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1 INFORME FINAL DE PROYECTOS DE INVESTIGACIN Caracterizacin molecular de la enfermedad Marchitez Manchada en tomate (Lycopersicum esculentum) Clave del Proyecto: 20070409 Director del proyecto: Dr. Sergio Medina Godoy Institucin: IPN, CIIDIR-UNIDAD SINALOA Fecha de Inicio: ENERO 2007 Fecha de conclusin: DICIEMBRE 2007

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INFORME FINAL DE PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN

Caracterización molecular de la enfermedad Marchitez Manchada en tomate

(Lycopersicum esculentum)

Clave del Proyecto: 20070409

Director del proyecto: Dr. Sergio Medina Godoy

Institución: IPN, CIIDIR-UNIDAD SINALOA

Fecha de Inicio: ENERO 2007

Fecha de conclusión: DICIEMBRE 2007

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Resumen

En México, el cultivo de tomate es un importante generador de divisas y de

empleos (Hernández y col., 2004). Sin embargo los rendimientos los cultivos se

ven mermados, por diversas enfermedades en México, particularmente la región

noroeste de México se ha detectado un nuevo virus infectando tomate que

pertenece a la superfamilia tipo picornavirus, siendo el objetivo de este trabajo

identificar por medio de la proteómica, proteínas de la cápside de virus ToANV en

plantas de tomate, así como identificar algunos cambios en el perfil de proteínas

de las plantas enfermas. Materiales y Métodos. Se utilizaron plantas de tomate

infectadas con el virus ToANV, se identificó el virus con la prueba

inmunoenzimática DAS-ELISA, utilizándose un anticuerpo policlonal donado por

Turina y col (2007), se extrajeron proteínas de la parte aérea de la plantas sanas

y enfermas por el método de extracción de proteínas del fenol y se separaron en

dos dimensiones (IPG strip pH 3-10), las proteínas se resolvieron en geles de

poliacrilamida al 10%, se fotodocumentaron con el sistema Gel-Doc (Bio-Rad) y

se analizaron los geles comparativos con el programa PDQuest (Bio-Rad), las

proteínas diferenciales serán identificadas por espectrometría de masas. Se

realizó Western blot en geles resueltos por peso molecular, obteniéndose los

siguientes resultados, las plantas enfermas son positivas por la prueba (DAS-

ELISA) contra el virus ToANV, se logran identificar de los geles comparativos

siete proteínas que están en plantas sanas y no en enfermas y el Western blot

reveló una proteína de aprox. 26 KDa que correspondería a una de las proteínas

del virus ToANV. Esta proteína se identificó como una proteína de Cápside, pero

los resultados no la identificaron como de virus ToANV, pero si de la familia

Potyvirae, lo que indica que esta es una nueva proteína que no se había

reportado de este virus. Conclusiones: Se logró detectar el virus ToANV en

plantas de tomate e identificar parcialmente la secuencia de una proteína de la

cápside del virus ToANV que no había sido previamente reportada, así como

otras proteínas diferenciales que en un futuro serán sometidas a estudios.

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Introducción Actualmente se esta viviendo una gran problemática en el campo sinaloense

debido a la presencia de una gran cantidad de enfermedades no antes

detectadas en esta región del mundo. Uno de los principales agentes causantes

de estas enfermedades son los virus. Recientemente se ha identificado síntomas

de la enfermedad �Marchitez Manchada� en cultivos de tomate (L. esculentum).

En el ciclo agrícola pasado (Verano-invierno 2005) en distintos lotes de tomate se

observaron plantas presentando síntomas de Marchitez Manchada, sin embargo

la identificación del agente causal no pudo ser determinada, por lo que se

sospecha sea otro virus que no ha sido reportado en la región previamente. Ante

esta situación se presentó un proyecto a CECYT-Sinaloa, el cual tiene como

objetivo identificar al agente causal de Marchitez Manchada empleando técnicas

de electroforesis bidimensional: Proteómica, lo cual ha sido realizado para otros

virus en plantas (Yao y col., 2002; Cooper y col., 2003). Por lo que se esta

proponiendo el empleo de esta metodología para la identificación de virus en

plantas de tomate que presentan sintomatología de Marchitez Manchada. En la

presente convocatoria se solicita apoyo para tratar de dilucidar la respuesta de la

planta a esta enfermedad empleando esta misma metodología: Proteómica.

Actualmente diversas investigación abordan este problema desde hibridación in

situ con sondas de genes específicos hasta ensayos masivos de expresión

mediante transcriptómica (Whitman y col., 2006). Ensayos para distintas especies

de solanáceas como papa, tomate y chile se han realizado empleando

microarreglos de papa (Rensink y col., 2005) esto indica la existencia de bases de

datos de secuencias de DNA de estas especies. Dichas bases de datos también

son compartidas en proyectos proteómicos y ayudan a la identificación de

secuencias de proteínas obtenidas mediante espectrometría de masas.

Empleando técnicas de microarreglos en infecciones de virus de RNA en plantas

susceptibles de Arabidopsis thaliana se observo que se modifican genes que con

funciones diversas: Un tercio relacionados a rescate celular, defensa, muerte

celular y envejecimiento, así como genes relacionados a estrés (Whitham et al

2003). Cabe señalar que son poco los reportes existentes apoyados en las

técnicas de proteómicas. Perez-Bueno y col. (2004) reportaron una modificación

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del sistema de transporte de electrones del fotosistema II en Nicotiana

benthamiana, empleando anticuerpos específico de este sistema monitorearon la

presencia o ausencia de algunos polipéptido que fueron modificados por la

infección de un tobamovirus. Ventelon-Debout y col. (2004) reportaron el estudio

mediante electroforesis bidimensional de plantas de arroz (dos variedades una

susceptible y una parcialmente resistente) al virus RYMV (Rice yellow mottle

virus) encontrando entre las dos variedades distintas proteínas reguladas que se

pueden relacionar a la susceptibilidad o resistencia.

La problemática de la región carece de información de primera mano en cuanto a

los cambios en la expresión genética que las infecciones virales están causando

en cultivos de alto valor agrícola como el tomate. La enfermedad Marchitez

Manchada en tomate generó junto con otras enfermedades pérdidas millonarias

al campo sinaloense en el ciclo agrícola pasado y actualmente se esta

presentando una situación similar. Lo anterior invita a conocer mejor nuestros

problemas para poder dar soluciones de fondo. Recientemente un grupo en Italia,

identificó un virus nuevo en muestras de Culiacán Sinaloa y de Obregón Sonora

cuyos síntomas corresponden a la enfermedad Marchitez Manchada, dicho virus

se denomina ToANV (Turina y col., 2007). Los autores de dicho reporte nos

proporcionaron anticuerpos para realizar pruebas tipo ELISA, para la detección,

mismo que empleamos para ensayos de inmunodetección tipo Western blot.

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Objetivo General

Identificar las proteínas que se encuentran reguladas en plantas de tomate a

causa de la enfermedad Marchitez Manchada

Objetivos Específicos

• Establecer y mantener la sintomatología de la enfermedad Marchitez

Manchada en variedades de tomates bajo condiciones controladas.

• Realizar extracción de proteínas y resolverlas en geles bidimensionales.

• Realizar la comparación de perfiles de proteínas entre plantas sanas y con

síntomas de Marchitez Manchada

• Identificar las proteínas con patrón de expresión modificado mediante

espectrometría de masas.

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Materiales y Métodos

• Mantenimiento de los síntomas de Marchitez Manchada

Semillas de tomate de la variedad Missouri y Gavilán se germinarán en semilleros

en el sustrato previamente descrito y a la edad de un mes se trasladaran a

maseta. Una vez establecidas las plantas con aproximadamente dos meses post-

germinación, se les colocará un injerto de una planta con síntomas, previamente

caracterizada. Las plantas se mantendrán en un cuarto de crecimiento con luz

artificial a 25 °C, hasta la presencia de síntomas.

• Extracción de proteínas

Método para la extracción de proteínas fenol de (Hurkman y Tanaka 1986). Cinco

gramos de tejido de plantas congelado, se pulverizarán en nitrógeno líquido

usando un pistilo y mortero, y se resuspenderán en 15 mL de buffer de extracción

1 (1% polyvinilpolypirrolidona (PVPP) 1%, sucrosa 0.7 M, KCl 0.1 M, Tris-HCl pH

7.5 al 0.5 M, EDTA 50 mM, PMSF 1mM, β-mercaptoetanol 2%). La mezcla será

extensivamente homogeneizada en frío usando un politron PT 10/35 con un SM

generador estándar, adicionando un volumen igual de Tris-HCl pH 7.5 fenol

saturado y vuelto a homogeneizar por 30 min. a 2 ºC y finalmente centrifugado a

10 000x g por 30 min. Se removerá la fase superior de fenol y se vuelve a extraer

dos o tres veces con buffer de extracción 1. Las proteínas precipitarán de la fase

final de fenol con cinco volúmenes de acetato de amonio saturado en metanol

toda la noche a -20 ºC y finalmente se obtiene la pastilla por centrifugación a

10000 x g por 30 min. La pastilla de proteínas a partir del protocolo descrito

anteriormente será lavado con metanol en frío, seguido de multiples lavados con

acetona en frio, y redisuelto en 125 ml de buffer IEF (Urea 7 M, CHAPS 4%, DTT

10mM, anfolitos pH 3-10 al 1.0 % peso/volumen). Una vez resuspendida la

pastilla se cuantificará empleando el reactivo de Bradford (Sigma, San Louis, MO,

EUA).

• Separación de proteínas por carga eléctrica [Electroisoenfoque (IEF)]

De manera analítica se emplearán 100 ug de proteína para rehidratar una tira de

gel de poliacrilamida en gradiente inmovilizado pH 3-10 (Ready Strip IPG Strip, Ph

3-10, 7 cm, BIORAD). Se permitirá la rehidratación por 12 h posterior a la etapa

de rehidratación las proteínas se enfocarán en el sistema Protean IEF Cell

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(BIORAD) aplicando un total de 20000 Volts.h. Las tiras tratadas se almacenarán

a -80 °C hasta su aplicación en la segunda dimensión.

• Separación de proteínas por peso molecular (SDS-PAGE)

El paso de la segunda a la primera dimensión involucra 2 etapas: primero, la

reducción, y segundo la alquilación de los grupos sulfhídricos. Las tiras de IPG

serán equilibradas adicionando 2.0 mL de buffer de equilibrio I (Urea 6 M, SDS

2%, Tris/HCl 0.05 M, pH 8.8, Glicerol 20%, DTT 2%) para reducir los grupos

sulfhídricos, durante 15 min. en agitación. Posteriormente, se decantará y se

adicionará el buffer de equilibrio II (Urea 6M, SDS 2%, Tris/HCl 0.05M, pH 8.8,

Glicerol 20%, Iodoacetamida 2.5%) para alquilar los grupos sulfhídricos. Se

agitaran las tiras en el gel para correr en una segunda dimensión. Las proteínas

resueltas y equilibradas, se separarán en base a su peso molecular en geles

desnaturalizante en condiciones reductoras (SDS-PAGE). Se utilizará un

marcador peso molecular (BenchMark 10 a 220 kDa (Invitrogen, Carlsbad CA,

EUA)). La corrida electroforética se realizará en una cámara vertical (Mini Protean

3 System, Bio-Rad) a temperatura ambiente y 70 V, por 4 horas y en buffer de

electroforesis 1X (Tris 25mM, Glicina 192 mM, SDS 0.1%). Para visualizar las

manchas de proteínas, los geles se teñirán con azul de Coomassie.

• Visualización de proteínas

La mayoría de las proteínas requiere el uso de compuestos que identifican los

enlaces peptídicos. El procedimiento que se utilizará en este caso será el método

de tinción con azul de Coomassie. La principal ventaja es que es un

procedimiento rápido y simple, produce geles teñidos mostrando las bandas o

manchas de proteínas en un color azul oscuro y un fondo transparente. Después

de realizar la corrida de SDS-PAGE, los geles serán teñidos con 50 ml de

solución de azul de Coomassie R-250 (10%), se agitarán a temperatura ambiente

por 30 minutos, se lavaran 2 veces con agua destilada para retirar el exceso de

solución de tinción. Los geles se destiñeron lavando con una mezcla de metanol

10%, ácido acético 10%, disuelto en agua, por al menos 3 horas en agitación.

Una vez teñidas las proteínas, se documentarán en el sistema Chemi Doc

(BioRad). Las imágenes de los geles bidimensionales se analizarán empleando el

programa (PDQUEST, BioRad), se analizarán al menos tres geles por condición.

• Ensayo de detección ELISA

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La prueba de inmunoadsorción con enzimas ligadas o ELISA (Enzime Linked

Inmunosorbent Assay), es un método confiable y rápido para la detección de

agentes fitopatógenos, ya que hace posible la detección de cantidades muy

pequeñas de estos agentes en órganos de plantas y además permite estimar la

concentración de los fitopatógenos en el tejido enfermo.

El ensayo denominado sándwich de doble anticuerpo (DAS), es la variante más

comúnmente utilizada del ELISA (ver principio de la técnica) y consiste en la

adsorción de anticuerpos específicos a una placa de poliestireno seguida de la

adición de los antígenos o fitopatógenos los cuales reaccionan con los

anticuerpos adheridos a la placa. Para formar el sándwich se agregan

nuevamente anticuerpos ligados con enzimas que se adhieren a los patógenos

capturados en la placa.

1.- Sensibilización de la placa. Anticuerpo adsorbido a la placa.

2.- Adición de la muestra. Extracto a probar contenido al antígeno.

3.- Adición de la enzima conjugada. Añadir el conjugado enzima más anticuerpo.

4.- Adición del sustrato. Añadir el sustrato de la enzima.

5.- Reacción positiva. Cantidad de hidrólisis del sustrato es proporcional a la

cantidad de agente patogénico presente.

La conversión del sustrato se detecta con un espectrofotometro, donde se

registra la absorbancia tanto de controles como de muestras.

• Western blot

El Western blot es una poderosa técnica ampliamente usada para la detección e

identificación de proteínas usando anticuerpos, el proceso involucra la separación

de muestra de proteína por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). La

transferencia de las proteínas separadas a partir del gel a una membrana delgada

de soporte, la membrana pega e inmoviliza las proteínas en los mismos patrones

que el gel original. La membrana (o blot) es luego expuesta a una solución

conteniendo anticuerpos que reconocen y se pegan a la proteína específica de

interés, los anticuerpos pegados a la membrana son detectados por cualquier

variedad de técnicas, usualmente involucrando tratamiento con algún anticuerpo

secundario.

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1.- Cortar la membrana al tamaño del gel que se haya preparado.

2.- Activar la membrana con metanol 100% por 10 segundos. (Hybond P.

Amersham) life science Polivinildiel difluoride (PVDF) transfer membrane.

3.- Lavar con agua destilada.

4.- Equilibrar en buffer de transferencia durante 15 minutos.

5.- Armar el sándwich; en el siguiente orden:

cara negra, colocar esponja; papel filtro ( equilibrado), gel, membrana, papel

filtro, esponja.

6.- Colocar en la cámara para transferir Mini Trans-Blot Electroforetic transfer Cell

(Bio-Rad) por 1 hora a 50 volts, si son 2 geles, se pone por 1 hora 100 volts por lo

cual, (50 volts cada gel).

7.- Bloqueo: Se lava la membrana 2 veces por 10 minutos con TTBS (20 ml) a

temperatura ambiente, y con agitación suave.

8.- Se prepara el anticuerpo en 10 ml, por tanto se pone en 5ul de anticuerpo

conjugado con la fosfatasa alcalina, diluyéndose 50ul�7.5ml de TTBS, se diluye

en buffer de bloqueo, el cual consiste en (1% BSA en TTBS). Agitación suave por

2 hrs.

-Eliminar el buffer del anticuerpo conjugado con la fosfatasa alcalina, (este buffer

se recicla)

y lavar con TTBS 2 veces por 10 min.

9.- Lavar 2 veces con TTBS por 10 seg. con agitación.

10.-Lavar 2 veces con TBS por 10 min.

11.- Adicionar 10 ml de solución de revelado (100mM de NaCl, 5mM MgCl2,

100 mM de tris), se le adiciona 49.5 ul de BCIP, y 39.06 ul de NBT. Agitación

suave en oscuridad por aprox.10 minutos, en este caso se tiene que estar

observando cada 5 minutos.

12.- Detener revelado con H2O dd.

13.- Poner a secar la membrana y se escanea para fotodocumentar.

• Identificación de proteínas mediante espectrometría de masas

Una vez realizada la comparación, se seleccionarán proteínas para ser

identificadas mediante espectrometría de masa (MALDI-TOF), para lo anterior se

realizará mediante un servicio externo en el Laboratorio de Proteómica del

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CINVESTAV-Unidad Sinaloa. Se espera obtener mediante la huella de masa de

los péptidos, PMF (por sus siglas en inglés, PMF, péptide mass fingerprinter) la

identificación de las proteínas involucradas en la enfermedad Marchitez

Manchada.

Resultados

Mantenimiento de plantas con síntomas de Marchitez Manchada

Se mantuvieron en invernadero plantas de tomate variedad Gávilan y

Missouri, estas fueron inoculadas mediante una técnica denominada infiltración.

Esta consiste en triturar tejido de planta con síntomas y resuspenderlo en un

amortiguador de fosfatos de sodio (10 mM, pH 7.5), a una relación de 100 ug de

tejido fresco o congelado en 1 mL de solución. Se centrifugó a 4000 g para

eliminar tejido y el sobrenadante se pasó a una jeringa. Con la cual se infiltro el

extracto hacia el envés de las hojas de tomate. Se observaron lesiones en las

plantas inoculadas con tejido proveniente de plantas con síntomas, y no en

aquellas que se infiltraron solo con solución de fosfatos. En la Figura 1 uno se

observan imágenes de los síntomas inducidos en dos distintas variedades, los

cuales asemejan a los encontrados en campo. Desafortudamente no fue posible

obtener tejido de este material, dado que las plantas que se mantenían en

invernadero presentaron infección de otro tipo, debido a la contaminación del

invernadero por insectos. Por lo anterior, los análisis de proteínas se realizaron

sobre plantas obtenidas de campo con síntomas característicos de Marchitez

Manchada. En la Figura 2, se observan los síntomas caracteristicos de esta

enfermedad en plantas de tomate: a) marchites, b) ralladura en el tallo, c)

necrosis en las hojas, d) amarillamiento, y e) necrosis apical.

Estandarización de electroforesis bidimensional

Una de los puntos críticos para tener éxito en e la separación de proteínas es el

método de extracción mas adecuado para la separación de proteínas.

En la Tabla 1 se muestran los rendimientos de proteínas obtenidos. Donde se

observa que las muestras resultantes contaban con cerca de 2 ug/ul, y en total

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cerca de 500 ug de proteína por 200 mg de tejido procesado, lo que nos permitirá

realizar hasta tres geles bidimensionales por extracción.

A B

Figura 1. Plantas de tomate inoculadas en invernadero. A. Tomate

variedad Missouri. B. Tomate variedad Gávilan.

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a) Planta asintomática b) Planta sintomática

a)

b)

c) d)

e)

Figura 2. Comparación de planta asintomáticas vs planta con síntomas de

Marchitez Manchada.

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Tabla 1. Rendimiento de extracción de proteínas

Método Modificaciones del método del fenol

(Hurkman, 1986).

mg proteína/g de muestra

fresca

I Fenol con lavados 2.955

II Fenol sin lavados 2.892

III Fenol/PVPP con lavados 2.389

IV Fenol/PVPP sin lavados 1.973

Una vez obtenidas estas muestras fueron separadas en base a su peso molecular

en un gel desnaturalizante (SDS-PAGE) al 12%. En la Figura 3 se observa el

patrón de proteína extraídas por los distintos métodos. Se observa que aun

cuando las proteínas fueron cuantificadas por el mismo métodos y se cargó en el

gel la misma cantidad de proteína, los patrones no se observan homogéneas

respecto a la cantidad. Esto se puede deber a la presencia de contaminantes que

reaccionan con el reactivo Bradford, generando un valor de la cuantificación

alterado. Pero en general las proteínas se separaron de manera correcta y

presentan un patrón electroforético muy homogéneo. Por lo que se decidió

continuar con el análisis de las muestras en geles bidimensionales el cual, fue el

criterio para la selección del método a emplear con el resto de las muestras.

Las muestras fueron separadas en tiras de pH inmovilizado de 7 cm Marca

BioRad de un rango de pH de 3 a 10 y posteriormente separadas en un gel SDS-

PAGE al 12%.

En la Figura 4 se muestran los geles bidimensionales representativos de los

distintos métodos de extracción evaluados. En el panel D) se observa que las

proteínas fueron correctamente enfocadas observándose los �spot� de las

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proteínas de manera mas adecuados. Mientras que en las otras condiciones A),

B), C), no se resolvieron las proteínas de manera adecuada, tal vez a procesos

de oxidación, degradación o agregación.

MM 1 3 42

50

20

15

10

40

30

25

220

160

60

70

120

Figura 3. Primera dimensión en gel de acrilamida al 12% con 5 µL de marcador

molecular benchmark.

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pH3

pH10

A)

pH3

pH10

B)Peso Molecular

Peso Molecular

pH3

pH10

C)

pH3

pH10

D)

Peso Molecular

Peso Molecular

Fi

gura

4.

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Análisis de plantas con Síntomas de Marchitez Manchada

Detección del virus ToANV en plantas de tomate con síntomas de Marchitez

Manchada mediante el ensayo ELISA

Turina y col 2007 reportaron la presencia de un nuevo virus en Culiacán y

Obregón denominado ToANV. Este virus citan los autores genera los síntomas de

Marchitez Manchada que se presento recientemente en los cultivos de tomate en

Sinaloa incluyendo al Valle de Guasave. Empleando anticuerpos policlonales

generados con el virus purificado ToANV donados por el Dr. Turina, se logró

detectar la presencia del virus en las plantas colectadas en campo.

Los resultados de las pruebas de ELISA dieron positivos para las plantas

colectadas no así para las plantas asintomaticas, donde se encontró un alto nivel

de detección, por lo que se corrobora la presencia del virus ToANV o una variante

cercana de este en el material colectado. En la Tabla 2. Se observan los

resultados obtenidos de dos plantas sanas, dos plantas con síntomas y la planta

control enviada por el Dr. Turina, la cual es una planta que ha sido infectada en

con el virus ToANV. También se incluyeron en el ensayo unas plantas

ornamentales que presentaron síntomas característicos.

De cada muestra se hicieron por duplicado. Las muestras se consideran positivas

si los valores de densidad óptica son mayores a 3 veces la densidad óptica del

negativo y el control positivo es de aprox 0.20. En base a los resultados se

consideró como positivas la MM1, MM2, plantas de tomate de Culiacán y

Teresitas.

Las muestras que dieron positivas en el primer ensayo se repitieron en un

segundo ensayo, las negativas no.

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Tabla 2. Se muestran las observancias obtenidas de algunas de las muestras

colectadas en campo

Muestra Absorbancia Absorbancia Promedio Desviación Estándar

Blanco 0.001 0.000 0.0005 0.00070711

Positivo 0.234 0.234 0.234 0

Negativo 0.004 0.004 0.004 0

Tomate Sano 1 0.006 0.005 0.0055 0.00040825

Tomate Sano 2 0.002 0.002 0.002 0

Tomate Machitez 1 0.312 0.352 0.332 0.00032321

Tomate Marchitez 2 1.124 1.288 1.206 0.11596551

Tomate Culiacán 1 0.134 0.126 0.130 0.04374103

Teresita Marchitez1 0.414 0.419 0.417 0.00353553

TeresitaMarchitez 2 0.396 0.404 0.400 0.00565685

En base a los resultados obtenidos se consideró como positivas aquellas

muestras mayores cuya absorbancia fuera dos veces mayor al blanco. Por lo que

podrías considerar que nuestras muestras presentan el virus ToANV o alguna

variante cerca de este, dado que la técnica de ELISA no genera resultados

contundentes, es posible obtener reacciones cruzadas entre virus similares. Por lo

que es necesario realizar más experimentos. En este caso optamos por el empleo

de la electroforesis bidimensional, que nos podrá generar información acerca de

la identidad del virus, así como los cambios a nivel de expresión de proteínas que

se presentan en plantas enfermas.

Análisis electroforeticos de los extractos de proteínas

De plantas sintomáticas y sintomáticas de tomate colectas en campo se

obtuvieron las proteínas y estas fueron analizadas mediante electroforesis

bidimensional. En la Figura 5 se muestran dos geles donde se separaron las

proteínas en un gradiente de pH de 4 a 7 y en un gel SDS-PAGE al 12 %. Se

observa el patrón de proteínas que se obtuvo de manera consistente en las

plantas analizadas (plantas con síntomas y sin síntomas) en tres replicas de cada

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4 7pH 4 7pHkDa

160120100

50607090

40

30

20

kDa

160120100

50607090

40

30

20

10 10

1

234

5 6

7

Figura 5. Electroforesis bidimensional de extractos de proteínas de hojas

de tomate. A. Extracto de plantas asintomáticas; B. sintomáticas de la

enfermedad Marchitez Manchada. 100 ug de proteínas se enfocaron en una tira

de rango de pH de 4 a 7, posteriormente se resolvieron en un SDS-PAGE de 12%

y se visualizaron con azul de Coomassie.

Tabla 3. Proteínas que se encuentran de manera diferencial en plantas con

Síntomas de Plantas con síntomas de Marchitez Manchada.

Proteína pI PM

1 5.7 26.4

2 5.8 18.8

3 6.0 18.9

4 5.7 18.9

5 5.2 19.6

6 5.6 19.6

7 5.3 37.2

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muestra. En las plantas �enfermas� se observó la presencia de siete proteínas

que no se encuentran en las plantas sanas, pero si en las plantas con síntomas,

en la Tabla 3, se muestra la relación de peso molecular y pI de dichas proteínas.

Ensayos Western blot

Conociendo que los anticuerpos contra el virus ToANV daban reacción positiva

con nuestras muestras, decimos determinar cual de las proteínas expresadas

diferencialmente en las plantas enfermas corresponden a proteínas del virus

ToANV y cuales a las de la planta de Tomate a causa de la enfermedad. Primero

se realizó un Western blot a un gel donde se resolvieron las proteínas en un gel

SDS-PAGE. En la Figura 6 se observa un gel teñido con azul de Coomassie

(Panel A) y el mismo gel pero decorado con el anticuerpo contra ToANV en el

panel B (Western Blot). Se observa que solamente una proteína de peso

molecular aproximado de 26 kDa fue identificada en las planta previamente

identificada positiva por la prueba ELISA (Carril 3, Panel A y B) y que tiene los

síntomas de Marchitez Manchada. En el caso de las plantas �asintomáticas�

(Carriles 1 y 2, Panel A y B). Por lo que se considera que esta es una proteína de

virus ToANV.

Para determinar si una de la siete proteínas identificadas previamente

(Figura 5 y Tabla 3) corresponde a la proteína de aproximada de 26 kDa, se

realizo un Western blot transfiriendo a membrana un gel resuelto en dos

dimensiones. En la Figura 7 se muestra que efectivamente una de las proteínas

identificadas como �diferenciales� corresponde en peso molecular (26.4 kDa) y pI

(5.7) a la detectada por los anticuerpos contra el virus. De lo anterior se puede

establecer que las otras seis proteínas muy probablemente correspondan a

proteínas que la infección esta afectando en el cultivo de tomate y por el tamaño

(menores a 30 kDa) podrían corresponder a proteínas reguladoras de expresión

genética. Desafortunadamente, la identificación de dichas proteínas se encuentra

en proceso.

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M1 M2 1 2 M2 1 2 A) B)

Figura 6. Detección inmunológica de proteínas del Virus ToANV. A. Gel teniño

con azul de Coomassie. B. Western blot, empleando anticuerpos contra ToANV.

Carril 1, Planta sana; Carril 2, Planta con síntomas; M1, Marcador de peso

molecular BenchMark; M2, Marcador de peso molecular BenchMarck Pre-stained.

10 ug de proteína fueron cargados en cada carril.

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21

64.2

48.8

30.1

25

19

4 75.7

~28 kDa

Figura 7. Western blot realizado a una muestra de síntomas de Marchitez

Manchada separada mediante 2D-SDS-PAGE, en un gradiente de 4-7. 100 ug de

proteína fueron aplicados a una tira IPG de 7 cm.

Identificación de proteínas mediante MALDI-TOF

La proteína no. 1 identificada como diferencial en plantas (Figura 5B) �con

síntomas� de Marchitez Manchada, misma que fue detectada mediante

anticuerpos contra el virus ToANV (Figura 7) fue seleccionada para ser

identificada mediante MALDI-TOF. En la Figura 8 se muestra el espectro de

masas obtenido al ser hidrolizada con pepsina. Los pesos moleculares de los

Péptidos obtenidos se emplearon para hacer una búsqueda en programas

específicos. En la Tabla 4 se muestran los resultados obtenidos de la búsqueda,

sorprendentemente no se identificó que esta proteína correspondiera a virus

ToANV, esto debido a que este virus no ha sido completamente caracterizado

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(Turina y col., 2007), pero los resultados son consistentes, dado que todas las

proteínas corresponden a la misma familia de virus que pertenece el virus ToANV,

la familia Potyviridae. Estos resultados necesitan ser complementados con

secuenciación de novo, así como mediante secuenciación del N-terminal lo que

nos dará una idea mas clara de la proteína obtenida. Lo cual permitirá entender

de una manera mas clara como este virus funciona y en un futuro determinar

estrategias de control de esta enfermedad en el cultivo de tomate.

843.878131854.844262862.984389868.887714876.829693878.805906885.726006891.786541894.763013897.758597902.853168908.7547431044.8322571058.6964901065.8352831075.7848941081.7752481083.7577441085.7651731096.6492151101.6921901109.756931

A) ESPECTRO-MALDI B) MASAS OBTENIDAS Figura 8. Resultados de espectrometría de masas obtenido de la proteína no. 1

mediante MALDI-TOF

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Tabla 4. Resultados obtenidos con el programa informático MASCOT.

Secuencias Probables Score CoberturaPeptide matches

Ornithogalum mosaic virus (OrMV) (Acc no. BAE92900)

35 28 % 9

Sweet potato feathery mottle virus

(SPFMV) (Acc no. NP_734318, Coat Protein)

39 20 % 9

Chilli veinal mottle virus (ChVMV) (Acc no. ABQ23265)

49 15 % 21

Impactos

Los resultados de este proyecto, servirán a investigadores del país e

internacionales a emplear esta metodología para entender más las interacciones

planta-virus. Además, abrirá nuevas propuestas de investigación para entender

con mayor precisión el mecanismo de acción del virus ToANV durante su

infección en tomate. Dado que al inició de esta investigación se ignoraba la

naturaleza de las proteínas del virus, y actualmente se ha aportado información

parcial de la identidad de unas de las proteínas del virus.

Conclusiones

• Se confirmó la presencia del virus ToANV en la región de Guasave o al

menos de una variante muy cercana a este mediante la técnica de ELISA.

• Se logró establecer una metodología de extracción de proteínas,

electroforesis bidimensional para la detección de proteínas expresadas

diferencialmente en plantas de tomate infectadas, este logro podrá permitir

en un futuro realizar ensayos similares para otras enfermedades que

afecten al cultivo de tomate.

• Se logró identificar una proteína del virus ToANV mediante Western blot

tanto en geles SDS-PAGE como en geles 2D-SDS-PAGE. Lo que nos dará

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más herramientas al momento de contar con la información de las

secuencias de las proteínas identificadas.

• Se logró identificar seis proteínas que presumiblemente son alteradas por

la presencia del virus ToANV. Dichas proteínas podrían dar pauta al

entendimiento de la enfermedad y en un futuro establecer estrategias de

mejoramiento para evitar daños por el virus.

• Por espectrometría de masas (MALDI-TOF-PMF) y los anticuerpos anti-

ToANV se pudo caracterizar la proteína encontrada por homología con

proteínas de la cápside de la familia potyviridae.

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