I+D+I-Paula Díaz

8/18/2019 I+D+I-Paula Díaz

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Valoración de semen de

rumiantes a través delmicroscopio óptico

Autora: Paula Díaz Álvarez. Centro: I.E.S Gregorio Prieto. Línea: Imagen y biomedicina.


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Índice: Páginas

Portada………………………………………………………………………………..1

Índice………………………………………………………………………………….2

1. Introducción…………………………………………………………………….….3

2. Materiales…………………………………………………………………………..4

3. Procedimiento………………………………………………………………………7

4. Hipótesis…………………………………………………………………………….9

5. Resultados…………………………………………………………………………..10

6. Conclusión…………………………………………………………………………..18

7. Webgrafía..………………………………………………………………………….19

8. Bibliografía………………………………………………………………………….20


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1. Introducción

Mi trabajo tiene como objetivo valorar la calidad inmediata del semen congelado enfunción de distintos métodos de descongelación para una rápida evaluación a través delmicroscopio óptico que se aproxime lo máximo a la calidad real de la muestra, teniendo

en cuenta que una descongelación no adecuada puede deteriorar o falsear la calidadinicial del eyaculado y considerando que en este trabajo vamos a ver la motilidadindividual que aparece en todas las especies y nos servirá para valorar la calidad delsemen, pero tenemos que tener en cuenta que existe otra motilidad llamada masal, quesolamente la tienen los animales salvajes y de los domésticos, solo los rumiantes y estaúltima guarda una relación más directa con la fertilidad y para la inseminación artificial,que constituye uno de los más antiguos e importantes adelantos en reproducción tanto anivel humana como animal, en el primer caso como respuesta a facilitar la concepciónen casos que de otra forma no sería posible y en el segundo, como método básicamentede mejora genética entre otros muchos objetivos.


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2. Materiales:

El objeto de estudio son las pajuelas de semen inmersas en un tanque de nitrógenolíquido a -196ºC:

Para su manejo, necesitaremos pinzas metálicas y guantes:

Para la medición del tiempo utilizaremos un cronómetro de laboratorio.


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Para la descongelación de las pajuelas vamos a utilizar tres bañosmaría, dos paradescongelar (uno a 37ºC y otro a 60ºC) y uno para atemperar (a 32º):

Estos baños, han de tener una temperatura determinada que la controlaremos gracias atermómetros con sonda sumergible:

Mezclaremos diluyente INRA 96 con el semen para determinar el movimiento de losespermatozoides:


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Necesitaremos tubos de ensayo, donde pondremos el semen y el diluyente, para llevar acabo los primeros procesos:

Utilizaremos una pipeta para manipular el diluyente y el semen:

Nos valdremos de un microscopio óptico Nikon Eclipse 50i con una cámara acoplada,de manera que se pueda visualizar en una pantalla el objeto de estudio:

Finalmente, necesitaremos material auxiliar desechable como porta y cubre objetos ypuntas de pipeta:


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3. Procedimiento

Vamos a trabajar con semen de cabra de la raza florida. Este, está envasado en pajuelasde 0,25 cc y almacenada a -196ºC en nitrógeno líquido. Para que nuestro experimentotenga cierto rigor científico, elegiremos idénticas pajuelas del mismo semental,

congeladas el mismo día y de idéntica calidad, es decir, pertenecientes a un mismo“lote” y con ellas comprobaremos el comportamiento a la descongelación de losespermatozoides a distintas combinaciones temperatura- tiempo. Tomaremos varios“lotes” de pajuelas y las someteremos a diferentes protocolos de descongelación,sementales de dos cabras diferentes a 37ºC, 5, 15, 30, 45 y 60 segundos, y a 60ºC, 1, 5,10 y 15 segundos; luego grabaremos las imágenes en el ordenador con el programa„SCA 2002‟ y trataremos de extraer alguna conclusión a lo que hayamos visto.

El primer paso es echar disolvente en tubos de ensayo previamente introducidos en el bañomaría a 32º C, donde se va a atemperar el semen después de haberlo descongelado.

El segundo paso es coger una pajuela de semen del tanque de nitrógeno líquido a -196ºC con una pinza y guantes protectores para nitrógeno líquido.

Después, debemos sumergir la pajuela en el bañomaría a temperatura y tiemposcontrolados (por ejemplo: a 37ºC, 5 segundos) para descongelarla.

El cuarto paso es cortar la pajuela por los extremos, de manera que podremos echar elsemen en un tubo de ensayo con el diluyente, en el bañomaría a 32ºC, 2 minutos y 30segundos, para atemperarlo.

Pasados los 2 minutos y medio, debemos coger el semen del tubo de ensayo con una

pipeta con una punta nueva (es importante tirar las puntas de pipetas usadas, ya que nose pueden usar más de una vez cada una).


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Después hay que poner el semen en un portaobjetos previamente colocado en elmicroscopio óptico, y seguidamente, poner un cubreobjetos encima.

El séptimo paso es encender el microscopio e iniciar el programa SCA 2002 en elordenador, para visualizar la movilidad y la calidad del movimiento de los

espermatozoides:

Por último, hay que guardar las grabaciones de los espermatozoides, y repetir el procesocontrolando las temperaturas y los tiempos necesarios.

Se valoran la motilidad en sí o % de formas móviles y la calidad de ese movimiento. Lacalidad del movimiento se valora en escala de 0 a 5, se admiten valores intermedios(3,5; 4,5), siendo:

0: Espermatozoides inmóviles.

1: Movimiento oscilatorio o de vaivén sin desplazamiento, cabeceo.

2: Movimiento circular. 3: Movimiento circular, eventualmente progresivo.

4: Movimiento progresivo.

5: Movimiento progresivo enérgico.


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4. Hipótesis

Hay unas temperaturas y tiempos de descongelación rápida en las que lamotilidad adquiere un máximo y, manteniendo una temperatura constante,comprobaremos si acortando el tiempo de descongelación, la motilidad es más baja

porque los espermatozoides “no han tenido tiempo suficiente” para recuperar suenergía o alargándolos, la motilidad baja también porque el tiempo excesivo ha

podido agotarles la citada energía. Como ya he dicho antes, vamos a tomar dostemperaturas diferentes y en cada una de ellas un tiempo de referencia, amboscontrastados y jugaremos con el tiempo hacia arriba y hacia abajo para ver si seconfirma nuestra hipótesis.


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5. Resultados

Los resultados obtenidos fueron los siguientes:

Descongelación a 37ºCSC10005 (sementales de la 1ªcabra)

JM09101 (sementales de la 2ªcabra)

Movilidad Calidad delmovimiento


5 segundos 64 3,5 67 2,515 segundos 51 3,5 44 230 segundos 41 2,5 49 345 segundos 29 2 38 2,560 segundos 19 2,5 44 3,5

Descongelación a 60ºCSC10005 (sementales de la 1ªcabra)

JM09101 (sementales de la 2ªcabra)



1 segundo 16 2,5 40 25 segundos 50 3,5 57 2,510 segundos 38 2,5 31 315 segundos 2 2 35 3

Movilidad en descongelación a 37º C:

0

20

40

60

80

100

120

140

5 segundos 15 segundos 30 segundos 45 segundos 60 segundos

JM09101

SC1005


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Calidad del movimiento en descongelación a 37º C:

Movilidad en descongelación a 60º C:

Calidad del movimiento en descongelación a 60ºC:

0

1

2

3

4

5

6

7

5 segundos 15 segundos 30 segundos 45 segundos 60 segundos

JM09101

SC10005

0

10

20

30

40

50

60

1 segundo 5 segundos 10 segundos 15 segundos

SC10005

JM09101

0

1

2

3

4

5

6

7

1 segundo 5 segundos 10 segundos 15 segundos

JM09101

SC10005


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Estas son las fotografías tomadas con el microscopio y el programa SCA 2002:

-A 37º:

SC10005 5 segundos:

SC10005 15 segundos:



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JM09101 5 segundos:


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JM09101 15 segundos:




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-A 60º C: SC10005 1 segundo:

SC10005 5 segundos:


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JM09101 1 segundo:


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JM09101 5 segundos:




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6. Conclusión

Al hacer este experimento, hemos comprobado que 37º y 5 segundos es una buenatemperatura y tiempo de descongelación, ya que el movimiento de los espermatozoides,en los dos sementales, es adecuado.

También hay variaciones individuales:

En el semental SC10005, el movimiento de los espermatozoides descienceindirectamente proporcionalmente con el tiempo de descongelación, menos en ladescongelación 1 segundo a 60ºC, que seguramente fuera demasiado pocotiempo para que los espermatozoides pudieran reaccionar.La media de la calidad del movimiento, tanto con la descongelación a 37ºC,como a 60ºC, es 2,72, una buena calidad, teniendo en cuenta que un calidadóptima ronda el 4.

En el semental JM09101, el movimiento de los espermatozoides no cambia

proporcionalmente con el tiempo de descongelación.La media de la calidad del movimiento, tanto con la descongelación a 37ºC,como a 60ºC, es 2,66, también una buena calidad, aunque no tanto como la delsemental SC10005.

En las fotografías tomadas con el microscopio y el programa mencionadoanteriormente, hemos comprobado, que a pesar de que los espermatozoides tengan unamovilidad alta, la calidad del movimiento no es tan buena en todos los casos.Por ejemplo: En el semental JM09101 con la descongelación a 60ºC 1 segundo, tieneuna movilidad de 40, que no está mal, pero su calidad es de 2, ya que la mayoría de losespermatozoides, se mueven en zig-zag.


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7. Webgrafía

Centro regional de selección y reproducción CERSYRA Valdepeñas:http://pagina.jccm.es/agricul/cersyra/

Asociación Española de Reproducción Animal: http://www.aera.org.es/en/

Embryotools: http://www.embryotools.com/#!reproduccin-animal/c1pb8 Centro de selección y mejora genética de ovino y caprino de Castilla y León:

http://ovigen.es/en/

Lista de centros de colecciones de semen aprobadas para comercio de intra-comunidad en semen de animales domésticos de ovinos y caprinos:http://www.magrama.gob.es/es/ganaderia/temas/comercio-exterior-ganadero/centrosderecogidadeespermadeovinos-caprinos_tcm7-5593.pdf

Researchgate:https://www.researchgate.net/publication/28229015_Centro_de_inseminacion_a

rtificial_Oskotz_seccion_de_ovino SERIDA: http://www.serida.org/areadetalle.php?id=70

Elsevier: http://www.journals.elsevier.com/animal-reproduction-science/

European Society for Domestic Animal Reproduction: http://www.esdar.org/

Animal Reproduction Science:http://www.sciencedirect.com/science/journal/03784320

http://pagina.jccm.es/agricul/cersyra/reproduccion.htmhttp://www.aera.org.es/en/http://www.aera.org.es/en/http://www.aera.org.es/en/http://www.embryotools.com/#!reproduccin-animal/c1pb8http://www.embryotools.com/#!reproduccin-animal/c1pb8http://www.embryotools.com/#!reproduccin-animal/c1pb8http://ovigen.es/en/http://ovigen.es/en/http://www.magrama.gob.es/es/ganaderia/temas/comercio-exterior-ganadero/centrosderecogidadeespermadeovinos-caprinos_tcm7-5593.pdfhttp://www.magrama.gob.es/es/ganaderia/temas/comercio-exterior-ganadero/centrosderecogidadeespermadeovinos-caprinos_tcm7-5593.pdfhttp://www.magrama.gob.es/es/ganaderia/temas/comercio-exterior-ganadero/centrosderecogidadeespermadeovinos-caprinos_tcm7-5593.pdfhttps://www.researchgate.net/publication/28229015_Centro_de_inseminacion_artificial_Oskotz_seccion_de_ovinohttps://www.researchgate.net/publication/28229015_Centro_de_inseminacion_artificial_Oskotz_seccion_de_ovinohttps://www.researchgate.net/publication/28229015_Centro_de_inseminacion_artificial_Oskotz_seccion_de_ovinohttp://www.serida.org/areadetalle.php?id=70http://www.serida.org/areadetalle.php?id=70http://www.serida.org/areadetalle.php?id=70http://www.journals.elsevier.com/animal-reproduction-science/http://www.journals.elsevier.com/animal-reproduction-science/http://www.journals.elsevier.com/animal-reproduction-science/http://www.esdar.org/http://www.esdar.org/http://www.esdar.org/http://www.sciencedirect.com/science/journal/03784320http://www.sciencedirect.com/science/journal/03784320http://www.sciencedirect.com/science/journal/03784320http://www.esdar.org/http://www.journals.elsevier.com/animal-reproduction-science/http://www.serida.org/areadetalle.php?id=70https://www.researchgate.net/publication/28229015_Centro_de_inseminacion_artificial_Oskotz_seccion_de_ovinohttps://www.researchgate.net/publication/28229015_Centro_de_inseminacion_artificial_Oskotz_seccion_de_ovinohttp://www.magrama.gob.es/es/ganaderia/temas/comercio-exterior-ganadero/centrosderecogidadeespermadeovinos-caprinos_tcm7-5593.pdfhttp://www.magrama.gob.es/es/ganaderia/temas/comercio-exterior-ganadero/centrosderecogidadeespermadeovinos-caprinos_tcm7-5593.pdfhttp://ovigen.es/en/http://www.embryotools.com/#!reproduccin-animal/c1pb8http://www.aera.org.es/en/http://pagina.jccm.es/agricul/cersyra/reproduccion.htm


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8. Bibliografía

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