D-manosil α D-glucosil

Triticum vulgaris N-acetil-β-D-glucosamina N-acetil-β-D-glucosaminil

Ulex europeus L-fucosa *Solamente estas lectinas reconocen estructuras de membrana celular de la línea celular J774. (Murillo, 2004).

Las lectinas tipo C contienen uno o más de los llamados dominios de reconocimiento

de carbohidratos (CDRs) que determinan su especificidad y que son dependientes

de calcio; los cuales se organizan en microdominios y tienen un papel importante

como receptores de reconocimiento de patógenos. Los iones de Ca2+ son

directamente involucrados tanto en la unión al ligando como en el mantenimiento de

la integridad estructural de los CDRs que son necesarias para la actividad de las

lectinas (Drickamer, 1999).

Las lectinas tipo C son producidas como proteínas transmembrana o secretadas

como proteínas solubles. Las colectinas participan en el reconocimiento de

patógenos. La principal función de las lectinas tipo C en el reconocimiento

microbiano es la unión y la subsecuente internalización por el macrófago. Al mismo

tiempo la degradación lisosómica produce fragmentos antigénicos que después de la

presentación por células dendríticas y macrófagos por moléculas MHC en la

superficie celular estimulan el sistema inmune adaptativo (Fiador et al, 2002; Lu et

al, 2002).

28

IV) Lípid Rafts

Las membranas biológicas estan compuestas por una bicapa de lípidos entre los

cuales se insertan proteínas y en menor proporción carbohidratos. Los lípidos de la

membrana son moléculas relativamente pequeñas con una parte hidrofílica y otra

hidrofóbica. Las proteínas de las membranas estan intercaladas en la bicapa de

lípidos. Las moléculas protéicas y lipídicas se mantienen unidas por múltiples

interacciones no covalentes, siendo estructuras fluídas, asimétricas, que constituyen

barreras de permeabilidad muy selectiva, que controlan el flujo de información entre

las células y su medio ambiente. Las membranas celulares están compuestas por

una mezcla de lípidos, entre los cuales se encuentran: fosfolípidos, glicolípidos y

colesterol. Dentro de las funciones biológicas de estos lípidos estan: la capacidad

para almacenar energía altamente concentrada, señalización y como componentes

estructurales de las membranas (Simona e Ikonen, 1997) (Figura 2).

Los lipid rafts son regiones localizadas, con un gran contenido de colesterol y

glicoesfingolípidos Comprenden un porcentaje importante de la superficie de la

membrana (30-40%), pero también se les puede encontrar en compartimentos

membranales como el aparato de Golgi (Simmons y Toomore, 2000). Existen

evidencia de que cambios dinámicos en la membrana plasmática, producidos por

estímulos extracelulares, se llevan a cabo en estos dominios específicos (Holowka y

Bair, 2000). Una de las características de estas plataformas lipídicas es que

permiten la segregación lateral de proteínas en la membrana plasmática, actuando

como plataformas de señalización (Simmons y Toomre, 2000). La capacidad de

segregación, provee un mecanismo para la compartamentalización de componentes

de señalización en la membrana, concentrando ciertos componentes en lípid rafts y

excluyendo otros, por lo que los lipid rafts pueden regular la iniciación y

prolongación de la señal. Los mecanismos que regulan la segregación lateral de

proteínas, no ha sido bién reconocido, sin embrago, se sabe que la incorporación de

residuos de ácido mirístico (miristilación) y ácido palmítico (palmitolación) en las

proteínas, permite la movilidad y la retención en los lipid rafts (Dykstra et al, 2003).

29

Figura 2. Estructura de las membranas biológicas. (Simona K and Ikonen E, 1997).

Foster y colaboradores identificaron mediante la tecnología de proteomics, la

presencia de aproximadamente 241 proteínas de señalización en los microdominios

lipídicos obtenidos de células HeLa (Foster et al, 2003). De las proteínas que

constitutivamente se encuentran asociadas a los lipid rafts están: las ligadas a GPI,

cinasas de la familia del Scr, cinasas miristoladas tales como p56 lck y p59 fyn,

proteínas de unión a GTP y LAT (Dykstra et al, 2003). Se postula que la asociación

de estas proteínas con los lipid rafts es crítica para la señalización, aunque este

mecanismo no se conoce por completo (Dykstra et al, 2003) (Figura 3).

La unión multivalente de ligandos a los MIRRs (TCR, BCR, FcЄRI) induce a la

oligomerización de los receptores; el oligómero tiene alta afinidad por los lipid rafts.

El oligómero puede permanecer en los lipid rafts el tiempo suficiente para que se

ensamblen componentes que intervienen en la señalización. También es importante

que se una el complejo receptor al citoesqueleto de actina, para dar estabilidad, ya

que el receptor oligomérico no es estable, con una débil asociación a su ligando; y el

30

receptor monomérico podría desplazarse fuera de los lipid rafts y la señal cesaría

(Dykstra et al, 2003) (Figura 4).

Figura 3. Estructura de lipid rafts. La región en color rosa muestra la presencia de colesterol y esfingolípídos, así como una

estructura más compacta de la membrana celular. Estas regiones membranales permiten la segregación de moléculas con

capacidad de anclarse a glicosil fosfatidil inositol (GPI) (Pierce , 2002).

Algunos microorganismos utilizan a los lipid rafts para protegerse de la respuesta

inmunitaria y poder propagarse dentro del hospedero (Rosemberg et al, 2000). Son

reconocidos como “puertas de entrada” por diversos patógenos. Se ha evidenciado

la movilización de lipid rafts hacia el sitio de contacto de varios patógenos, así como

la dependencia estricta del colesterol para la internalización apropiada de éste. El

destino de los lipid rafts una vez que el patógeno ha sido internalizado y la

naturaleza de los componentes del patógeno que interactuan con estos, es

desconocido. Ha sido demostrado que el M. avium induce la movilización de lipid

rafts y que infecta la línea celular murina J 774 por un mecanismo dependiente del

colesterol, demostrando que los fagosomas micobacterianos albergan los lípid rafts,

siendo en parte originados de la membrana plasmática, además que los ligandos

micobacterianos unidos a los lipid rafts son, al menos en parte, lípidos de alta

polaridad (Maldonado-García et al, 2004).

El colesterol es requerido para la viabilidad y proliferación celular. Más del 90% del

colesterol celular está localizado en la membrana plasmática. Varios

microorganismos y productos bacterianos tienen como blanco los lipid rafts, que son

microdominios de membrana enriquecidas en colesterol, esfingolípidos y ciertas

31

proteínas. El colesterol confinado en lipid rafts es un componente esencial para que

algunos micoorganismos, puedan entrar o salir de los compartimentos intracelulares.

También es requerido para la actividad citolítica de las citolisinas dependientes del

colesterol conocida como toxina activada por thilio. El retículo endoplásmico es el

sitio con mayor concentración de colesterol. El colestrol de la membrana plasmática

podría jugar un rol dual en la internalización del micoorganismo como un sitio de

unión para patógenos microbianos y como un costituyente integral de lipid rafts

proveyendo una plataforma para la iniciación eficiente de la cascada de señalización

(Dykstra et al, 2003) (Tabla 2).

Figura 4. Translocación de los receptores a los lipid rafts. El entrecruzamiento de BCR por su ligando favorece la movilización

de este hacía los lipid rafts donde se encuentra con moléculas de señalización. Por esta característica, a los lipid rafst se les ha

llamado también “plataformas de señalización”. (Pierce, 2002).

Las micobacterias se unen a una gran variedad de receptores en la superficie

celular del macrófago, incluyendo receptores de manosa, complemento o tipo

“scavenger”; son también capaces de interactuar directamente con el colesterol de

la membrana plasmática. Ricos en glicolípidos, la pared celular de la micobacteria

tiene una alta afinidad por sitios de unión a colesterol. Por lo que se ha postulado

que el colesterol puede actuar como “puertas de entrada” para la micobacteria y

estabilizar su interacción con las membranas. El nivel de colesterol en la membrana

plasmática parece ser crítica en la regulación de la entrada del micoorganismo,

tráfico intracelular y salida. El secuestro de colesterol de la membrana plasmática

con filipina, nistatina, o metil-β-ciclo dextrina, reduce significativamente la fagocitosis

32

de la micobacteria. Similares hallazgos sobre los requerimientos de colestrol en

macrófagos murinos han sido reportados para M. bovis BCG (Dykstra et al, 2003).

La inhibición de la invasión de numerosos micoorganismos patógenos, por

secuestro de colestrol o depleción, indican que el colestrol es crucial en el proceso

de invasión (Maldonado-García et al, 2004).

Tabla 2. Patógenos que utilizan a los lipid rafts como puertas de entrada.

(Mañes , 2003).

33

La proteína TACO (tryptophan-aspartate-containing coat protein) fue identificada en

los fagosomas que contienen micobacterias viables. La proteína TACO previene la

maduración o la fusión con los lisosomas, permitiendo que la micobacteria sobreviva

en el fagosoma. El proceso de incorporación de TACO en la membrana fagosomal

es dependiente de colesterol. La micobacteria entra al macrófago vía lipid rafts, que

son secuestrados en los fagosomas cubiertos por TACO, el cual previene la

liberación lisosomal y asegura la sobrevida intracelular (Ferrari et al, 1999).

34

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La interacción molecular de M. tuberculosis con el macrófago es importante para el

destino que tendrá la micobacteria en la célula huésped. Existen diversas moléculas

de la superficie de la micobacteria que son ligandos de múltiples receptores en el

macrófago, incluyendo a los receptores de manosa, complemento, receptores tipo

“scavenger” y Toll-like receptors (TLRs), siendo también capaces de interactuar

directamente con el colesterol de la membrana plasmática (Schlrsinger, 1993;

Hirschfeld, 2001; Triantafilou et al, 2002). Rica en glicolípidos, la pared celular de

la micobacteria tiene alta afinidad al colesterol. M. tuberculosis, al igual que otras

micobacterias puede entrar a la célula blanco, al menos en parte, por un proceso

mediado por lipid rafts, pudiendo ser considerados como “puertas de entrada” para la

micobacteria, jugando un papel importante, tanto en la internalización de los

microorganismos, como en el inicio de cascadas de señalización, lo cual, en

conjunto, determinará el desarrollo ulterior de la interacción micobacteria-macrófago

(Maldonado-García et al, 2004).

El bacilo M. tuberculosis utiliza mecanismos que le permiten entrar, sobrevivir y

multiplicarse en el macrófago, al interaccionar con receptores bien definidos,

iniciando así vías de señalización. Ha sido demostrado que diversas micobacterias

inducen la movilización de lipid rafts. Sin embargo, los mecanismos de interacción

micobacteria-macrófago tanto a nivel molecular como celular y la naturaleza de los

componentes, tanto del patógeno como de los lipid rafts no han sido bien definidos.

Por lo que en este trabajo se pretende identificar algunos de los constituyentes de

los lipid rafts que tengan alguna participación en el proceso de estimulación de

macrófagos con moléculas de secreción de M. tuberculosis H37Rv.

35

JUSTIFICACION

Los lipid rafs han sido reconocidas como “puertas de entrada” para algunas

micobacterias. Se desconoce si estos microdominios modulan el curso de la

infección por micobacteria, así como la composición proteíca de los lipid rafts en el

proceso infeccioso. El análisis de la composición de los lipid rafts durante la

estimulación de macrófagos con moléculas de secreción de M. tuberculosis,

permitirá conocer mejor el proceso de comunicación patógeno-hospedero.

HIPOTESIS

Los lipid rafts contribuyen a la modulación del proceso de comunicación macrófago-

micobacteria, al modificar su composición proteica en el curso de la estimulación con

moléculas de secreción de M. tuberculosis.

36

OBJETIVO GENERAL

Determinar la composición proteica de los lipid rafts de macrófagos murinos (J774)

durante la estimulación con moléculas de secreción de M. tuberculosis.

OBJETIVOS PARTICULARES

-Determinar la distribución del receptor de manosa (CD206), receptor del

complemento (CD35), receptores tipo “scavenger” (CD14 y MARCO) y receptores

tipo Toll (TLR-2 y TLR4), en células J774 en reposo y activadas con componentes

solubles de M. tuberculosis.

-Determinar la distribución de glicoproteínas reconocidas por las lectinas Agaricus y

Datura, en células J774 en reposo y activadas con componentes solubles de M.

tuberculosis.

-Identificar algunas proteínas que se expresen de manera diferencial en células

J774 en reposo y activadas con moléculas de secreción de M. tuberculosis en

fracciones membranales ricas en GM1 (lipid rafts) mediante análisis proteómico.

37

MATERIALES Y METODOS

A) Cultivo de la línea celular de macrófagos murinos J774 y estimulación con

moléculas solubles de M. tuberculosis H37Rv.

La línea celular de macrófagos murinos J774 se cultivó en cajas de Petri (100mm X

20mm) (Corning), en medio de cultivo Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)

(Invitrogen, Grand Island, NY) suplementado con suero fetal bovino al 5%

(Invitrogen) a 37 oC y con una atmósfera de bióxido de carbono al 5%, hasta obtener

una confluencia del 80% (10 millones de células por caja aproximadamente). Las

células fueron raspadas y lavadas 2 veces con PBS (Sigma) (NaCl 137 mM, KCl 2.7

mM, N2HPO4-7H2O 4.3 mM, KH2PO4 1.4 mM, pH 7.3) y centrifugadas a 2000 rpm

durante 5 minutos. El botón celular se resuspendió en 1.0 ml de DMEM sin

suplementar. Las células se estimularon con sobrenadante de cultivo de M.

tuberculosis H37Rv (la cual fue donada por el Dr Hernández Pando). La interacción

de células J774 con los componentes micobacterianos se analizó a los 30, 60 y 120

min. Después de la estimulación, las células fueron lavadas con PBS y lisadas con 1

ml de regulador de lisis TENEV (NaCl 150 mM, Tris-HCL 25 mM, EDTA 5mM, Triton

X-100 1%) suplementado con un cocktel de inhibidores de proteasas

(Completo)(Roche, Indianápolis IN) y de fosfatasas. Después de 30-60 min a 4oC, el

lisado celular fue homogenizado en un homogenizador tipo Potter (5ml, Wheaton,

USA)

B) Purificación de lipid rafts mediante gradiente de sacarosa.

Para obtener una fracción membranal enriquecida en lipid rafts, se prepararon

gradientes de sacarosa, en los cuales las células J774 se lisaron con Triton X-100 al

1.0 % y un cóctel e inhibidores de proteasas (Completo) (Roche). Los lisados (1.0

ml) fueron mezclados con volúmenes iguales de sacarosa al 85% (1 ml) en TENEV

[25mM Tris HCl (pH 6.5), NaCl 150 mM (pH 6.5)] y transferidos a tubos de

ultracentrífuga. Se adicionó una capa de TENEV al 35% de sacarosa (6.5 ml) y una

38

segunda capa de TENEV al 5% de sacarosa (3.5ml), las células lisadas fueron

centrifugadas a 40,000 rpm, con un rotor de SW40Ti (Beckman) por 16 hrs a 4 C.

Se colectaron 12 fracciones de 1 ml, empezando por la parte superior del gradiente

de sacarosa. La fracción correspondiente a los lipid rafts fue identificada mediante

western blot anti GM1 (Sigma-Aldrich).

C) Purificación de lipid rafts mediante una técnica libre de detergentes.

Los lipid rafts fueron también obtenidas por un procedimiento libre de detergentes

(Macdonald y Pike, 2005), para lo cual, se obtuvieron un total de 1X108 células en

2 ml de regulador base (20 mM Tris-HCl, pH 7.8, 250 mM sacarosa, 1mM CaCl2 y 1

mM MgCl2) adicionado un cocktel de inhibidores de proteasas (Completo) (Roche).

Posteriormente, las células fueron lisadas, pasando la suspensión a través de una

jeringa de insulina varias veces, seguido por la homogenización en un

homogeinizador tipo Dounce (5ml, Wheaton, USA).

Los lisados fueron centrifugados a 1000 X g por 10 minutos. Los sobrenadantes

resultantes fueron mezclados en volúmenes iguales (2ml) de OptiPrep (Sigma-

Aldrich) 50% en regulador base y transferido a un tubo de ultracentrifuga

(Beckman), 3.0 ml de OptiPrep 20%, 3.0 ml de OptiPrep 10% y OptiPrep 0%. Los

gradientes fueron centrifugados a 180,000 x g en un rotor SW40Ti (Beckman) por 90

minutos a 4oC. Fracciones de 1.0 ml fueron colectados, empezando por la parte

superior del gradiente (Fracciones 1-12).

D) “Slot blott” anti GM-1

Con el propósito de identificar la fracción que contiene a los lipid rafts, se realizaron

ensayos de “slot-blott” anti GM-1, colocando 50µl de las diferentes fracciones de los

gradientes en una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad, Hércules, CA); las membranas

se bloquearon con PBS-5% de leche descremada en polvo, durante 40 min. Y

posteriormente se adicionó la subunidad β de la toxina del colera biotilinada (5µg/ml)

(Sigma-Aldrich) que reconoce al gangliósido GM1, y finalmente Sterptavidin-PO; la

39

señal quimioluminiscente fue capturada en película de rayos X (Kodak, Rochester, NY).

Estos resultados fueron analizados por densitometría mediante un software Sigmagel.

E) Separación de proteínas por SDS-PAGE e identificación de proteínas

fosforiladas.

Las proteínas presentes en cada una de las fracciones de los gradientes, fueron

separadas por SDS-PAGE al 10%, por duplicado. Un gel fue teñido con azul Coomasie

(proteínas totales) y el segundo gel fue usado para la tinción de proteínas fosforiladas.

Para lo cual, el gel se colocó en 100 ml de regulador de fijación (50% de metanol y

10% de ácido acético) por 30 minutos y después de lavar con con agua MiliQ (tres

veces), se incubó con la solución “Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Staining”, en

agitación por 60 minutos. Posteriormente, el gel fue colocado con 80-100ml de

regulador de desteñimiento y capturado digitalmente en un transiluminador.

F) Separación de proteínas por SDS-PAGE e identificación de proteínas por

secuenciación.

Las proteínas presentes en cada una de las fracciones de los gradientes, fueron

separadas por SDS-PAGE al 10%. El gel fue teñido con azul Coomasie (proteínas

totales), para identificar las proteínas expresadas de manera diferencial en células

J774 en reposo y en células estimuladas con sobrenadante de cultivo de M.

tuberculosis. Se cortaron la bandas diferenciales y se llevó a cabo la micro

secuenciación de las proteínas presentes en cada una de las bandas identificadas

(esta parte fue realizada en colaboración con el Dr Edgar Zenteno Galindo del

Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina-UNAM y la Unidad de

Glicobiología Estructural y Funcional, Paris Francia).

40

G) Citometría de Flujo.

Las células J774 fueron raspadas, lavadas y ajustadas a una densidad celular de 10

x107 células/ml. Las células fueron estimuladas con extractos solubles de M.

tuberculosis durante 0, 15, 30 y 60 min. 100µl de la suspensión celular fueron

colocados en tubos para FACS a los cuales se les agregó alguno de los siguientes

reactivos: lectina de Agaricus (Vector laboratrories, Inc) (Burlingame), lectina de Datura

(Vector laboratrories, Inc) (Burlingame) (ambas biotinadas) (5µg/ml), anti-TLR2 (BD

Pharmingen), anti-TLR4 (BD Pharmingen), anti MARCO (BD Pharmingen), anti CD14

(Becton Dickinson), anti CD35 (BD Pharmingen), anti- CD206 (eBioscience). Las

células fueron incubadas a 4 C durante 30 min, depués de lavadas, se adicionó a la

suspensión celular streptavidina–PerCP (BD Pharmingen)(1µg/ml) para la lectina

biotilinada, o un anticuerpo secundarior unido a PE (eBioscience) (para anti TLR2,

TLR4, MARCO, CD14, CD35, CD206), toxina del cólera unida a FITC (reconoce al

gangliosido GM1) (Sigma-Aldrich), se utilizó como control de isotipo anticuerpos

secundarios unidos a PE (eBioscience), PerCP (BD Pharmingen) y FITC (Sigma).

Después de lavadas, las células fueron fijadas con paraformaldehído al 1% y

analizadas por citometría de flujo (FACScalibur Cytometer) (BD Bioscence). Los datos

fueron analizados usando el programa CellQuest (Becton Dickinson).

H) Microscopía de Fluorescencia y Confocal.

Para determinar la distribución de los lipid rafts y la colocalización de estos con las

glicoproteinas reconocida por las lectinas Agaricus y Datura, TLR-2, TLR4, MARCO,

CD14, CD35, CD206 sobre la superficie de las células J774, se utilizaron placas de

cultivo de 6 pozos, se colocaron cubreobjetos (previamente lavados, desengrasados y

esterilizados) y, sobre los cubreobjetos, se depositaron células J774 y se incubaron a

37 C toda la noche, para favorecer la adhesión celular al cubreobjetos. Posteriormente,

las células fueron estimuladas con un extracto micobacteriano libre de células (5-10

µg/ml). Las células fueron incubadas por 5, 15, 30 y 60 minutos y posteriormente

fijadas con paraformaldehído al 1%. Las células ya fijadas fueron bloqueadas con PBS-

41

BSA e incubadas a temperatura ambiente con agitación continua por 30 minutos. Las

células fueron incubadas con lectina (5µg/ml), anti TLR-2, anti-TLR-4, anti-MARCO,

anti-CD14, anti-CD14, anti-CD206 a temperatura ambiente por 30 min y marcadas con

la subunidad β de la toxina del colera (5µg/ml), streptavidina PE (para su unión a la

lectina), o una segundo anticuerpo unido a PE ( para su unión a anti-TLR-2, anti-TLR-

4, anti-MARCO, anti-CD14, anti-CD14, anti-CD206). Finalmente, las células fueron

lavadas y montadas en Vectashield (Vector, Burlingame, CA) para su análisis por

microscopia de fluorescencia (Nikon) o Confocal (Carl Zeiss, Jena, Germany, LSM

510).

I) Obtención de los extractos solubles de M. tuberculosis.

La bacteria (especie virulenta H37Rv) fue crecida en agitación a 370C, enriquecida en

glicerol, albúmina, catalasa y dextrosa (Becton Dickinson, Cockysville, MD, USA). El

crecimiento fue monitoriado por densitometría. La suspensión bacteriana fue

cuantificada usando microscopía de fluorescencia y cámara de Newbauer y ajustada a

2.5X105 células viables por 100µl de PBS (Dormans et al, 2004).

Los extractos solubles fueron obtenidos después de 4-5 semanas de crecimiento de la

especie virulenta H37Rv de M. tuberculosis en medio modificado Proskaver y Beck

por Youmans (Lawrence, 1994; Youmans, 1946). Los antígenos del filtrado del cultivo

fueron precipitados con 45% (w/v) de sulfato de amonio, lavados y redisueltos en PBS.

Utilizando un total de 5- 10µg/ml de extracto soluble para la estimulación (Dormans et

al, 2004).Blackwell Science, Ltd Oxford, UK

CEIClinical and Experimental Immunolog0009-9104Blackwell Publishing Ltd, 20042004 137strains

J. Dor

J) Infección pulmonar en modelos murinos e histopatología.

Se usaron ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad. Los animales fueron

anestesiados intraperiotonealmente con fenobarbital. Se realizó una pequeña

incisión en la línea media para exponer la tráquea, seguida por la inyección de

2.5X105 células víables en 100µl de PBS. Después de suturada la incisión, el ratón

infectado fue mantenido en posición vertical hasta que pasó el efecto de la anestesia.

42

Tres grupos de ratones fueron mantenidos por 24, 48 y 72 hrs después de la infección.

Posteriomente fueron sacrificados por dislocación cervical. Se realizó una incisión a

través de la línea alba del animal desde el estrenón hasta el abdomen y se extrajo de la

cavidad torácica ambos pulmones.

El pulmón derecho fue fijado y embebido en parafina. El pulmón izquierdo fue

rápidamente congelado en nitrógeno líquido y mantenido a -700C, para estudios

microbiológicos. Se utilizó 3 µm de la sección de parafina. Los cortes fueron

desparafinados a 600C durante 30min, introducidos en xilol e hidratados pasándolos en

una serie de alcoholes (absoluto 96, 70 y 50%), por último se colocaron en agua

destilada durante 2 min, posteriormente los tejidos se introdujeron en recuperador de

antígeno (S1700 Dako) calentado a 900C (en horno de microondas) durante 10 min; se

lavaron con PBS (Sigma) a 370C durante 5 min, una vez lavadas la laminillas, se

colocaron en camara húmeda; posteriormente se les adiccionó la subunidad β de la

toxina del coléra unida a FITC (5µg/ml) (reconoce la fracción GM1 de los lipid rafs) y

anti-CD206 (5µg/ml) por 45 minutos, se eliminó el anticuerpo con PBS, y posteriomente

se incubó con un segundo anticuerpo unido a PE ( para su unión a anti-CD206) por

45 min, se realizaron 2 lavados con PBS y se montaron en Vectashield (Vector,

Burlingame, CA) para su análisis por microscopia de Confocal (Carl Zeiss, Jena,

Germany, LSM 510).

43

RESULTADOS

A) Cambios morfológicos y movilización de lipid rafts en célula J774 estimuladas

con moléculas de secreción de M. tuberculosis.

Se ha evidenciado la movilización de lipid rafts hacia el sitio de contacto de varios

patógenos, así como la dependencia estricta del colesterol en la internalización

apropiada de éstos, bajo estos conceptos nosotros quisimos determinar si los

extractos solubles de M. tuberculosis son capaces de inducir cambios morfológicos y

movilización de los lipid rafts en macrófagos murinos. Observamos cambios

morfológicos como la contracción de filopodios y movilización célular, así como la

movilización de lipid rafts principalmente en filipodios y en los sitios de contacto célula-

célula. En contraste, en células J774 no estimuladas no se observó movilización de los

lipid rafts y los cambios morfológicos fueron mínimos (Figura 5).

B) Análisis de la composición proteica de lipid rafts.

Una vez que determinamos que los extractos solubles de M. tuberculosis eran

capaces de inducir cambios morfológicos y movilización de lipid rafts, determinamos

si algunos receptores ya bien caracterizados para ligandos micobacterianos, como

receptores del complemento CD35, scavenger (“recolectores de basura”): CD14 y

MARCO; manosa (CD206), lectinas (Agaricus y Datura) , TLR (Toll-like receptors) 2 y

4, eran capaces de interactuar directamente con los lipid rafts al estimular a la

célula con los extractos micobacterianos; ya que la unión multivalente de los

ligandos a los receptores induce la oligomerizacion de los receptores, y este

oligómero tiene alta afinidad por los lipid rafts. Para ello las células J774 fueron

estimuladas con extractos solubles de M. tuberculosis a diferentes tiempos (15, 30 y 60

minutos) y analizamos por microscopía confocal la colocalización de CD14, CD35,

TLR-2, TLR-4, MARCO y lectinas (Agaricus y Datura) (en rojo) con el gangliosido GM1

(como marcador de lipid rafts) (en verde). Como se muestra en la Figura 6, al tiempo 0

solo se encuentra una discreta expresión de glicoproteinas reconocidas por la lectina

44

Datura y GM1 pero, en el curso del tiempo ésta se intensifica llegando a ser más

prominente a los 15 y 30 minutos, para posteriormente disminuir.

En la Figura 7 podemos observar una sobreexpresión de CD206 y colocalización con

GM1 a los 30 minutos; semejantes resultados se obtuvieron con CD35 (Figura 8).

Figura 5. Cambios morfológicos y redistribución de los lipid rafts. Las células J774 fueron incubadas en ausencia (A) y presencia (B) (C) de sobrenadante de cultivo de M. tuberculosis a los 0, 10, 20 y 30 minutos e incubadas durante toda la cinética con la toxina del Cólera unida a FITC que reconoce la fracción GM1 de los rafts y analizadas en tiempo real en Microscopía Confocal. A) Prácticamente no hay cambios morfológicos evidentes o rediistribución de lipid rafts en células no estimuladas; B) Cinética donde se observa la movilización de lipid rafts a través de un filopodio como se índica en las flechas.C) Cinética en donde se hace evidente la contracción de filopodios y la movilización celular como se indica con las flechas.

En la Figura 9 se puede observar la sobreexpresión de TLR-2 en el curso del tiempo

con un máximo a los 30 minutos y con una colocalización casi perfecta con GM1 a los

30 minutos (como se puede observar por el ángulo de 45 grados en la colocalización),

lo mismo se puede observar para CD14 (Figura 10). Por lo tanto, los extractos

solubles de M. tuberculosis fueron capaces de inducir colocalización de CD14,CD35,

CD206, TLR-2 y la lectina Datura en lipid rafts en macrófagos murinos, no así para

TLR-4, MARCO y la lectina Agaricus (dato no mostrado). En la Figura 11 se muestra

0´ 10´ 20´ 30´0´ 10´ 20´ 30´

A

B

C

0´ 10´ 20´ 30´

45

la co-expresión de GM1 (rafts) con CD14, TLR-2, CD35 y CD206 (las imágenes de

microscopía confocal fueron transferidas a una computadora y empleando el software

NIH Image v1.61 fueron analizadas; siendo mayor la co-expresión de GM1 con CD14

y menor para TLR-2; cabe señalar que no encontramos este fenómeno de

colocalización ni para TLR-4 o MARCO (dato no mostrado).

Es importante señalar que CD35, CD206 y Datura se encuentran constitutivamente

asociados a lipid rafts, datos que nos habían sido reportados previamente.

C) Colocalización del receptor de manosa (CD206) con lipid rafts en macrófagos

de pulmón de ratón infectado con M. tuberculosis H37Rv.

En cortes de pulmón de ratón infectado por M. tuberculosis, encontramos que al igual

que en la línea celular de macrófagos murinos estimuladas con extractos

micobacterianos, hubo una sobre-expresión de CD206 y una colocalización casi

perfecta con los lipid rafts (gráfica de colocalización a 45 grados) a las 24hrs, siendo

ésta más pronunciada a las 48 hrs de infección (Figura 12).

D) Análisis de la expresión de CD14, CD35, CD206 y TLR2 por citometría de flujo.

Mediante un análisis por citometria de flujo de la línea celular de macrófagos murinos

estimulados con productos de secreción de M. tuberculosis, se confirmó los resultados

obtenidos previamente mediante microscopía confocal, en donde lo extractos de M.

tuberculosis fueron capaces de modular la sobre-expresión de CD14, CD35, CD206 y

TLR2 (Figura 13).

46

Figura 6. Expresión de la lectina Datura y su translocación a lipid rafts posterior al estímulo con sobrenadante de cultivo de M. tuberculosis. Células J774 no estimuladas (A) y estimuladas con sobrenadantes de cultivo de M. tuberculosis a los 15 (B), 30 (C) y 60 (D) minutos. Datura (rojo). GM1 (verde). En los recuadros azules se muestra la expresión de cada una de las moléculas en la superficie celular, mostrando la colocalización de ambas moléculas que va del verde (colocalización leve), amarillo (colocalización moderada) y rojo (colocalización máxima).

-

GM1 Datura

COLOCALIZACIÓN

GM1 Datura

-

GM1 Datura

COLOCALIZACIÓN

GM1 Datura

SOBRENADANTE H37Rv 30 MIN

GM1 Datura

COLOCALIZACIÓN

GM1 Datura


GM1 Datura

COLOCALIZACIÓN

GM1 Datura

DaturaGM1

GM1 Datura

COLOCALIZACIÓN


DaturaGM1

GM1 Datura

COLOCALIZACIÓN


DaturaGM1

GM1 Datura

COLOCALIZACIÓN


SIN ESTÍMULO

C)

B)

D)

A)

H37Rv 60 MIN

COLOCALIZACIÓN

GM1 Datura

H37Rv 60 MIN

GM1 Datura

COLOCALIZACIÓN

GM1 Datura

H37Rv 60 MIN

COLOCALIZACIÓN

GM1 Datura

GM1 Datura

COLOCALIZACIÓN

GM1 Datura

SOBRENADANTE H37Rv 60 MINH37Rv 60 MIN

COLOCALIZACIÓN

GM1 Datura

H37Rv 60 MIN

GM1 Datura

COLOCALIZACIÓN

GM1 Datura

H37Rv 60 MIN

COLOCALIZACIÓN

GM1 Datura

GM1 Datura

COLOCALIZACIÓN

GM1 Datura


47

Figura 7. Expresión de CD206 y su translocación a lipid rafts posterior al estímulo con extractos solubles de M. tuberculosis. Células J774 no estimuladas (A) y estimuladas con extractos de M.tuberculosis a los 30 minutos (B). CD206 (rojo). GM1 (verde). En los recuadros azules se muestra la expresión de cada una de las moléculas en la superficie celular, mostrando la colocalización de ambas moléculas que va del verde (colocalización leve), amarillo (colocalización moderada) y rojo (colocalización máxima).

Figura 8. Expresión de CD35 y su translocación a lipid rafts posterior al estímulo con extractos solubles de M. tuberculosis. Células J774 no estimuladas (A) y estimuladas con extractos de M. tuberculosis a los 30 minutos (B). CD35 (rojo). GM1 (verde). En los recuadros azules se muestra la expresión de cada una de las moléculas en la superficie celular, mostrando la colocalización de ambas moléculas que va del verde (colocalización leve), amarillo (colocalización moderada) y rojo (colocalización máxima).

SIN ESTIMULO

GM1 CD206

COLOCALIZACIÓN

GM1 CD206

SIN ESTIMULO

GM1 CD206

COLOCALIZACIÓN

GM1 CD206

GM1 CD206

GM1 CD206

COLOCALIZACIÓN


GM1 CD206

GM1 CD206

COLOCALIZACIÓN


SIN ESTIMULO

GM1 CD35

COLOCALIZACIÓN

GM1 CD35

SIN ESTIMULO

GM1 CD35

COLOCALIZACIÓN

GM1 CD35

GM1 CD35

GM1 CD35


GM1 CD35

GM1 CD35


A) B)

A) B)

48

Figura 9. Expresión de TLR2 y su translocación a lipid rafts posterior al estímulo con extractos solubles de Mycobacterium tuberculosis. Células J774 no estimuladas (A) y estimuladas con extractos de M.tuberculosis a los 15 (B), 30 (C) minutos. TLR-2 (rojo). GM1 (verde). En los recuadros azules se muestra la expresión de cada una de las moléculas en la superficie celular, mostrando la colocalización de ambas moléculas que va del verde (colocalización leve), amarillo (colocalización moderada) y rojo (colocalización máxima). Se puede observar que la colocalización es casi perfecta cuando el angulo llega a los 45 grados (recuadro inferior derecho).

TLR2 GM1

COLOCALIZACIÓN

TLR2

GM1

SIN ESTIMULO

TLR2 GM1

COLOCALIZACIÓN

TLR2

GM1

SIN ESTIMULO

GM1TLR2

COLOCALIZACIÓN

TLR2

GM1


GM1TLR2

COLOCALIZACIÓN

TLR2

GM1


TLR2 GM1

COLOCALIZACIÓN

TLR2

GM1


TLR2 GM1

COLOCALIZACIÓN

TLR2

GM1


A) B)

C)

49

Figura 10. Expresión de CD14 y su translocación a lipid rafts posterior al estímulo con extractos solubles de M. tuberculosis. Células J774 no estimuladas (A) y estimuladas con extractos de M.t uberculosis a los 15 (B) y 30 (C) minutos . CD14 (rojo). GM1 (verde). En los recuadros azules se muestra la expresión de cada una de las moléculas en la superficie celular, mostrando la colocalización de ambas moléculas que va del verde (colocalización leve ), amarillo ( colocalización moderada) y rojo (colocalización máxima). Se puede observar que la colocalización es casi perfecta cuando el angulo llega a los 45 grados (recuadro inferior derecho).

CD14 GM1

COLOCALIZACIÓN

CD14

GM1

SIN ESTÍMULO

CD14 GM1

COLOCALIZACIÓN

CD14

GM1

SIN ESTÍMULO

CD14 GM1

CD14

GM1

COLOCALIZACIÓN


CD14 GM1

CD14

GM1

COLOCALIZACIÓN


CD14 GM1

CD14

GM1

COLOCALIZACIÓN


CD14 GM1

CD14

GM1

COLOCALIZACIÓN


B) C)

A)

50

Figura 11. Macrófagos murinos fueron incubados sin o con sobrenadantes de cultivo de M. tuberculosis. La colocalización de GM1 con los receptores celulares indicados fue evaluada mediante microscopía confocal. Las imágenes fueron analizadas empleando el software NIH image v1.61.

Figura 12. Expresión de lipid rafts en pulmón de ratón infectado con M. tuberculosis. Cortes de pulmón de ratón infectado con M. tuberculosis por 24 (A) y 48 hrs (B) y el análisis por microscopía confocal de la colocalización de CD206 con los lípidos rafts. GM1(en verde), CD206 (rojo) y colocalización de ambas moléculas (en blanco), Cortes de pulmón donados por el Dr Hernández Pando. Dpto de Patología del HNSZ.

24 h 48 h

GM1-verde

CD206-rojo

Colocalización-blanco

Pulmón de ratón infectado

con M. tuberculosis

24 h 48 h

GM1-verde

CD206-rojo

Colocalización-blanco

Pulmón de ratón infectado

con M. tuberculosis

60’

30’

0’

A) B)

51

Figura 13. Expresión de moléculas expresadas en macrófagos murinos posterior al estímulo con extractos solubles de M. Tuberculosis. Macrófagos murinos fueron incubados en ausencia (A) y presencia (B) de extractos solubles de M. tuberculosis. Mediante citometría de flujo fue analizada la expresión de rafts (GM1), CD14, CD35 y CD206. La media de la IMF de más de 3 experimentos.

E) Efecto de la modificación de la estructura de lipid rafts en la expresión de

receptores celulares.

Una vez que observamos que los extractos de M. tuberculosis per se eran capaces de

modular la expresión y la colocalización de los receptores a lipid rafts, se evaluó si la

expresión de estos receptores era dependientes de la integridad de los lipid rafts, por lo

que las células J774 fueron pretratadas con metil-β-Ciclodextrina (BCD) o Filipin

(disgregan colesterol de los lipid rafts y de esta manera inhiben su función) y

posteriormente se estimularon con productos de secreción de M. tuberculosis,

observando que la expresión de los receptores fué dependiente de lipid rafts. En la

Figura 14 podemos observar que la expresión de GM1 fue inhibida con el tratamiento

con filipina y BCD.

A)

B)

IMF 160

IMF 228

IMF 263

IMF 332 IMF 195

IMF 179

IMF 267

IMF 162

52

Figura 14. Inhibición de la expresión de GM1 en macrófagos murinos estímulados en extractos solubles de M. tuberculosis al alterar la estructura de los lipid rafts. Macrófagos murinos estimulados con extractos de M. tuberculosis en ausencia y presencia de Filipin 200ng/ml y 400 ng/ml por 30 minutos; BCD 10mM, y 40mM por 30 min. Se analizó la expresión de GM1 en la membrana mediante citrometría de flujo .

F) Inducción de fosforilación de proteínas de lipid rafts en respuesta al estímulo

con moléculas de secreción de M. tuberculosis en células J774.

Una de las características de las lipid rafts es que permiten la segregación lateral de

proteínas en la membrana plasmática, y se postula que la asociación de estas

proteínas con los receptores es crítica para la señalización. Por ello, se evaluó si los

extractos micobacterianos per se eran capaces inducir fosforilación de proteínas

citoplasmáticas o de membrana al ser estimulados con extractos micobacterianos a

diferentes tiempos (0, 5, 15, 30 y 60 minutos), observando fosforilación de las

proteínas citoplasmáticas a partir de los 5 minutos con un máximo a los 30 minutos

(figura 15). La centrifugación diferencial nos permitió separar las lípidos de la

membrana en 12 fracciones deacuerdo a su gradiente, encontrando a los lipid rafts

en las fracciones 4, 5 y 6, como se observa en el dot-blotting, siendo confirmado por

densitometría (Figura 16), aunque cabe mencionar que los lipid rafts pueden ser

Filipina Metil- -cicloidextrina

medio

10 mM

40 mM

200ng/ml

400 ng/ml

medio

IMF=271

239

160

71

86

43

Filipina Metil- -cicloidextrina

medio

10 mM

40 mM

200ng/ml

400 ng/ml

medio

IMF=271

239

160

71

86

43

53

encontrados entre las fracciones 3-6 dependiendiendo del método de separación. Se

observó que de las fracciones membranales de las células J774 estimuladas con

extractos micobacterianos, la fosforilación fue más evidente en las fracciones

correspondientes a los lipid rafts (Figura 17).

Figura 15. Identificación mediante SDS-PAGE de proteínas citoplasmáticas fosforiladas en células J774 estimuladas con extractos solubles de M. tuberculosis. Las células J774 fueron estimuladas con extractos de M. Tuberculosis a diferentes tiempos (5, 15, 30, 45 y 60 minutos), lisadas, montadas en geles de poliacrilamida, y posteriormente se evaluó la fosforilación de las proteínas por transiluminación.

G) Identificación de proteínas expresadas diferencialmente en los lipid rafts de

células J774 estimuladas con moléculas de secreción de M. tuberculosis

mediante análisis proteómico.

Aunque por tecnología de proteomics, se han identificado la presencia de proteínas

de señalización en los lipid rafts, se desconoce cual o cuales son las proteínas que

se asocian a los lipid rafts al momento de la infección por M. tuberculosis, por lo que

mediante secuenciación de proteínas evaluamos la heterogeneidad de los lipid rafts

al estímulo con extractos micobacterianos, observando una expresión diferencial de

las proteínas ante dicho estímulo. En la Tabla 3 se muestran algunas características

de las bandas secuenciadas. Dentro de las proteínas que mayormente se

expresaron en las fracciones correspondientes a los lipid rafts se encontraron la

proteína de choque térmico 70, Moesina, isomerasa disulfido, ligasa glicina-tRNA,

60’ 45’ 30’ 15’ 5’ 0’

Tiempo de estímulo

54

nexina 2 y cinasa de fosfoglicerato 1; es intersante mencionar que dichas proteínas

no habian sido reportadas previamente y quizá formen parte del arsenal de

proteínas empleadas por M. tuberculosis para infectar a la célula (Tabla 4).

------------------ 2 3 4 5 6 7 8 9

Figura 16. Fracciones membranales correspondientes a los lipid rafts. Separación de lipid rafts mediante ultracentrifugación diferencial (fracciones 4-6). A) Dot blot anti- GM-1, usando la subunidad β de la toxina del cólera. B) La densitometría corrobora que la máxima intensidad corresponde a los lipid rafts.

DENSITOMETRIA

-100

0

100

200

300

400

500

600

700

0 2 4 6 8 10 12 14

No DE FRACCIÓN

INT

EN

SID

AD

MÁ

XIM

A

Fracciones membranales

Lipid rafts

B)

A)

55

-----------------

Figura 17. Identificación mediante SDS-PAGE de proteínas membranales fosforiladas en células J774 estimuladas con extractos solubles de M. tuberculosis. Las células J774 fueron estimuladas con extractos de M. tuberculosis por 30 minutos, lisadas, y separados los lípidos de la membrana por gradientes de sacarosa mediante la técnica de centrifugación diferencial, montadas en geles de poliacrilamida, y posteriormente evaluando la fosforilación de las proteínas en las 12 fracciones lipídicas.

En la tabla 3 se muestra el número de bandas analizadas, el peso molecular

aproximado, la fracción membranal perteneciente a los lipid rafts en la cuál se

obtuvo mayor expresión de la proteína en relación a su contraparte: con (+) o sin (-)

estímulo con extractos micobacterianos; y si se encontró o no identidad con

proteínas en bases de datos (reconocimiento).

Tabla 3. Características de las bandas analizadas para secuenciación.

Banda PesoMolecular (KDa) Fracción (-/+) Reconocimiento

1 108,000 4 (-) No

2 104,000 4 (+) No

3 97,000 4 (+) Si*

4 89,000 4 (+) No

5 86,000 4 (+) Si*

6 73,000 4 (+) Si*

7 53,000 4 (+) Si*

8 50,000 4 (+) No

9 64,000 3 (-) Si*

10 62,000 3 (-) Si*

11 52,000 3 (-) No

12 80,000 4 (-) Si*

13 49,000 4 (+) Si*

14 45,000 4 (+) Si*

15 36,000 4 (-) Si* En presencia (+) o ausencia (-) de estímulo con extractos micobacterianos. *Score significativo

7 6 5 4 3 2

rafts

7 6 5 4 3 2

rafts

Fracciones membranales

lipid rafts

8 7 6 5 4 3

56

Tabla 5. Proteínas encontradas en las diferentes bandas y la fracción rafts correspondiente.

Banda Fracción Proteína identificada / Score

3 4 (+) Fosofoglicerato cinasa 1. Score 39

9 3 (-) Antígeno de rechazo a tumor. Score 233 Alfa actina 1. Score 83 Factor de elongación 2. Score 70

10 3 (-) HSP 90. Score 99

12 4 (-) Fosfolipasa A2. Score 58

13 4 (+) HSP70. Score 433 Moesina. Score 331 Disulfuro isomerasa. Score 104

15 4 (-) HSP60. Score 405 Piruvato cinasa. Score 402 Sintetasa seril-tRNA. Score 194 Fosfatasa pp2a. Score 83.

En presencia (+) o ausencia (-) de estímulo con extractos micobacterianos. En colaboración con el Dr Edgar Zenteno Galindo. UNAM

H) Análisis de la heterogeneidad en la composición proteica de los lipid rafts.

El microscopio confocal nos permite visualizar la colocalización de dos o más

moléculas sobre la superficie celular, o determina la distancia entre ellos; pero existe la

necesidad de técnicas adecuadas con nos permitan realizar un análisis de la

composición de los lípidos rafts, identificando simultáneamente dos o más

proteínas, la cantidad relativa de cada proteína, y su discriminación en cada una de

las diferentes fracciones lipídicas de la membrana; para ello aprovechamos el uso

combinado de un protocolo de aislamiento de lípidos rafts por centrifugación

57

diferencial libres de detergentes, ya que la presencia de detergentes (como en el

caso de la ultracentrifugación por gradientes de sacarosa) induce agregación de

componentes de la bicapa lipídica, y la solubilización del detergente podría provocar

la formación de grandes estructuras no fisiológicas, pudiendo esto alterar la

composición de los lípidos rafts; seguido por la detección de moléculas presentes en

las en cada una de estas fracciones membranales con anticuerpos unidos a

fluorocromos y analizados por citometría de flujo, permitiendonos con ello evaluar la

composición y heterogeneidad de los lípid rafts de una manera rápida y sensible

(Morales-García et al, 2008). Con esta técnica fue posible evaluar en forma

cuantitativa la expresión de GM1 en cada una de las fracciones lipídicas membranales,

pudiendo observar como era de esperarse una mayor expresión en las fracciones

correspondientes a los lipid rafts, en este caso fracciones 3 y 4 (Figura 18). Aunque

ha sido reportado que CD14 se expresa constitutivamente en lípidos rafts de

macrófagos murinos; mediante esta técnica fue posible determinar que sólo un 37.7%

de la fracción lipídica correspondiente a lipid rafts fue positiva para CD14, pero cabe

mencionar que interesantemente el 92.2% de este CD14 se encontró asociado con

GM1. Además se pudo evaluar que solamente el 39.2% de dicha fracción se encontró

enriquecida en GM1 (Figura 19).

58

Figura 18. Análisis de la expresión de GM1 en las 12 fracciones lipídicas membranales. Las fracciones obtenidas por centrifugación diferencial (12 fracciones) fueron incubadas con toxina del coléra unida a FITC para reconocer la fracción GM1 que identifica a los lipid rafts, posteriomente fueron analizadas por citometría de flujo. A) Histogramas y B) Grafíca de la IMF obtenidas de los histogramas. Representativo de 3 experimentos.

Figura 19. Expresión de CD14 en fracciones lipídicas membranales correspondientes a los lipid rafts. Una fracción lipídica correspondiente a lipid rafts fué incubada con CD14 (PE) y GM1 (FITC) y posteriomente analizada por citometría de flujo. .

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Fraction number

GM

1 e

xp

res

sio

n(M

FI)

B

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Fraction number

GM

1 e

xp

res

sio

n(M

FI)

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Fraction number

GM

1 e

xp

res

sio

n(M

FI)

BGM1

co

un

ts

A

GM1

co

un

ts

A

rafts

59

DISCUSION

Una de las características de los lipid rafts es que permiten la segregación lateral de

proteínas en la membrana plasmática, actuando como plataformas de señalización

(Simmons y Toomore, 2001; Holowka y Bair B, 2000; Foster et al, 2003). La

capacidad de segregación, provee un mecanismo para la compartamentalización de

componentes de señalización en la membrana, concentrando ciertos componentes

en los lipid rafts y excluyendo otros, regulando así la iniciación y prolongación de las

señales celulares en respuesta al micro-ambiente celular (Dykstra et al, 2003;

Foster et al, 2003).

La interacción molecular de M. tuberculosis con el macrófago es determinante para

el destino que tendrá la micobacteria en la célula huésped. Existen diversas

moléculas de la superficie de las micobacterias que funcionan como ligandos de

múltiples receptores de la membrana celular de los macrófagos, incluyendo a los

receptores de manosa, complemento, receptores tipo “scavenger” y tipo Toll (TLRs)

(Schirsinger, 1993; Triantafilou et al, 2002; Nardel, 1993; Nagai et al, 1991; Lien,

2000; Cambi, 2005). M. tuberculosis, al igual que otras micobacterias puede entrar a

la célula blanco, al menos en parte, por un proceso mediado por lipid rafts. En este

proceso se encuentran involucrados lípidos micobacterianos de alta polaridad, por lo

que los lipid rafts han sido consideradas como “puertas de entrada” para diversos

patógenos. Estos microdominios membranales juegan un doble papel; como sitio de

unión para el patógeno y de plataforma de señalización intracelular (Maldonado-

García, 2004; Meñes et al, 2003).

En el presente trabajo se observó que la estimulación de macrófagos de la línea

celular J774 con sobrenadantes de cultivo de M. tuberculosis H37Rv (10-20 µg/ml)

induce cambios morfológicos en la célula, así como la redistribución de lipid rafts y

una diferente composición proteica de los mismos. Un proceso al que denominamos

“maduración de lipid rafts”.

El análisis por microscopía confocal nos sugiere fuertemente que la composición de

lipid rafts varía como resultado del estímulo con moléculas de secreción de M.

tuberculosis, ya que se observó compartamentalización de algunos receptores bien

60

definidos como ligandos micobacterianos (CD14, CD35, TLR2, CD206) además de la

expresión de la glicoproteína reconocida por la lectina Datura. Proponemos que

estos cambios en la composición de lipid rafts contribuyen en el destino final de las

micobacterias dentro de las células hospederas. Además, tomando en cuenta que

estos cambios ocurrieron en respuesta al estímulo con moléculas de secreción de M.

tuberculosis, lo que podría sugerir que de esta manera, los macrófagos se “preparan”

para la infección bacteriana, mediante un proceso que hemos denominado

“maduración de las lipid rafts”.

Cabe señalar que la colocalización de estos receptores con GM1 (marcador de lipid

rafts) fue inhibida por el tratamiento con BCD, lo que sugiere que la integridad de los

lipid rafts es un requisito para la señalización inducida por las moléculas de

secreción de las micobacterias.

Por otro lado, se observó que a los 30 minutos de estimulación con las moléculas de

secreción de M. tuberculoisis hay un incremento en la fosforilación de proteínas del

citosol de los macrófagos, así como una mayor fosforilación de proteínas presentes

en los lipid rafts, en comparación con la fosforilación en proteínas de las membranas

no-rafts, lo que es indicativo de que en la señalización intracelular de los macrófagos

participan de manera primordial los lipid rafts, aunque queda por determinar cual o

cuales son las proteínas que se encuentran fosforiladas tanto a nivel citosólico como

membranal a diferentes tiempos de estímulos ya que la fosforilación puede variar

en el transcurso de la infección.

Por otra parte, el estímulo de macrófagos J774 con productos de secrección de M.

tuberculosis indujo la migración de algunas proteínas hacia los lipid rafts o fuera de

las mismas. Entre las proteínas que migraron hacia los lipid rafts, identificamos a la

fosfoglicerato cinasa 1, la cual participa en la glicolisis (Jang et al, 2008); la proteína

de choque térmico HSP70, que participa en el plegamiento de diversas proteínas, en

la respuesta al estés celular, y de manera importante en la inmunidad innata

(Livingston et al, 2006); moesina, la cual actua como molécula de unión entre la

membrana plasmática y la actina del citoesqueleto. Esta proteina se localiza en los

filopodios y en otras protusiones de la membrana celular y por lo tanto, es importante

en el movimiento celular, asi como en el reconocimiento y señalización (Tsukita y

61

Yonemura, 1997); proteína disulfuro isomerasa, la cual cataliza el plegamiento

proteico y ayuda a cargar péptidos antigénicos en la las moléculas MHC clase I

(Bulleid, 1993); glicina tRNA, una enzima participa en el metabolismo de glicina,

serina y treonina, y en la biosíntesis de aminoacyl-tRNA (Fraser,1963), nexina

(variante 2), que participa en la comunicación celular y en el trasporte de proteínas

intracelulares (Suzuki et al, 1997). De la identidad de estas proteínas se hace

evidente su importancia en la actividad biológica de los macrófagos estimulados con

productos de secreción de M. tuberculosis. Es muy probable que el movimiento de

estas moléculas hacia los lipid rafts, preparen al macrófago para su “encuentro” con

las micobacterias. Destacan el fosfoglicerato cinasa, que prepararía a la célula para

una mayor demanda metabólica, la moesina, que está involucrada en procesos de

señalización intracelular y movilidad celular, lo cual tiene una relación directa con la

observación, por microscopía confocal, de la emisión de filopodios en las células

estimuladas y, la proteína de choque térmico hsp70, la que participa en la inmunidad

innata y en la presentación de antígenos. Es importante mencionar que algunas

proteínas de choque térmico habian sido encontradas en los lipid rafts de células

estimuladas con LPS, pero en este trabajo, por primera vez, se demostró su

presencia en los lipid rafts de células estimuladas con productos micobacterianos.

Cabe mencionar, que la presencia de todas estas proteínas no había sido

demostrada en lipid rafts, lo que abre nuevas líneas de investigación.

El análisis de la composición protéica de los lipid rarfts ayudará a entender mejor el

papel de estas estructuras de la membrana en la activación celular, patogénesis y

otros procesos celulares mediados por la membrana. Es importante destacar que

con las metodologías disponibles para tal efecto, la heterogeneidad en la

composición de los lipid rafts no puede ser analizada, por lo que en el curso de

nuestros estudios, tuvimos que diseñar una metodología que nos permitiera estudiar

esta importante característica. El uso combinado de centrifugación diferencial y

citometría de flujo hizo posible observar la presencia simultanea de dos o más

proteínas en lipid rafts a nivel de vesiculas individuales (Morales-García et al, 2008)

permitiendonos hacer un análisis cuantitativo, en forma rápida y sensible la

composición y heterogeneidad de los lipid rafts, lo cual no habría sido posible con las

62

metodologías actuales, aunque quedaría por determinar con esta metodología cual

o cuales son las proteínas que se presentan simultáneamente en lipid rafts al

estímulo con extractos solubles de M. tuberculosis, además de que sería interesante

determinar la cantidad relativa de cada uno de ellas, aunque para ello se requiere de

hacer varios ensayos a diferentes tiempos de estímulo con micobacteria, ya que

sería probable que la heterogeneidad de los lipid rafts varíe dependiendo del tiempo

de infección.

63

CONCLUSIONES

-Los productos de secreción de M. tuberculosis en macrófagos murinos son capaces

de inducir cambios morfológicos y movilización de lipid rafts.

-La composición protéica de los lipid rafts varía posterior al estímulo con moléculas de

secreción de M. tuberculosis, ya que se observó una compartamentalización de los

varios receptores celulares hacia estos microdominios. Esta variabilidad de la

composición protéica podría contribuír al reconocimiento de la micobacteria.

-La pérdida de integridad de los lipid rafts, disminuye la expresión de algunos de los

receptores que reconocen ligandos micobacterianos, lo que confirma la

compartamentalización de estos receptores en lipid rafts.

-Los extractos solubles de M. tuberculosis son capaces de inducir fosforilación de

proteínas en las fracciones membranales enriquecidas en lipid rafts, lo que sugiere

que estos microdominios son indipensables para que se lleven a cabo algunas vías

de señalización iniciadas por la estimulación de estos receptores.

-El estímulo de macrófagos J774 con productos de secrección de M. tuberculosis

indujo la migración de algunas proteínas hacia los lipid rafts.De la identidad de estas

proteínas se hace evidente su importancia en la actividad biológica de los

macrófagos estimulados con productos de secreción de M. tuberculosis. Es muy

probable que el movimiento de estas moléculas hacia los lipid rafts, preparen al

macrófago para su “encuentro” con las micobacterias. Este trabajo identifica, por

primera vez, algunas proteinas presentes en los lipid rafts de células estimuladas

con productos micobacterianos, lo que abre nuevas rutas de investigación.

-El análisis de la heterogeneidad de los lipid rafts podría ayudarnos a entender mejor

el papel de estas estructuras de la membrana tanto en la activación celular,

patogénesis, como en otros procesos célulares mediados por la membrana.

64

PERSPECTIVAS

En el presente trabajo se demostró que los lipid rafts pueden modular el proceso de

comunicación macrófago-micobacteria. Pero, en la actualidad se desconoce qué

proteínas en particular, dentro de los lipid rafts, tienen algún papel durante el proceso

infeccioso. Por lo tanto, después de haber identificado mediante análisis proteómico,

algunas proteínas “candidatos”, que se expresan diferencialmente en los lipid rafts de

células previamente estimuladas con productos de secreción de M. tubreculosis, es

ahora necesario confirmarlo por otros métodos (western blot, citometría de flujo,

microscopía confocal). Un aspecto novedoso será el análisis de la heterogeneidad de

los lipid rafts en procesos infecciosos; por lo que es el momento de aplicar a este

problema, la metodología desarrollada por nuestro grupo.

65

BIBLIOGRAFIA

1) Akira S. Mammalian Toll-like receptors. Curr Opin Immunol, 2003; 15: 5-11.

2) Armostrong J, D´Arcy and Hart P. Response of culture macrophages to M.

tuberculosis with observation on fusiono of lisosomes with fagosomes. J Exp Med

1971; 134: 713-40.

3) Arredouani MS, Palecanda A, Koziel H, Huang YC, Imrich A, Sulahian TH, Ning

YY, Yang Z, Pikkarainen T, Sankala M, Vargas SO, Takeya M, Tryggvason K,

Kobzik L. MARCO is the major binding receptor for unopsonized particles and

bacteria on human alveolar macrophages. J Immunol 2005; 175: 6058-64.

4) Barton G and Medzhitov. Toll-like receptor and their ligand. Curr Top Microbiol

Immunol 2002; 270; 81-92.

5) Brightbill H, Libraty D, Krutzik S, Yang R and Belisle J. Host defense mechanisms

tiggered by microbial lipoproteins through toll-like receptors. Science 1999; 285: 732-

36.

6) Branes P, Mehra G, Hirschfield,Fong C, Abou-Zeid,Rook S, Hunter P, Brennan a

R.W Modlin. Characterization of T cell antigen associated with the cell wall protein-

peptidoglycan complex of M. tuberculosis. J Immunol 1989; 143: 2656-62.

7) Brown MC and Taffet SM. Lipoarabinomannens derived from different strains of M.

tuberculosis differentially stimulate the activation of NF-kB and KBF1 in murine

macrophages. Infect Immun 1995; 63: 1960-68.

8) Bulleid, N.J. Protein Disulfide Isomerase: Role in biosynthesis of secretory proteins.

Advances in Protein Chemistry 1993; 44, 125-50.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Arredouani%20MS%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Palecanda%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Koziel%20H%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Huang%20YC%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Imrich%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Sulahian%20TH%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Ning%20YY%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Yang%20Z%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Pikkarainen%20T%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Sankala%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Vargas%20SO%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Takeya%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Tryggvason%20K%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Kobzik%20L%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

66

9) Cambi A, M Koopman and C Figdor. How C- type lectins detect pathogens. Cell

Microbiol 2005 ; 7(4): 481-488.

10) Chan J and Flynn J. Latent and reactivation tuberculosis. Infection and Immunity

2001; 69:4195-4201.

11) Dennis EA. Diversity of group types, regulation, and function of phospholipase A2.

J Biol Chem 1994; 269: 13057-13060.

12) Dombrauckas J.D. Santarsiero B.D. and Mesecar A.D. Structural basis for tumor

pyruvate kinase M2 allosteric regulation and catalysis. Biochem 2005; 44:9417-9429.

13) Dormans J, Burger M, Aguilar D, Hrenadéz-Pando R, Krener K, Roholl P, Arend M

and Soolingen Van. Correlation of virulence, lung pathology, bacterial load and

delayed typehypersensitivity responses after infection with different M. tuberculosis

genotypes in a BALB/c mouse model. Clin Exp Immunol 2004; 137:460-68.

14) Drickamer K. C-type lectin-like domains. Curr Opin Struct Biol 1999; 9: 585-590 .

15) Dykstra M, Cherukuri A, Shon HW, Tzeng SJ and Pierce SK. Location is

everything lipid rafts and immune cel signaling. Annu Rev Immunol 2003; 21:457-81.

16) Egerton M, Moritz RL and Druker B. Identification of the 70kD heat shock cognate

protein (Hsc70) and alpha-actinin-1 as novel phosphotyrosine-containing proteins in T

lymphocytes. Biochem Biophys Res Commun 1996; 224 (3): 666–74.

17) Ferrari G, Lancen H, Naito M, Pieters J. A coat protein on phagosomes envolved

in the intracellular survival of mycobacteria. Cell 1999; 97: 435-447.

18) Figdor C, Van Kooyk Y and Adema G. C-type lectin receptors on dendritic cells

and Langerhans cells. Nat Rev Immunol 2002; 2: 77-88.

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Dombrauckas+J.D.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Santarsiero+B.D.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Mesecar+A.D.%22

67

19) Foster L, De Hoos C, Mann M. Unbiased quantitative proteomics of lipid rafts

reveals high especifity for signaling factors. PNAS 2003; 13:100.

20)Fraser MJ . Glycyl-RNA synthetase of rat liver: partial purification and effects of

some metal ions on its activity. Can J Biochem Physiol 1963. 41: 1123–33.

21) Franceschini V, Lazzari M, Ciani F. Identification of surface glycoconjugates in the

olfactory system of turtle. Brain Res 1996; 725(1):81-7.

22) Gevaert K, Goethals M. Martens L. Staes A. Thomas G.R. and Vandekerckhove J.

Exploring proteomes and analyzing protein processing by mass spectrometric

identification of sorted N-terminal peptides. Nat Biotechnol 2003; 21:566-569.

23) Harth, H, Lee B-Y, Wang J, Clemens DL, Horwitz MA. Novel insights into the

genetics, biochemistry, and immunocytochemistry of the 30–kilodalton major

extracellular protein of M. tuberculosis. Infect Immun 1996; 64: 3038-47.

24) Hernández-Díaz P, Matrín.González O, Rodriguez de Pablos Vélez Y, Félix A and

Báez G. Aplicaciones de las lectinas. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 1999;

12(2): 91-5.

25) Horwitz MA, Lee B-Y, Dillon BJ, harth G. Protective immunity against tuberculosis

induced by vaccination with major extracellular proteins of M. tuberculosis. Proc Natl

Acad Sci 1995; 92:1530-4.

26) Hirschfeld M. Signaling by Toll-like receptor 2 and 4 agonist results in differential

gene expression in murine macrophages. Infec Immun 2001; 69: 1477.

27) Holowka D and Bair B. Interaction between FcεRI and lipid rafts components are

regulated by the actin cytoeskeleton. J Cell Sci 2000; 113: 1009-1019.

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Goethals+M.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Martens+L.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Staes+A.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Thomas+G.R.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Vandekerckhove+J.%22

68

28) Jang CH, Lee IA, Ha YR, Lim J, Sung MK, Lee SJ and Kim JS. PGK1 induction by

a hydrogen peroxide treatment is suppressed by antioxidants in human colon

carcinoma cells. Biosci Biotechnol Biochem 2008; 72 (7): 1799-808.

29) Kawasaki N, Kawasaki T and Yamashina I. Isolation and characterization of a

mananan-binding protein from human serum. J Biochem 1983; 94: 937-47.

30) Kraal G, Van Der Laan L, Elomaa O, Tryggvason K. The macrophage receptor

MARCO. Microbes Infect 2000; 2: 313-16.

31) Kong ZL, Chiang LC, Frang F, Shinohara K, Pan P. Immune bioactivity in shell fish

toward serum-free cultured human cell lines. Biosci Biotechnol Biochem 1997; 61(1):

24-8.

32) Lawrence GW. Cultivation of mycobacterium tuberculosis. Pathogenesis ,

protecton and control. Washington. ASM Press 1994, 73-83.

33) Lien E. Toll-like receptor 4 imarts ligand-specific recognition of bacterial

lipopolysaccharide. J Clin Invest 2000; 195: 497-504.

34) Livingston R.J., Rieder M.J. Shaffer T. Bertucci C. Baier C.N. Rajkumar N. Willa

H.T. Stanaway I.B. Nguyen C.P. Gildersleeve H. Johnson E.J. Swanson J.E.

McFarland I. Park C. and Nickerson D.A. Submitted (MAY-2006) to the

EMBL/GenBank/DDBJ databases.

35) Lu J, Teh C, Kishore U and Rrid K. Collectins and ficolins: sugar pattern

recognition molecules of the mammalian innate immune system. Biochim Biophys Acta

2002; 1572: 387-400.

36) Macdonald JL and Pike LJ. A simplified method for the preparation of detergent-

free lipid rafts. J Lipid Res 2005; 46(5): 1061-7.

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Livingston+R.J.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Rieder+M.J.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Shaffer+T.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Bertucci+C.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Baier+C.N.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Rajkumar+N.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Willa+H.T.%22



http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Stanaway+I.B.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Nguyen+C.P.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Gildersleeve+H.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Johnson+E.J.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Swanson+J.E.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22McFarland+I.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Park+C.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Nickerson+D.A.%22

69

37) Maldonado-García G, Chico-Ortiz, López-Marín LM and Sanchez-García FJ.

High-polarity M. avium-derived lipids interact with murine macrophages lipid rafts.

Sacand J Immunol 2004; 60(5): 463-70.

38) Mañes S, Reak G, Martínez AC. Pathogens; Rafts hijackers. Nat Rev Inmunol

2003; 3: 557-68.

39) Maradi L, Schreiber D, Anderson R, MacDermott, Korchak H and Johnston R.

Enhancement of macrophages candidacidal activity by interferon-gamma: increased

phagocytosis, killing, and calcium signal mediated by decreased number of mannose

receptors. J Clin Invest 1993; 91: 2596-2601.

40) Morales-García M. Guadalupe, Jean-Jacques Fournie M, Maximina Bertha

Moreno-Altamirano, Gabriela Rodríguez-Luna, Ricardo-Mondragon- Flores, F. Javier

Sánchez-García. A flow-cytometry method for analyzing the composition of membrane

rafts. Cytometry 2008; 73(10):918-25.

41) McDonough KA, Kress Y and Bloom R. Phatogenesis of tuberculosis interaction

of M. Tuberculosis with macrophagos. Infect Immun 1993; 61:2763-73.

42) Missale C, Nash SR and Robinson SW. Dopamine receptors: from structure to

function. Physiol Rev 1998; 78 (1): 189–225.

43) Murillo Najera FJ. Señalización temprana vía rafts durante la interacción macrófago-

micobacteria. Tesis de Maestría 2004. ENCB-IPN.

44) Nagai. Essential role of MD-2 in LPS responsiveness and TLR4 distribution. Nat

Immunol 2002; 3; 667-72.

70

45) Nagai S, Wiker HG, Harboe M, Kinomoto M. Isolation and partial characterization

of major protein antigens in the culture fluid of M. tuberculosis. Infect Immun 1991;

59:372-82.

46) Nardell E. Phatogenesis of tuberculosis. Luna Biol Health Dis 1993; 103: 123.

47) Ohama T, Yang DC and Hatfield DL. Selenocysteine tRNA and serine tRNA are

aminoacylated by the same synthetase, but may manifest different identities with

respect to the long extra arm". Arch Biochem Biophys 1994; 315: 293–301.

48) Orme IM, Andersen P and Boom WH. T cel response to M. tuberculosis. J infect

Dis 1993; 167: 1481-97.

49) Pancholi P, Mirza N, Bhardwaj and Steinman R. Sequestration from immune

CD4+ T cells of mycobacteria growing in human macrophages. Science1993; 260:984-

86.

50) Pierce SK. Lipid rafts and B-cell activation. Nature Reviews/ Immunol 2002; 2: 96-

104.

51) Rosemberg CM, Brumell JH, Finlay BB. Microbial Phatogénesis: Lipid rafts as

phatogen portals. Curr Biol 2000; 10: 823-25.

52) Scheiber S, Pekins S, Teitelbaum J, Stahl P and Blum J. Regulation of mouse

bone marrow macrophages mannose receptor expression and activation by

prostaglandin E and IFN-gama. J Immunol 1993; 151: 4973-81.

53) Schmitz G and Orso E. CD14 signalling in lipid rafts: new ligands and co-

receptors. Curr Opin Lipidol 2002; 13: 513-21.

71

54) Schlrsinger LS. Macrophage phagocytosis of virulent but not attenuated strain of

M. tuberculosis is mediated by manose receptors in addition to complement receptors.

J Immunol 1993;150:2920-30.

55) Schnitzer JE, Oh P and McIntosh D P. Role of GTP hydrolysis in fission of

caveolae directly from plasma membranes. Science 1996; 274: 239-242.

56) Simona K, Ikonen E. Funcional rafts in cell membranas. Nature 1997; 387: 569-

72).

57) Simmons K and Toomre D. Lipids rafts and signal transduction. Nat Rev Mol Cell

Biol. Brown DA. Seeing is believing: visualization of rafts in model membranas. Proc

Natl Acad Sci USA 2001: 98: 10517-18.

58) Sorensen AL, Nagai S, Housen G, Andersen P and Anderesen AB. Purification

and characterization of a low-molecular mass T-cell antigen secreted by M.

tuberculosis. Infect Immun 1995; 63:1710-7.

59) Stein M, keshav N, Harris N and Gordon S. Interleukin 4 potently enhance murine

macrophages mannose receptor activity: a marker of alternative immunologic

macrophages activation. J Exp Med 1992; 176: 287-92.

60)Sturge J, Todd SK, Kogianni G, McCarthy A, Isacke CM. Mannose receptor

regulation of macrophage cell migration. J Leukoc Biol 2007; 82:585-93.

61) Sturgill-Koszycki S, Schlesinger P, Chakraborty P, Haddix H, Collins A, Fok R,

Allen S, Gluck J, Heuser and Russell DG. Lack of acidification in mycobacterium

phagosomes produced by exclusión of the vesicular proton-ATPasa. Science 1994;

263: 678-681.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Sturge%20J%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Todd%20SK%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Kogianni%20G%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22McCarthy%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Isacke%20CM%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

72

62) Suzuki Y., Yoshitomo K., Maruyama K., Suyama A. and Sugano S. Construction

and characterization of a full length-enriched and a 5'-end-enriched cDNA library.

Gene1997; 200: 149-156.

63) Takeda K, Kaisho T and Akira S. Toll-like receptors. Annu Rev Immunol 2002; 21:

335.

64) Triantafilou M, Miyake K, Golenbock D and Triantafofilou K. Mediators of innate

immune recognition of bacteria concentrate in lipid rafts and facilitate

lipopolisaccharide-induced cell activation. J Cell Sci 2002; 15: 2603-11.

65) Tsukita S and Yonemura S. ERM (ezrin/radixin/moesin) family: from cytoskeleton

to signal transduction. Curr Opin Cell Biol 1997; 9 (1): 70–5.

66) Underhill D and Ozinsky. Toll-like receptors: key mediators of microbe detection.

Curr Opin Inmunol 2001; 14: 103-110.

67) Vázquez-Velázquez MA, Barrera D, Gónzalez-Arenas A, Rosales C and

Agramonte-Hevia J. Macrophage-micobacterium tuberculosis interactions: role of

complement receptor 3. Microb Pathog 2003; 35(3): 125-31.

68) Wintergest E, Manz-Keinke H, Plattner H and Schlepper-Schafer J. The

interaction of a lung surfactant protein (SP-A) with macrophages is mannose

dependent. Eur J Cell Biol 1989; 50: 291-98.

69) Wollenberg A, Mommaas M, Oppel T, Schottdorf EM, Günther S, Moderer M.

Expression and function of the mannose receptor CD206 on epidermal dendritic cells

in inflammatory skin diseases. J Invest Drematol 2002; 118:327-34.

70) Wright S, Ramos R, Tobias P, Ulevitch R and Mathison. CD14, a receptor for

complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein. Science 1990; 249,

1431-33).

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Suzuki+Y.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Yoshitomo+K.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Maruyama+K.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Suyama+A.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Sugano+S.%22

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Wollenberg%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Mommaas%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Oppel%20T%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Schottdorf%20EM%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22G%C3%BCnther%20S%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Moderer%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

73

71) Youmans GP. A method for detremination of cultura cycle and the growth rateo f

virulent human type tubercle bacilli. J Bacteriol 1946; 51: 703.

72) Zabaleta J, Arias M, Maya JR and García LF. Diminished adherence and/or

ingestion of virulent M. tuberculosis by monocyte-derived macrophages from patients

with tuberculosis. Clin Diag Lab Immunology 1998; 5: 690-694.

73) Zhengfan J, Philippe G, Xin D, Shamel L and Sovath S. CD14 is required for

MyD88-independent LPS signaling. Nat Immunol 2005; 565-70. M. tuberculosis

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL · las balsas lipÍdicas (lipid rafts) modulan el proceso de...

Documents

Transcript of INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL · las balsas lipÍdicas (lipid rafts) modulan el proceso de...