INTRODUCCIÓN

La luz que es un "agente físico que hace visibles los objetos1", es utilizada frecuentemente para el estudio de sustancias que absorben algunas longitudes de ondas de este tipo de energía. Esto ocurre ya que la mayoría de los elementos tienen la capacidad de absorber, repeler o emitir energía, ya sea en forma de luz o calor. Debido a la distinta intensidad de atrapar o repeler la luz, es posible de identificar a cada elemento o sustancia mediante la luz, ya que se podrá registrar el nivel de absorbancia o transmitancia de cada objeto, más aún si es que estos poseen color. “Un espectro de emisión, se produce cuando los átomos en un estado excitado emiten fotones característicos del elemento a medida que regresan a sus estados de más baja energía. En tanto que, el espectro de absorción se produce cuando los átomos absorben fotones de ciertas longitudes de onda y se excitan desde estados de energía menores hasta estados de energía mayores2”.

Para poder medir cuantitativamente cuanta luz atraviesa o capta cada elemento, se utiliza un instrumento que bombardea con fotones a las soluciones, y mide la energía que es capaz de atravesar. Básicamente, se encarga de tomar una señal producida previa excitación de una muestra a determinada concentración mediante la aplicación de distintas longitudes de onda y que, no suele ser detectable directamente por el ser humano, para convertirla en una forma que sea perceptible, ya sea, entregando gráficas o datos numéricos dependiendo de la complejidad del aparato, este instrumento se llama espectrometrómetro. “Además, de permitir la identificación de una sustancia, un espectrómetro puede usarse para medir su concentración, porque la Absorbancia, la cantidad de luz a una longitud de onda dada absorbida por una sustancia es proporcional al número de moléculas2”. Mientras mayor sea la concentración del objeto, menos luz será captada por el aparato, por lo tanto mayor será la absorbancia. Una analogía que puede ocupar es cuando se patea un tiro libre, mientras más jugadores se ocupen en la barrera, más probable es que la pelota impacte a algún deportista.

Dos conceptos que se han ocupado varias veces en esta introducción son el de absorbancia y transmitancia. El primero se define como "la cantidad de intensidad de luz que absorbe la muestra3". A mayor cantidad de luz absorbida, mayor será la absorbancia del cuerpo, y menor cantidad de luz será transmitida por dicho cuerpo.

Por otro lado la transmitancia, se refiere a la "cantidad de luz que atraviesa un cuerpo, en una determinada longitud de onda. Cuando un haz de luz incide

sobre un cuerpo traslúcido, una parte de esa luz es absorbida por el mismo, y otra fracción de ese haz de luz atravesará el cuerpo, según su transmitancia4". El valor de la transmitancia de un objeto se puede determinar según la siguiente expresión:

I es la cantidad de luz transmitida por la muestra e I0 es la cantidad total de luz incidente.

Muchas veces encontraremos la transmitancia expresada en porcentaje, según la fórmula:

Como podemos darnos cuenta, la absorbancia y la concentración de una sustancia están íntimamente relacionados entre sí, eso destaca la ley de Lambert-Beer. Esta ley se basa en tres fenómenos que explicarían cuanta luz es capaz de atravesar un objeto:

La cantidad (concentración) de material que absorbe en el medio. La distancia que la luz tiene que viajará través de la muestra Probabilidad de que el fotón de cierta longitud de onda sea absorbido por el

material (coeficiente de absorción o de extinción molar del material).

Estas tres condiciones se integran en una fórmula que establece esta ley:

cbA

: Coeficiente de extinción molar en L mol-1 cm-1

b: Longitud de la muestra (cubeta) en cmc: Concentración del compuesto en solución en mol L-1

Por último es importante destacar que esta ley establece dos gráficos que indican comportamientos de la absorbancia y la transmitancia. Los cuales se llaman curvas de calibración.

Estos gráficos indican que la absorbancia directamente proporcional al camino óptico, al contrario de la transmitancia que es indirectamente proporcional al camino que debe atravesar la luz.

Finalmente, es importante conocer la estructura de la Riboflabina, ya que a esta vitamina se realizarán distintos estudios de absorbancia y transmitancia para obtener los datos que nos permitan obtener todos los datos y así realizar una curva de calibración, es por esto que a partir de este elemento se realizarán distintas disoluciones con concentraciones distintas y así ir observando que ocurre con la luz en cada una de las situaciones.

"La vitamina B2 es una vitamina hidrosoluble de color amarillo, constituida por un anillo de isoaloxazina dimetilado al que se une el ribitol, un alcohol derivado de la ribosa. Los tres anillos forman la isoaloxacina y el ribitol es la cadena de 5 carbonos en la parte superior.

Esta vitamina es sensible a la luz solar y a ciertos tratamientos como la pasteurización, proceso que hace perder el 20% de su contenido. Por ejemplo, la exposición a la luz solar de un vaso de leche durante dos horas hace perder el 50% del contenido de vitamina B2. Algunas fuentes de vitamina B2 son: leche, queso, vegetales de hoja verde, hígado y legumbres6".

OBJETIVOS

Estudiar y ejecutar los pasos básicos que se utilizan en la técnica de

espectrofotometría.

Construir una curva de calibración para la Riboflavina según la longitud de

onda de máxima absorción que se haya determinado experimentalmente.

Determinar la concentración de una solución problema a través del

comportamiento de la luz.

Comprobar de manera práctica los sustentos en los que se basan la ley de

Lambert-Beer.

Determinar el comportamiento de la luz en la Riboflavina (vitamina) y

posteriormente realizar una curva de calibración.

METODOS

Materiales

Solución patrón de Riboflavina 1 x 10-4 M 5 Tubos de ensayo / 2 cubeta 5ml Agua bidestilada Espectrofotómetro Mircropipetas

Procedimientos

Experiencia n° 1: REALIZACIÓN DE UN ESPECTROGRAMA

1. Se enciende y deja estabilizar el instrumento (15 min).2. Enseguida se efectúa lecturas entre 330 y 560 m. (Cada 10 m). En todas las lecturas se usa agua destilada como blanco.3. En las zonas de máxima absorción, se vuelve a leer en intervalos más pequeños (cada 5 m) para definir adecuadamente la curva en estas regiones.4. Se anota la naturaleza de la solución, su concentración original, coeficiente de extinción molar, la concentración calculada y el espesor de la cubeta.5. Se anota en forma tabulada la longitud de onda, el % de transmitancia (%T) y la absorbancia correspondiente.6. Se grafica en papel milimetrado el espectrograma, colocando A en la ordenada y [C] en la abscisa.7. Posteriormente se calcula el coeficiente de extinción experimental a la longitud de onda de trabajo y anótelo. Finalmente se compara el valor obtenido experimentalmente con el de la literatura.

Preparación de la solución coloreada.A partir de una solución patrón de Riboflavina 1 x 10-4 M, mediante el coeficiente de extinción, se calcula concentración de Riboflavina requerida para que el espectrograma resultante. Posteriormente se prepara 5 ml de la solución.

Experiencia n°2: CURVA DE CALIBRACIÓN

Preparación de soluciones.a) Se prepara una serie de tubos que contengan: 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 y 0,5 moles de Riboflavina por tubo, y se lleva a todos los tubos a un volumen final de 10 ml con agua bidestilada. Enseguida se realizan los cálculos necesarios.b) Se utiliza el espectrofotómetro, se mide la absorbancia de cada muestra, a la longitud de onda experimental de mayor absorbancia para la Riboflavina.c) Se grafica en papel milimetrado A (eje y) versus μmoles de Riboflavina en la muestra (eje x).d) Se mide la absorbancia de una muestra problema que le será proporcionada en el laboratorio. Se utiliza la misma longitud de onda del paso (b).

RESULTADOS

Experiencia n°1: REALIZACIÓN DE UN ESPECTROGRAMA

Calculo de concentración de Riboflavina requerida para el espectrograma.

- V1 x C1 = V2 x C2- V1 x 1x10-4 M = 8 x 10-5M x 5ml

V1 = (8 x 10-5M/ 1x10-4 M) x 5ml V1 = 4ml

Se necesitan 5m de solución, por lo tanto se añaden en un tubo, 4 ml de Rivoflavina + 1ml de agua destilada.

Tabla n°1: Lectura de absorbancia a diferentes longitudes de ondaLongitud de onda (m) 330 340 350

Absorbancia 0,315 0,419 0,503360 370 380 390 400 410 420

0,618 0,610 0,552 0,506 0,474 0,521 0,600430 440 450 460 470 480 490

0,671 0,717 0,700 0,624 0,535 0,391 0,224500 510 520 530 540 550 560

0,098 0,038 0,019 0,011 0,009 0,004 0,004

- El valor de absorbancia más alto se observó a 440 m, lo que significa que está en el rango de los 445 m, por lo tanto la Riboflavina posee un

Longitud de onda (nm)

Absorbancia

coeficiente de extinción molar de 12.500. Según los siguientes datos:

λmáx ε (M-1 cm-1 ) 266 31.800 373 10.400

445 12.500

Calculo de concentración de Riboflavina

A = ε·c·b por lo tanto c = A/ εb

Experiencia n°2: CURVA DE CALIBRACIÓN

Tubo µmoles Riboflavina 1x10-4 M Vol. Riboflavina 1x10-4 M Vol. de H20

1 (Blanco) 0 µmol 0 mL 5 mL2 0,1 µmoles 1 mL 4 mL3 0,2 µmoles 2 mL 3 mL4 0,3 µmoles 3 mL 2 mL5 0,4 µmoles 4 mL 1 mL6 0,5 µmoles 5 mL 0 mL

Tabla n° 2 : Volúmenes de cada tubo

Tabla n°3: Calculo de volúmenes de cada tubo

Tubo 1 Tubo 2

1x10-4 moles de Riboflavina 1000 mL0x10-6 moles de Riboflavina X mL

X= 0 mL de Riboflavina

1x10-4 moles de Riboflavina 1000 mL0,1 x10-6 moles de Riboflavina X mL

X= 0,1 mL de RiboflavinaTubo 3 Tubo 4

1x10-4 moles de Riboflavina 1000 mL0,2 x10-6 moles de Riboflavina X mL

X= 0,2 mL de Riboflavina

1x10-4 moles de Riboflavina 1000 mL0,3x10-6 moles de Riboflavina X mL

X= 0,3 mL de RiboflavinaTubo 5 Tubo 6

1x10-4 moles de Riboflavina 1000 mL0,4 x10-6 moles de Riboflavina X mL

1x10-4 moles de Riboflavina 1000 mL0,5 x10-6 moles de Riboflavina X mL

A= 0,717ε = 12.500 M-1 cm-1

b = 1 cm

C = 0,717 / 12.500 M-1 cm-1 x 1 cmC = 0,717 / 12.500 M-1

C = 5,736x10-5 M 57,36 uM

X= 0,4 mL de Riboflavina X= 0,5 mL de Riboflavina

Tabla n°4: Absorbancia de las solucionesInformación básica: Espectrofotometría realizada a 440 m

Tubo 1 (blanco)

2 3 4 5 6

Concentración 0 umol 0,1umol 0,2 umol 0,3 umol 0,4 umol 0,5 umolAbsorbancia 0,0 0,109 0,215 0,320 0,423 0,529

Muestra problema Información básica: Se determinó la absorbancia de la muestra problema y posteriormente se interpoló en la curva de calibración realizada.

Absorbancia muestra problemaInformación básica: Espectrofotometría realizada a 440 m

Absorbancia 0,138

Interpolar absorbancia de muestra problema en curva de calibración

Concentración (umol)

Absorbancia

Absorbancia

Cálculo ecuación lineal :

- y = 1,0548x + 0,0023- 0,138 = 1,0548x + 0,0023- 1,0548x = 0,138 – 0,0023- 1,0548x = 0,1357- x = 0,1357 / 1,0548- x = 0,128649981

DISCUSION

Experiencia n°1: ESPECTROGRAMA

Concentración (umol)

Concentración de Riboflavina con una absorbancia de 0,138 es de 0,128649981 umoles

En la realización del espectrograma podemos decir, que la Riboflavina “constituida por un anillo de isoaloxazina dimetilado al que se une el ribitol, un alcohol derivado de la ribosa. Los tres anillos forman la isoaloxacina y el ribitol es la cadena de 5 carbonos en la parte superior”6, debido a esto la Riboflavina absorbe mucha luz al momento de realizar un procedimiento de absorciometría, obteniendo como pick de absorción 440 nm, que está en el rango teórico que son 445 nm, esta variación se produjo porque existe una “exactitud fotométrica, que es el grado de concordancia entre la absorbancia real y la absorbancia medida”7. Por ende, las variaciones obtenidas se producen por “el error cometido al leer una absorbancia respecto de una referencia se denomina entonces “inexactitud fotométrica”7.

Experiencia n°2: CURVA DE CALIBRACIÓN

En la realización de la curva de calibración podemos decir que nuestra curva fue casi perfecta, donde todos los puntos se acercan mucho a la línea de tendencia trazada, al ser un gráfico lineal haciendo que exista una relación directa entre la absorbancia y la concentración de las soluciones, haciendo que estos resultados sean estadísticamente significativos y confiables para poder interpolar cualquier solución problema. Esta confección de la curva se pudo realizar de la mejor manera gracias a los cálculos realizados que fueron los precisos, a la preparación de los tubos con diferentes concentraciones y a la medición en el espectrofotómetro de estas soluciones.

En el caso de la muestra problema podemos decir que no hubo problemas en la obtención de la absorbancia en esta se pudo interpolar de manera perfecta en la curva de calibración, obteniendo así su concentración a través de esta curva que presenta datos significativos y confiables.

CONCLUSION

En síntesis, podemos decir que los métodos de absorciometría, en este caso la espectrofotometría son métodos básicos y no complejos para conocer la

cantidad de alguna sustancia que se requiera, muy útiles para exámenes médicos. Este método se pudo lograr con bastante satisfacción en nuestro grupo de trabajo, en especial todo lo que es manejo de realizar las disoluciones.

Por otro lado, en realización de la curva de calibración, podemos decir que efectivamente se cumple la ley de Lambert y beer, la cual nos dice que existe una relación directa entre la absorbancia y la concentración, puesto que, la absorciometría aprovecha la propiedad de ciertos compuestos de absorber radiación electromagnética, una herramienta útil que mide cuantitativamente esta propiedad de los compuestos que absorben radiación es el espectrofotómetro que calcula la capacidad de absorbencia y transmitancia a distintas longitudes de onda y concentración de una solución en particular. Por lo tanto, a mayor concentración de una solución, mayor es la absorbancia.

Logramos comprender que hay compuestos que absorben luz a distintas longitudes de onda debido a su estructura, en este caso, la riboflavina al presentar anillos aromáticos en su estructura presentaba podía absorber gran cantidad de luz a 440 nm.

Por último, el espectrofotómetro como instrumento cuantitativo, entrega datos de carácter precisos, pues, existe una concordancia o cercanía entre valores al repetir las mediciones.

BIBLIOGRAFÍA

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2. Siberberg, M. (2000). Chemistry: The Molecular Nature of Matter and Change. New York City: Mcgraw-Hill College.

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5. González, M. (2011). Química. Transmitancia y absorvancia. Consultado el 25 de Agosto 2014 en http://quimica.laguia2000.com/enlaces-quimicos/cromoforo.

6. Vásquez, X. (2014). . Vitamina B2. Consultado el 25 de Agosto del 2014 en http://es.wikipedia.org/wiki/Vitamina_B2.

7. Instrumentalización y absorciometría (espectrofotometría). Consultado el 25 de Agosto 2014 en http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/lhh345a/InstrumentalLecc1.pdf