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“Año de la Diversificación Productiva y del Fortalecimiento de la Educación”

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE INGENIERÍAE. A. P. DE AGROINDUSTRIA

Informe del curso internacional de actualización en:

GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA VEGETALDocente:

DR. JULIO CHICO RUIZAutor:

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ARROYO LOZANO JUNIOR

Nuevo Chimbote- Perú2015

INTRODUCIÓN

La parte de la biología que estudia los genes y los mecanismos que regulan la transmisión de los caracteres hereditarios es la llamada genética, mientras que; la Biotecnología, en términos simples es expresada como, “la tecnología aplicada a los procesos biológicos”.

Una tecnología hoy en día muy desarrollada en el mundo, poco difundida en el Perú y muy fácil de utilizar es la “Micropropagación de cultivos vegetales” o “cultivo in vitro”, que no es más que cultivar plantas en depósitos de vidrio (aunque hoy en día también se cultivan en bolsas de polietileno y en birreactores) de esta manera propagarlas y a continuación llevarlas al campo, es decir; criar plantas en diminutos depósitos para luego sembrarlas en campos de cultivo. Esta estrategia biotecnológica y por tanto de utilidad genética, cuenta con más de 30 años de investigación y desarrollo, sin embargo aún es poco utilizada en la región.

El “cultivo in vitro” fue uno de los principales temas del curso desarrollado, el presente informe pretende mostrar los resultados de la práctica realizada.

OBJETIVOS

- Definir el cultivo in vitro- Mostrar los resultados de la práctica realizada en el curso- Discutir los resultados

REVISION BIBLIOGRÁFICA

El cultivo in vitro

Un cultivo in vitro es aquel realizado sobre un medio nutritivo en condiciones estériles. Puede ser de: plantas, semillas, embriones, órganos, explantos, células y protoplástos. Dos de los pioneros en desarrollar esta tecnología fueron Toshio Murashige y Folke Skoog.

Características

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- Es empleado a microescala. - Hay optimización de las condiciones ambientales.- No se produce el patrón normal de desarrollo de una planta.- Hace factible la manipulación de las célula individuales o tejidos. Fundamental para transformación genética.

Beneficios

El cultivo in vitro puede desarrollarse inicialmente en un espacio reducido e independientemente de factores climáticos y estaciones del año. Se calcula que 10 m2

de estantes son suficientes para el cultivo de 20.000 plantines.

El número de individuos que se produce por cultivo in vitro es mucho mayor al número de individuos que podría obtenerse por el método de multiplicación tradicional. El cultivo de una gema de eucalipto puede originar en un año 75 trillones de mudas en vez de las 100 o 200 que se obtienen habitualmente por estaquillado. Estos resultados son de gran interés para las industrias del papel, celulosa y maderera.

El cultivo in vitro permite la producción y distribución de mudas libres de patógenos a partir de tejidos meristemáticos, que no están infectados por virus. Un ejemplo es la producción de tubérculos de papa libres de virus para la inclusión en programas de certificación de papa-semilla.

También permite la producción de semillas sintéticas, que consisten en un embrioide formado a partir de una masa de tejidos obtenida in vitro, envuelta en una sustancia gelatinosa con nutrientes y cubierta por un plástico biodegradable. El conjunto constituye una semilla artificial que se desarrolla normalmente cuando se siembra en la tierra. Lanzada desde aviones, estas semillas facilitan la reforestación en regiones degradadas de difícil acceso.

Las técnicas de cultivo in vitro de vegetales fueron asimiladas rápidamente (en países desarrollados) por las empresas e instituciones de investigación y desarrollo, porque facilitan el mejoramiento genético de las variedades comerciales y, también, porque representan una etapa indispensable en la obtención de una planta transgénica.

Siendo técnicas de dominio público, relativamente simples y de bajo costo, numerosas empresas las utilizan, en todo el mundo, para garantizar la calidad genética y fitosanitaria de las mudas y semillas comercializadas. Esta tecnología está ampliamente difundida en América Latina (sobre todo en países como Chile y Argentina), donde representa el segundo producto más comercializado de la biotecnología agrícola, con una amplia difusión en la olericultura, en la horti-fruticultura, floricultura y en la propagación de plantas ornamentales, así como en la producción de plantas de interés industrial (caña de azúcar, café) y de mudas forestales para la industria del papel.

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Tipos de cultivo

Cultivo in vitro de plantas enteras

Las semillas germinan y se desarrollan en el medio de cultivo hasta el momento de la transferencia a tierra. Esta técnica es aplicada comercialmente en la producción de orquídeas, pero en el laboratorio de enseñanza conviene comenzar con simientes mayores y que germinen más rápido.

Tuvimos bastante éxito con el cultivo in vitro de embriones de maíz. Dentro de esta modalidad, se trata de separar los embriones del resto de la semilla y transferirlos al medio de cultivo.

Cultivo in vitro de órganos aislados

El explante puede ser extraído de un tejido (meristemas) o de un órgano (gemas o brotes, raíces, anteras, etc.). La capacidad de regeneración disminuye con la edad de la planta y también depende del genotipo y de las condiciones ambientales. Mayor en las plantas herbáceas que en las leñosas, dicha capacidad está distribuida en forma desigual dentro de algunas familias de Solanáceas, Crucíferas, Geraniáceas, Compuestas y Liliáceas.

Cultivo in vitro de callos

Un callo es una masa de células indiferenciadas que crece a partir de un explante. Una vez establecido en un medio de cultivo, el callo puede ser subdividido cada tres o cuatro semanas y mantenido indefinidamente en un medio nutritivo de igual composición. Su transferencia a medios de cultivo con

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diferentes concentraciones de hormonas induce la embriogénesis y/o la organogénesis.

Cultivo in vitro de células aisladas

Los cultivos de células aisladas en medio líquido apuntan a la producción de metabolitos secundarios en fermentadores industriales (alcaloides, perfumes, enzimas, hormonas, etc.).

MATERIALES Y METODOS

El presente trabajo de investigación, se llevó a cabo en el laboratorio del Instituto de Investigación Tecnológica Agroindustrial de la Universidad Nacional del Santa.

Variables dependientes:

Contaminación: Definida por el porcentaje de contaminación (presencia de hongo y/o bacterias) obtenido en cada tratamiento evaluado.

Oxidación: Definida por el porcentaje de explantes que presentaron oscurecimiento en la totalidad del explante.

Procedimiento

La evaluación de las variables se realizó 5 días después de la siembra llenando adecuadamente los formatos diseñados para tal fin. Todos los tratamientos (medios de cultivo) fueron suplementados con sacarosa 7,5 g y agar 2,5 g y con 1,1 g de MS preparándose en total una solución de 250 ml (en algunos depósitos también se agregó un enraizador), sus componentes se pesaron en una balanza analítica de precisión y se disolvieron en agua destilada. El medio de cultivo fue dispensado en recipientes de vidrio con una capacidad de 25 ml aproximadamente y a cada recipiente se le adicionaron 1 ml del medio. Los depósitos llenados con el medio fueron llevados a baño maría a una temperatura de 80° C por alrededor de 1 hora, posteriormente se enfriaron.Una vez preparado el medio (todo lo anterior), se desinfectó la parte de la planta que que se introduciría a los depósitos (semilla, yema…), seguidamente se pasó a colocarlos. Para mayor detalle a continuación se muestran los esquemas correspondientes.

1.En un vaso de precipitación agregar 100ml de agua destilada.

2.Adicionar el MS (para algunas muestras tambien el enraizador)

3.Colocar el azucar y calentar

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Agregar (mientras se esta calentando) de a pocos la carragenina y disolver bien (la carragenina se hace grumos cuando no se disuleve bien), luego completar con agua destilada los 250 ml.

6.dispnensar 1 ml de la preparacion en cada frasco (previamnete lavado y desinfectado).

7.llevar al autoclave o mantener en baño maría por 1 hora.

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1.lavar 3 veces con agua destilada. (en el caso de la las semillas previamnete dejar remojando en agua por 30 min para ayudar con la germinacion).

2. dejar en alcohol etilico 70° por 30 segundos realizando movimiento.

3. lavar con agua destilada

5.colocar en legia al 2% por 2 min en movimiento

6.lavar 3 veces con agua destilada. .

7.secar en papel filtro

1°- Preparacion del medio

2°- Desinfección de la parte a introducir

3°- Introducción

4°- inspección de los explantes.

Esquema 2: Preparación del medio de cultivo

Esquema 1: Pasos generales llevados a cabo durante la práctica.

Esquema 3: Desinfección de los explantes.

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1.limpiar con lejia al 2% la zona donde se va a trabajar

2.lavarce las manos con jabon, luego enjuagarce con alcohol etílico de 70°.

3.colocar alcohol etílico de 70° en un vaso de precipitado

5.sumergir la pinza en el alcohol de 70° y flamearla con el mechero.

6.realizar el paso 5 cada vez que se introduce un explante en el depósito con el medio de cultivo.

7.serrar el depósito con papel aluminio.

RESULTADOS

Semilla

Tipo de contaminación

N° Fenolizacion Hongos Bacterias Necrosis

Esquema 4: Introducción de los explantes.

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1 No No Si No2 No No No No3 No No No No4 No No No No5 No No No No

La evaluación de las variables se realizó 5 días después de la siembra obteniéndose como resultado los siguientes cuadros:

Cuadro 1: contaminación en el cultivo de semilla.

Cuadro 2: contaminación en el cultivo de yemas.

Yemas Tipo de contaminaciónN° Fenolizacion Hongos Bacterias Necrosis1 Si No No No2 Si No No No3 No No No No4 No No No No5 No No No No

80%

20%

% de contaminación del cultivo in vitro de semillas

sin contaminación contaminadas

Muestra contaminada

Muestras con fenolizacion

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Cuadro 3: contaminación en el cultivo de nudos.

Nudos Tipo de contaminaciónN° Fenolizacion Hongos Bacterias Necrosis1 No No No No2 No No No No3 No No No No4 No No No No

El cultivo de embriones también mostro el mismo comportamiento que el cultivo de nudos, los cinco cultivos estuvieron libre de contaminación.

Tipo de Tipo de Contaminación

Muestras libres de contaminación

60%

40%

% de contaminación del cultivo in vitro de yemas

sin contaminación contaminadas

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ExplanteFenolización Hongos Bacterias

N° % N° % N° %Semillas - - - - 1 20Yemas 2 40 - - - -Nudos - - - - - -

Embriones

- - - - - -

- 20 % de los cultivos in vitro de semillas fueron contaminados por bacterias posiblemente debido a las condiciones de trabajo.

- 40 % de las yemas presentaron fenolización, esta no fue causada por la falta de higiene, dado que es consecuencia de reacciones bioquímicas en las yemas.

DISCUSION

De acuerdo con EDUCARED (artículos cubanos en línea), la contaminación microbiana in vitro de tejidos vegetales, puede originarse de dos fuentes fundamentales: una llevada a cabo por microorganismos en la superficie o en los tejidos de los explantes, o por deficiencias en la manipulación de los operadores en los laboratorios.

El articulo destaca también 5 principales fuentes de contaminación:

El explante

En dependencia del tipo de explante utilizado los microorganismos superficiales o endofíticos de las plantas pueden ser introducidos al cultivo in vitro. Con el cultivo de meristemos, pueden ser eliminados muchos de ellos pero en explantes de hojas, peciolos o tallos en su mayoría pueden ser introducidos.

Los métodos de desinfección utilizados no siempre eliminan las poblaciones de microorganismos asociados a los tejidos de las plantas, muchos son capaces de permanecer latentes en el interior de las células, en los espacios intercelulares o en los haces conductores y quedan protegidos de los agentes químicos. De esta forma se introducen en el cultivo de tejidos, se propagan con el material vegetal y pueden manifestarse sobre los medios de cultivo en la fase de establecimiento o permanecer sin expresarse por largos períodos de tiempo.

El ambiente

El ambiente de los locales de trabajo es una fuente de contaminación ya sea directa o indirectamente. A través de las corrientes de aire las partículas de suelo cargadas de esporas son arrastradas y penetran a los locales por los acondicionadores de aire; son transportadas o introducidas por el hombre y permanecen en el ambiente por condiciones higiénicas inadecuadas.

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Para realizar el cultivo de tejidos se requiere del mantenimiento de condiciones asépticas. El uso de aires acondicionados domésticos, los cuales intercambian constantemente aire con el ambiente, elevan las probabilidades de entrada de microorganismos. Es importante el estricto mantenimiento de la limpieza para disminuir la carga microbiana ambiental, así como la organización adecuada del proceso productivo.

El hombre

El hombre interviene directamente en todas las operaciones y es una fuente primaria de contaminantes a través del estornudo, la tos, la conversación, etc. La presencia de microorganismos contaminantes que son habitantes de la microbiota normal del cuerpo humano como por ejemplo: Staphylococcus epidermidis o Candida albicans, generalmente indican ineficientes técnicas de asepsia por parte de los operarios.

En el trabajo dentro de la cabina del flujo laminar es donde el operario puede introducir la mayoría de los microorganismos. Incumplimientos de la disciplina tecnológica contribuyen al incremento de la contaminación y llegan a ocasionar pérdidas muy costosas. Juega un papel importante el personal técnico y auxiliar que labora en la limpieza y fregado de frascos, en la preparación y esterilización del medio y en el control de la calidad.

Los equipos y el instrumental

La esterilización por calor húmedo en autoclave se emplea comúnmente para eliminar los microorganismos de los medios de cultivo, de la calidad de este paso depende en gran medida la continuidad del proceso. Los problemas en la esterilización pueden deberse a fallos en los funcionamiento de las autoclaves o a errores en su manipulación.

Determinados microorganismos son particularmente introducidos por esta vía, como por ejemplo: el género Bacillus, que puede contaminar los medios por insuficiente esterilización o mal funcionamiento de las autoclaves y puede ser diseminado durante las operaciones con el material vegetal.

Las colonias bacterianas pueden detectarse dentro del medio a partir de las 24 horas de preparado y luego emergen a la superficie ocasionando daños severos a las plantas. Esta problemática es muy común en las biofábricas, de ahí la importancia de mantener en reposo los medios de cultivo por 24-72 horas para verificar la calidad de la esterilización. La cabinas de flujo laminar si funcionan adecuadamente proporcionan condiciones de asepsia para el trabajo en biotecnología vegetal, pero esto depende en gran medida del uso, cuidado y revisión periódica de los filtros.

Los equipos destinados al tratamiento de agua (desionizadores, destiladores, etc.) también pueden introducir contaminación; por fallos en el mantenimiento o procederes inadecuados, en sus resinas pueden abrirse oquedades donde los microorganismos, principalmente bacterias, se sitúan y multiplican.

En los laboratorio con clima centralizado, estos equipos también pueden introducir y diseminar contaminación. Cuando se combinan la limpieza ineficiente de los cuartos con la existencia de focos contaminantes y se producen fluctuaciones de temperatura; en los conductos de aire hongos filamentosos como Cladosporium sp. se pueden

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multiplicar y esparcir. Además, los instrumentos utilizados se esterilizan con calor seco o se flamean en alcohol, pero si esto no se hace por el tiempo suficiente las esporas de Bacillus spp. pueden sobrevivir y contaminar los cultivos.

Los insectos

Una rápida aparición de contaminantes fúngicos en muchos frascos a la vez dentro de una cámara de cultivo puede ser evidencia de la presencia de ácaros, trips u hormigas, que aunque no provocan graves daños a las plantas sirven como vectores para esparcir la contaminación.

Como se puede apreciar, la contaminación bacteria y fúngica es una cuestión de la vida diaria y se pudo mostrar durante la práctica, dado que pasada las 24 horas se observó que muchos cultivos mostraban rastros de una fase blanca formada sobre el agar de carragenina, dando a mostrar asi, la la presencia de bacterias.

Por otro lado con respecto a la fenolizacion (oscurecimiento de los explantes), se puede deber a la oxidación de proteínas, a que fenoles se unan con proteínas mediante puentes de hidrógeno (Harms et al. 1983), a la acción de enzimas peroxidasas, las cuales pueden calalizar su oxidación en presencia de peróxido. Este y otros radicales libres son liberados o generados durante el proceso de escisión, limpieza, desinfección y cultivo del explante (George 1996, Uddin y Titov 2007). La presencia de algunas sustancias fenólicas dañinas puede tener un efecto autocatalítico en su síntesis. El daño que resulta de la producción de exudados es usualmente más severo durante los estados iniciales de cultivo. El problema tiende a cesar cuando el explante inicia su crecimiento.

CONCLUSION

- Un cultivo in vitro es aquel realizado sobre un medio nutritivo en condiciones estériles.

- Los métodos de desinfección utilizados no siempre eliminan las poblaciones de microorganismos asociados a los tejidos de las plantas, muchos son capaces de permanecer latentes en el interior de las células.

- las partículas de suelo cargadas de esporas son arrastradas y penetran a los locales por los acondicionadores de aire.

- la fenolizacion (oscurecimiento de los explantes), se puede deber a la oxidación de proteínas, a que fenoles se unan con proteínas mediante puentes de hidrógeno.

- Durante al practica se pudo apreciar que:

20 % de los cultivos in vitro de semillas fueron contaminados por bacterias posiblemente debido a las condiciones de trabajo.

40 % de las yemas presentaron fenolización, esta no fue causada por la falta de higiene, dado que es consecuencia de reacciones bioquímicas en las yemas.

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

- Abdelwahd, R; Hakam, N; Labhilili, M; UduPA, S. 2008. Use of an adsorbent and antioxidants to reduce the effects of leached phenolics in in vitro plantlet regeneration of faba bean. African Journal of Biotechnology 7: 997-1002.

- Abdullah, A; Yeoman, M; Grace, J. 1987. Micropropagation of mature Calabrian pine (Pinus brutia Ten.) from fascicular buds. Tree Physiology 3:123-136.

- EDUCARED; Contaminación microbiana in vitro (Tejidos vegetales), seriada en línea, disponible en URL: http://www.ecured.cu/index.php/EcuRed:Enciclopedia_cubana