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Antecedentes históricos

El ISP como Laboratorio de Referencia delMinisterio de Salud ha cumplido un importanterol en el manejo de la infección por hantavirus.En 1995 participó en la elaboración de la nor-mativa ministerial sobre manejo de casos defiebres hemorrágicas, que sirvió de base para lavigilancia de infección por hantavirus. En octu-

bre de ese mismo año se diagnosticó el primercaso de infección humana por hantavirus en elpaís. Los análisis fueron realizados en el Insti-tuto Carlos Malbrán de Argentina. En octubrede 1997 fue inaugurado el Laboratorio de En-fermedades Infecciosas Emergentes (Laborato-rio de Referencia de Hantavirus), con capaci-dad de realizar los exámenes serológicos nece-sarios para humanos y roedores. En los aspec-

Infección por hantavirus en humanos:Experiencia del Laboratorio de Referencia para

Enfermedades Infecciosas Emergentes*

T.M. HECTOR GALENO A.1, ELIECER VILLAGRA C.1, B.Q. JORGE FERNANDEZ O.1, B.Q. EUGENIO RAMIREZ V.1 y M.V. JUDITH MORA R.1

1 Instituto de Salud Pública de Chile, Sección Virología.* Este artículo contó con el apoyo del proyecto del National Institutes of Health número U19 AI45452-01 "Hantavirus:

ecología y enfermedad en Chile".

Rev Chil Infect (2000); 17 (3): 216-219

HANTAVIRUS HUMAN INFECTION: EXPERIENCE OF THE EMERGINGINFECTIOUS DISEASES REFERENCE LABORATORY

In Chile hantavirus human infection is linked to Oligoryzomys longicaudatusmouse, hantavirus circulation has been documented in specimens captured fromthe Metropolitan to the eleventh regions. Hantavirus Cardiopulmonary Syndromecases have been reported from the sixth to the eleventh regions. The emergence ofthis disease in the Chilean population stimulated the implementation of a nationalreference laboratory in order to confirm its etiology. In this article it is describedthe national reference laboratory development and its contribution to know theepidemiology of infection in Chile. We briefly report the postmortem recovery ofAndes virus from a child.

Key words: Hantavirus; Reference laboratory; Experience; Hantavirusrecovery; Andes virus.

Suplemento: Infección por hantavirus en Chile

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tos técnicos se contó con la colaboración, parala capacitación en serología de hantavirus, delCDC de Atlanta, E.U.A. y el Instituto C.Malbrán de Buenos Aires, Argentina. En di-ciembre de 1998 se puso en marcha la metodo-logía de TR-RPC para el diagnóstico mediantepesquisa de ARN viral, como complemento deldiagnóstico serológico y para efectuar estudiosen roedores, contando para esto con la colabo-ración del Instituto C. Malbrán. En 1999 seefectuó adiestramiento en diferentes técnicasvirológicas para hantavirus en la Universidadde New Mexico, Albuquerque, NM, E.U.A.,entre ellas, el manejo de cultivo en células VeroE6.

Serología en humanos

El Laboratorio de Referencia de Hantavirusdel ISP realiza a partir de noviembre de 1997pesquisa serológica en muestras enviadas direc-tamente desde los centros clínicos o ratificadiagnósticos efectuados en otros laboratoriosque realizan la detección serológica dehantavirus. El registro oficial de los casos esefectuado a base de la información reportadapor el ISP. En la actualidad efectúa la detecciónde IgM mediante ELISA de captura, conantígeno total de virus Laguna Negra (suminis-trado por CDC de Atlanta, E.U.A.) y/o connucleoproteína recombinante de virus Andes(suministrado por Instituto C. Malbrán, Argen-tina). La detección de IgG se realiza medianteELISA tipo sandwich, con antígeno denucleoproteína recombinante de virus Sin Nom-bre (suministrado por el CDC de Atlanta,E.U.A.) y/o de virus Andes (suministrado por elInstituto C. Malbrán, Argentina).

Estadísticas actualizadas de los casos dehantavirus chilenos notificados se puede obte-ner del boletín “El Vigía” y de la página electró-nica http://epi.minsal.cl del Ministerio de Sa-lud. Del total de casos de infección aguda porhantavirus confirmados, 92% corresponden acasos de SCPH y 8% a casos que cursaron lainfección sin compromiso cardiorrespiratorio.Dentro de la vigilancia, los casos confirmadospositivos constituyen alrededor del 20%. El gru-po de casos descartados lo constituyen pacien-tes con cuadros febriles con heterogéneasintomatología, incluyendo a personas falleci-

das con sospecha de infección aguda por agenteno identificado. Del total de casos de infecciónaguda confirmados, sobre 97% han sido diag-nosticados a través de IgM en la primera mues-tra analizada. En pocos casos se ha debidorecurrir a la obtención de otras muestras o atécnicas de alternativa. No se ha observadodiferencias significativas para la detección deIgM entre el uso de antígeno de virus LagunaNegra y de virus Andes. En cuanto a IgG, sedetecta una mejor respuesta al antígeno de virusAndes que a virus Sin Nombre; sin embargo,algunos pacientes reaccionan primero contra elantígeno de virus Sin Nombre. Se han observa-do algunos pacientes con reacción positiva fal-sa en la detección de IgG, pero a títulos bajos(cercanos al nivel de corte). En pacientes cuyamuestra para diagnóstico ha sido tomadaprecozmente (entre 3 y 6 días del inicio de lasintomatología), se detecta exclusivamente IgM,mientras que en muestras tomadas mas tardía-mente (entre 7 y 30 días) se detecta tanto IgGcomo IgM.

Transcriptasa reversa-reacción depolimerasa en cadena

En 1998 fue incorporada al uso rutinario latécnica de TR-RPC para la detección del ARNviral, tanto para muestras de sangre (coágulos)de pacientes, como para tejidos de personasfallecidas o de órganos de roedores. Para diag-nóstico se ha utilizado la detección de secuen-cias del gen de la nucleoproteína, por ser estaregión mas conservada entre las diferentes va-riantes de hantavirus (menor frecuencia de mu-taciones). Para fines de tipificación genética seha utilizado la amplificación de secuencias delgen de envoltura. La utilidad mayor de la TR-RPC ha estado en descartar la infección porhantavirus en aquellos pacientes seronegativosfallecidos que, por antecedentes clínicos oepidemiológicos, han sido altamente sospecho-sos de infección por hantavirus y de los cualesse dispone de muestras congeladas de diferentesórganos.

InmunohistoquímicaDado que esta metodología no está

implementada en el ISP, trozos de muestras detejidos fijados en formalina tamponadas sonenviadas al CDC para su procesamiento. La

Experiencia del laboratorio de referencia para hantavirus - H. Galeno A. et al

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mayor utilidad de este método ha estado enaquellos casos en que no se dispone de otrasmuestras para diagnóstico que tejidos fijados.También ha sido útil para precisar algunas ca-racterísticas locales de la infección diseminadaen los diferentes órganos estudiados.

Evaluación de reactivos para diagnósticoEl propósito de esta actividad es garantizar

el uso de reactivos para diagnóstico de hantavirusen el país. La normativa vigente permite eldiagnóstico de infección por hantavirus en loscentros que reúnan las condiciones mínimas debioseguridad. Esta actividad puede ser realiza-da mediante el uso de reactivos comerciales.Los ensayos realizados permiten sostener quelas pruebas basadas exclusivamente en antígenosde virus asiáticos o europeos no tienen el nivelde detección apropiado para cuadros agudossospechosos de SCPH. Una prueba negativapor estos tests no descarta con seguridad lainfección por virus Andes (bajo valor predictivonegativo -VPN). En general las pruebas quecontienen antígenos de hantavirus sudamerica-nos pueden tener buen VPN.

AISLAMIENTO DE HANTAVIRUS APARTIR DE UN PACIENTE EN CHILE

El aislamiento de hantavirus en cultivos ce-lulares no constituye un procedimiento habitualpara diagnóstico, su utilidad está restringida alámbito de la investigación, especialmente, en laobtención de cepas virales de roedores para sucaracterización. Sin embargo, mediante estametodología logramos aislar una cepa dehantavirus a partir de una muestra de sueroproveniente de un caso humano.

El caso lo constituyó un niño de 10 años deedad, que residía en la Región del Bío Bío,contacto de un familiar fallecido víctima delSCPH. La muestra analizada mediante cultivofue obtenida originalmente para análisisserológico como parte de la investigaciónepidemiológica del caso índice. Dos días des-pués de la obtención de la muestra de sangre, elniño desarrolló sintomatología que lo obligó ahospitalizarse. Falleció a los 4 días de evolu-ción de la sintomatología, con sospecha deSCPH. No se dispuso de nuevas muestras de

sangre durante este período sintomático o postmortem. En la única muestra de suero disponi-ble los exámenes de anticuerpos IgG e IgM antihantavirus fueron negativos.

El procedimiento de cultivo viral (aislamien-to) consistió en inocular 0,5 ml de muestra desuero del paciente a frascos que contienenmonocapa semiconfluente de células Vero E6,incubadas por 10 días en estufa con CO

2. Lue-

go se realizaron sucesivos pasajes de estas célu-las en nuevos frascos con monocapa de célulasVero E6. Finalmente se realizaron las pruebaspara detectar proteínas y genoma de hantavirusen los frascos de cultivo.

La primera prueba confirmatoria utilizadafue la inmunofluorescencia directa, utilizandosueros de pacientes con anticuerpos antihantavirus y sueros negativos para hantavirus.Al observar láminas con células tratadas conlos correspondientes sueros y conjugadosfluorescentes al microscopio de luz UV, se ob-servó la presencia de fluorescencia sólo en lascélulas Vero E6 derivadas del inóculo del casoen estudio. Estas células no mostraronreactividad al ser enfrentadas con sueros que nocontenían anticuerpos anti hantavirus. Por otraparte, los sueros con anticuerpos anti hantavirusno mostraron reactividad en células controles(no inoculadas).

En una segunda instancia de análisis, se rea-lizó prueba de ELISA utilizando un lisado decélulas infectadas y células controles como ma-terial antigénico. Estos preparados fueron en-frentados contra suero de conejo hiperimmuneanti virus Andes (suministrado por el InstitutoC. Malbrán, B. A., Argentina). En esta pruebase observó diferencia significativa de reactividadentre el lisado celular derivado de la línea infec-tada con respecto a las células controles.

Para un tercer análisis se preparó extractosde ARN total de células infectadas y célulascontroles. Con este ARN se realizó prueba detranscripción reversa ligada a RPC anidada(nested RT-PCR) con partidores específicospara detectar secuencias del gen que codificapara la nucleoproteína de hantavirus. Los pro-ductos de esta reacción fueron visualizados engeles de agarosa - bromuro de etidio. Se obser-vó la presencia de un amplificado del tamañoesperado (338 pb, gen nucleoproteína) en losextractos derivados de las células infectadas y

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ausencia de bandas específicas en células con-troles. El producto de 338 pb fue posteriormen-te clonado y secuenciado. La secuencianucleotídica obtenida fue idéntica en 91% a lasecuencia correspondiente de virus Andes yapublicada, ratificando la especificidad del pro-ducto de la TR-RPC.

Conclusión y proyecciones. Mediante lasdiferentes pruebas confirmatorias ha quedadoestablecida la presencia de una cepa dehantavirus en células Vero E6 derivadas de lainoculación de una muestra de suero humano.Parece importante para este logro la ausenciade anticuerpos anti hantavirus en el paciente, loque permitió mantener la infectividad de laspartículas virales contenidas en la muestra. Que-da pendiente una mayor caracterización genéticay fenotípica del aislado.

Este hallazgo constituye un hito histórico,puesto que esta cepa viral es la primera obteni-da de un paciente con SCPH, enfermedad pro-pia del continente americano, de alta letalidad.Todas las cepas de hantavirus americanos pu-blicadas han sido aisladas a partir de roedores.Se ha aislado algunas cepas de hantavirus apartir de pacientes con fiebre hemorrágica consíndrome renal (HFRS) de ocurrencia en Euro-pa y Asia.

Bajo las circunstancias en que ocurrió esteaislamiento, también permitió conocer algo mássobre el curso de esta infección. El virus fuerecuperado de una muestra de sangre obtenidamientras el paciente no manifestaba síntomas(periodo de incubación) y aún no desarrollabarespuesta de anticuerpos (etapa de ventanaserológica). Esto nos sugiere que en las perso-nas infectadas ocurre una importante disemina-ción del agente por la sangre (viremia), permi-tiendo al virus iniciar focos de replicación enmúltiples partes del cuerpo del sujeto afectadoantes que el sistema inmune del huésped reac-cione o antes del desarrollo de síntomas o sig-

nos indicativos de daño de tejidos.Un significado práctico de disponer de esta

cepa capaz de multiplicarse en el laboratorio esque mediante su caracterización podemos llegara conocer las cualidades más esenciales conrespecto a su mecanismo de agresión y tambiénsus puntos vulnerables. Otro frente puede signi-ficar la producción de antisueros específicospara inmunoterapia, con capacidad para neutra-lizar in vivo al virus y que pudiera ser útil paradisminuir la letalidad del SCPH, o bien, paraatenuar la gravedad, acortar la duración de laenfermedad o para prevenir la ocurrencia deinfección en personas en alto riesgo. Esta cepaademás puede ser útil tanto para el desarrollo devacunas como para probar la efectividad de laprotección conferida por éstas o para cuantificarlos anticuerpos neutralizantes desarrollados porlas personas infectadas. Por otra parte, el dispo-ner de una cepa de origen humano permiteprobar in vitro diferentes antivirales como even-tuales alternativas terapéuticas para el SCPH.

RESUMEN

En Chile la infección humana por hantavirusestá ligada al ratón Oligoryzomys longicau-datus, reportándose la circulación de hantavirusen especímenes capturados desde la RegiónMetropolitana hasta la XI Región. Se han noti-ficado casos de síndrome cardiopulmonar porhantavirus desde la sexta a la undécima regiones.La emergencia de esta enfermedad en la pobla-ción chilena estimuló el desarrollo de un labora-torio nacional de referencia para su diagnósticoetiológico. Se describen las etapas de desarrollode este laboratorio y su contribución a establecerel trazado epidemiológico de la infección enChile. Relatamos brevemente el aislamientopostmortem de virus Andes a partir de un niño.

Correspondencia a:Héctor Galeno A.Fax : 56 (2) 350 7583Email: hagaleno@yahoo.com

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