Ref.: S2009/AGR-1464

III REUNIÓN CIENTÍFICA

ANALISYC-II

Instituto de Química Orgánica General, (CSIC). Madrid, 12 de Junio de 2012

GRUPO UCM-QA

Principales hitos:

1. Alimentos funcionales (Se)

2.Nanopartículas: su problemática analítica, determinación, bioacumulación y su efecto. (Se, Ag y TiO2)

3.Contaminantes orgánicos: clásicos y emergentes (metodologías analíticas y bioacumulación)

GRUPO UCM-QA

ALIMENTOS FUNCIONALES

en SELENIO

GRUPO UCM-QA

Objetivo principal: Evaluación y estudio sobre la posible incorporación y/o biotransformación de

selenio a proteínas, en productos lácteos por la acción de Lactobacillus Lactis.

Seinorgánico

Seorgánico

Procedimiento experimental: A través del enriquecimiento de yogurt con

Se(IV), se ha procedido a la extracción y precipitación de proteínas,

determinación de selenio y/o selenoproteínas por SDS-PAGE y Asymmetric

Flow-Field-Flow-Fractionation (AF4) usando UV e ICP-MS como técnicas de

detección.

GRUPO UCM-QA

RESULTADOS Y CONCLUSIONES: Se ha demostrado la capacidad de biotransformación y,

la incorporación de selenio a proteínas mediante la acción de L. Lactis. Tras la optimización

del proceso de extracción proteica, se comprobó como el Se se une/bioincorpora de forma

mayoritaria a proteínas de 20-37kDa (Caseínas, proteínas mayoritarias en la leche) y

biomoléculas de alto peso molecular.

AF4-ICPMS

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

cp

s,

78S

e

> 200kDa 20-30kDa

UV ICP-MS

Congresos:

-7º Workshop Hispano-Francés sobre Química Analítica Bioinorgánica (Gijón 2012)

- XXIII Reunión Nacional Espectroscopía (Córdoba 2012)

GRUPO UCM-QA

Fermentación de coles con Selenio Objetivo: Evaluar la transformación de Se(IV) en el proceso de fermentación de coles y

estudiar el efecto de la adición de selenito en los productos de hidrólisis de los indol-

glucosinolatos (GLS) (considerados anticancerígenos), la vitamina C, la actividad antioxidante

de las coles fermentadas, y la biotransformación del Se.

Col blanca (Brassica oleácea) Coles fermentadas Fermentación láctica

Na2SeO3

7 días, 22ºC

Procedimiento experimental: se desarrolló la metodología analítica necesaria utilizando

las técnicas HPLC-ICP-MS, HPLC-PAD, EC.

GRUPO UCM-QA

Resultados: Las col enriquecida con 0,14µg Se/g

incorporó 0,11µg Se/g (80-100%),

biotransformándose a SeMeSeCys en su totalidad.

La adición de selenito aumentó la formación de

algunos compuestos derivados de la hidrólisis de

GLS. Se observó un aumento en la actividad

antioxidante (163 mmol trolox/g). 05000

100001500020000250003000035000

0 5 10

cp

s

time / min

SeMeSeCys

PRP-X100

Publicaciones y Congresos Peñas E., Martinez-Villaluenga C., Frias J., Sánchez-Martínez M.J., Pérez-Corona M.T., Madrid Y., Camara C. and Vidal-Valverde C.

Se improved indole glucosinolate hydrolysis products content, Se-methylselenocysteine content, antioxidant capacity and potential anti-

inflammatory properties of sauerkraut. Food Chemistry 132 (2012) 907-914

M. J. Sánchez Martinez, M T: Perez Corona, C. Cámara and Y. Madrid . Selenite Biotransformation during brewing. Evaluation by

HPLC-ICP-MS Talanta 88 ( 2012) 272-276

M. Sanchez, M. T Pérez-Corona, C. Cámara and Y. Madrid. Se Biotransformation by Saccharomyces cerevisiae and S. bayanus

during white wine manufacture: Lab-scale experiments Food Chemistry 124 (2011)1050-1054

Euro Food Chem XVI. Translating Food Chemistry into Health Benefits. 6-8 Julio 2011. Polonia

7º Workshop Hispano-Francés sobre Química Analítica Bioinorgánica, 1-3 Julio 2012. Gijón, España.

GRUPO UCM-QA

NANOPARTÍCULAS

Se, TiO2 y Ag

Objetivos: Desarrollar métodos analíticos

para la determinación de nanopartículas, su

estabilización y caracterización

GRUPO UCM-QA

Nanopartículas de TiO2 en productos de consumo humano

ANTECEDENTES & OBJETIVOS

El actual desarrollo de la nanotecnología en el área de la alimentación está

estrechamente relacionado con la seguridad de la salud humana y medio ambiente

Por qué es importante llevar a cabo la

identificación/caracterización de

nano-TiO2 en productos alimenticios

En función del tamaño y estructura,

presentan diferentes efectos biológicos.

Riesgos para la salud del consumidor:

Daño oxidativo celular

Acumulación de nano-TiO2 en intestino

nano-TiO2

Nano-TiO2 presentes en…

ADITIVOS. Agente colorante (E 171)

AGENTES “ANTI-CAKING” (anti-coagulantes) en polvos.

TiO2 en azúcar glass, café en crema…

PROTECCIÓN frente RADIACIÓN UV.

TiO2 en envases de plástico, cremas solares…

GRUPO UCM-QA

Nanopartículas de TiO2 en productos de consumo humano

(Fase desarrollo)

AZÚCAR GLASS

Ti TOTAL: 938 ± 83 mg Ti /Kg

Ti EXTRAÍDO: (3.48 ± 0.09)·10-2 mg Ti /Kg

¿¿NANOPARTÍCULAS??

Digestión ácida-ICP MS

USP-ICP MS

AF4-ICP-MS

0

5000

10000

15000

20000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Tiempo (min)

CPS 47Ti

IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN

de TITANIO

PRESENCIA DE NANOPARTÍCULAS

RUTILO

ANATASA

0

20000

40000

353637383940414243444546

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Tiempo (min)

Nano-TiO2 (rutilo) ~ 100 nm

Nano-TiO2 (anatasa) ~ 25 nm

CPS 47Ti

Presencia de

vacuolas vesículas

PROLIFERACIÓN CELULAR

FASES CICLO CELULAR

Estudio de la EXPRESIÓN PROTEÍCA

mediante Inmunofluorescencia

Inhibición del desarrollo celular Bloqueo de la síntesis de proteínas y replicación de ADN

GRUPO UCM-QA

EFECTO de NANOPARTÍCULAS de Se en células humanas Los efectos antioxidantes, biodisponibilidad y toxidad de SELENIO dependen de su

FORMA QUÍMICA

LOCALIZACIÓN nanoSe en células HepG2

mediante TEM

CONGRESOS:

III Jornadas Bienales de Jóvenes Investigadores en Proteómica

(2012 Santiago de Compostela, España). Tipo de participación: Póster

13as Jornadas de Análisis Instrumental (2011 Barcelona, España).

Tipo de participación: Comunicación Oral

I Simposio de Jóvenes Investigadores en Espectroscopía Aplicada

(2011 Madrid, España). Tipo de participación: Comunicación Oral

7º Workshop Hispano-Francés sobre Química Analítica

Bioinorgánica (Gijón 2012)

Inhibición de la expresión factores de iniciación

eucariotas

Células de hepatocarcinoma humano HepG2 mitocondria

GRUPO UCM-QA

Objetivos realizados

- Estabilidad de las suspensiones de AgNPs:

- Se consigue su estabilidad (48h) en un medio de HAc y almidón al 0,1%.

- Se han realizado ensayos de bioacumulación en larvas del pez cebra. (No se ha detectado bioacumulación

en los ensayos)

Objetivos en fase de desarrollo

- Desarrollo de método de análisis de especiación de AgNP y Ag+ mediante ultrafiltración a 10KDa y

determinación por ICP-MS en productos de herbolario y cervezas

- Estudios de caracterización del tamaño y forma de suspensiones de nanopartículas en estos productos,

mediante el fraccionamiento en flujo con campo de flujo asimétrico (AF4) acoplado con ICP-MS.

- Logros: Se ha comprobado la presencia de nanopartículas de plata en algunos productos y la de plata iónica.

Publicaciones Zebrafish larvae as a Model for the Evaluation of Inorganic Arsenic and Tributyltin Bioconcentration. Ana López-

Serrano; Jon Sanz Landaluze, Riansares Muñoz-Olivas, Joaquín Guinea, Carmen Cámara. Water Research, 45

(2011) 6515-6524

DETERMINACIÓN y CARACTERIZACIÓN de AgNPs

GRUPO UCM-QA

CONTAMINANTES CLÁSICOS Y EMERGENTES

GRUPO UCM-QA

ESTUDIO DE LOS MECANISMOS BIOMOLECULARES

IMPLICADOS EN LA TOXICIDAD INDUCIDA POR MeHg

Objetivo principal: Identificación de proteínas y mecanismos celulares implicados en los

efectos tóxicos inducidos por MeHg en células y organismos en desarrollo (larvas de pez

cebra).

MeHg Hepatocitos Larvas de pez

cebra

Procedimiento experimental: Empleo de dos estrategias de proteómica cuantitativa (SILAC y iTRAQ)

para la identificación de proteínas de-reguladas. Validación de los datos proteómicos mediante análisis

bioinformáticos, morfológicos e histológicos.

GRUPO UCM-QA

Resultados y Conclusiones: Se han identificado diversas proteínas de-reguladas como

consecuencia de la exposición a MeHg permitiendo, por un lado, profundizar en los

mecanismos de toxicidad y de detoxificación de este compuesto, y por otro identificar

potenciales biomarcadores de toxicidad. Los resultados de los análisis morfológicos e

histológicos han corroborado los datos proteómicos obtenidos.

Publicaciones:

- Trends in Analytical Chemistry 30 (2011) 703.

- Talanta. 89 (2012) 169– 177

- Analytical and Bioanalytical Chemistry (DOI 10.1007/s00216-012-6042-3)

- Analytica Chimica Acta (Enviado)

Congresos:

-III Jornadas de Jóvenes Investigadores en Proteómica (Santiago, 2012).

-13ª Jornadas de Análisis Instrumental (Barcelona, 2011)

-3rd International Symposium on Metallomics (Munster, 2011)

GRUPO UCM-QA

Objetivo: Determinación de estaño inorgánico y de especies organoestánnicas en larvas de

pez cebra.

La medida de Sn total se realiza mediante ICP-MS y de especies de Sn mediante GC-FPD. Además se desarrolla un polímero de impresión molecular para la determinación de especies de Sn.

BIOACUMULACIÓN DE ESPECIES ORGANOESTÁNNICAS

Las muestras de larvas se exponen a 2 ppb de TBT en 45h y 48h, y depuración de 12h y 24h.

45h 48h dep 12h dep 24h

0

300

600

900

1200

1500

1800

2100

2400

GC FPD

ICP MS

GF AAS

ng g

-1 S

n

Time

Resultados:

Figura 1: Comparación de tecnicas para determinar Sn total

45h 48h dep 12h dep 24h

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

ng g

-1

Time

MBT

TBT

Figura 2: Concentración de MBT y TBT (GC FPD)

GRUPO UCM-QA

Diferentes estrategias de polimerización:

Mejores resultados:

Porogen: C6H5CH3

Emulsión: 1.5 g PVA y 0.1 g SDS en 75 mL de agua caliente

Etapas de limpieza y elución

Limpieza: MeOH

Elución

(%)

HCl 0.3M/MeOH 10

CH2Cl2/MeOH 1:1 50

CHCl3 60

MeOH/CH3COOH 9:1 100

Publicaciones:

- Water Research. 45 (2011) 6515-6524

Congresos:

- 5th Iberoamerican congress on Anaqlytical Chemistry

GRUPO UCM-QA

TRICLOSAN Triclosan es un agente antibacteriano y antimicrobiano de amplio espectro que puede

estar presente en el medio ambiente, en envoltorios de alimentos, superficies y máquinas

cortadoras utilizadas en la industria alimentaria. Es tóxico para organismos acuáticos y

se bioacumula en los tejidos del pescado (BCF = 2000-5000).

OBJETIVO: evaluación y comparación de métodos de extracción

miniaturizados para triclosan y su metabolito en muestras derivadas del

pescado mediante GC-MS.

MUESTRAS DE AGUAS DE CONSUMO Y HUEVAS DE PESCADO EXTRACCIÓN CON EtOAc Y MICROSONDA DE ULTRASONIDOS

PURIFICACIÓN MEDIANTE FLORISIL

C, mg V, µL

A/A

IS

1.2-1.26 1.26-1.32 1.32-1.38 1.38-1.44 1.44-1.5 1.5-1.56 1.56-1.62 1.62-1.68 1.68-1.74

-1 -0.6 -0.2 0.2 0.6 1 -1 -0.6 -0.2 0.2 0.6 1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8

Optimización mediante diseño experimental de las condiciones de la microsonda (tiempo,

amplitud y temperatura) y de la relación cantidad de muestra/volumen de extractante

PRECISIÓN RSD < 6.5 %

R > 94%

Aplicaciones: huevas de lumpo comerciales

Ensayos de bioacumulación con larvas de pez cebra

Optimización de la etapa de limpieza

GRUPO UCM-QA

Trabajo en fase de desarrollo: MUESTRAS DE SURIMI

EXTRACCIÓN CON ACET Y SONDA DE ULTRASONIDOS

PURIFICACIÓN MEDIANTE FLORISIL + PSA

Optimización de la etapa de limpieza empleando distintos sorbentes y cartuchos comerciales

PRECISIÓN RSD < 12 % R > 92%

MÉTODO QUECHERS

Optimización de la extracción empleando distintos disolventes (EtOAc y ACN, con y sin fase

acuosa) y sorbentes para dSPE

Mejores resultados: MÉTODO QUECHERS CON ACN Y dSPE: PSA + C18 + FLORISIL

PRECISIÓN RSD < 10 % R > 97%

Publicaciones:

- Anal Bioanal Chem (2012) 403:927–937

-Congresos:

- 16th European Conference of Analytical Chemistry. Euroanalisis. Belgrade, Serbia.

GRUPO UCM-QA

FÁRMACOS: REGULADORES LIPÍDICOS Y

ANTIINFLAMATORIOS Problemática: Los reguladores lípidos y los antiinflamatorios son ampliamente usados para el tratamiento humano y animal, respectivamente. Por ello, hay una preocupación creciente sobre su estudio y determinación en diferentes matrices tales como leche materna, leche animal y leche en polvo. Según la Directiva de la Comisión Europea 96/23/EC, los residuos de estas drogas deben ser controlados debido al riesgo potencial que supone para la salud humana.

Objetivo: Desarrollo de metodologías para la determinación de ácido clofíbrico (regulador

lipídico) y diclofenac (antiinflamatorios), en muestras de leche comercial mediante HPLC-DAD.

LECHE COMERCIAL: precipitación de las proteínas empleando AcN (1:1). El extracto

obtenido se hace pasar por un MIP comercial, selectivo para cuatro fármacos (ácido clofíbrico,

diclofenac, ibuprofeno, naproxen) HPLC-DAD

% R, CFB %R, DC

76 ± 5 95 ± 14

Extracto de leche comercial enriquecida con 400 mg/L de cada analito

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 18,0 Retention Time [min]

0

2000

4000

6000

Inte

nsity

[µV]

0512-4 - CH6CFB

DC

Congresos:

- I Simposio de Jóvenes Investigadores en

Espectroscopía Aplicada

GRUPO UCM-QA

BIOACUMULACIÓN DE FÁRMACOS Problemática: Debido al elevado consumo de fármacos, la legislación europea “REACH” (Registration,

Evaluation and Authorisation of Chemicals) ha propuesto la necesidad de evaluar los parámetros toxicológicos

(persistencia, capacidad de bioacumulación, etc) de compuestos químicos con producción superior 100

toneladas/año a través del TEST 305 empleo de numerosos peces adultos, elevada duración de los

ensayos y costes amplios.

Objetivo: Determinar los factores de bioacumulación de diclofenac y ácido clófibrico en larvas de pez cebra

Puesta a punto de un método de extracción de ácido clofíbrico y diclofenac en los medios de crecimiento y

larvas de pez cebra empleando como técnica analítica HPLC-DAD.

En fase de desarrollo: Alternativa al Test 305 Exposición de 48h a larvas de pez cebra a diferentes

concentraciones de los compuestos objeto de estudio + 24h adicionales a un sistema de depuración

Análisis

1) Extracción con ácido cítrico en AcN 0.1M

2) Empleo de sonda de ultrasonidos focalizada (A = 40%, 1 min)

3) Evaporación hasta sequedad con corriente de N2

4) Reconstitución en 150 mL de fase móvil

5) Centrifugación a 14 rcf, 15 minutos a Tª ambiente

6) HPLC-DAD

LARVAS MEDIOS

CFB HPLC-DAD

DC

2x500mL AcOEt Vórtes 30s HPLC-DAD

% R, CFB %R, DC

98 ± 20 89 ± 8

GRUPO UCM-QA

DETERMINACIÓN DE PAHs Ensayos de bioacumulación de los PAHs: antraceno y fluoreno

Se ha desarrollado un método por HPLC-FL para determinar antraceno y fluoreno en muestras

complejas y muy pequeñas.

Se ha aplicado a larvas de pez cebra para ensayos de bioacumulación

Durante la fase de bioconcentración se alcanzaron condiciones de “steady-state”.

Los BCFs obtenidos están de acuerdo con los de la base de datos METI-NITE Japan.

Publicaciones:

- Rapid Determination of PAHs in Zebrafish Eleutheroembryos as a Model for the Evaluation of PAHs

Bioconcentration S. El-Amrani, J. Sanz-Landaluze, J. Guinea, C. Cámara. Submitted to Journal of

Environmental Monitoring

Congresos:

-23rd International Symposium on Polycyclic Aromatic Compounds (ISPAC 23), Münster (Alemania)

-EuroTox (The 47th Congress of the European Societies of Toxicology), Paris (Francia).

- En el 2nd CEFSER workshop "Persistent organic pollutants in food and environment", Novi Sad (Serbia)

GRUPO UCM-QA

Trabajo en fase de desarrollo: Ensayos de bioacumulación de 8 PAHs en células humanas

DETERMINACIÓN DE PAHs

Objetivos: Determinación de la bioacumulación de PAHs en células humanas. Efectos sobre

el proteoma humano

Desarrollo:

• Ensayos de estabilidad en medios de cultivo celular

• Contaminación de las células con 8 PAHs, ensayos de bioacumulación

Trabajo en fase de desarrollo: Ensayos en alimentos para 16 PAHs

Los PAHs se pueden encontrar en alimentos ahumados artesanalmente. Estos alimentos se

quedan impregnados básicamente con PAHs reconocidos como ligeros

Objetivo: optimización de métodos de extracción miniaturizados de PAHs en salchichas

ahumadas con reducción del tiempo de extracción para su posterior análisis por HPLC-FL.

Tipos de Muestras: salchichas ahumadas

Procedencia: Portugal

Colaboraciones: Azti

GRUPO UCM-QA

DETERMINACIÓN DE PAHs

Trabajo en fase de desarrollo: Ensayos en alimentos para 16 PAHs

Evaluación de métodos de extracción en salchichas ahumadas:

1.- Sonda de ultrasonidos y limpieza con cartuchos de SPE: C18.

Optimización de la etapa de limpieza.

2.- QuECheRs: ACN + dSPE (PSA + C18)

1

8

9

7

6

5

4

3

2

µg/kg

1.-Acenaphtene 193,52

2.- Fluorene 302,71

3.- Phenatrene 221,49 Σligeros= 749,45 µg/kg

4.- Antracene 31,73

5.- Benzo(a)antracene 12,21

6.- Chrysene 58,43

7.- Benzo(b)fluorene 290,61 Σpesados= 1775,04 µg/kg

8.- Benzo(k)fluorene 314,62

9.- Benzo(a)pyrene 1099,17

GRUPO UCM-QA

RESUMEN DE PUBLICACIONES

Food Chemistry . 124 (2011) 1050-1054 JAAS 26(1) 116-122, (2011) JAAS 26(1) 178-186 (2011) TRAC 30, 5, 703-716 (2011) Water Research 45 (2011) 6515-6524 Talanta 88( 2012) 272-276) Food Chem. (2011) 11: 64 Anal. Bioanal. Chem. 403, 4 (2012), 927-937 Talanta. 89 (2012) 169– 177 (2011) Anal. Bional. Chem. (2012) 403:927–937. Science of Total Environment (2012) 425 184–190