IDENTIFICAR Y CARACTERIZAR UNA CONDUCTANCIA AL …
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Profesor Patrocinante Dra. Maria Isabel Niemeyer Marich Centro de Estudios Científicos IDENTIFICAR Y CARACTERIZAR UNA CONDUCTANCIA AL CLORURO ACTIVADA POR CALCIO INTRACELULAR EN EPITELIO INTESTINAL SILVESTRE DE RATÓN Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico DENNIS ARIEL CISTERNA AGUILA VALDIVIA – CHILE 2011
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Profesor Patrocinante
Dra. Maria Isabel Niemeyer Marich
Centro de Estudios Científicos
IDENTIFICAR Y CARACTERIZAR UNA CONDUCTANCIA AL
CLORURO ACTIVADA POR CALCIO INTRACELULAR EN
EPITELIO INTESTINAL SILVESTRE DE RATÓN
Tesis de Grado presentada como parte
de los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioquímica y Título
Profesional de Bioquímico
DENNIS ARIEL CISTERNA AGUILA
VALDIVIA – CHILE
2011
I
AGRADECIMIENTOS
Agradezco en primer lugar a mi profesor patrocinante la Dra. Maria Isabel
Niemeyer M., por aceptarme como integrante de su grupo de trabajo, y por su valiosa
guía y apoyo en mi etapa de formación profesional.
Agradezco de igual manera al Dr. Francisco Sepúlveda, por su excelente
disposición en el momento de solicitar poder realizar mi tesis en el CECS.
A mi profesor copatrocinante el Dr. José Sarmiento y a mi profesor informante,
el Dr. Alejandro Reyes por formar parte de esta comisión.
Al Director de Escuela Dr. Alejandro Claude, por su amabilidad, disposición y
apoyo brindado durante este proceso.
En forma muy especial a mis padres, por el apoyo y esfuerzo realizado,
principales responsables de que esto se cumpliera.
A Carolina por acompañarme desde el comienzo de este largo proceso y por su
apoyo incondicional.
De la misma forma agradezco a mis viejos amigo y a todos aquellos que
conocí en el transcurso de mi carrera universitaria y en el laboratorio, por todo lo
brindado y por eso geniales momentos que recordaré el resto de mi vida.
Este trabajo fue realizado en el Laboratorio de Biofísica y Fisiología Molecular
del Centro de Estudios Científicos, gracias al apoyo del proyecto FONDECYT
Nº1061069.
II
INDICE
Pág.
1 RESUMEN.............................................................................................. 1
1.1 SUMMARY.............................................................................................. 2
2 INTRODUCCIÓN.................................................................................... 3
2.1 El canal de cloruro activado por calcio………………............................. 4
2.1.1 Rol fisiológico del los canales de cloruro activados por calcio............... 6
2.2 Transporte de cloruro y agua en el intestino……………………………... 8
2.3 Relación entre el canal CFTR y CaCC…………………………………… 11
2.4 Candidatos moleculares para CaCCs……………………………………. 16
2.5 Hipótesis……………............................................................................... 20
2.6 Objetivos generales................................................................................ 20
2.7 Objetivos específicos.............................................................................. 20
3
MATERIALES Y MÉTODOS..................................................................
21
3.1 Materiales……….................................................................................... 21
3.11 Reactivos…………………………........................................................... 21
3.12 Manejo de animales de experimentación............................................... 21
3.2 Métodos……………………………………………………………………… 22
3.2.1 Medición de corriente de cortocircuito en cámara de Ussing………….. 22
3.2.1.1 Preparación del tejido……………………………………………………… 22
III
3.2.1.2 Medición de la diferencia de potencial transepitelial y las corrientes de
cortocircuito……………………………………………………………….....
23
3.2.2 Genotipificación……………………………………………………………... 26
3.2.2.1 Extracción de DNA genómico……………………………………………… 26
3.2.2.2 Reacción de la polimerasa en cadena PCR……………………………… 28
3.2.3 RT-PCR………………………………………………………………………. 30
3.2.3.1 Aislamiento celular………………………………………………………….. 30
3.2.3.2 Reacción de la polimerasa inversa acoplada a reacción de polimerasa
en cadena
31
4
RESULTADOS.......................................................................................
35
4.1 Descripción de la colonia de ratones CFTR……………………………… 35
4.2 Efecto de agonistas de calcio intracelular sobre la diferencia de
potencial transepitelial y la corriente de cortocircuito en colon distal de
ratones nativos
42
4.2.1 Efecto del carbacol sobre Vte y Isc…………………………………………. 42
4.2.2 Efecto del UTP sobre Vte y Isc................................................................. 52
4.3 Efecto de agonistas de calcio intracelular sobre la diferencia de
potencial transepitelial y la corriente de cortocircuito en colon distal de
ratones KO para CFTR……………………………………………………..
54
4.3.1 Efecto del carbacol sobre Vte y Isc.......................................................... 54
4.3.2 Efecto del UTP sobre Vte y Isc................................................................. 57
4.4 Identidad molecular de los posibles candidatos responzables de la 59
IV
secreción de cloruro activada por calcio intracelular…………………….
5
DISCUSIÓN............................................................................................
64
6
BIBLIOGRAFIA......................................................................................
74
V
INDICE DE FIGURAS
Pág.
1 Proceso secretor en epitelio intestinal…………………………………… 10
2 Canal de cloruro activado por calcio…………………………………….. 15
3 Curva de sobrevida de ratones CFTR…………………………………… 38
4 Peso corporal de ratones CFTR…………………………………………. 40
5 Secreción aniónica en colon distal de ratón nativo……………………. 43
6 Efecto de carbacol sobre la secreción de cloruro en colon de ratón
nativo………………………………………………………………………..
46
7 Interacción de NFA con el canal CFTR en colon de ratón nativo……. 48
8 Efecto del NFA sobre la secreción de cloruro inducida por carbacol
en colon de ratón nativo…………………………………………………..
51
9 Efecto de UTP sobre la secreción de cloruro en colon de ratón nativo 53
10 Secreción de cloruro inducida por carbacol en colon distal de ratón
nativo y KO para CFTR……………………………………………………
55
11 Efecto de UTP sobre la secreción de cloruro en colon de ratón nativo
y KO para CFTR
58
12 Detección por RT-PCR del mRNA para los miembros de la familia
mCLCA y VMD en tejido colónico………………………………………..
62
13 Detección por RT-PCR del mRNA para los miembros de la familia
TMEM en tejido colónico………………………..………………………..
63
VI
INDICE DE TABLAS
I Buffer de lisis para extracción de DNA genómico…………………….. 27
II Partidores CFTR para genotipificación………………………………… 29
III Partidores para transcritos de la proteína CLCA……………………… 32
IV Partidores para transcritos de la proteína VMD………………………. 33
V Partidores para transcritos de la proteína TMEM…………………….. 34
VI Colonia de ratones CFTR……………………………………………….. 36
VII
ABREVIATURAS
CFTR Regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística
CaCC Canal de Cloruro activado por calcio
DIDS Diisotiocianatoestilbeno disulfonato
NFA Ácido Niflúmico
pS picoSimens
NKCC1 Triple cotransportador Na+, K+, Cl-
KCNQ1/KCNE3 Canal de Potasio basolateral (activado por cAMP)
KCNN4 Canal de Potasio basolateral (activado por calcio)
ENaC Canal de sodio apical
CF Fibrosis Quística
CLCA Proteína canal de cloruro activado por calcio
VMD Visual Molecular Dynamics
TMEM16 Proteína de Transmembrana 16
TTX Tetradotoxina
IBMX Isobutil metilsantino
Vte Potencial eléctrico transepitelial
Isc Corriente de cortocircuito
Rte Resistencia transepitelial
R Resistencia
I Corriente macroscopica
VIII
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
RT-PCR Reacción de polimerasa inversa acoplada a reacción de polimerasa
en cadena
bl basolateral
ap apical
1
1. RESUMEN
El colon de mamíferos participa en la mantención del balance hidrosalino y volumen
plasmático a través de los procesos absortivos y secretorios que ocurren en este tejido.
Para esto los enterocitos disponen de canales iónicos, bombas e intercambiadores
ubicados estratégicamente en los dominios apicales y basolaterales de estas células.
Ciertas mutaciones en el canal CFTR (Regulador de la conductancia de
transmembrana de la CF) producen defectos en el transporte de cloruro, provocando
en los epitelios secretorios la deshidratación de su contenido. En el caso del sistema
digestivo pueden provocar obstrucción que puede ser letal. Sin embargo algunos
pacientes afectados por la CF parecen tener una conductancia alternativa al cloruro la
que se cree puede disminuir la ocurrencia de episodios obstructivos. Basados en estas
observaciones hemos decidido estudiar la presencia de canales de cloruro activados
por calcio (CaCC) que pudiesen participar de la secreción de cloruro en el colon y ser
responsables de las diferencias en el curso clínico de la enfermedad.
Para indagar esta hipótesis utilizamos un modelo animal para la CF, un ratón CFTR KO,
y estudiamos la presencia de conductancias de cloruro activadas por calcio en el colon
mediante técnicas de electrofisiología. Además realizamos una búsqueda de transcritos
de los miembros de las hasta ahora descritas familias de CaCC.
Pese a que en el colon se expresa una gran cantidad de CaCC de diferentes familias,
nuestros datos funcionales demuestran que estos canales no participan de la secreción
de cloruro en colon de animales normales o con CF. Estos datos sugieren que en el
epitelio intestinal el canal CFTR es el único canal de cloruro que participa de la
secreción aniónica.
2
1.1 SUMMARY
The mammalian colon is involved in maintaining sodium balance and plasma volume
through absorptive and secretory processes that occur in this tissue. To this end, the
enterocytes are endowed with ion channels, pumps and exchangers strategically
located in the apical and basolateral domains of these cells.
Mutations in the CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) channel
leads to defective transport of chloride in secretory epithelia resulting in dehydration of
its contents. In the case of the digestive system it can cause intestinal obstructions,
which can be lethal. However, patients affected by cystic fibrosis seem to have
alternative chloride conductance which is believed can reduce the occurrence of
obstructive events. Based on these observations we decided to study the presence of
calcium activated chloride channels (CaCC) that could participate in chloride secretion in
the colon and be responsible for the differences in the clinical course of the disease.
To test this hypothesis we have used an animal model for cystic fibrosis, the CFTR null
mouse, and studied the presence of chloride conductance activated by calcium in the
colon using electrophysiological techniques. We also conducted a search of transcripts
of members of the families described so far CACC.
Although the colon is expressed various of CaCC from different families, our functional
data show that these channels do not participate in chloride secretion in the colon of
normal animals or those with cystic fibrosis. These data suggest that in the intestinal
epithelium CFTR is the only chloride channel involved in anion secretion.
3
2. INTRODUCCIÓN
Las células del epitelio secretorio poseen canales iónicos, cotransportadores,
intercambiadores y bombas que están asimétricamente distribuidos entre la membrana
apical y basolateral. El movimiento vectorial de los iones a través de un subconjunto
de estas proteínas produce una gradiente osmótica que conduce a movimiento de
fluido hacia el lumen del epitelio (Loewen & Forsyth, 2005).
Los canales aniónicos son poros proteicos en la membrana biológica, los que permiten
la difusión de iones cargados negativamente. Estos canales pueden conducir otros
aniones (I-, NO3-) mejor que el cloruro, pero aun así, se les denomina canales de
cloruro, ya que éste es el anión permeante más abundante en el organismo en
condiciones fisiológicas (Jentsch et al., 2002).
Los canales pueden ser clasificados de acuerdo a su mecanismo de apertura, como
canales dependiente de ligando, canales de cloruro dependientes de voltaje, canales de
cloruro regulado por fosforilación, canales aniónicos regulado por volumen, y CaCCs.
Estos últimos, tienen como característica aumentar su probabilidad de apertura ante
aumentos de la concentración de calcio citosólico produciendo una depolarización de la
membrana celular. Los canales de cloruro activados por calcio han sido encontrados en
distintos tipos celulares, incluyendo células epiteliales, neuronas, células sanguíneas,
células de músculo liso y cardíaco, estando relacionados con actividades fisiológicas
tales como la secreción epitelial, la excitabilidad de membrana en músculo cardiaco y
las neuronas, la transducción olfatoria, la regulación del tono vascular, la modulación de
4
los fotorreceptores, así como probablemente otras funciones hasta ahora desconocidas.
(Hartzell et al., 2005a).
2.1 EL CANAL DE CLORURO ACTIVADO POR CALCIO
Uno de los primeros estudios de la conductancia al cloruro activada por calcio fue
realizado en glándulas lagrimales de rata aproximadamente hace 25 años atrás. Se
demostró la presencia de corrientes aniónicas activadas por aumentos de calcio
intracelular inducidos ya sea por ionóforos de calcio o por estimulación colinérgica
muscarínica. Estas corrientes mostraban rectificación externa, activación a potenciales
depolarizantes y una dependencia de calcio con un umbral de 500 nM y saturación a 2
µM (Marty et al., 1984;Evans & Marty, 1986). Corrientes con similares caracteristicas
fueron observadas más tarde en células acinares de la glándula parótida (Arreola et al.,
1996).
El calcio que activa estas corrientes puede provenir de la entrada del catión divalente
desde el intracelular o por su liberación desde los almacenes intracelulares. Hay dos
posibles mecanismos generales por los cuales el calcio puede activar el canal, uno es
que el calcio se puede unir directamente al canal y el otro mecanismo propuesto es
que actúe indirectamente sobre el canal vía proteínas de unión a calcio o enzimas
dependientes de calcio. (Hartzell et al., 2005a).
5
Estudios electrofisiológicos del CaCC, en diversos tipos celulares, incluyendo varias
células epiteliales secretorias, mostraron tener propiedades similares. En general, estas
corrientes eran sensibles a calcio y a voltaje; se activaban lentamente a potenciales
despolarizantes; mostraban una rectificación hacia afuera; mayor permeabilidad al
yoduro que al cloruro; y era parcialmente bloqueado por DIDS (4,4`-
Diisotiocianatoestilbeno-2,2`disulfonato 100-500 µM), y NFA (acido niflúmico, 100 µM)
(Jentsch et al., 2002;Hartzell et al., 2005a). Sin embargo, los estudios de conductancia
unitaria, indican la existencia de distintos tipos de CaCCs en los diferentes tipos
celulares. CaCC de baja conductancia (1-3 pS) como en ovocito de Xenopus
(Takahashi et al., 1987); CaCC con una conductancia de 8-pS, como es el caso de
hepatocitos (Koumi et al., 1994); CaCC de 15-pS descrito en colon (Morris & Frizzell,
1993). Pese a la diversa información que describe estas conductancias, la identidad
molecular de estos canales sigue siendo desconocida.
6
2.1.1 ROL FISIOLÓGICO DE LOS CANALES DE CLORURO ACTIVADO POR
CALCIO
Como se mencionó anteriormente los CaCCs se encuentran en diferentes tipos
celulares, participando así, en diversas funciones, de las cuales podemos mencionar:
La contracción de músculo liso, por ejemplo, en aorta torácica de rata (Lamb & Barna,
1998), en donde el calcio activa corrientes de cloruro, produciendo la salida de este.
Esta salida de cloruro despolariza la membrana celular lo que activa canales de calcio
dependientes de voltaje, aumentando la entrada de calcio y promoviendo la contracción
del músculo liso.
Otra función en la que participan CaCCs es la secreción de fluido por la glándula
exocrina, como las glándulas salivares (Melvin et al., 2005), en las cuales la salivación
ocurre en respuesta a agonistas que generan un incremento en el calcio intracelular.
Muchos estudios en diferentes especies han mostrado que aumentos intracelulares de
calcio pueden estimular una secreción de cloruro en las células del epitelio de la vía
aérea. Este epitelio utiliza el mecanismo de transporte iónico para controlar el nivel de
fluido en la superficie, el cual es importante para la correcta hidratación del mucus y la
protección contra agentes infecciosos. En la membrana apical del epitelio de la vía
aérea de humano y ratón, se ha descrito dos conductancias de cloruro: Una activada
por cAMP (Adenosin monofosfato cíclico) que corresponde a CFTR, y otra activada por
calcio. Este CaCC en particular es activado por calcio vía el receptor purinérgico P2Y
7
que incrementa la producción de IP3 e induce la liberación de calcio de los almacenes
intracelulares (Tarran et al., 2002).
Otro ejemplo de la participación de CaCC ocurre en el epitelio secretorio del ducto
pancreático. En este tejido la secreción de cloruro activada por calcio, estimulada por
acetilcolina es la que produce la secreción de fluidos en células del ducto pancreático
de ratas (Winpenny et al., 1998).
8
2.2 TRANSPORTE DE CLORURO Y AGUA EN EL INTESTINO
El intestino juega un importante rol en la absorción y secreción de nutrientes,
electrolitos y fluido. El colon es el segmento final del tracto digestivo donde se
recuperan electrolitos y agua, normalmente entre un 80%-90% del fluido que proviene
del segmento ileal, participando de la mantención de la homeostasis electrolítica. Para
que esto se cumpla es necesario que exista una compleja interacción entre los
procesos secretorios (criptas de lieberkuhn) y absortivos (células de la superficie), para
lo cual las células del epitelio colónico están equipadas con numerosos canales iónicos,
transportadores y bombas, localizados en la membrana apical (lado interno) y
basolateral (lado externo) de las células (Kunzelmann & Mall, 2002;Zachos et al., 2005).
El aumento o disminución de uno de los procesos puede llevar a la pérdida de este
equilibrio, lo cual trae como consecuencia trastornos fisiopatológicos que en algunos
casos puede llevar a la muerte. Por ejemplo es sabido que la secreción de fluido en el
intestino es un proceso altamente regulado cuyo mayor componente se debe a la
secreción electrogénica de cloruro, cuyo aumento debido a infecciones bacterianas
como el cólera y rotavirus resultan en diarrea secretoria produciendo grandes pérdidas
de agua y sales. Por el contrario, la CF es una enfermedad que se caracteriza por el
impedimento de la salida de cloruro al lumen intestinal, debido a mutaciones en el canal
CFTR. Esta deficiencia secretoria puede provocar cuadros obstructivos (Grubb &
Gabriel, 1997).
9
Como se mencionó anteriormente la secreción de cloruro intestinal es a través del
canal de cloruro CFTR ubicado en la membrana apical, el cual, una vez activado
mediante aumentos de cAMP, permite el flujo de cloruro hacia el lumen. El cloruro es
acumulado dentro de la célula por sobre su potencial de equilibrio electroquímico, por la
actividad del triple cotransportador basolateral NKCC1, el cual incorpora en forma
paralela 2 iones cloruro, 1 sodio, 1 potasio utilizando como energía la gradiente
favorable al sodio establecida por la bomba de sodio, también ubicado en la membrana
basolateral. (Barrett & Keely, 2000;Kunzelmann & Mall, 2002). (Figura 1).
La presencia de canales basolaterales de potasio es central en la maquinaria de
secreción aniónica, ya que su apertura permite mantener el potencial de membrana
favorable a la continua salida de cloruro, por reciclar el potasio que ingresa a través del
triple cotransportador NKCC1 y la bomba de sodio (Kunzelmann & Mall, 2002). Gracias
al uso de algunas herramientas farmacológicas y a la incorporación de modelos
animales modificados genéticamente, ha sido posible identificar los dos tipos de
canales de potasio basolaterales que participan en la secreción de cloruro en el
intestino. El primero corresponde al canal KCNQ1/KCNE3, responsable de la secesión
de cloruro dependiente de aumentos de cAMP e inhibido específicamente por la
molécula cromanol 293B (Mall et al., 2003;Vallon et al., 2005). El segundo corresponde
al canal KCNN4, que participa en la secreción de cloruro en respuesta a el aumento de
calcio intracelular (Flores et al., 2007).
10
Figura 1. Proceso secretor en el epitelio intestinal. Esquema general de la secreción
de cloruro en el colon, a través del canal CFTR, el cual es estimulado por incrementos
cAMP. A la secreción de cloruro también ocurre en forma paralela la secreción de sodio
vía paracelular. El cloruro hace ingreso a la célula por medio del triple cotransportador
basolateral NKCC1. El transporte de cloruro es mantenido por los canales de potasio
basolaterales KCNQ1/KCNE3 (activado por cAMP) y SK4 o KCNN4 (activado por
Ca2+).
BasolateralApical
11
2.3 RELACIÓN ENTRE EL CANAL CFTR Y CaCC
El canal CFTR es un canal de cloruro epitelial que se activa por aumentos en la
concentración intracelular de cAMP, lo que induce la fosforilación de la proteína. Se
localiza en la membrana apical de las células epiteliales, donde proporciona la vía para
el flujo del anión, siendo una actor central en el mecanismo de transporte transepitelial
de sales y agua (Sheppard & Welsh, 1999).
Las mutaciones en CFTR producen la CF que corresponde a una enfermedad
autosómica recesiva, asociada a complicaciones multisistémicas que en humanos
comprometen la función pulmonar, intestinal y pancreática principalmente (Brouillard et
al., 2005). En Europa, uno de cada 2500 nacidos vivos padece la enfermedad y una de
cada 25 personas es portadora sana (Grubb & Gabriel, 1997;Perez-Aguilar &
Berenguer, 1998). De las casi 2000 mutaciones reportadas para el canal CFTR la
deleción de un aminoácido, la fenilalanina en la posición 508 (∆F508), es la causante de
cerca del 70% de los casos de la enfermedad (Grubb & Gabriel, 1997).
En el epitelio pulmonar la CF produce una deficiente secreción aniónica y una excesiva
absorción de sodio a través del epitelio, produciendo una insuficiente hidratación del
contenido del lumen, lo que causa la acumulación de mucosidad viscosa de difícil
transito y que favorece la colonización de patógenos (Greger, 2000;Brouillard et al.,
2005).
12
La fisiopatologìa de la CF en el tracto gastrointestinal desemboca en la obstrucción
intestinal producto del mucus viscoso que se forma por la disminuida secreción en este
epitelio. Clínicamente este sindrome obstructivo se denomina meconium ileus en recién
nacidos y síndrome obstructivo intestinal distal en los pacientes adultos (Russo et al.,
2003). Al momento de nacer, las obstrucciones intestinales afectan a aproximadamente
el 15-20% y el episodio de obstrucción intestinal distal en adultos afectan al 25% de los
pacientes (Canale-Zambrano et al., 2007). Durante el primer año de vida,
aproximadamente el 50% de los pacientes exhiben signos y síntomas de mal digestión
de nutrientes debido a insuficiencias pancreáticas y bajo peso corporal (Wilschanski &
Durie, 1998).
Existe evidencia experimental que sugiere que un canal de cloruro activado por calcio,
puede proporcionar una importante ruta alternativa de secreción de cloruro en células
epiteliales. Dichas corrientes activadas por calcio han sido observadas, en la vía aérea
así como también en el intestino, aunque aún no es muy claro cuál es el mecanismo
celular y los canales involucrados. A diferencia del epitelio intestinal, es en el epitelio de
la vía aérea, donde existe evidencia más acabada acerca de la presencia de CaCC.
Mediante aproximaciones experimentales electrofisiológicas, se demostró la presencia
de CaCC en el cultivo primario de células de la vía respiratoria (Anderson & Welsh,
1991). Permeabilizando de manera selectiva la membrana basolateral de células
epiteliales de la traquea de ratón se demostró la localización apical de este canal
(Gabriel et al., 2000c). Estudios funcionales en este mismo epitelio demuestran que la
activación de receptores P2Y activarían corrientes de este tipo (Tarran et al., 2002).
13
La presencia de CaCCs en epitelio intestinal es controversial. Se ha demostrado que en
el tejido intestinal de pacientes CF así como en el obtenido de animales CFTR KO no
presentan secreción de cloruro en respuesta a aumentos de cAMP o calcio intracelular
(Grubb & Gabriel, 1997). Estudios funcionales en células aisladas del epitelio del colon
de ratón (Bohme et al., 1991) colon de humano obtenido de individuos normales y de
pacientes con CF no demostraron presentar conductancias de cloruro dependiente de
calcio. Estos estudios sugieren que la activación de la secreción de cloruro dependiente
de calcio requiere la presencia funcional del canal CFTR (Mall et al., 1998;Mall et al.,
2000). Por el contrario, tiempo después se han reportado análisis que demuestran la
existencia de una conductancia tipo CaCC en la membrana apical de epitelio intestinal
de rata (Schultheiss et al., 2005).
En estudios comparativos de la capacidad de transporte iónico de la mucosa intestinal,
entre ratones afectados por CF, se observó una conductancia del tipo CaCCs, más
activa en los ratones con manifestaciones leves que en las severas (Wilschanski et al.,
1996). Mientras que estudios electrofisiologicos en células aisladas del intestino de
ratones que presentaban un fenotipo leve de CF, mostraron la presencia de una
conductancia a cloruro dependiente de calcio, sugiriendo que la presencia de estas
corrientes se correlacionaba con una manifestación intestinal menos severa (Rozmahel
et al., 1996).
14
Estudios donde se examinó la secreción de cloruro en pacientes afectados por la
mutación ∆F508 también demostraron la presencia de una conductancia alternativa al
cloruro distinta de CFTR y que es activada por agonistas de calcio como histamina y
carbacol (Bronsveld et al., 2000).
En base a estas observaciones, se propone un modelo de la secreción de cloruro,
(figura 2), en el que los canales CaCCs existirían como vía paralela al CFTR para la
salida de cloruro a través de la membrana apical de las células secretorias.
15
Figura 2. Canal de cloruro activado por calcio. Esquema general de la secreción de
cloruro en el colon, en el cual frente a la deficiencia del canal CFTR postula una vía
alternativa a la secreción de cloruro siendo esta activada por aumento de calcio
intracelular, cuya identidad molecular es desconocida.
X
Apical Basolateral
16
2.4 CANDIDATOS MOLECULARES PARA CaCCs
Existen diversos candidatos que podrían corresponder al canal o los canales tipo
CaCCs que han sido descritos funcionalmente en el intestino. Algunos se agrupan en la
familia de proteínas CLCA, que se constituye de seis miembros con sus respectivas
características estructurales y diferentes patrones de expresión tisular. Estudios de la
expresión de estas proteínas, en el intestino de ratones normales y con CF, postulan a
mCLCA3 como candidato a la conductancia de cloruro dependiente de calcio (Brouillard
et al., 2005). Estos datos son consistentes con lo encontrado en pacientes humanos
(Ritzka et al., 2004), donde las observaciones apuntan a hCLCA4 y hCLCA1, la
contraparte humana de mCLCA3, como moduladores del defecto gastrointestinal en la
CF. Otro miembro de esta familia, mClCA6 fue aislado del intestino de ratón. Este al ser
expresado en células HEK 293 mostró una corriente de cloruro en respuesta al
tratamiento con ionomicina (ionóforo de calcio), así como sensibilidad al inhibidor de
este tipo de corrientes, el ácido niflúmico (NFA) (Evans et al., 2004).
Otra familia de canales de cloruro activados por calcio putativos corresponde a las
llamadas Bestrofinas. Uno de ellos han sido identificado en el epitelio pigmentado
retinal, que corresponde a una proteína codificada por el gen de la distrofia macular
vitiliforme (VMD), y se localiza en la membrana basolateral de las células del epitelio
retinal pigmentado. Mutaciones asociadas a VMD muestran una reducida o nula
corriente de cloruro activada por calcio (Hartzell et al., 2005b). La expresion heteróloga
de esta proteína en células HEK293, mostraron corrientes de cloruro activadas por
17
calcio (Qu et al., 2003b). Un estudio reciente investigó el rol de Best2 como candidata a
proteína CaCC, utilizando ratones KO para Best2. Se observó una gran reducción de
corriente aniónica bajo una estimulación colinérgica, consistente con lo observado en
CaCC. Sin embargo ensayos de inmunofluorescencia revelaron la localización de Best2
en la membrana basolateral en células globet, no en la membrana apical,
adicionalmente en ausencia de HCO3-, la activación colinérgica de la corriente fue
idéntica en el tejido control y Best2 KO, lo que sugiere que la mayor corriente de Best2
es por HCO3-. Finalmente proponen que Best2 es un posible canal de HCO3
- que
trabaja en conjunto con el intercambiador Cl:HCO3- (Yu et al., 2010).
En el 2008 tres equipos independientes de investigadores (Yang et al., 2008;Caputo et
al., 2008a;Schroeder et al., 2008b) identificaron a TMEM16A como un fuerte candidato
a CaCCs, utilizando diferentes métodos experimentales y bioinformáticos obteniendo
casi los mismos resultados. Se observó que la expresión heteróloga de TMEM16A en
diferentes tipos celulares siempre generaban corrientes de cloruro con propiedades
clásicas de CaCC, lenta activación a potenciales de membranas positivos e inhibición
por NFA y otros bloqueadores de CaCC (Galietta, 2009a).
De acuerdo con el importante rol de CaCC en células epiteliales, se ha determinado
que a nivel protéico o mRNA de TMEM16A en epitelios secretorios, células acinares
pancreáticas, células de bronquiolos pulmonares, tubo proximal de riñón, glándula
mamaria y células de la retina. Sin embargo, de la presencia de TMEM16A en otro tipo
18
de células epiteliales, como es el caso del intestino, requiere de mayor estudio (Yang et
al., 2008;Rock et al., 2009a).
Estudios funcionales in vitro e in vivo han demostrado que TMEM16A es de hecho
necesario para la secreción de cloruro dependiente de calcio. El uso de siRNA para
silenciar TMEM16A ha mostrado una inhibición de la secreción de cloruro dependiente
de calcio en cultivos polarizados de células epiteliales bronquiales humanas (Caputo et
al., 2008b) y en la secreción de fluidos por la glándula salivar (Yang et al., 2008).
Posteriores análisis, consistentes con estos estudios, han demostrado que la secreción
de cloruro en epitelios silvestre activados por agonistas de calcio desaparece por
perdida de expresión de TMEM16A. Aquí el transporte de cloruro dependiente de calcio
se vio muy disminuido o incluso ausente en epitelio colónico y traqueal así como en
hepatocitos, células acinares pancreáticas, y glándulas submandibulares en animales
TMEM16A-/- (Ousingsawat et al., 2009).
Se ha observado que existen grandes similitudes entre las corrientes dependientes de
TMEM16A y CaCCs, lo que sugiere que TMEM16A puede ser una proteína de canal.
Varios escenarios son posibles con respecto a esta proteína: se debe considerar que
TMEM16A puede ser la única proteína necesaria para formar el canal CaCC o quizás
solo forma parte del este (Galietta, 2009b).
19
En resumen, y basándonos en los antecedentes bibliográficos postulamos que el el
intestino se expresa un canal tipo CaCC que determina una vía alternativa de secreción
de cloruro a la mediada por CFTR.
20
2.5 HIPOTESIS Existe una conductancia apical al Cl- en el epitelio del colon de ratón que es activada
por un aumento en la concentración de Ca+2 intracelular.
2.6 OBJETIVOS GENERALES Identificar a nivel funcional la presencia de estos canales en epitelio de colon distal.
Identificar molecularmente los integrantes de este grupo de canales de Cl- activados por
calcio, cuyos mensajeros estén presentes en estas células.
2.7 OBJETIVOS ESPECIFICOS Utilizar epitelio intestinal de ratones para medir corrientes de cortocircuito utilizado
como indicador del transporte iónico a través del epitelio para así dar cuenta de la
presencia de corrientes de cloruro activadas por calcio en las células secretorias
Averiguar mediante estudios de RT-PCR qué mensajeros para canales de cloruro
activados por calcio se expresan en las criptas intestinales, específicamente miembros
del ClCA, Bestrofinas, TMEM16a.
21
3. MATERIAL Y METODOS
3.1 MATERIALES 3.1.1 Reactivos. El inhibidor Cromanol 293 B (10 µM) fue obtenido de Tocris Bioscience (USA). Carbacol
(100µM), UTP (100µM), amilorida (10µM), indometacina (2µM), Tretodotoxina (TTX,
4µM), IBMX (100µM), forskolina (1µM), acido niflúmico (150µM), DIDS (100µM-500µM)
fueron adquiridos en Sigma (USA).
3.1.2 Manejo de los animales de experimentación. Los ratones (Mus musculus) silvestre y CFTR KO endocriados de las cepas Black
Swiss, fueron obtenidos mediante una colaboración establecida entre el laboratorio del
Dr. James E. Melvin del University of Rochester Medical Center y nuestro laboratorio del
Centro de Estudios Científicos de Valdivia. Los animales fueron mantenidos en nuestro
bioterio bajo estándares internacionales de manejo de animales. Los animales se
generaron a partir de apareamientos entre heterocigotos de la misma camada siempre
que esto fuera posible. La identificación del genotipo de los animales se llevó a cabo
por PCR como se explica más adelante.
22
3.2 METODOS 3.2.1 Medición de corriente de cortocircuito en cámara de Ussing. 3.2.1.1 Preparación del tejido. Para los experimentos de cámara de Ussing se utilizó el colon distal de ratones machos
(en su mayoría para evitar la influencia de modificaciones hormonales en la actividad y
expresión de algunos canales) y hembras adultas (2-5 meses). Los animales tuvieron
libre acceso a alimento y agua hasta el día del experimento y se sacrificaron por
dislocación cervical, método aprobado por las disposiciones del comité de bioética de
nuestro centro. El segmento de intestino fue lavado con abundante solución salina
(NaCl 0,9%) y luego abierto longitudinalmente a lo largo del borde mesentérico.
Posteriormente, la mucosa debe ser desprendida, para esto el segmento de intestino se
fija manualmente en uno de sus extremos utilizando un portaobjetos, a continuación la
serosa y musculares propia se separó de la mucosa-submucosa por medio de un
desplazamiento mecánico de esta última con otro portaobjetos.
23
3.2.1.2 Medición de la diferencia de potencial transepitelial y las corrientes de
cortocircuito.
Para realizar los experimentos en la cámara de Ussing (Physiological Instruments, USA)
se procedió a montar las dos hemicamaras P-2300, que conforman la cámara de
Ussing, en ausencia del tejido, con el fin de poder calibrar el sistema. A cada
hemicámara se le instalaron dos electrodos (del tipo puentes de agar al 4% y se
mantienen en solución KCl 150 mM) uno de voltaje y otro de corriente, los cuales se
conectaron a un amplificador EVC 4000 (World Precision Instruments, EEUU). La
ubicación de los electrodos depende de lo que se desea registrar. En el caso de la
diferencia de potencial transepitelial, los electrodos de voltaje deben estar en posición
más próxima al tejido.
Una vez instalada la cámara, se agregó a ambos lados 4 ml de solución de baño de la
siguiente composición: NaCl 120 mM, NaHCO3 25 mM, KH2PO4 3,3 mM, K2HPO4
0,8 mM, MgCl2 1,2 mM y CaCl2 1,2 mM.
La cámara se debe mantener a 37º C, lo cual se realiza por medio de un baño
termorregulado (HAAKE-FJ), el cual bombea y hace circular agua por un costado de la
cámara.
Luego, se procedió a abrir el circuito y corrigió cualquier asimetría entre los electrodos
que miden el voltaje, así como también se compensó la resistencia en serie del fluido.
24
A continuación se desconectó la cámara, se descartó la solución de baño y la
preparación de tejido se montó en la cámara utilizando sujetadores de tejido
P-2303 de apertura de 0,1 cm2 de área (Physiological Instruments, USA), la que se
introduce como membrana divisoria entre las dos hemicámaras. Inmediatamente
después de montado el tejido se agregó nuevamente a ambos lados 4 ml de solución
de baño, cuya composición se describió anteriormente. Esta solución es suplementada
con D-glucosa 10 mM. La temperatura se mantiene a 37º C y ambas cámaras son
burbujeadas de manera continua con mezcla de O2 95% y CO2 5%.
La diferencia de potencial eléctrico transepitelial (Vte), definida como el potencial del
lado mucoso con respecto al lado basolateral de la preparación, es medida de manera
continua, bajo configuración current clamp (corriente mantenida) utilizando el
amplificador anteriormente mencionado. El tejido es mantenido a corriente de 0 µA y
sometido a pulsos de 10 µA de 4 s de duración. La corriente (I) registrada se digitalizó a
200 Hz por medio de una interfase análoga-digital modelo TL-1 (Axon Instruments,
USA). Luego con los datos de ∆Vte y ∆I, y utilizando la ley de Ohm, se calculó la
resistencia transepitelial (Rte):
Rte = ∆Vte/∆I
25
A continuación se calcularon las corrientes de cortocircuito equivalentes (Isc), definida
como la corriente que se debe inyectar al sistema para mantener la diferencia de
potencial transepitelial igual a cero. Este cálculo se realizo a partir de los valores de
resistencia y diferencia de potencial transepitelial:
Isc= Vte/R
Los cambios en Isc a consecuencia de los diferentes estímulos (∆Isc) fueron calculados
como se indica a continuación:
∆Isc inducida por cAMP: Isc después menos Isc antes de agregar IBMX /
forskolina.
∆Isc inducida por carbacol: Isc después menos Isc antes de agregar carbacol.
∆Isc inducida por UTP: Isc después menos Isc antes de agregar UTP.
26
3.2.2 Genotipificación 3.2.2.1 Extracción de DNA genómico de cola. Procedimiento :
1) Agregar 400 µl de buffer lisis a cada trozo de cola, (Tabla I).
2) Digerir toda la noche a 55 °C
3) Centrifugar 5 minutos a 14000 rpm
4) A un tubo conteniendo 800 µl de ETOH frío traspasar 320 µl de sobrenadante y
mezclar por inversión.
5) Centrifugar 5 minutos a 14000 rpm
6) Eliminar todo el líquido sobrenadante invirtiendo una vez y escurrir en una toalla
nova.
7) Dejar secar el precipitado
8) Resuspender en 100 µl de buffer TE (20 µl EDTA 0.25 M y 100 µl de Tris-HCl
500 mM en 5 ml finales)
9) Incubar 30 minutos a 55°C agitando
27
Tabla I. Buffer de lisis para extracción de DNA genómico
Tabla resumen indica las concentraciones correspondientes a cada uno de los reactivos
tanto para el formato de almacenamiento (stock) como para el formato de trabajo. De
igual manera, el resumen del protocolo de preparación para 10 y 5 ml de buffer de lisis
a partir del formato de trabajo.
Stocks Trabajo 10 mL 5 mL
Tris-HCl 500 mM 100 mM 2 ml 1ml
EDTA 0.25 M 10 mM 400 µl 200 µl
NaCl 5 M 200 mM 400 µl 200 µl
SDS 10% 0.2% 200 µl 100 µl
DOW --- --- 7 ml 3.5 ml
Proteinasa K --- --- 7.4 mg 3.7 mg
28
3.2.2.2 Reacción de la polimerasa en cadena PCR
Las reacciones de amplificación fueron llevadas a cabo mediante PCR. Se fijaron los
siguientes parámetros: un paso previo de denaturación a 94°C por 5 minutos, 35 ciclos
con una temperatura de denaturación de 94°C por 30 segundos, de alineamiento de
60°C por 30 segundos y de elongación de 72°C por 30 segundos y finalmente una
etapa de 7 minutos a 72°C.
Los partidores se muestran en la (Tabla II). Cada reacción de PCR contiene, 12,5 µl
Buffer 2X Go taq flexi (Promega), 6,5 µl de agua libre de nucleasas, 1 µl de primers
(CFTR 26, 27, 28), en un volumen total de 25 µl.
29
Tabla II. Partidores CFTR para genotipificación.
Secuencia nucleotídica correspondiente a los partidores 26, 27, 28 para CFTR
utilizados en la reacción de la polimerasa en cadena.
CFTR 26 5´ TTCAAGCCCAAGCTTTCGCGAG 3´
CFTR 27 5´ CTCCCTTCTTCTAGTCACAAGCG 3´
CFTR 28 5´ CATCTTGATAGAGCCACGGTGC 3´
30
3.2.3 RT-PCR
3.2.3.1 Aislamiento celular
Para este propósito se extrae el colon de ratón, de este los 3 cm distales serán
utilizados para obtener las células de la cripta. El colon se lava 3 veces con suero
fisiológico (NaCl 0,9 %) a 37 ºC. Luego se lava con la solución A que contiene (en mM)
7 K2SO4, 44 K2HPO4, 180 Glucosa, 10 HEPES, 10 citrato de sodio, pH 7,4, a 37 ºC. Se
ligan los extremos, con la solución A en su interior, y se sumerge en esta solución por
10 minutos a 37 ºC. A continuación se descarta el contenido apical y se reemplaza por
la solución B que contiene (en mM) 7 K2SO4, 44 K2HPO4, 180 Glucosa, 10 HEPES, 10
EDTA, 0,5 DTT, pH 7,4 y se incuba por 3 min a 37 ºC. Las células superficiales se
liberaron por un palpado manual de la porción distal del colon por aproximadamente 3
min a temperatura ambiente, la fracción obtenida se suspende en la solución A y se
mantiene a 4 ºC. Este paso se repitió 6 veces obteniendo fracciones 1 – 6. A partir de la
fracción 5 se obtienen de células de la cripta (Del Castillo & Sepulveda, 1995;Catalan et
al., 2002).
31
3.2.3.2 Reacción de polimerasa inversa acoplada a reacción de polimerasa en
cadena.
A partir de las criptas obtenidas, se procedió a aislar el RNA total utilizando la
extracción con TRIZOL (Invitrogen, USA). La reacción de polimerasa inversa se realizó
a partir de 3 µg de RNA total utilizando el Kit SuperScript II system (Invitrogen, USA),
utilizando partidores hexaméricos al azar y oligo dT bajo las condiciones establecidas
por el fabricante. Los partidores utilizados fueron para transcritos de las familias mClCA
(Tabla III), Vmd (Tabla IV), TMEM16 (Tabla V). La mezcla de reacción contiene,
alícuota de templado, 0,2 µM de cada partidor, 2.5 unidades de DNA Taq polimerasa
(Promega), 2mM dNTPs, y 1,5 mM MgCl2 en un volumen total de reacción de 25 µl. Se
fijaron los siguientes parámetros como sigue: Una denaturación inicial a 95 ºC por 2
minutos, 30 ciclos a 95 ºC por 30 segundos, alineamiento a 58 ºC por 30 segundos,
elongación a 74 ºC por 30 segundos, y un paso final de 5 minutos a 74 ºC.
Transcurrida la reacción, 10 µl del volumen total (25 µl) son cargados en un gel de
agarosa al 1% de con tampón de corrida TAE 1X para verificar amplificación.
32
Tabla III. Partidores para transcritos de la familia mCLCA.
Secuencia nucleotídica correspondiente a los partidores sentido y antisentido utilizados
en la reacción de polimerasa inversa acoplada a reacción de polimerasa en cadena
para la amplificación de los transcritos para la familia mCLCA.
Gen Partidor sentido Partidor antisentido
mClCa1 5' GTTCCACCAGGATCACTGGCACCA 3' 5' GGCAAATTGAAGTTCCACCAGAA 3'
mClCa2 5' GCTCCGCCAGCATCACAGGCAAGA 3' 5' GCGTCGATAAGGCTGCTTACATGTT 3'
mClCa3 5' CAAGCAGTGAGGTGTTCAGCAGCC 3' 5' CCTCCCCATCGGTCAGCAGCACAA 3'
mClCa4 5' CAAACAAATCCCAGACTGCGAG 3' 5' AGGGTCAGACGAGTGATGGG 3'
mClCa5 5' GTTCTCCCTCTTGCAGGCTGGTGA 3' 5' TCTGCGTCAGTGGACACGGCGGTC 3'
mClCa6 5' GCTACAGATGAAGCCCAGAACAAT 3' 5' CCTGAGATAAATGGCAGGGGCTTG 3'
33
Tabla IV. Partidores para transcritos de la familia VMD.
Secuencia nucleotídica correspondiente a los partidores sentido y antisentido utilizados
en la reacción de polimerasa inversa acoplada a reacción de polimerasa en cadena
para la amplificación de los transcritos para la familia VMD.
Gen Partidor sentido Partidor antisentido
Vmd2l1 5' AGGGTCTGCACAAGCTAGCTAG 3' 5' CATGAGGTAGGCCGTCAATTCC 3'
Vmd2l3 5' CCACCTCAAATCGCCTCATCTG 3' 5' CCTTCCGATCAGGCACGCAAAG 3'
Vmd2 5' TGGAGCCAGTACGAGAACTTGC 3' 5' GTAGGCCCAACTTCTGCAACTG 3'
34
Tabla V. Partidores para transcritos de la familia TMEM.
Secuencia nucleotídica correspondiente a los partidores sentido y antisentido utilizados
en la reacción de polimerasa inversa acoplada a reacción de polimerasa en cadena
para la amplificación de los transcritos para la familia TMEM.
Proteína Partidor sentido Partidor antisentido
TMEM16A 5' TTCGTCAATCACACGCTCTC 3' 5' CTCACGCATAAACAGCTCCA 3'
TMEM16B 5' CGGATATCCCCACTGACATC 3' 5' CTTAAGCCAGTTCCCAGCAG 3'
TMEM16CV1 5' CATCTGGTGCTGCTGTCTGT 3' 5' ATTTGTGACCCCCATTCTCA 3'
TMEM16CV2 5' ATATGGCCCTTGTGCAAATC 3' 5' CCAAGTATTTCTCTCGCCGT 3'
TMEM16D 5' CGACTTCATCCCTCGCTTAG 3' 5' TTGTCATGGCCACTCATTGT 3'
TMEM16E 5' GCCTGGCTGATACCAGATGT 3' 5' CATCCAGCCTGAAACCCAGA 3'
TMEM16F 5' CTGGGCACCCACAAGAGTAT 3' 5' TAGGAGTTCCAATGCCATCC 3'
TMEM16G 5' ATGGCTTCCTCAATTTCACG 3' 5' GTATTCCCGCTTCACCTTGA 3'
TMEM16J 5' CTTCAATGACCACAGCAGGA 3' 5' TTATGGATAGGGGCAAGCTG 3'
TMEM16H 5' CTGAAGCAGATCATCCCGTT 3' 5' GGTTAAGGCCTGTGACCTGC 3'
TMEM16K 5' CATGCACTCTTGGCTCTGAA 3' 5' GAGCTAGACCTTGGTGTGCC 3'
35
4. RESULTADOS
4.1 DESCRIPCIÓN DE LA COLONIA DE RATONES CFTR.
El uso de modelos animales modificados genéticamente ha proporcionado grandes
avances en la investigación y comprensión de enfermedades humanas como el caso
del modelo murino de CF KO para CFTR (Snouwaert et al., 1992;Delaney et al.,
1996). Su uso ha facilitado el estudio de la enfermedad, y ofrece la oportunidad de
poder realizar pruebas farmacológicas u otro tipo de terapia que permitiría modificar la
severidad de la enfermedad.
Este trabajo de tesis se realizó utilizando una colonia de ratones KO en cepa híbrida
Balb C/Black Swiss, utilizando ratones silvestres y KO para CFTR, los cuales se
clasificaron por genotípificación y sexo. De acuerdo al sexo contamos con una
proporción aproximada de 1:1 entre machos y hembras. Según la identificación
genotípica esperaríamos contar con una típica proporción 1:2:1 en la colonia, pero en
este caso la proporción CFTR KO está muy por debajo de los silvestres (Tabla VI).
Como se mencionó en la introducción, la CF es una enfermedad multisistémica, siendo
uno de los órganos afectados el intestino, cuyo fenotipo clínico es la obstrucción
intestinal (Russo et al., 2003). Como ha sido previamente demostrado en estos modelos
animales, una gran cantidad de crías CF mueren siendo neonatos y luego son
canibalizados por las madres (Grubb & Boucher, 1999) lo que impide su identificación y
puede explicar el bajo número de CFTR KO obtenidos.
36
Tabla VI. Colonia de ratones CFTR.
Resumen de la cantidad de ejemplares disponibles de acuerdo al sexo (M) masculino,
(F) femenino y clasificación de la colonia de acuerdo a genotipificación en donde se
muestra porcentajes de (+/+) homocigoto o silvestre, (+/-) heterocigoto, (-/-) CFTR KO.
+/+ +/- -/- Total
M 38 46 6 90
F 34 58 9 101
Total 72 104 15 191
% 38 54 8 100
37
Además un número importante de crías CFTR KO muere por este tipo de
complicaciones intestinales antes del destete y después del destete, debido al consumo
de alimento sólido, lo cual dificulta aún más su tránsito (Grubb & Boucher, 1999).
Con el fin de obtener una estadística y un seguimiento de la colonia se realizó una
curva de sobrevida para ratones silvestres y KO para CFTR (Figura 3). En nuestro caso
los ratones, no importando el genotipo, son destetados a los 21 días, luego disponen de
una dieta normal de comida y agua. Se hizo un seguimiento durante 60 días,
registrando una mortalidad de aproximadamente un 40 % a la fecha del destete y al
final del monitoreo alcanzó aproximadamente un 80 % para el caso de los animales KO
para CFTR. En los animales silvestre y heterocigotos no se registraron muertes.
La creación de un modelo en ratón modificado genéticamente que tiene la proteína
CFTR no funcional desarrolla un fenotipo muy similar al ileo meconial y al síndrome
obstructivo intestinal distal (Canale-Zambrano et al., 2007). Histológicamente, la
mayoría de estos ratones sufren de hiperplasia de las células caliciformes, acumulación
de mucus y dilatación y elongación de las criptas (Greger, 2000). En adición al fenotipo
que reflejan los ratones CF, en parte relaciona este defecto intestinal con un bajo peso
corporal. En pacientes CF esto está dado por una serie de factores, incluyendo el nivel
nutricional y entorno, así como una mala absorción de grasas. La causa del bajo peso
corporal de los ratones CF es desconocida, pero estudios lo relacionan con una mala
absorción de grasas, posiblemente por una alteración en el pH intestinal , así como
también ha sido reportada la presencia de bacterias intestinales las cuales estarían
afectando el crecimiento de los ratones con CF (Canale-Zambrano et al., 2007).
38
Figura 3. Curva de sobrevida de ratones CFTR. Se presenta una curva de sobrevida
en el tiempo (días) de los ratones control (CFTR silvestre) y KO para CFTR.
39
En conjunto al monitoreo de la sobrevida realizado a la colonia, se registró el peso
corporal en el tiempo graficado en la figura 4. Básicamente de este ensayo logramos
identificar y clasificar nuestra colonia en tres tipos, CFTR silvestre, CFTR KO tipo I,
CFTR KO tipo II, esto en base a las diferencias en la ganancia de peso corporal al paso
del tiempo.
Lo que pudimos observar es que durante el primer periodo de alimentación,
correspondiente a los primeros 21 días de nacidos, en el cual su dieta se basa
solamente en leche materna, existían dos grupos de ejemplares, diferentes en cuanto al
promedio del peso corporal, pero semejantes en cuanto a la ganancia de este hasta la
fecha del destete (0,48 gr/día; 0,59 gr/día; 0,55 gr/día). Una vez que se realiza el
destete, la dieta se basa en alimentación sólida y es en esta etapa en donde podemos
observar mayores diferencias. Por ejemplo, el grupo que presentó un mayor promedio
de peso durante los primeros 21 días se disgregó en dos grupos más, uno que
continuo aumentando de peso normalmente (0,44 gr/día), el que se clasificó como
CFTR silvestre y un segundo grupo que mostró una disminución de peso corporal,
posiblemente por una adaptación al cambio de alimentación, con una posterior
recuperación y un continuo aumento de peso corporal (0,38 gr/día), clasificándose
como CFTR KO tipo I.
Con respecto al grupo que presentó un menor promedio de peso corporal en la primera
etapa de la alimentación, tras el cambio al alimento sólido observamos una continua
pérdida de peso hasta el punto de causar la muerte (-0,21 grs/día), este grupo fue
clasificado como CFTR KO tipo II. Esto nos da cuenta de las variaciones fenotípicas
que pueden existir debido a un defecto debido a una mutación determinada,
40
Figura 4. Peso corporal de ratones CFTR. Gráfica del peso (en gramos) en el tiempo
(días) para ratones silvestres (+/+) y KO para CFTR (tipo I y II). Línea punteada marca
día 21, donde se produce el destete. La pendiente de cada recta determina el promedio
de ganancia de peso por día para los ratones silvestres, CFTR tipo I y CFTR tipo II
antes del destete (0,48 gr/día; 0,59 gr/día; 0,55 gr/día) respectivamente y después del
destete (0,44 gr/día, 0,38 gr/día, -0,21 grs/día).
CFTR (silvestre) CFTR tipo I
CFTR tipo II
41
Esto coincide con estudios clínicos que han establecido que el curso de la CF es
altamente variable, las enfermedades intestinales causadas por esta están
determinadas en parte por la naturaleza de la mutación de CFTR (Canale-Zambrano et
al., 2007).
42
4.2 EFECTO DE AGONISTAS DE CALCIO INTRACELULAR SOBRE LA
DIFERENCIA DE POTENCIAL TRANSEPITELIAL Y LA CORRIENTE DE
CORTOCIRCUITO EN COLON DISTAL DE RATONES SILVESTRES.
4.2.1 EFECTO DE CARBACOL SOBRE Vte Y Isc.
En la figura 5, se presenta un registro representativo de Vte del segmento distal de colon
de ratón silvestre. El Vte inicial, que es la diferencia de potencial transepitelial referido
al lado basolateral de la preparación, es de – 5 ± 0,7 mV. Para el caso de la resistencia
transepitelial se observó un registro cercano a 77 ± 3 Ohm cm2 (promedio ± error
estándar, n=16)
En primer lugar se realiza un tratamiento con indometacina (2 µM, bilateral) por
aproximadamente 20 minutos, para Inhibir la actividad de la enzima ciclooxigenasa así
impidiendo la formación de precursores de prostaglandinas producto de la manipulación
del tejido. De esta forma disminuye la formación de cAMP estimulada por
prostaglandinas que podría interferir en la activación de manera no predecible de la
secreción de cloruro vía este segundo mensajero (Carew & Thorn, 2000). Luego a esto
se adiciona en forma conjunta amilorida más TTX. La adición de amilorida (10 µM) por
el lado apical del tejido provocó una deflexión en dirección positiva del Vte. Esto es
consistente con una inhibición de las corrientes de sodio absortivas, como
consecuencia de la acción de la amilorida sobre la actividad del canal de sodio ENaC
presente en la membrana apical de las células superficiales de este epitelio.
43
Figura 5. Secreción aniónica en colon distal de ratón silvestre. La figura muestra
un registro continuo de Vte obtenido de un experimento en la cámara de Ussing. Al
aumentar el cAMP tisular (IBMX 100µM + forskolina1µM) se produce un cambio
negativo de Vte consistente con secreción de cloruro. Este proceso es revertido al
utilizar el inhibidor del canal de potasio KCNQ1/KCNE3, cromanol 293 (10µM) por el
lado basolateral (bl). La aplicación de carbacol (100µM) produce una deflexión negativa
de Vte consistente con secreción de de cloruro. La adición de amilorida (10µM) apical
(ap) al inicio del experimento evidencia la existencia de absorción de sodio por canales
ENaC. Todos los experimentos fueron realizados en presencia de indometacina (2µM)
y TTX (4µM).
5 min-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0 Carbacol (bl)
IBMX/Forskolina (bl)
Cromanol 293 (bl)
Amilorida(ap)
44
Por otro lado, la adición de (TTX, 4µM) por el lado basolateral tiene como objetivo
bloquear la actividad espontánea de neuronas subepiteliales. En el ratón muchas
neuronas entéricas están localizadas a micrómetros de la superficie serosa del intestino
(Bjerknes & Cheng, 2001) y podrían liberar mediadores de la secreción. Luego, se
procedió a agregar por el lado basolateral del epitelio IBMX (100 µM) más forskolina (1
µM) con el fin de elevar las concentraciones de cAMP intracelular mediante el efecto
inhibitorio de fosfodiesterasas por IBMX y la activación de adenilato ciclasa por
forskolina. Se sabe que este aumento de cAMP produce la activación de canales de
cloruro CFTR apicales y canales KCNQ1/KCNE3 de potasio basolaterales, lo que lleva
a una secreción neta de cloruro. El efecto hiperpolarizante de la adición de
IBMX/forskolina es consistente con este proceso secretorio electrogénico. La
participación de los canales basolaterales de potasio KCNQ1/KCNE3 en la secreción de
cloruro se exploró agregando al lado basolateral su inhibidor específico cromanol 293 B
(10 µM). La adición del inhibidor abolió la hiperpolarización estimulada por
IBMX/forskolina, confirmando que estos canales son centrales en este proceso (Diener
et al., 1996).
Como se mencionó en la introducción, los receptores muscarínicos en el epitelio
colónico, una vez siendo activados, pueden provocar un aumento en la concentración
del calcio intracelular. Esto tiene como consecuencia una secreción aniónica
dependiente de calcio. Para causar este efecto nos ayudamos del agonista de
receptores muscarínicos carbacol (100 µM) (Haberberger et al., 2006). Como es posible
observar, la adición de carbacol al lado basolateral del tejido indujo un cambio negativo
del Vte consistente con la secreción aniónica.
45
Con el fin de descartar una posible desensibilización de los receptores muscarínicos o
vaciamiento de los almacenes intracelulares de calcio, se realizaron dos adiciones
consecutivas de carbacol (100 µM) separadas por un lavado posterior a la primera
adición, (figura 6A). Como resultado se pudo observar que la adición de carbacol por el
lado basolateral del tejido indujo un cambio negativo reproducible de Vte. En la figura
6B, se muestra las corrientes de cortocircuito calculadas, que corresponden a corrientes
negativas, inducida por carbacol, donde la diferencia es no significativa (-80 ± 28 µA cm-
2 y -71 ± 28 µA cm-2 para el estímulo I y II respectivamente).
46
Figura 6. Efecto de carbacol sobre la secreción de cloruro en colon de ratón silvestre. En la figura A después de aplicar IBMX/forskolina e inhibir la secreción de
cloruro inducida por cAMP con cromanol 293 basolateral, se estimuló el tejido con
carbacol. La adición consecutiva produjo una secreción aniónica de manera
reproducible. Esto en presencia de amilorida y TTX. En B se resumen las corrientes de
cortocircuito calculadas para las corrientes de cloruro activadas por carbacol. valores
son promedio ± error estándar significativa (-80 ± 28 µA cm-2 y -71 ± 28 µA cm-2 para el
estímulo I y II respectivamente), con un n=3.
-120
-100
-80
-60
-40
-20
0
Is
c (c
m-2
)
Carbacol Basolateral
I II
-14
-12
-10
-8
-6
-4
Vte
( m
V)
5 min
Carbacol (bl)A
B
5 min
47
Las herramientas farmacológicas son muy útiles en el estudio de canales iónicos, por lo
cual hemos querido hacer uso de éstas para nuestro propósito. El NFA es un agente
antiinflamatório no esteroidal y es considerado un bloqueador específico que ha sido
utilizado para identificar corrientes aniónicas como los CaCCs en diferentes tejidos,
tales como células endoteliales de arteria pulmonar de rata (Kato et al., 1999), células
epiteliales de la vía aérea de ratón (Gabriel et al., 2000b) y ovocito de Xenopus (White
& Aylwin, 1990). Como ya se mencionó, el NFA es un bloqueador de los CaCCs. Existe
evidencia que lo vinculan con una posible interacción con el canal CFTR, por ejemplo,
como antiinflamatorio no esteroidal funciona inhibiendo la enzima ciclooxigenasa 2
para prevenir la formación de prostaglandinas, por lo que se ve disminuida la formación
de cAMP. Por otro lado la estructura química del NFA está cercanamente relacionada al
agente inhibidor de CFTR arylaminobenzoato difeniyl-amino-2-carboxylato (DPC). En
base a estos datos se realizó el experimento de la figura 7 con el objeto de verificar si
existe alguna relación entre la función del NFA y el canal CFTR que pudiera interferir en
la identificación de una conductancia al cloruro dependiente de calcio intracelular (Scott-
Ward et al., 2004).
48
Figura 7. Interacción de NFA con el canal CFTR en colon de ratón silvestre. En la
figura A, luego de la activación de la secreción de cloruro inducida por IBMX/forskolina
se procedió a agregar en forma consecutiva NFA hasta alcanzar una concentración de
600 µM, no presentando ningún cambio en el Vte. En B se resumen las corrientes de
cortocircuito calculadas para las 4 aplicaciones de NFA. (Forskolina + IBMX -138 ± 22
µA cm-2), NFA (153 ± 34 µA cm-2, 150 ± 36 µA cm-2, 143 ± 35 µA cm-2, 130 ± 25 µA cm-2
para 150, 300, 450 y 600 µM respectivamente. Valores son promedio ± error estándar,
con un n=3.
µM µM
µM
µM
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0V
te (
mV
)
5 min
-200
-150
-100
-50
0
50
Is
c (c
m-2
)
Ac. Niflúmico
600450
300150
IBMX + Forskolina (bl)
µM Ac. Niflúmico (ap) 150
µM
µM
µM
293 B
150
150
150
A
B
IBMX/Forskolina IBMX/Forskolina + NFA
NFA (ap)
NFA
49
En la figura 7A, se presenta un registro de Vte, en el cual, seguida la adición de
amilorida (10 µM apical) se procedió a agregar por el lado basolateral del epitelio
(IBMX, 100 µM) más forskolina (1 µM) con el fin de elevar las concentraciones de cAMP
intracelular. Una vez activada esta corriente de cloruro se procedió a agregar NFA a
concentraciones crecientes (150 µM - 600 µM) por el lado mucoso del epitelio. Esta
maniobra no produjo cambios en el Vte, sugiriendo de que el NFA no interfiere en la
corriente de cloruro activada por aumento en el cAMP intracelular. En la figura 7B, se
muestra los cálculos de la corriente de corto circuito para la activación de la corriente
de cloruro por forskolina + IBMX (-138 ± 22 µA cm-2) y para las distintas
concentraciones de NFA (150 µM, 300 µM, 450 µM, 600 µM) que fueron 153 ± 34 µA
cm-2, 150 ± 36 µA cm-2, 143 ± 35 µA cm-2, 130 ± 25 µA cm-2 respectivamente.
Según los resultados obtenidos anteriormente en la figura 6, en la cual se demostró que
bajo estímulos consecutivos al epitelio con carbacol no se observaba una
desensibilización de la secreción aniónica, y en la figura 7 en la cual se mostró que el,
NFA, no tenía efecto sobre la corriente de cloruro activada por el aumento de cAMP
intracelular, quisimos probar el efecto del NFA sobre el estimulo inducido por carbacol al
epitelio.
50
La figura 8A, muestro el registro de Vte , el que se obtuvo siguiendo el protocolo
realizado en la figura 6, luego de la primera aplicación de carbacol basolateral para
aumentar el calcio intracelular y el posterior lavado del compartimiento basolateral para
volver a alcanzar el estado basal de Vte, se procedió a adicionar NFA (150 µM, en
ninguno de os experimentos mostro cambios en el Vte), al cabo de unos minutos se
adicionó nuevamente carbacol basolateral. Como se puede apreciar no hubo cambio en
el efecto carbacol manteniendose el mismo cambio negativo característico del Vte. La
corriente de cortocircuito de la figura 8B muestra de igual manera que no se produjo
cambio en la corriente negativa antes y después del tratamiento con NFA (-73 ± 24 µA
cm-2 y -81 ± 21 µA cm-2 respectivamente).
51
Figura 8. Efecto del NFA sobre la secreción de cloruro inducida por carbacol en
colon de ratón silvestre. En la figura A después de aplicar el primer estímulo con
carbacol se adicionó el inhibidor NFA seguido de un segundo estímulo con carbacol, no
observando ningún cambio en el Vte. En B resumen de las corrientes de cortocircuito
calculadas para los dos estímulos con carbacol (-73 ± 24 µA cm-2 y -81 ± 21 µA cm-2
para I yII respectivamente),valores son promedio ± error estándar, con un n=3.
-14
-12
-10
-8
-6
-4
Vte
( m
V)
Is
c (c
m-2
)
-120-100
-80-60-40-20
020
Carbacol Basolateral
NFA 150
Carbacol (bl) Carbacol (bl)
NFA (ap)
5 min
Carbacol NFA + Carbacol
52
4.2.2 EFECTO DEL UTP SOBRE Vte Y Isc.
El efecto de los agonistas purinergicos como el ATP o UTP producen una rápida
acumulación de inositol fosfato en células epiteliales de las vías respiratorias de los
seres humanos, siendo UTP el agonista más potente (Brown et al., 1991). El efecto de
estos agonistas se debe a su interacción con los receptores purinergicos (P2). En
mamíferos los receptores P2 se subdividen en P2X y P2Y. Este último se expresa en
tejidos epiteliales, siendo los receptores P2Y2 y P2Y4 los responsable de la interacción
con el agonista UTP (Matos et al., 2005).
Existe evidencia de que pone de manifiesto la interacción del agonista UTP con el
receptor P2Y2 provoca la activación de conductancias de cloruro dependientes de
calcio intracelular en el epitelio de la vía respiratoria (Paradiso et al., 2001).
En el epitelio intestinal se ha demostrado la expresión del receptor P2Y4 y siguiendo los
antecedentes recopilados se utilizó el agonista purinergico UTP para provocar una
activación de la conductancia de cloruro dependiente del aumento de calcio intracelular.
Los resultados de las figura 9A muestran el comportamiento del Vte bajo el estímulo del
UTP. La figura 9B muestra un experimento semejante pero en un tejido previamente
tratado con NFA. En ambos casos hay una pequeña deflexión negativa en el Vte
consistente con una secreción aniónica. El resumen de la corriente de cortocircuito,
(figura 9C), mostró para ambos casos un pequeña corriente negativa no registrando
diferencias para el tratamiento sólo con UTP (-5 ± 1 µA cm-2) o habiendo incubado con
NFA (-5 ± 1 µA cm-2).
53
Figura 9. Efecto de UTP sobre la secreción de cloruro en colon de ratón
silvestre.. En la figura A registro del Vte después de aplicar UTP basolateral. En B se
aplicó NFA apical previo al estímulo con UTP no mostrando diferencias en el Vte. En C
resumen de las corrientes de cortocircuito calculadas para los dos estímulos con UTP,
(-5 ± 1 µA cm-2) o (-5 ± 1 µA cm-2) para I y II respectivamente, valores son promedio ±
error estándar, con un n=3.
Vte
( m
V)
2 min-2
-1
0
1 UTP (bl)
NFA (ap)
-8
-6
-4
-2
0
2
Is
c (c
m-2
)
UTP Basolateral
III
Vte
( m
V)
-2
-1
0
1
2 min
UTP (bl)
UTP NFA + UTP
54
4.3 EFECTO DE AGONISTAS DE CALCIO INTRACELULAR SOBRE LA
DIFERENCIA DE POTENCIAL TRANSEPITELIAL Y LA CORRIENTE DE
CORTOCIRCUITO EN COLON DISTAL DE RATONES KO PARA CFTR.
4.3.1 EFECTO DE CARBACOL SOBRE Vte Y Isc.
Los experimentos anteriormente realizados mostraron la acción de del agonista
muscarínico carbacol sobre el epitelio colónico de ratones silvestre. En la figura 10 se
sigue el protocolo establecido en la figura 5, para comparar las respuestas secretorias
del tejido epitelial del colon de ratones silvestres y ratones KO para CFTR. La figura
10A muestra un registro representativo de Vte del segmento distal de colon de ratón
silvestre. Cuando se repitió este experimento utilizando tejido de colon de animales KO
para CFTR (figura 10B), la aplicación de IBMX/forskolina para aumentar el cAMP tisular
y el bloqueo de la secreción aniónica con cromanol 293 B no produjo ningún cambio en
el Vte, lo cual es consistente con la ausencia de la conductancia de cloruro dependiente
de CFTR. Luego se procedió a estimular el tejido con carbacol basolateral. A diferencia
del colon de animal silvestre, en este tejido se observó una total ausencia del cambio de
Vte negativo (secreción aniónica) y en su lugar aparece un transitorio cambio positivo de
la Vte. Este cambio positivo en Vte corresponde a una corriente secretoria de potasio.
55
Figura 10. Secreción de cloruro inducida por carbacol en colon distal de ratón silvestre y KO para CFTR. En la figura A y B se muestran registros de Vte en colon de
ratón silvestre y KO para CFTR respectivamente, mostrando en B la ausencia de
secreción de cloruro y la presencia de secreción de potasio. En C se resumen las
corrientes de cortocircuito calculada para la aplicación IBMX/forskolina y carbacol en
tejido de animales silvestre y KO para CFTR. Valores (detallados en pag. 56) son
promedio ± error estándar, n=3 para cada grupo.
Is
c (c
m-2
)
IBMX/Forscolina Carbacol
-150
-100
-50
0
50
100
-15
-11
-7
-3
1V
te (
mV
)
5 min
Carbacol (bl)
IBMX / Forskolina (bl)
Cromanol 293 B (bl)
-10
-6
-2
2
6
Vte
( m
V)
5 min
Carbacol (bl)
IBMX / Forskolina (bl)
Cromanol 293 B (bl)
Silvestre (WT) Knockout (KO)
56
En la figura 10C se resumen las diferencias de la corriente de cortocircuito calculadas
donde se puede observar que la secreción de cloruro es activada por IBMX/forskolina
en animales silvestre (-105 ± 32 µA cm-2) y en el caso de los animales KO no se registra
activación (0 ± 0 µA cm-2). Para el caso de la activación de la secreción aniónica con
carbacol, los animales silvestre mostraron una robusta secreción de cloruro (-114 ±
30 µA cm-2), a diferencia de los animales KO, los cuales mostraron corrientes positivas
asociadas a secreción de potasio (44 ± 20 µA cm-2).
57
4.3.2 EFECTO DEL UTP SOBRE Vte Y Isc.
Como en todos los demás ensayos el tejido epitelial se trató previamente con
(amilorida, indometacina, TTX), con el fin de proporcionar los mismas condiciones
experimentales. En la figura 11 se presentan los resultados de este experimento. En
primer lugar, la figura 11A muestra el efecto del UTP por el lado basolateral del tejido
epitelial silvestre. Se aprecia un pequeño cambio negativo en el Vte, lo que es
consistente con una secreción aniónica.
La figura 11B, se procedió a repetir el mismo procedimiento descrita en la figura 9A
pero en epitelio de ratones KO para el canal CFTR. Como se puede apreciar no existe
ninguna variación en el Vte una vez que se adicionó el agonista purinérgico. El resumen
de las diferencias de corriente de cortocircuito calculadas de la figura 11C muestra, en
los animales silvestre, una pequeña corriente negativa debido al estímulo con UTP (-5 ±
1 µA cm-2), en el caso de los animales KO no se registraron corrientes posterior al
estímulo (0 ± 0 µA cm-2).
58
Figura 11. Efecto de UTP en la secreción de cloruro en colon de ratón silvestre y KO para CFTR. En A y B se muestra el registro de Vte en colon silvestre y KO para
CFTR respectivamente, en tejidos tratados previamente con indometacina, amilorida,
TTX, que fueron estimulados con UTP. En C se resumen las corrientes de cortocircuito
calculadas para las corrientes de cloruro. Valores (detallados en la pag. Anterior) son
promedio ± error estándar, n=3 para cada grupo.
Vte
( m
V)
-3
-2
-1
0
1
2
2 min
UTP (bl)V
te (
mV
)
-2
-1
0
1
2 min
UTP (bl)
Is
c (c
m-2
)
UTP Basolateral
-8
-6
-4
-2
0
2
silvestre Knockout (KO)
59
4.4 IDENTIDAD MOLECULAR DE LOS POSIBLES CANDIDATOS RESPONSABLES
DE LA SECRECIÓN DE CLORURO ACTIVADA POR CALCIO INTRACELULAR.
Como se mencionó anteriormente, la conductancia al cloruro activada por calcio ha sido
caracterizada fisiológicamente en varios tipos celulares incluyendo epitelios, poco es lo
que se conoce acerca de la identidad molecular de estos canales. La potencial ventaja
de esta identificación incluye, entre otras, el estudio del rol fisiológico y patofisiológico,
un estudio en detalle de la función estructural y una identificación de potenciales
inhibidores específicos. Al menos tres proteínas han sido propuestas como candidatos
moleculares homólogos de CaCCs:
La familia de genes CLCA es una familia heterogénea de multigenes con patrones de
expresión específicos del tipo celular, diversidad de procesamientos y estructuras
proteicas en los diferentes miembros de la familia (Loewen & Forsyth, 2005).
La evidencia que la familia CLCA se postule como candidato proviene de las
expresiones heterólogas de un número de isoformas de CLCA en sistemas celulares,
registrando el primer clonamiento en el año 1995 desde una genoteca traqueal de
bovino, mostrando como resultados conductancias activadas por calcio, y estas a su
vez sensibilidad a bloqueadores de canales de cloruro como por ejemplo en NFA
(Cunningham et al., 1995;Gruber et al., 1998a).
A la fecha, la familia CLCA comprende 18 miembros conocidos de los cuales 6 están
presentes en el ratón (mCLCA) (Bothe et al., 2008).
60
Existe un segundo candidato al cual se le atribuye la responsabilidad de activar
conductancias de cloruro dependientes de calcio, denominado Bestrofinas, una proteína
involucrada en la enfermedad macular viteliforme (VMD). En contraste a otros
candidatos moleculares, no existe un conocimiento detallado sobre las propiedades
biofísicas ni se dispone de su estructura molecular.
Las Bestrofinas parecen comportarse como canales de cloruro en sistemas de
expresión heteróloga. Así, las de varias especies forman canales que se activan en
EC50 de calcio de 200 nM (Tsunenari et al., 2003;Qu et al., 2003a). La evidencia más
convincente de que las bestrofinas son efectivamente canales de cloruro proviene de
experimentos de mutagénesis sitio-dirigidas que demuestran una alteración de la
selectividad y la conductancia de los canales asociados a la expresión de mBest-2 (Qu
et al., 2004;Qu & Hartzell, 2004).
Recientemente, ha sido propuesta la familia de proteínas de membrana
Anoctamina/TMEM16 como canales de cloruro activados por calcio, donde al menos
tres publicaciones reportan a la proteína TMEM16A como un buen candidato (Yang et
al., 2008;Schroeder et al., 2008a;Caputo et al., 2008b). Yang y colaboradores
describieron una proteína con 8 segmentos de transmembrana, la cual co-expresada
con receptor de endotelina A en células HEK293, obtuvo una corriente típicamente
selectiva de canales de cloruro activados por calcio, la cual fue inhibida por
bloqueadores de canales de cloruro, como NFA.
61
El silenciamiento por siRNA o sobreexpresión por transfección del cDNA de la proteína
TMEM16A, demostró una disminución y aumento, respectivamente, de la corriente de
membrana, encontrando que esta propiedad biofísica se asemeja a la clásica corriente
de cloruro activada por calcio en varios tipos celulares (Caputo et al., 2008b).
De acuerdo a esta información, se procedió a identificar los distintos transcritos
correspondientes a la familia CLCA, Bestrofinas y TMEM16 en el epitelio colónico de
ratón. Los resultados obtenidos mostraron para el caso de la familia CLCA los
transcritos correspondientes a mCLCA1, mCLCA2, mCLCA3, mCLCA4 y mCLCA6
(figura 12). La figura 12 muestra la expresión de los transcritos correspondientes a la
familia de las Bestrofinas, en donde se aprecia la expresión de Vmd2, Vmd2/1 y
Vmd2/3. En el caso de la familia de los TMEM16, se determinó la expresión de siete
transcritos, TMEMs A, B, E, F, G, J y K (figura 13).
62
Figura 12. Detección por RT-PCR del mRNA para los miembros de la familia
mCLCA y VMD en tejido de colon distal. Se utilizaron los partidores específicos
detallados en la table III para familia mCLCA y IV para familia VMD. Ladder
corresponde a 1-kb, luego mCLCA1 (606 bp), mCLCA2 (855 bp), mCLCA3 (699 bp),
mCLCA4 (290 bp), mCLCA5 (263 bp), mCLCA6 (221 bp), Vm2/1 (249 bp), Vm2/3 (249
bp), Vm2 (249 bp).
75050 500
250
75050 500
250
63
Figura 13. Detección por RT-PCR del mRNA para los miembros de la familia
TMEM16 en tejido colónico. Se utilizaron los partidores específicos detallados en la
table V. Ladder corresponde a 1-kb, luego TMEM16A (324 bp), TMEM16B (330 bp),
TMEM16C1 (341 bp), TMEM16C2 (320 bp), TMEM16D (493 bp), TMEM16E (226 bp),
TMEM16F (380 bp), 1-kB ladder, TMEM16G (248 bp), TMEM16H (296 bp), TMEM16J
(374 bp), and TMEM16K (329 bp). Control de los experimentos se llevaron a
cabo utilizando muestras de cerebro y de epitelio olfativo para comprobar la habilidad
de los partidores de amplificar el producto esperado.
Ladder
250 pb
500 pb
TMEM16
64
5. DISCUSIÓN
El colon de mamífero interviene en diversos procesos homeostáticos, tales como el
balance hidrosalino, la osmorregulación y la regulación del volumen plasmático. Para
éstas funciones fisiológicas el epitelio colónico cuenta con la maquinaria celular
necesaria para absorber y secretar electrolitos. Sus células, polarizadas, disponen de
canales iónicos y diversos tipos de bombas e intercambiadores ubicados
estratégicamente en los dominios apical y basolateral. Defectos en la regulación de sus
funciones puede producir estados patológicos como diarrea, estreñimiento o
enfermedades, como la CF (mutaciones en canal CFTR) (Grubb & Gabriel,
1997;Kunzelmann & Mall, 2002).
La alteración del tracto gastrointestinal debido a la CF transforma la superficie epitelial.
El déficit de la secreción produce una insuficiente hidratación apical que favorece la
formación de un contenido mucoso viscoso, lo que como consecuencia puede generar
una severa obstrucción intestinal (Greger, 2000;Brouillard et al., 2005). Estas
obstrucciones intestinales se presentan en aproximadamente un 15 – 20% de los
pacientes recién nacidos y en un 25% de los pacientes adultos con CF (Canale-
Zambrano et al., 2007).
Obstrucción intestinal con resultado de muerte es característica que se observa en los
ratones con mutación en CFTR. En muchos casos, la caracterización de ratones
mutantes para CFTR han revelado anormales perfiles electrofisiológicos (Donald J.
Davidson et al., 2001)
65
En nuestro trabajo el uso de uno de estos modelos nos muestra la severidad con la
que se presenta la CF. De acuerdo a lo observado durante el análisis de la sobrevida
realizado a nuestra colonia de ratones (figura 3), un gran porcentaje de los ratones
CFTR KO murieron entre los 10 y los 30 días de edad, donde aproximadamente un
40% de los ejemplares CFTR KO murieron antes de producirse el destete (día 21),
manifestando a temprana edad complicaciones en el sistema digestivo, pese a basar su
alimentación en una dieta líquida. Posteriormente al periodo de destete se vuelven a
registrar decesos en aproximadamente un 40% para estos mismos ejemplares.
Estos datos nos indican tanto la corta sobrevida como la severidad de las deficiencias
sistémicas ocasionadas por la CF, entre las cuales, la obstrucción intestinal tiene la
principal participación en la causa de muerte, sin importar el tipo de alimentación que
estos reciban.
Por otro lado, un pequeño porcentaje de los ratones CFTR KO (20% aproximadamente)
mostraron una sobrevida por un periodo superior a los 60 días después de nacidos.
Esta información nos indica que pese a que estos animales poseen una alteración
genotípica potencialmente letal, presentan factores desconocidos que logran en algún
grado compensar este defecto.
Un fenotipo adicional de CF se observó en esta colonia de ratones, el cual involucra el
defecto intestinal, este es el bajo peso corporal en comparación a la población CFTR
nativa (figura 4). Estudios clínicos relacionan el porcentaje ideal del peso corporal con
un pronóstico de aumento de sobrevida para los pacientes con CF.
66
Al analizar en conjunto el peso corporal con la sobrevida de estos ejemplares,
obtuvimos datos que nos permitieron diferenciar dentro de la colonia ratones silvestres
de los CFTR KO, siendo este último grupo los que además mostraron diferentes
características entre sí.
Durante la evaluación pudimos notar que en el periodo previo al destete la totalidad de
los ratones observados tenían una respuesta normal con respecto al aumento del peso
corporal, no obstante, se logró percibir diferencias en el peso entre los ejemplares
CFTR KO, mostrando algunos pesos similares al de los silvestres, mientras otros un
peso notoriamente menor, proporcionando la idea de una condición fisiológica
aparentemente normal.
Sin embargo la respuesta al aumento de peso corporal posterior al paso de una
alimentación líquida a una alimentación sólida se vio drásticamente afectada, estos
resultados nos permitieron clasificar en tres distintos tipos nuestra colonia, en donde los
animales silvestres continuaron con una esperada respuesta de aumento de peso
corporal. En cuanto a los ejemplares que mostraron un pequeño tamaño corporal desde
un comienzo, manifestaron grandes complicaciones para aumentar su peso corporal en
esta segunda etapa dietética (CFTR KO tipo II), no logrando revertir la situación,
llevándolos finalmente a la muerte, esto producto de la grave obstrucción intestinal.
A la luz de estos resultados podemos sugerir que una causa adicional de esta
deficiencia en la ganancia de peso corporal se trate de un problema de mala absorción
como consecuencia de la obstrucción intestinal, lo cual se correlaciona con los datos
obtenidos por (Rozmahel et al., 1996) Rozmahel et al., 1996, donde se menciona que
el incremento de células goblet, en ratones con CF, producen y secretan cantidades
67
alteradas de mucus hacia el lumen intestinal, lo cual puede influir en el peso corporal a
través de la creación de una barrera física extra para la absorción de nutrientes.
Estudios adicionales con respecto a la sobrevida de estos ratones CFTR KO podrían
proporcionar nueva información. Tal vez modificando su dieta posterior al periodo de
destete y basándola en una dieta líquida, se podría reducir la incidencia de esta letal
complicación intestinal.
Con respecto al tercer grupo de ejemplares, los CFTR KO tipo I, manifestaron un
fenotipo distinto al CFTR KO tipo II. Observamos una respuesta fisiológica totalmente
diferente (figura 4), muy similar a los ejemplares silvestre en cuanto a lograr ganar peso
corporal en el tiempo así como al tiempo de sobrevida, pese a los cambios en el tipo de
alimentación. Sin embargo los días iniciales sometidos a la dieta sólida provocaron una
disminución de su peso, lo cual lograron superar aparentemente tras un periodo de
adaptación.
Una inhabilidad por parte del ratón CFTR KO tipo II de eliminar la obstrucción posterior
al destete puede dar cuenta de sus niveles de mortalidad. Por otro lado, la posible
habilidad de los ratones CFTR KO tipo I de eliminar esta obstrucción en momentos
críticos pueda explicar su prolongada sobrevida.
En primer lugar esto nos refleja que la CF puede ocurrir con grados de agresividad que
van desde la sintomatología leve hasta la letalidad temprana, de acuerdo a esto
podríamos estar ante la posible presencia de ciertos factores que ayudarían a
compensar esta deficiencia.
68
La pérdida de la funcionalidad del canal CFTR debido a mutaciones ha llevado a
indagar en vías alternativas las cuales permitirían mejorar el fenotipo clínico presente en
pacientes con CF. Una compensación para el anormal transporte iónico en este
periodo quizás puede proporcionar una explicación para este estado, pero el factor
modulador que confiere este leve fenotipo aún no han sido identificado.
Estudios electrofisiológicos han señalado que la protección de estos ratones, de
severas patologías intestinales, puede estar relacionada con el aumento de la expresión
o actividad localizada apicalmente en este tejido, de una conductancia de cloruro
activada por calcio, en donde se utilizaron animales modificados genéticamente, como
es el caso de ratones KO para CFTR así como también en humanos (Wilschanski et al.,
1996;Rozmahel et al., 1996;Bronsveld et al., 2000). La localización apical de esta
conductancia sugiere que podrían cumplir una función protectora, a través de la
modulación de la composición del fluido mucoso.
La existencia de evidencias tanto a favor como en contra permite que aún persista la
controversia con respecto a la participación de otros canales en la secreción de cloruro
en el epitelio intestinal. Es así como autores sostienen que la activación de la secreción
de cloruro dependiente del aumento de calcio intracelular necesita la activación del
canal CFTR en la membrana apical (Grubb & Gabriel, 1997;Mall et al., 1998;Flores et
al., 2007), esto en rata y ratón, así como también de la actividad de canales de potasio
basolaterales dependientes de calcio (Strabel & Diener, 1995).
69
El objetivo que se perseguía en este estudio era lograr identificar una conductancia al
cloruro activada por calcio en epitelio intestinal silvestre de ratón, la cual actuaría como
vía alternativa a la salida de cloruro de las células secretoras intestinales en la CF.
Para poder identificar esta conductancia al cloruro dependiente del aumento de calcio
intracelular utilizamos fármacos que se conoce puede activar este tipo de canales,
como es el caso del agonista muscarínico carbacol y el agonista purinérgico UTP. En
nuestros experimentos el estímulo producido por carbacol en epitelio de ratones
silvestre, demostró una activación de secreción aniónica (figura 5) al igual que lo
obtenido al estimular el epitelio con UTP (figura 9). Datos insuficientes para atribuirlos a
un canal de cloruro activado por calcio.
Debemos tener presente que en este tejido el canal CFTR se encuentra funcional y
según datos previos la secreción intestinal de cloruro activada por calcio requiere de la
activación simultánea del canal dependiente de cAMP , CFTR, en la membrana apical
(Mall et al., 1998;Matos et al., 2005). Evidencia obtenida en nuestro laboratorio
demostró que los canales de potasio activados por calcio (KCNN4) son responsables
de la conductancia al potasio esencial para la secreción de cloruro activada por
aumentos del calcio intracelular por estímulos de carbacol o histamina en el epitelio
intestinal de ratón pero la secreción de aniones precisa de una activación previa del
CFTR por cAMP (Flores et al., 2007).
Un problema muy común en el análisis de respuestas electrofisiológicas en epitelio es
que estas pueden contener contribuciones de otras corrientes aparte de la que a uno le
interesa. El uso de estímulos apropiados en conjunto con una conveniente solución de
70
registro y bloqueadores de canales permite, en muchos casos, aislar la corriente de
interés. Aunque hay muchos bloqueadores de canales catiónicos, existen relativamente
pocos inhibidores de canales aniónicos.
El uso de ovocitos de Xenopus ha proporcionado una útil herramienta en el estudio de
propiedades moleculares en canales iónicos. Es en este sistema en el cual se describió
por primera vez el bloqueo de canales de cloruro activados por calcio por compuestos
(Fenamatos), dentro de los cuales se encontraba el NFA (White & Aylwin, 1990).
Estudios en epitelio de las vías respiratorias han mostrado que aumentos intracelulares
de calcio pueden estimular una secreción de cloruro transepitelial (Tarran et al., 2002).
Para este epitelio, el uso del NFA ha mostrado ser un buen inhibidor (Gabriel et al.,
2000a).
Verificamos si la secreción aniónica activada por calcio en epitelio silvestre de ratón,
correspondía al canal de cloruro dependiente de este catión por intermedio del inhibidor
NFA, lo cual no mostró cambios en el Vte (figura 7 y 8), que nos llevaría a pensar que
los CaCCs no se encontrarían presentes en el lado apical del epitelio intestinal.
Como muchos de estos compuestos pueden tener efectos secundarios inespecíficos
que pueden alterar una correcta interpretación de los resultados observados, la
utilización del animal CFTR KO, como una aproximación alternativa al estudio de este
canal en el intestino era una oportunidad que ofrecía muchas ventajas.
Los experimentos realizados en ratones CFTR KO mostraron una completa ausencia
de la secreción de cloruro dependiente de cAMP (figura 10), así como también una
71
absoluta ausencia de secreción aniónica dependiente del aumento de calcio
intracelular, ya sea mediante el estímulo con carbacol o UTP (figura 10 y 11
respectivamente), lo que entonces nos estaría indicando que la secreción de cloruro
observada en el epitelio silvestre es la correspondiente a la vía CFTR.
El cambio positivo en el Vte, a consecuencia del estímulo con carbacol, en ausencia del
canal CFTR, sugiere que un proceso secretor de potasio habría sido desenmascarado,
la secreción catiónica observada en la (figura 10 B), correspondiente a secreción
electrogénica de potasio dependiente de calcio, es atribuida totalmente a la actividad de
canales KCNMA1 apicales (Sausbier et al., 2006), según estos reportes este canal de
igual forma sería activado por UTP apical, datos que apoyan lo observado
anteriormente en nuestro laboratorio.
De acuerdo a estos datos, aparentemente la salida de cloruro desde los enterocitos por
otra vía distinta a la proporcionada por CFTR se encontraría ausente. Esto en conjunto
a los datos previos existentes en nuestro laboratorio, apoyarían la idea de que para el
epitelio intestinal, la secreción de cloruro estaría mediada primeramente por la
activación de canales de potasio dependientes de calcio lo que proporcionaría una
hiperpolarización de la membrana favoreciendo indirectamente el flujo de cloruro por el
incremento de la fuerza de conducción de este vía, apertura espontánea del canal
CFTR, lo cual quiere decir que el canal CFTR no solamente es esencial para la
secreción de cloruro dependiente de cAMP, sino que también para la secreción de
cloruro dependiente del aumento de calcio intracelular, lo que concuerda con lo
observado por otros autores (Clarke et al., 1994;Mall et al., 1998).
72
Como se ha hecho notar en la introducción, desde el punto de vista molecular, existen
evidencias en las que se demuestra la expresión de algunos miembros de la familia de
proteínas CLCA (mCLCA3, mCLCA 6 en ratón) (Evans et al., 2004;Brouillard et al.,
2005) y (hCLCA 1, hCLCA 4 en humanos) (Gruber et al., 1998a;Ritzka et al., 2004) en
el epitelio intestinal. Pero existe gran escepticismo sobre la función de CLCAs como
canales de cloruro (Eggermont, 2004).
Sin embargo, en este trabajo se identificó la presencia de los transcritos
correspondientes a la familia CLCA, Bestrofinas y TMEM16A en el epitelio intestinal de
ratón por medio de RT-PCR. Estudios previos han demostrado, en el caso de la familia
CLCA, la expresión de los transcritos en el intestino: mCLCA1/2 localizado en las
criptas epiteliales (Gruber et al., 1998b), mCLCA 3 en granulos secretorios de las
células caliciformes (Leverkoehne & Gruber, 2002), mCLCA 4 en células del músculo
liso (Elble et al., 2002), para el caso de mCLCA 5 su expresión en el intestino hasta
ahora es desconocida, mientras que mCLCA 6 se expresaría en las criptas del intestino
grueso (Bothe et al., 2008) lo cual concuerda con la detección de los mismos
transcritos en nuestro modelo de estudio.
Para el caso de las Bestrofinas existen cuatro isoformas en el ratón, las que están
codificadas por los genes Vmd2, Vmd2l1 hasta -3, con Vmd2l2 aparentemente
correspondiendo a un pseudogen. Hay evidencia para la expresión de Vmd2 y Vmd2l1
en el colon (Kramer et al., 2004), lo cual coincide con nuestros datos.
La familia de proteínas TMEM16A actualmente es uno de los candidatos que corre con
mayor ventaja para adjudicarse la función de canal de cloruro activado por calcio
intracelular, numerosos estudios de expresión en diferentes epitelios apoyan esta
73
candidatura. En nuestros ensayos de RT-PCR obtuvimos la expresión de varias
isoformas en el epitelio intestinal (figura 13), sin embargo aún hay autores que
sostienen que la expresión de esta proteína en este epitelio requiere mayores estudios
(Yang et al., 2008;Rock et al., 2009b). Pese a toda la información disponible con
respecto a esta familia de proteínas aún hay muchas interrogantes sin resolver, como la
relación estructura-función, mecanismos de regulación y el significado fisiológico de
cada una de las isoformas.
La evidencia molecular proporcionada por los análisis de expresión nos llevaría a
pensar que existe la posibilidad que el canal de cloruro dependiente de calcio pueda
estar presente en el epitelio intestinal y cumplir una función fisiológica. La evidencia
funcional acumulada apunta a que estos canales no participarían de la secreción de
cloruro, esto debido a que probablemente su contribución a la secreción transepitelial
sea muy pequeña o transiente y la razón por la cual no fue determinada su presencia
en nuestros experimentos se deba al enmascaramiento sufrido por una fuerte activación
del canal secretor de potasio (KCNMA1). Por otro lado no se puede descartar que la
presencia de los canales CaCCs esté en el lado basolateral, por lo cual no cumpliría el
hipotético rol altersilvestre en la deficiente secreción de cloruro en la CF.
En conclusión, el colon del ratón no parece contar con canales aniónicos altersilvestres
al CFTR disponibles para la secreción, lo que es consistentes con la gravedad de la
enfermedad intestinal en esta especie.
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