Identificación y caracterización de un sistema de
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Identificación y caracterización de un sistema de secreción de proteínas tipo I en Agrobacterium tumefaciens Haurigot, Lorena Cristina 2010 12 22 Tesis Doctoral Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires www.digital.bl.fcen.uba.ar Contacto: [email protected] Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente. This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir. It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source. Fuente / source: Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
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Identificación y caracterización de un sistema desecreción de proteínas tipo I en Agrobacterium
tumefaciensHaurigot, Lorena Cristina
2010 12 22
Tesis Doctoral
Facultad de Ciencias Exactas y NaturalesUniversidad de Buenos Aires
www.digital.bl.fcen.uba.ar
Contacto: [email protected]
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica conreconocimiento de la fuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir.It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source.
Fuente / source: Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
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A mis padre s, Fe ric a Sc hwe nde r e Hiram Haurigo t
A Martin Haurigo t y Le yla Haurigo t
A Juan Manue l Calvo
AGRADECIMIENTOS
A la Dra . Ánge le s Zo rre g uie ta po r dirig ir e sta te sis y brindarme la po sibilidad de
hac e rla e n su labo rato rio . Po r e nse ñarme e l va lo r de l trabajo , a c o nfiar e n mi misma y
a no de jarme ve nc e r po r ningún o bstác ulo , po r impo sib le que pare zc a . Po rque supo
fo me ntar mi c re atividad dándo me muc ha libe rtad lo que pro mo vió mi c re c imie nto
pro fe sio nal y pe rso nal. Po r to do Ange le s, muc has g rac ias!
A mi c o dire c to ra Dra . Danie la Russo , g rac ias Dani po r tanta pac ie nc ia , po r
e sc uc harme y ac o mpañarme e n mo me nto s tan difíc ile s y a le ntarme sie mpre , po r
ayudarme y e nse ñarme .
A Jime na Be rni y Ale jandro Rabo ssi, no pue do más que ag rade c e rle s c o n to do
mi c o razó n. Grac ias po r se r mis amigo s, mis c o nse je ro s y po r ayudarme tanto , po r
ac o mpañarme y a le g rar e l día a día . Uste de s fue ro n e l mo to r que me pe rmitió lle gar
hasta ac á . A la Dra . Ana María Ste lla , e xc e le nte pro fe so ra y amiga . A Juan Carlo s
Calvo .
A lo s labo rato rio s que c o labo raro n y apo rtaro n a e sta te sis: Dr. Go ldbaum (FIL),
Dr. Pito ssi (FIL), Dr. Santa Co lo mma (FIL), Dr. Wappne r (FIL), Dr. Que sada Allué (FIL), Dr.
Etc he nique (FCEN).
A lo s amig o s que c o se c he e n e sto s año s que me han so po rtado
pac ie nte me nte , Le andro Martíne z To sar, Edgardo Salvatie rra , Guille rmo Tamine lli,
Vanina Alzo garay, Gustavo Ge e rke n, Pablo Nike l y Silvia Ag üe ro y a lo s amig o s que
e stán de sde sie mpre Jime na Be rni, So le dad Ale ssandro , Ho rac io Padula , Javie r
Lo mbardi, Analía Ro mbo lá y So raya Pe re z Rullán.
A Alic ia Ullo a , po r e star a l e mpe zar y a l te rminar, Grac ias Ali! A Susana Carrillo
po r c o nte nerme durante e sto s año s.
A mi familia Martin, Le yla , so bre to do a mi mama, mi e je mplo de muje r, de
amo r y de pac ie nc ia , g rac ias mami. Mis tío s Guille rmo y Luc ia Sc hwe nde r y Anita
Sc hwe nde r. Lo s que ya no e stán pero sigue n sie mpre c o nmig o , mi papa y mi he rmano
Marc e lo y a mi so brinito s amado s Manue l, Fe de ric o , Agustín y Abril, sie mpre le d ie ro n
a le gría a mi vida . A Go nzalo , c o n to do mi amo r.
A mi amo r, Manue l, g rac ias mi vida po r e star c o nmigo y ac o mpañarme .
A la Age nc ia Nac io na l de Pro mo c ió n Cie ntífic a y Te c no ló g ic a , AL CONICET y a
la FIL.
A lo s que no agrade zc o puntualme nte pe ro sie mpre e stuvie ro n ahí, apo rtando
su e sfue rzo y bue na vo luntad para que pudie ra hac e r mi traba jo . Espe ro no o lvidar a
nadie .
A to do s muc has grac ias…
Identificación y caracterización de un Sistema de Secreción de Proteínas Tipo I en Agrobacterium tumefaciens
RESUMEN
Lo s Siste mas de Se c re c ió n de Pro te ínas tipo I (T1SS) pe rmite n a una amplia
varie dad de bac te rias Gram-ne gativas se c re tar pro te ínas a l me dio e xtrac e lular; e sto s
siste mas partic ipan e n varias re spue stas fisio ló g ic as c o mo la adaptac ió n a l me dio
ambie nte y c o ntribuye n a la virule nc ia e n dive rso s pató g e no s. Lo s T1SS e stán fo rmado s
po r un c o mpo ne nte de me mbrana inte rna (ABC) un c o mpo ne nte de fusió n de
me mbrana (MFP) y un c o mpo ne nte de me mbrana e xte rna (OMF). Lo s ge ne s de lo s
do s prime ro s (e inc lusive e l OMP) sue le n e star fo rmando un o pe ró n y pue de n e star
adyac e nte s a lo s ge ne s que c o dific an sus pro te ínas sustrato .
En la bac te ria simbio nte Rhizo bium le gumino sarum, e l T1SS, PrsDE, e s
re spo nsable de la se c re c ió n de dive rsas pro te ínas que partic ipan e n la supe rvive nc ia
de l rizo bio e n e l sue lo , favo re c ie ndo la fo rmac ió n de e struc turas c o munitarias
de no minadas b io films. A. tume fac ie ns e s un fito pató ge no de a lto inte ré s agro nó mic o y
b io te c no ló g ic o . A pe sar de la re le vanc ia que lo s TISS mue stran te ne r e n dive rsas
bac te rias Gram ne gativas, hasta la fe c ha no se ha avanzado e n e l e studio y la
re le vanc ia fisio ló g ic a de e sto s siste mas de se c re c ió n e n e ste fito pató g e no .
En e ste traba jo , se a isló a partir de una b ib lio te c a g e nó mic a pro ve nie nte de A.
tume fac ie ns e l c ó smido pIJ7760 que fue c apaz c o mple me ntar e l fe no tipo de
se c re c ió n de c e pas mutante s e n e l siste ma PrsDE de R. le gumino sarum. Se de te rminó
que dic ho c ó smido a lbe rga lo s ge ne s de un siste ma ho mó lo go a l que se de no minó
AspD-AspE, Agro bac te rium se c re tio n pro te in D and E) fo rmado po r un c o mpo ne nte
ABC (do minio de unió n a ATP) y o tro MFP (pro te ína de fusió n de me mbranas),
re spe c tivame nte . Este siste ma fue re spo nsable de la se c re c ió n de una pro te ína , a la
que se de no minó Hla , de func ió n de sc o no c ida c o dific ada rio arriba de aspDE. El
aná lisis de las se c ue nc ias de l c ó smido pe rmitió ide ntific ar, río arriba de hla , ge ne s c uyo
pro duc to s pre se ntan a lta similitud de se c ue nc ia amino ac ídic a c o n re c e pto re s de
he mo (de no minado hlaR) y a fac to re s sigma y anti sigma (de no minado s hlaS y hlaI).
Las zo nas pro mo to ras de ambo s lo c i pre se ntaro n se c ue nc ias c o nse nso de
re c o no c imie nto de l re gulado r RirA que re spo nde a la c o nc e ntrac ió n de hie rro
e xtrac e lular. Rio arriba de e sto s ge ne s se ide ntific ó un pro bable siste ma ABC de
c aptac ió n de he mo (de no minado ahuUVTB) que pre se nta e n su re g ió n pro mo to ra
se c ue nc ias de re c o no c imie nto de RirA y de l re g ulado r de l me tabo lismo de l he mo IrrA.
El aná lisis de las pro te ínas pre se nte s e n e l me dio e xtrac e lular e n dive rsas
c o ndic io ne s de c ultivo y nutric io nale s pe rmitió re fle jar un c o mple jo c o ntro l y una
re gulac ió n dife re nc ia l de la se c re c ió n de la pro te ína Hla e n e l ho spe dado r sustituto R.
le gumino sarum A34 y A. tume fac ie ns C58. Se o bse rvó una muy e le vada se c re c ió n de
Hla e n e l ho spe dado r sustituto R. le gumino sarum A34 e n me dio s ric o s de c ultivo . Se
de te rminó que e sta de sre gulac ió n se de be a que la c e pa de A34 c o ntie ne una
mutac ió n anc e stra l e n a lgún re g ulado r de sc o no c ido hasta la fe c ha que pro vo c a un
fe no tipo ple io tró pic o . Este re gulado r e s c o dific ado e n e l plásmido simbió tic o pRL1JI y
re gula , la se c re c ió n de Hla . El e studio de la re gulac ió n e n e l parie nte he te ró lo go R.
le gumino sarum mo stró que la se c re c ió n de Hla tambié n se ve re primida po r lo s
re gulado re s g lo bale s de re spue sta a hie rro de sc ripto s e n Rhizo biac e ae , RirA e IrrA. Po r
o tro lado , e l agre gado de he mo g lo bina c o mo fue nte de he mo e xtrac e lular, indujo la
se c re c ió n de Hla c o mo pro te ína mayo ritaria e n e l c o nte xto he te ró lo go de Rhizo b ium.
El análisis de l c o nte xto ge né tic o de hla mo stró que e ste ge n e stá inc luido e n un lo c us
sinté nic o a o tro s c luste rs de g e ne s invo luc rado s e n la c aptac ió n de hemo a travé s de
he mó fo ro s, aunque Hla no pre se nta similitud de se c ue nc ia amino ac ídic a c o n
he mó fo ro s c arac te rizado s. Sin e mbargo , la purific ac ió n po r c o lumna de a finidad de
he mina mo stró que Hla pre se nta c apac idad de unir he mina y se ría e l prime r he mó fo ro
de sc ripto e n la familia Rhizo biac e ae .
Me diante mutagé ne sis dirig ida se ge ne ró una mutante de se c re c ió n e n aspD
de A. tume fac ie ns C58. Lo s fe no tipo s aso c iado s a e sta mutante mo straro n un c arác te r
ple io tró pic o , tanto la auto ag reg ac ió n bac te riana , la adhesió n a so po rte abió tic o y la
mo tilidad e n ag ar se vie ro n a fe c tadas. En A. tume fac ie ns la se c re c ió n de Hla
re spo ndió princ ipa lme nte a c o ndic io ne s mic ro ó xic as/ anó xic as, ade más de a la
ause nc ia de hie rro y pre se nc ia de he mo . Inte re sante me nte , la mutante de fic ie nte e n
la se c re c ió n de Hla fue inc apaz de induc ir la fo rmac ió n de tumo re s e n Kalanc ho e sp .
En c o njunto , lo s re sultado s pre se ntado s e n e ste traba jo sug ie re n que e l T1SS
AspDE, partic iparía e n la c aptac ió n de he mo e xtrac e lular a travé s de la se c re c ió n de
un nue vo he mó fo ro (Hla) pro bab le me nte e n c o ndic io ne s mic ro ae ró filas y de bajo
hie rro pre se nte s e n e l c o nte xto de l tumo r.
Palabras claves: T1SS, he mó fo ro , Ag ro bac te rium, virule nc ia , Rhizo bium
Identification and characterization of a Type I Secretion System in
Agrobacaterium. tumefaciens
ABSTRACT
Type I secretion systems (TISSs) enable a wide spectrum of Gram-negative
bacteria to deliver proteins to the extracellular medium. This secretion machinery has
been shown to be involved in several physiological responses such as adaptation to
the environment and virulence. T1SS are composed by an inner membrane
component (ABC), a membrane fusion component (MFP) and an outer membrane
component (OMP). ABC and MFP are ussually encoded as an operon and they can
even be located in adjacency to some of their substrate proteins.
The PrsDE System of the related symbiont R. leguminosarum is responsible for the
secretion of several proteins that participate in the survival behaviour of rhizobia in the
soil by the establishment of structured communities known as biofilms. A. tumefaciens is
an important agroeconomical and biotechnological phytopathogen. Despite the
physiological relevance of the subject, previous observations suggested the presence
of T1SS in A.tumefaciens since C58 strain genome sequences are available (2001),
however there have been no advances in the characterization or functional studies of
the secretion system in this phytopathogen.
In this work, heterologous functional complementation assay has been carried
out using an A. tumefaciens genomic library to revert PrsDE mutant strains of R.
leguminosarum A34. This strategy allowed us to isolate an A. tumefaciens cosmid,
pIJ7760 encoding a T1SS, namely AspDE (Agrobacterium secretion protein D and E).
aspD and aspE genes encoded the ABC (ATP binding domain) and MFP (membrane
fusion protein) components of the secretion system respectively. Hla, a conserved
unknown protein located upstream in the cosmid, was identified as a substrate of
AspDE system. The genetic analysis of the surrounding region revealed a putative heme
receptor (HlaR) and an ECF sigma and antisigma factor (HlaSI) encoded upstream of
Hla. These genes have a RirA (global iron regulation) consensus sequence in their
promoter region. Another putative ABC uptake system (AhuUVTB) was identified in
pIJ7760 with recognition sequence for RirA and IrrA (heme response regulator).
Extracellular protein analysis from different cultured conditions shown that
complex and differential control of the secretion of Hla occurs between R.
leguminosarum A34 and A. tumefaciens C58 strains. An elevated Hla secretion was
observed in rich medium in the R. leguminosarum A34 heterologous host. This miss
regulation was found to be in response to a so far unknown mutation which triggers
pleiotropic phenotypes. This regulator is encoded in the pRL1JI symbiotic plasmid and
appe ars to re gulate Hla se c re tio n. The mo dulatio n o f Hla se c re tio n was studie d using
the re late d strain R. le gumino sarum, and re ve ale d that the se c re tio n o f the pro te in is
a lso c o ntro lle d by the two g lo bal re gulato rs pre vio usly de sc ribe d in Rhizo biac e ae , RirA
and IrrA. Additio nally, adding he mo g lo bin as an e xtrac e llular he me so urc e induc e s the
se c re tio n o f Hla as the majo r pro te in in the R. le g umino sarum he te ro lo go us c o nte xt.
De spite the fac t that Hla sho ws no ho mo lo gy with pre vio usly c harac te rize d
he mo pho re s, the ge ne is inc lude d in a re g io n with re markable ho mo lo gy to a lo c us
invo lve d in he me uptake thro ugh he mo pho re s. Hla was purifie d fro m e xtrac e llular
me dium c ulture s using he min a ffinity c o lumn sugge sting no ve l he mo pho re in
Rhizo biac e ae family.
Using dire c te d mutage ne sis, an aspD se c re tio n mutant was ge ne rate d in A.
tume fac ie ns C58 stra in. Phe no typic c harac te rizatio n re ve ale d that the mutatio n has a
ple io tro pic phe no type a ffe c ting the bac te rial agg re g atio n, adhe sio n to an abio tic
surfac e and ag ar-mo tility. Studie s o n A. tume fac ie ns sho we d that apart fro m
re spo nding to iro n starvatio n and additio n o f heme to the me dium, Hla se c re tio n mainly
re spo nds to mic ro o xic / ano xic c o nditio ns. Inte re sting ly, aspD mutant, unab le o f Hla
se c re tio n was avirule t, as sho wn by inc apability o f tumo r induc tio n in Kalanc ho e sp .
plants.
Taking to g e the r, the se re sults sugg e st that the AspDE Type I Se c re tio n Syste m
c harac te rize d in this wo rk c o uld be invo lve d in he me uptake thro ugh the se c re tio n o f a
no ve l he mo pho re (Hla ) pro bably in the lo w iro n and mic ro ae ro b io sis pre se nt in the
tumo r.
Key words: T1SS, hae mo pho re , Agro bac te rium, virule nc e , Rhizo b ium
Parte de lo s re sultado s que se de sc ribe n e n esta te sis se rán pub lic ado s e n lo s
sig uie nte s trabajo s:
The AspDE TISS is involved in the secretion of Hla, a new hemin-binding protein required
for full virulence in Agrobacterium tumefaciens.
Lo re na Haurig o t, Marc e la Fe re lla , Christine Finnie , Danie la Russo , Allan Do wnie and
Ange le s Zo rre g uie ta
The hla aspDE hemophore locus of Agrobacterium tumefaciens belongs to a gene
cluster that responds to iron, heme and low oxygen conditions.
Lo re na Haurigo t, Danie la Russo and Ange le s Zo rre g uie ta
ABREVIATURAS
A. Agro bac te rium.
aa amino ác ido s
ABC (ATP b inding c asse tte ) Casse tte de unió n a l ATP.
ADN Ác ido de so xirribo nuc le ic o .
ADP Ade no sina difo sfato .
ADN-T Fragme nto o nc o gé nic o transfe rib le de DNA.
ARN Ác ido ribo nuc le ic o .
ATP Ade no sina trifo sfato .
ATPasa Ac tividad de hidró lisis de l ATP.
AS Ác ido siá lic o .
bv. Bio varie dad.
CMC Carbo xime til c e lulo sa .
C-ter. Extre mo c arbo xilo te rminal.
Da Dalto ns
DMSO Dime tilsulfó xido .
ECF (Extrac ito plasmatic sig ma fac to r) Fac to r sigma e xtrac ito plasmátic o .
EPS e xo po lisac árido .
Fe2+ Ió n fe rro so
Fe3+ Ió n fé rric o
Fig. Figura
GABA Ác ido γ amino butíric o .
GTPasa Ac tividad de hidró lisis de GTP (g uano sina trifo sfato ).
Hb He mo g lo bina
HSL Ho mo se rín lac to na .
IAA Ác ido indo l-3-ac é tic o
IS Se c ue nic ias de inse rc ió n.
Kan Kanamic ina .
Kb Kilo base s.
Kd Co nstante de a finidad.
kDa Kilo Dalto n.
KDO Ác ido 2-c e to 3-de o xio c tano ic o .
LPS Lipo po lisac árido .
M Mo lar
MALDI-TOF (Matrix Assite d Lase r De so rptio n Io nizatio n-Time Of Flight) Espe c tro me tria de masa y tie mpo de vue lo .
mARN ARN me nsaje ro
sARN pe que ño ARN no c o dific ante
ME me mbrana e xte rna
MDR (multiple drug re sistanc e ) Siste ma de e flujo de dro gas.
MFP (me mbrane fusio n pro te in) Pro te ína de fusió n de me mbranas.
MI me mbrana inte rna
mM milimo lar
mV Milivo ltio s
NBD (Nuc le o tide b inding do main) Do minio de unió n a nuc le ó tido .
nM nano mo lar.
N-ter Extre mo amino te rminal.
OD (o ptic al de nsity) de nsidad ó ptic a .
OMP (o ute r me mbrane pro te in) Pro te ína de la me mbrana e xte rna .
O-PS Po lisac árido O.
ORF (o pe n re ading frame ) Marc o de le c tura abie rto .
pAT Plásmido c ríptic o AT.
PAGE (po liac rilamide ge l
e le c tro pho re sis) Ele c tro fo re sis e n ge l de po liac rilamida .
pb pare s de base s.
PBP (pe riplasmic b indin pro te in) Pro te ína pe riplasmátic a de unió n a sustrato .
PC Fo sfatidilc o lina
PCR (po lime rase c hain re ac tio n) Re ac c ió n e n c ade na de la po lime rasa .
PM Pe so mo le c ular.
PMF (Pe ptide mass fring e rprint) Hue lla dig ita l de masa de pé ptido .
pmoles pic o mo le s.
PPIX Pro to po rfirina IX, pre c urso r inme diato de l g rupo he mo .
PO4 Fo sfato .
PrsDE T1SS de R. le gumino sarum 8401, c o mpo ne nte s D y E.
pRL1JI Plásmido simbió tic o de la c e pa 8401 de R. le gumino sarum.
pTI Plásmido de virule nc ia Ti.
pv. Pato varie dad.
R Rhizo bium.
RAP (Rhizo bium adhe ring pro te in) Pro te ína de adhe sió n de Rhizo b ium.
RMN Re so nanc ia mag nétic a nuc le ar.
rpm re vo luc io ne s po r minuto
RTX Pro te ínas (re pe at in to xin) re pe tic io ne s e n tande m pre se ntes e n to xinas.
SDS So dio do de c il sulfato .
sRNA Fragme nto s pe que ño s de RNA no c o dific ante s.
Spec Espe c tino mic ina .
TMD (transme mbrane do main) Do minio transme mbrana.
T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS (type I, II, III, IV, V, VI se c re tio n syste m) Siste ma de se c re c ió n de pro te ínas tipo I, II, III, IV, V, VI re spe c tivame nte .
TCA Ác ido tric lo ro ac é tic o .
Vir Ge ne s de virule nc ia .
2,2D 2,2 dipiridil
Glosario:
Buffer: so luc ió n de pH c o nstante o tampó n.
Pellet: pre c ipitado o bte nido de spué s de c e ntrifugac ió n de una so luc ió n.
CAPITULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL
1.1 Mic ro o rganismo s de la rhizo sfe ra…………………………………………………...……......2
1.2 Rhizo bium…………………………...………………………………………………………….….3
1.3 Agro bac te rium……………………………………………………………………………….…..5
1.4 Plásmido Ti y transfe re nc ia de l T-DNA…………………………………………………...…..5
1.5 Me c anismo de virule nc ia de Agro bac te rium………………………………………..…....7
1.6 Otro s fac to re s a fe c tan la virule nc ia de Agro bac te rium…………………………..….…8
1.7 Impo rtanc ia b io te c no ló g ic a de Agro bac te rium………………………………........…...10
1.8 Siste mas de se c re c ió n de pro te ínas e n bac te rias Gram ne gativas………………..…11
1.9 Siste ma de Se c re c ió n de Pro te ínas Tipo 1……………...………………………………..…14
1.10 Pro te ínas ac c e so rias de lo s T1SS: Pro te ína de Fusió n de Me mbrana (MFP)….……..16
1.11 Pro te ínas ac c e so rias de lo s T1SS: Pro te ína de me mbrana e xte rna (OMP)……….…16
1.12 Hipó te sis ge ne ral, o b je tivo ge ne ral……………………………………………………….….19
CAPÍTULO II: IDENTIFICACIÓN DE UN SISTEMA DE SECRECIÓN DE PROTEÍNAS TIPO I EN
Agrobacterium tumefaciens.
2.1 Introducción
2.1.1 Transpo rte a travé s de la me mbrana bac te riana……………………………………..….21
2.1.2 Transpo rtado re s de la supe r-familia ABC……………………………………………..…….21
2.1.3 Impo rtado re s de la supe r-familia ABC………………………………………………….…...22
2.1.4 Expo rtado re s de la supe r-familia ABC………………………………………………………24
2.1.5 Siste mas tripartito s de transpo rte ………………………………………………………...…...24
2.1.6 Se c re c ió n me diada po r e l TISS, PrsDE, e n R. le gumino sarum…………………………...26
2.1.7 Obje tivo s e spe c ífic o s…………………………………………………………………………...28
2.2 Resultados
2.2.1 Ide ntific ac ió n de un TISS e n A. tume fac ie ns. Mé to do de sc re e ning………………....29
2.2.2 Análisis b io info rmátic o de po sib le s siste mas ABC c o nte nido s e n e l c ó smido
pIJ7760………………………………………………………………………………………..………..…...30
2.2.3 AspDE e s e l re spo nsable de la c o mple me ntac ió n he te ró lo ga………………………..40
2.2.4 Co mple me ntac ió n de o tras pro te ínas PrsDE de pe ndie nte s y se c re c ió n de Hla e n e l
c o nte xto he te ró lo go ……………………………………………………………………………………...43
2.2.5 Hla e s sustrato de l siste ma AspDE…………………………………………………………….48
2.2.6 Estudio de l c o nte xto ge né tic o de hla-aspDE………………………………………………52
2.2.7 Ide ntific ac ió n de o tro s T1SS c o dific ado s e n e l ge no ma de A. tume fac ie ns………..52
2.3 Conclusiones y discusión…………………………………………………………………...…..57
CAPÍTULO III: CONTEXTO GENÉTICO Y REGULACIÓN DE HLA-AspDE EN EL HOSPEDADOR
HETERÓLOGO DE R. LEGUMINOSARUM.
3.1 Introducción
3.1.1 Impo rtanc ia de l hie rro para lo s mic ro o rganismo s……………………………….………..61
3.1.2 El hie rro y e l e stré s o xidativo …………………………………………………………………...62
3.1.3 Re gulac ió n de l me tabo lismo de l hie rro …………………………………………………….63
3.1.4 Re gulac ió n me diada po r RirA………………………………………………………...………64
3.1.5 Fe no tipo re lac io nado a l hie rro de la c e pa A34 de R. le gumino sarum………………65
3.1.6 Re gulac ió n me diada po r IrrA…………………………………………………………………66
3.1.7 Otro s re gulado re s de la e xpre sió n ge né tic a re lac io nado s c o n hie rro ………………68
3.1.8 Obje tivo s e spe c ífic o s…………………………………………………………………………...69
3.2 Resultados
3.2.1 Co mparac ió n de la o rganizac ió n ge né tic a de l c luste r aso c iado a hla aspDE c o n
o tro s c luste rs de ge ne s invo luc rado s e n la c aptac ió n de he mo ………………………………70
3.2.2 Ide ntific ac ió n de un c luste r de ge ne s sinté nic o a hla e n Sino rhizo bium me lilo ti…..71
3.2.3 Pre se nc ia de mo tivo s de re c o no c imie nto a IrrA y RirA e n e l c luste r hla……………..72
3.2.4 Análisis b io info rmátic o de HlaR………………………………………………………….……74
3.2.5 Análisis de la influe nc ia de l plásmido simbió tic o pRL1JI de R. le gumino sarum e n la
se c re c ió n de Hla…………………………………………………………………………………………..76
3.2.6 Influe nc ia de lo s re gulado re s IrrA y RirA e n la se c re c ió n de Hla e n R.
le gumino sarum…………………………………………………………………………………………….78
3.2.7 Efe c to de l he mo e n la se c re c ió n de Hla e n e l c o nte xto he te ró lo go ………………..83
3.2.8 Ensayo he te ró lo go de pro duc c ió n de Hsl e n pre se nc ia de pIJ7760…………………83
3.2.9 Ane xo s: Ane xo s 3.2.1, 3.2.2 y 3.2.3, Espe c tro 3.2.1, Ane xo s 3.2.4 y 3.2.5, Espe c tro
3.2.2, Ane xo s 3.2.6, Espe c tro 3.2.3 y Ane xo 3.2.7…………………………………………………...85
3.3 Conclusiones y discusión……………………………………………………………………...89
CAPITULO IV: ESTUDIO DEL ROL DEL SISTEMA AspDE Y SU SUSTRATO, HLA, EN LA FISIOLOGÍA
DE A. tumefaciens.
4.1 Introducción
4.1.1 El he mo c o mo fue nte de hie rro y/ o pro to po rfirina……………………………………….96
4.1.2 Me c anismo s de c aptac ió n de l he mo , hie rro u o tro s sustrato s de sde e l me dio
e xtrac e lular a l c ito plasma…………………………………..………………………………………98
4.1.3 Captac ió n me diada po r he mó fo ro s: c asc ada Has………………………………….100
4.1.4 Obje tivo s e spe c ífic o s……………………………………………………….…………….104
4.2 Resultados
4.2.1 Carac te rizac ió n fe no típic a de una mutante e n e l ge n aspD………………………105
4.2.3 Estudio de l se c re to ma de A. tume fac ie ns e n c ultivo s ae ró b ic o s…………………107
4.2.4 Estudio de l se c re to ma de A. tume fac ie ns e n c ultivo s anae ró bic o s……………....111
4.2.5 Po sib le ac tividad de Hla……………………………………………………………………112
4.2.6 Hla e s una pro te ína que une he mina……………………………………………………113
4.2.7 Ane xo s: Ane xo s 4.2.1, 4.2.2 y 4.2.3, Grafic o 4.2.1, Ane xo 4.2.4……………….……….115
4.3 Conclusiones y Discusión………………………………………………………………..…119
CAPITULO IV: OTROS FENOTIPOS ASOCIADOS A LA MUTACION aspD.
5.1 Introducción……………………………………………………………………………………..127
5.1.1 Ob je tivo s e spe c ífic o s………………………………………………………………………….130
5.2 Resultados
5.2.1 Cre c imie nto ……………………………………………………………………………………..131
5.2.2 Fe no tipo s de Supe rfic ie bac te riana………………………………………………………..133
5.2.3 Pro duc c ió n de side ró fo ro s……………………………………………………………………139
5.2.4 Virule nc ia……………………………………………………………………..………………….139
5.3 Conclusiones y discusión……………………………………………………………………..142
CAPITULO V: DISCUSION GENERAL
5.1 Discusión general……………………………………………………………………………..149
MATERIALES Y MÉTODOS
Técnicas y ensayos microbiológicos………………………………………………………………157
Ensayos y técnicas bioquímicas……………………………………………………………..……..165
Técnicas de Biología molecular……………………… ……………………………………………168
BIBLIOGRAFÍA 177
CAPÍTULO I:
INTRODUCCIÓN
GENERAL
2
CAPITULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL
1.1 Microorganismos de la rhizosfera
La rizo sfe ra e s la po rc ió n de l sue lo que inc luye las ra íc e s ve g e ta le s y la zo nas
que se e nc ue ntran e n c o ntac to íntimo c o n e llas, e stá a ltame nte po blada y o fre c e un
nic ho dinámic o y c o mpe titivo e n e l que las ra íc e s ve ge ta le s se aso c ian e stre c hame nte
c o n lo s mic ro o rg anismo s (Dixo n, 2001). Las bac te rias han de sarro llado e strateg ias para
so bre vivir y adaptarse e n la rizo sfe ra . La c o lo nizac ió n de la supe rfic ie radic ular no e s
unifo rme y se o bse rvan áre as re lativame nte libre s de bac te rias y áre as que pue de n
e star de nsame nte po bladas (Fukui e t al., 1994; Ne wman y Bo we n, 1974). Las áre as mas
de nsame nte po bladas so n aque llas do nde c o nfluye n c é lulas radic ulare s, lastimaduras
e n la e pide rmis y lug are s do nde nac e n nue vas ra íc e s. To do s e sto s so n c o nside rado s
sitio s de e xudac ió n ve g e ta l (Blo e mbe rg e t al., 1997; Lugte nbe rg e t al., 2001). Se ha
e stable c ido que dife re nte s e spe c ie s ve ge ta le s pue de n se le c c io nar po b lac io ne s
mic ro bianas e spe c ífic as e n la rizo sfe ra (Pre ss y Pho e nix, 2005; Kuske e t al., 2002; Smalla
e t al., 2001; Yang y Cro wle y, 2000).
La familia Rhizo biac e ae pe rte ne c e a la subc lase 2 de α-pro te o bac te rias. Esta
fo rmada po r bac te rias que habitan la rizo sfe ra e inc luye e spe c ie s simbio nte s de
plantas fijado ras de nitró ge no c o mo Rhizo bium, Sino rhizo b ium, Me so rhizo bium,
Azo rhizo bium, y Bradyrhizo b ium, llamadas c o le c tivame nte rizo bio s, y e spe c ie s
fito pató ge nas c o mo Agro bac te rium tume fac ie ns, Agro bac te rium rubi, Agro bac te rium
vitis y Agro bac te rium rhizo ge ne s o la e spe c ie no pató g e na Agro bac te rium
radio bac te r, de no minadas ag ro bac te rias. To das las e spe c ie s pató ge nas de
ag ro bac te rias so n c apac e s de induc ir la fo rmac ió n de tumo re s e n plantas me diante
transfo rmac ió n ge né tic a (Binns y Co nstantino , 1998). A. rhizo g e ne s induc e la fo rmac ió n
de “ra íc e s e n c abe lle ra” y A. vitis e s c apaz de c ausar le sio ne s ne c ró tic as y radic ulare s
(Burr y Otte n, 1999). La infe c c ió n ve ge ta l induc ida po r Agro bac te rium e s un pro ble ma
impo rtante e n vario s c ultivo s ho rtíc o las y fruta le s (Mc Culle n y Binns, 2006). Po r su
c e rc anía filo g e né tic a , se ha pro pue sto que la de no minac ió n c o mo gé ne ro de
Agro bac te rium de be ría se r abando nada y que dic has e spe c ie s de be rían se r inc luidas
e n e l g é ne ro Rhizo bium (Yo ung e t al., 2003; Farrand e t al., 2003; Yo ung e t al., 2001). Las
bac te rias de la familia Rhizo biac e ae tie ne n una e xte nsa vida libre c o mo o rganismo s
he te ró tro fo s e n e l sue lo , aso c iándo se c o n las ra íc e s y c o nsumie ndo lo s e xudado s
ve g e ta le s para c re c e r y dividirse sin fo rmar nó dulo s o pro vo c ar tumo re s (Chi e t al.,
2005). Las mayo re s similitude s e ntre lo s mie mbro s de e sta familia se o bse rvan e n e l
me tabo lismo , transpo rte y vías re gulato rias que pro mue ve n su supe rvive nc ia e n e l
nic ho e c o ló g ic o . La inte rac c ió n íntima de lo s rizo bio s y agro bac te rias c o n las plantas
3
e s po sib le grac ias a que las bac te rias po se e n e le me nto s ge né tic o s auto -transmisib le s,
ya se a e n fo rma de plásmido s o e le me nto s inte grativo s c o njug able s, que inc luye n c asi
to do s lo s de te rminante s para la inte rac c ió n simbió tic a o pató ge na c o n e l ho spe dado r
ve g e ta l (Yo ung e t al., 2006; Cape la e t al., 2001; Fuqua y Winans, 1996; Wo o d e t al.,
2001; Go o dne r e t al., 2001). Lo s pro c e so s de se ña lizac ió n e n la rizo sfe ra a fe c tan
pro fundame nte la fisio lo g ía de las plantas y de las bac te rias que la habitan y jue g an
un ro l fundame ntal e n e l e stab le c imie nto de inte rac c io ne s e fe c tivas, pató ge nas o
be né fic as, e ntre bac te rias y plantas (Mark e t al., 2005). Esto s me c anismo s de
se ñalizac io n se induc e n po r nume ro so s c o mpue sto s e xudado s de las ra íc e s ve g e ta le s y
c o mpue sto s químic o s de rivado s de lo s mic ro o rganismo s (Phillips e t al., 2004; Bais e t al.,
2005; Hüc ke lho ve n, 2007).
1.2 Rhizobium
R. le gumino sarum e s un mie mbro de la familia Rhizo biac e ae ; vive e n do s
hábitat dife re nte s, la rizo sfe ra e n do nde pre se nta un e stilo de vida ae ró bic o y sapró fito
y e n e l nic ho e c o ló g ic o de la planta , e l nó dulo , do nde vive e n c o ndic io ne s
mic ro ae ró filas. El nó dulo e s un ó rg ano e spe c ia lizado e n las ra íc e s ve g e ta le s do nde lo s
mic ro o rganismo s simbio nte s fijan e nzimátic ame nte e l N2 a tmo sfé ric o a la fo rma
me tabó lic ame nte utilizable de NH3 (Pe te rs y Szilagyi, 2006). El NH3 e s pro visto a la planta
a c ambio de c o mpue sto s c arbo nado s de rivado s de la fo to sínte sis. Lo s nó dulo s
pe rmite n a la planta inde pe ndizarse de fue nte s de nitró g eno e xte rnas y pro ve e n un
mic ro ambie nte apto para e l pro c e so de re duc c ió n de l nitró g e no . Rhizo bium e s c apaz
de induc ir la o rg ano gé ne sis de l nó dulo e n la ra íz, do nde se e stable c e c o mo un
e ndo simbio nte intrac e lular c ró nic o (Spre nt, 2008). Esta simbio sis jue ga un ro l
fundame nta l e n e l c ic lo de l nitró ge no y disminuye la ne c e sidad de fe rtilizante s
sinté tic o s nitro ge nado s (Vanc e , 2001).
La fo rmac ió n de l nó dulo e s un pro c e so a ltame nte c o mple jo y re gulado , la
no dulac ió n se inic ia c o n un “diá lo g o mo le c ular” e spe c ífic o que invo luc ra la
pe rc e pc ió n bac te riana de flavo no ide s libe rado s po r la planta y la sínte sis de fac to re s
No d (no dulatio n fac to rs) po r las bac te rias que induc e n la o rgano gé ne sis (Dé narié e t
al., 1993) (Figura 1.1). La mayo ría de lo s g e ne s e spe c ífic o s y ne c e sario s para la
no dulac ió n de lo s rizo bio s se e nc ue ntra c o dific ada en plásmido s deno minado s
simbió tic o s (500Kpb-1,5Mpb) o e n islas simbió tic as e n e l c ro mo so ma (Fre ibe rg e t al.,
1997). La inte rac c ió n e ntre Rhizo bium y la planta ho spe dado ra se inic ia c uando la
bac te ria se adhie re a l e xtre mo de l pe lo radic ular. Se pro puso que e l anc la je no
e spe c ífic o e sta me diado po r adhe sinas e xtrac e lulare s de pe ndie nte s de Ca 2+ mie ntras
que e l anc la je e spe c ífic o e s de pe ndie nte de le c tinas se c re tadas po r la planta que
pro mue ve n la adhe sió n a c arbo hidrato s de la supe rfic ie bac te riana (Ho e t al., 1986), y
CAPÍTULO I- Introducción general
de
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PÍTULO I- Intro
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1999),
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neral
5
adaptac ió n a l c re c imie nto e n fase e stac io naria (Tho rne y Williams, 1999), fijac ió n
simbió tic a de nitró ge no y no dulac ió n e n a lg unas e spe c ie s de Rhizo biac e ae (Danie ls e t
al., 2002). La sínte sis de HSL tie ne un ro l c lave e n la inte rac c ió n e c o ló g ic a e ntre
rizo bac te rias y su ho spe dado r e uc ario ta (Cha e t al., 1998). La planta e s c apaz de
re spo nde r e inte rfe rir c o n las se ñale s de l quó rum se nsing bac te riano (Sanc he z-
Co ntre ras e t al., 2007).
1.3 Agrobacterium
A. tume fac ie ns e s un fito pató ge no que utiliza e strate g ias ge né tic as similare s a
o tras rizo bac te rias e n nume ro so s aspe c to s fisio ló g ic o s. El ge no ma de A. tume fac ie ns,
c e pa C58 (bv. 1) ha sido se c ue nc iado (Go o dne r e t al., 2001; Wo o d e t al., 2001) y
mo stró una e struc tura inusua l. Está fo rmado po r un c ro mo so ma line a l c o n te ló me ro s
c o va le nte me nte c e rrado s, un c ro mo so ma c irc ular, e l plásmido c ríptic o , de no minado
At (pAt) y e l plásmido de virule nc ia (pTi). Existe una gran c o line aridad nuc le o tídic a y
o rto lo g ía c o n e l ge no ma de S. me lilo ti que sug ie re una dive rg e nc ia e vo lutiva re c ie nte
e ntre e stas do s bac te rias
1.4 Plásmido Ti y transferencia del T-ADN
Smith y To wnse nd, de mo straro n que Agro bac te rium e s c apaz de induc ir
tumo re s e n plantas (Smith y To wnse nd, 1907); más tarde , se de mo stró que e ste
fito pató ge no po se e la habilidad únic a de transfe rir un fragme nto o nc o gé nic o mó vil de
ADN, c o no c ido c o mo ADN-T (T-ADN, transfe rre d ADN) (Chilto n e t al., 1977; Esc o bar y
Dande kar, 2003). El inte ré s inic ia l de e sto s e studio s se de b ió a l inte nto de c o no c e r lo s
me c anismo s de o nc o gé ne sis e n ge ne ral, c o n e l fin de aplic ar e sto s c o no c imie nto s
para de sarro llar dro gas que pe rmitie ran c o mbatir e l c ánc e r. Co n po ste rio ridad, e l
inte ré s se de svió hac ia e l fe nó me no de la transfe re nc ia g é nic a de sde A. tume fac ie ns
hac ia la c é lula ve ge ta l infe c tada (De la Riva e t al., 1998). Una ve z de ntro de l
ho spe dado r, e l ADN-T se inte g ra de fo rma e stable e n e l c ro mo so ma ve g e ta l e induc e
la so bre pro duc c ió n de las ho rmo nas ve ge ta le s auxinas y c ito quininas que de te rminan
la pro life rac ió n c e lular ne o plásic a y o rig inan un tumo r c o no c ido c o mo “ag alla de
c o ro na”. El ADN-T dirige ade más la e xpre sió n de ge ne s de sínte sis de amino -azúc are s
únic o s, c o no c ido s c o mo o pinas. Esto s c o mpue sto s re pre se ntan una nue va fue nte de
c arbo no y nitro ge no utilizado s únic ame nte po r Agro bac te rium y le o to rgan un nue vo
nic ho e c o ló g ic o c o n c laras ve nta jas re spe c to a o tras bac te rias c o lo nizado ras de
plantas (De ssaux e t al., 1998).
El frag me nto que se inte gra e n e l ge no ma de la planta (ADN-T) se e nc ue ntra
o rig ina lme nte e n e l pTi (tumo r induc ing ), un plásmido de apro ximadame nte 200 Kb
CAPÍTULO I- Introducción general
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trasc ripc ió n ge né tic a : 1- La pre se nc ia de hidro c arburo s aro mátic o s mo no c íc lic o s
c o mo la ac e to siringo na y vainillina . 2 - La pre se nc ia de mo no sac árido s ác ido s o
ne utro s c o mo g luc o sa y ác ido g luc uró nic o y 3 – El pH ác ido y la ba ja c o nc e ntrac ió n
de fo sfato (Winans, 1990; Winans 1991; Cange lo si e t al., 1990).
Se han de sc ripto vario s ge ne s c ro mo so male s impo rtante s e n la pato g éne sis de
Agro bac te rium; e sto s g e ne s se c o no c e n c o mo c hv (c hro mo so mal virule nc e ). La
pro te ína pe riplasmátic a ChvE, une nume ro so s azúc are s pre se nte s e n la rizo sfe ra e
inte rac c io na c o n la re g ió n pe riplasmátic a de VirA. ChvE e s re spo nsable de se nsib ilizar
a la pro te ína se nso ra VirA a la pre se nc ia de ac e to siringo na y e s ne c e saria para la
c o rre c ta inte rac c ió n c o n la planta e induc c ió n de l re guló n vir. Ade más, ChvE e stá
invo luc rada e n la quimio taxis hac ia vario s azúc are s (Huang e t al., 1990). A pH ác ido 5,5
- 6 (pH c arac te rístic o de la rizo sfe ra ) se induc e la e xpre sió n de l siste ma de do s
c o mpo ne nte s ChvG-ChvI que re gula la e xpre sió n de ge ne s e n re spue sta a
c o ndic io ne s de c ultivo ác idas e ntre lo s que se e nc ue ntra VirG (Charle s y Ne ste r, 1993;
Li e t al., 2002; Yuan e t al., 2008 a ). Una ve z que VirA pe rc ibe e l e stímulo se auto fo sfo rila
y transfie re e l g rupo fo sfo rilo a un re siduo c o nse rvado de VirG (Jin e t al., 1990; Stac he l y
Zambryski, 1986; Stac he l e t al., 1986). VirG fo sfo rilado inte rac c io na e spe c ífic ame nte
c o n se c ue nc ias c o nse nso c o nse rvadas e n lo s pro mo to re s, de no minadas vir bo x (Das e t
al., 1986), ac tivando la transc ripc ió n de l re guló n vir (Pazo ur y Das, 1990; Krishnamo han
e t al., 2001; Ge lvin 2005). Lo s ge ne s vir c o dific an la maquinaria de transfe re nc ia de l
ADN-T fo rmada po r un T4SS (ve r se c c io n Se c re c io n de Pro te inas e n Bac te rias Gram
ne gativas). Este siste ma e s c o no c ido c o mo T-pilus e inte rac c io na fisic ame nte c o n la
c e lula ho spe dado ra transpo rtando e l ADN-T de sde e l c ito plásma bac te riano hac ia e l
c ito plásma de la c é lula ve g e ta l (Christie e t al., 2005). Una ve z de ntro de l ho spe dado r,
e l ADN-T simple c ade na se dirige a l núc le o e inte gra e n e l ge no ma e uc ario ta
induc ie ndo la transc ripc ió n de ho rmo nas ve ge ta le s re spo nsable s de la pro life rac ió n
c e lular y de e nzimas que c ata lizan la pro duc c ió n de o pinas (Fig ura 1.3).
1.6 Otros factores afectan la virulencia de Agrobacterium
La inte gridad y lo s c o mpo ne nte s de la me mbrana de Agro bac te rium tie ne n un
ro l fundame ntal e n e l pro c e so infe c tivo e invasió n a la planta ho spe dado ra . Lo s
e ve nto s que inic ian la infe c c ió n de Ag ro bac te rium c o mie nzan c o n la quimio taxis,
c o lo nizac ió n y adhe sió n a la supe rfic ie de c é lulas ve ge ta le s (Matthysse 1986, 1987). Se
ha de sc ripto un lo c us e n e l plásmido c ríptic o AT (attA1A2BCDEFGH) invo luc rado e n la
adhe sió n y la virule nc ia (Matthysse e t al., 1996). Sin e mbargo , si b ien la pre se nc ia de l
plásmido AT no e s de te rminante para la adhe sió n y virule nc ia de Ag ro bac te rium,
mutante s e n attG o attC so n do minante s ne gativas e n las que la adhe sió n y virule nc ia
CAPÍTULO I- Introducción general
9
se e nc ue ntran b lo que adas, e l me c anismo po r e l que e sto o c urre e s aún de sc o no c ido
(Matthysse e t al., 2008). Lo s po lisac árido s de supe rfic ie han mo strado se r ne c e sario s
para la adhe sió n a la planta y jue gan un ro l fundame ntal e n la virule nc ia de
Agro bac te rium. Mutante s e n e l EPS (e xo po lisac árido s) o LPS (lipo po lisac árido s)
pre se ntan re duc c ió n o ause nc ia de virule nc ia (Tho masho w e t al., 1987, Marks e t al.,
1987; Kamo un e t al., 1989; Me tts e t al., 1991). ChvA y ChvB e stán invo luc rado s e n la
e xpo rtac ió n de g luc ano s c íc lic o s ne utro s y so n ne c e sario s para la adhesió n a la c é lula
ho spe dado ra (Zo rre guie ta e t al., 1988; Zo rre guie ta y Ugalde , 1986). La ho me o stasis de
la me mbrana e xte rna de Agro bac te rium e s impo rtante e n e l de sarro llo de l pro c e so
infe c tivo . Se ha pre dic ho que so lo e l 10% de las bac te rias pre se nta fo sfatidilc o lina (PC)
e n la me mbrana y é ste e s e l c aso de Ag ro bac te rium que po se e 23% de PC e ntre lo s
fo sfo lípido s que c o mpo ne n la me mbrana inte rna y e xte rna . Mutante s que no sinte tizan
PC e n las me mbranas de Agro bac te rium mo straro n ause nc ia de l T4SS y so n avirule ntas
(Klüse ne r e t al., 2009; We sse l e t al., 2006).
El o pe ro n re pABC c o ntro la la re plic ac ió n, partic ió n y núme ro de c o pias de l
plásmido Ti y e s ac tivado dire c tame nte po r e l siste ma VirA-VirG, po r lo que la pre se nc ia
de ac e to siringo na aume nta e l núme ro de c o pias de l plásmido Ti y pro mue ve la
virule nc ia (Cho y Winans, 2005). El quo rum se nsing bac te riano tambié n tie ne una
influe nc ia impo rtante en la virule nc ia de Agro bac te rium. Este siste ma está fo rmado po r
una N-3-o xo o c tano il-L-ho mo se rina lac to na sintasa (3-o xo -C8 HSL sintasa ) TraI (Fuqua y
Winans, 1994; Hwang e t al., 1994) y un re c e pto r de 3-o xo -HSL, TraR (Hwang e t al., 1994;
Zhang e t al., 1993). La e xpre sió n de TraR se induc e e n pre se nc ia de o pinas
pro ve nie nte s de c é lulas ve g e ta le s infe c tadas (Be c k vo n Bo dman e t al., 1992; Fuqua y
Winans, 1996 a ) po r lo que la c o njugac ió n so lo o c urre e n e l c o nte xto de l tumo r
(Ge ne te llo e t al., 1977; Ke rr e t al., 1977). A a ltas de nsidade s po blac io nale s, se
ac umulan mo lé c ulas de 3-o xo HSL (qu ho rmo nas) y se une n a l re c e pto r TraR. El
c o mple jo TraR-3-o xo HSL ac tiva lo s ge ne s b lanc o e n e l plásmido Ti e ntre lo s que se
inc luye n aque llo s ne c e sario s para la c o njugac ió n (Fuqua y Winans, 1996 a ) y ade más
induc e la transc ripc ió n de l o pe ro n re pABC re spo nsable de l aume nto de l núme ro de
c o pias de l plasmido Ti (Bre nc ic y Winans, 2005). La amplific ac ió n de l núme ro de c o pias
de l plásmido Ti y la induc c ió n de la transfe re nc ia c o njugativa de l plásmido Ti so n
impo rtante s para la infe c c ió n c o le c tiva de Agro bac te rium y la se ve ridad de lo s
tumo re s g e ne rado s.
Dive rso s trabajo s de sc ribe n la re spue sta de la planta a la infe c c ió n de
Agro bac te rium y a lguno s me c anismo s de inte rac c ió n que po sibilitan e l é xito de la
c o lo nizac ió n bac te riana . La e xpre sió n de l ADN-T e n e l c ro mo so ma ve g e ta l de la s
plantas transfo rmadas induc e la sínte sis de c ito quininas y ác ido indo l-3-ac é tic o (IAA)
CAPÍTULO I- Introducción general
10
que re sultan e n la pro life rac ió n c e lular ne o plásic a . IAA e s una fito ho rmo na c lave e n
c re c imie nto y e l de sarro llo ve ge ta l (Te a le e t al., 2006) e inhibe la e xpre sió n de l re guló n
vir c o mpitie ndo c o n e l siste ma de do s c o mpo ne nte s VirA-VirG po r las se ñale s fe nó lic as
libe radas de las he ridas ve ge ta le s, pro bable me nte c o mo me c anismo de apagado de
la e xpre sió n de lo s ge ne s vir una ve z e stab le c ido un tumo r (Liu y Ne ste r, 2006). Las
c é lulas e uc ario tas transfo rmadas, inte rfie re n c o n e l siste ma de quo rum se nsing
bac te riano libe rando GABA. Este c o mpue sto ac tiva e l me c anismo de quo rum
que nc hing bac te riano que c o nsiste e n una γ-hidro xibutirato de shidro ge nasa y una
ho mo se rin lac to nasa que de gradan las qu ho rmo nas de l siste ma de quo rum se nsing . El
me c anismo de quo rum que nc hing o inac tivac ió n de l quo rum se nsing , a te núa la
virule nc ia de Ag ro bac te rium (Carlie r e t al., 2004; Che vro t e t al., 2006). El ác ido siá lic o
(SA) e s una mo lé c ula c lave e n la re gulac ió n de la de fe nsa ve ge ta l que c o ntro la la
e xpre sió n de l re guló n vir inhib ie ndo e spe c ífic ame nte e l do minio kinasa de VirA, e
induc ie ndo la e xpre sió n de l siste ma de quo rum que nc hing , attLM (Yuan e t al., 2007). Se
ha pub lic ado un traba jo que c o mpara e l transc ripto ma de Ag ro bac te rium e n
re spue sta a e sto s c o mpue sto s liberado s po r la planta , GABA, IAA y SA, durante e l
transc urso de la inte rac c ió n c o n la planta . Ade más de re spue stas e spe c ífic as a GABA,
IAA y SA, e n Agro bac te rium e xiste una re spue sta so lapada a lo s tre s c o mpue sto s, que
inc luye ge ne s de virule nc ia y de re spue sta a l quo rum se nsing . Esto re fle ja un inte nso
inte rc ambio de mo lé c ulas se ñal e ntre Agro bac te rium y su ho spe dado r ve ge ta l y
e vide nc ia un pre c iso balanc e c o -e vo lutivo e n e l que Agro bac te rium ha de sarro llado
la habilidad de utilizar se ñale s ve ge ta le s para su pro pio be ne fic io (Yuan e t al., 2008).
1.7 Importancia biotecnológica de Agrobacterium
La c o lo nizac ió n ge né tic a me diada po r Ag ro bac te rium hizo de e sta bac te ria un
mo de lo de e studio e n e l áre a de inte rac c ió n planta -pató ge no . El me c anismo
so rpre nde nte de transfe re nc ia ho rizo nta l e ntre do minio s tan dife re nte s ha po sibilitado
e l uso de Ag ro bac te rium c o mo una po de ro sa he rramie nta b io te c no ló g ic a . Se han
de sarro llado varias e strate g ias basadas e n e l pTi mo dific ado para la transfo rmac ió n
ve g e ta l. En ge ne ral, lo s ge ne s de pro duc c ió n de o pinas se de le c io nan y se c lo nan e n
su lugar ge ne s de inte ré s ag ro e c o nó mic o . Lue go se c o -c ultivan Ag ro bac te rium (e n
c o ndic io ne s de induc c ió n de virule nc ia ) y un frag me nto de te jido ve ge ta l para pe rmitir
la infe c c ió n, las c é lulas transfo rmadas se de s-dife re nc ian fo rmando una e struc tura
c o no c ida c o mo “c a llo ”. Las c é lulas de l c a llo se se le c c io nan c o n marc ado re s de
se le c c ió n ade c uado s y se re ge ne ran plantas a partir de e llas (Be van e t al., 1992; Fra le y
e t al., 1983; Ge lvin, 2006; Le e y Ge lvin, 2008).
El de sarro llo de siste mas binario s, e n lo s que e l ADN-T y plásmido s ac c eso rio s de
virule nc ia e stán se parado s e n do s re plic o ne s dife re nte s, aume nta la e fic ienc ia de
CAPÍTULO I- Introducción general
11
transfe re nc ia ge nétic a y rango de ho spe dado r de Agro bac te rium (Ho e ke ma e t al.,
1983). La transfo rmac ió n ve ge ta l me diada po r A. tume fac ie ns e s e stable y he re dable y
no só lo se limita a g e ne s de inte ré s agro e c o nó mic o s sino que e s ade más e s aplic ada
para pro duc ir vac unas o ra le s ve g e ta le s (Rybic ki, 2009). El uso de A. tume fac ie ns
c o nfie re ve nta jas fre nte a o tras té c nic as de intro duc c ió n de ADN e n c é lulas ve ge ta le s,
de bido a la a lta fre c ue nc ia de inte grac ió n ge né tic a e n fo rma e stable y a l ba jo
núme ro de c o pias de l transgé n e n las c é lulas transfo rmadas (Mc Co rmac e t al., 1998).
Estas c arac te rístic as han po te nc iado e l uso de Ag ro bac te rium inc luso e n e spe c ie s
re c a lc itrante s c o mo mo no c o tile dó ne as (Po pe lka e t al., 2003; Khanna y Daggard, 2003;
Mitic e t al., 2004). Se ha de sc ripto e l rang o de ho spe dado r de Ag ro bac te rium se
e xtie nde virtualme nte a to das las e spe c ie s e uc ario tas, inc luye ndo ho ng o s, e rizo s de
mar y c é lulas animale s y humanas. Agro bac te rium e s c apaz de transfe rir e l ADN-T e
inye c tar pro te ínas e n e sto s ho spe dado re s (Cito vsky e t al., 2007; Lac ro ix, 2008; Pe lc zar e t
al., 2004). La pe rspe c tiva de usar a Ag ro bac te rium c o mo ve c to r e n te rapia ge né tic a
e stá e mpe zando a e studiarse y o fre c e un pano rama sumame nte a le ntado r
(Zie mie no wic z, 1999; Lac ro ix e t al., 2006; Kunik e t al., 2001; Tzfira e t al., 2006).
1.8 Sistemas de secreción de proteínas en bacterias Gram negativas
La se c re c ió n de pro te ínas jue ga un ro l e se nc ia l e n las inte rac c io ne s b ió tic as
e ntre bac te rias y c o n sus ho spe dado re s e uc ario tas. Muc has pro te ínas so n inye c tadas
e n e l ho spe dado r dire c tame nte y tie ne n la habilidad de mo dific ar la fisio lo g ía c e lular
para pro mo ve r la c o lo nizac ió n bac te riana (to xinas y pro te ínas e fe c to ras). Mie ntras
a lg uno s siste mas implic an la translo c ac ió n de pro te ínas a l pe riplasma inic ia lme nte y
lue go a l me dio e xtrac e lular, o tro s siste mas so n c apac e s de transpo rtar sus sustrato s a
travé s de las do s me mbranas sin c o ntac to c on e l pe riplasma. Hasta e l mo me nto , varias
c lase s de siste mas de se c re c ió n de pro te ínas han sido de sc ripto s (Figura 1.4):
Lo s siste mas Sec y TAT so n unive rsa le s y se e nc ue ntran e n Eubac te ria , Arc hae a y
Euc ario tas. El sistema Sec re c o no c e una se ña l hidro fó bic a e n e l e xtre mo N-te r de la
pro te ína sustrato y la translo c a e n fo rma de sple gada . La pro te ína c ito plasmátic a Se c A
e ne rg iza e l pro c e so usando la hidró lisis de l ATP y e l g radie nte de pro to ne s (Figura 1.4a ).
El sistema TAT re c o no c e un mo tivo ric o de re siduo s amino ac ídic o s básic o s e n e l
e xtre mo N-te r de las pro te ínas sustrato . Lo s sustrato s so n translo c ado s pleg ado s
utilizando e l g radie nte de pro to ne s c o mo únic a fue nte de e ne rg ía (Mulle r, 2005)
(Figura 1.4b ). Lo s siste mas Se c y TAT e xpo rtan pro te ínas a l pe riplasma y pue de n fo rmar
parte de siste mas de se c re c ió n de pro te ínas tipo II y tipo V (Figura 1.4 a ,b ,c y f). En A.
tume fac ie ns se ha de sc ripto un siste ma Se c (Fe ldman e t al., 2008) y un siste ma TAT
(Ding y Christie , 2003). El siste ma TAT e stá invo luc rado e n la mo vilidad, virule nc ia ,
c re c imie nto y d ivisió n c e lular, e s re spo nsable de la se c re c ió n de e nzimas ple gadas y
CAPÍTULO I- Introducción general
12
unidas a sus c o fac to re s que func io nan e n la re spirac ió n a lte rnativa y se ha mo strado
que c o ntribuye e n la b io g é ne sis de l flag e lo y a la re spue sta quimio tác tic a hac ia la
planta (Ding y Christie , 2003).
El siste ma de se c re c ió n de pro te ínas tipo II (T2SS) translo c a sus pro te ínas
sustrato s e n do s paso s: lo s sustrato s atravie san la me mbrana inte rna a travé s de l
siste ma Se c o de l siste ma TAT inic ia lme nte y una ve z e n e l pe riplasma, las mo lé c ulas
so n e xpo rtadas a travé s de l T2SS. El T2SS e s un multic o mple jo de pro te ínas que
atravie sa la e nvo ltura c e lular, la se c re c ió n e s de pe ndie nte de una ATPasa intrac e lular
que pro ve e la e ne rg ía ne c e saria para re gular la ape rtura o c ie rre de l c anal (Figura
1.4c ). La se ñal para la se c re c ió n me diada po r e ste siste ma no ha sido c o mple tame nte
e stable c ida pe ro se c re e que invo luc ra e l re c o no c imie nto de mo tivo s e struc turale s
ple gado s (Fillo ux, 2004). El T2SS e stá e spe c ia lizado e n pro mo ve r func io ne s e spe c ífic as
de la inte rac c ió n c o n e nto rno s b ió tic o s o abió tic o s y e s re spo nsable de la se c re c ió n de
pe c tinasas y pe c tato liasas e n pató ge no s ve ge ta le s c o mo Erwinia c hrysanthe mi, E.
amylo vo ra y Xantho mo nas c ampe stris pv.c ampe stris. Sin e mbarg o , o tro s mie mbro s de
la rizo sfe ra c o mo A. tume fac ie ns y S. me lilo ti c are c e n de e sto s siste mas (Cianc io tto ,
2005; Fillo ux, 2004).
El siste ma de se c re c ió n de pro te ínas tipo III (T3SS) partic ipa e n inte rac c io ne s
pató ge nas o mutualístic as c o n ho spe dado re s ve g e ta le s y animale s. Su maquinaria e s
llamada inye c to so ma y pare c e te ne r un o rige n e vo lutivo c o mún c o n e l flag e lo
(Co rne lis, 2006). Lo s T3SS so n de pe ndiente s de apé ndic e s e xtrac e lulare s, que ac túan
c o mo c ana le s. Están fo rmado s po r una se rie de anillo s basa le s anc lado s a la
me mbrana inte rna y e xte rna de la bac te ria que se c o ne c tan c o n un filame nto que
pro truye más a llá de la me mbrana e xte rna . Este filame nto atravie sa la me mbrana de l
ho spe dado r e inye c ta pro te ínas e fe c to ras dire c tame nte e n e l c ito plasma de la c é lula
e uc ario ta . Una ATPasa c o nse rvada se aso c ia c o n la base de l inye c to so ma y e ne rg iza
e l transpo rte (Fig ura 1.4d). Las pro te ínas e fe c to ras mo dulan una g ran variedad de
func io ne s c e lulare s inc luye ndo re spue stas inmune s y de de fe nsa (Grant e t al., 2006;
Mo ta y Co rne lis, 2005). Lo s sustrato s atravie san e l filame nto o aguja e n fo rma
de sple gada y po se e n una se c ue nc ia N-te r re c o no c ida po r c hape ro nas que asiste n la
translo c ac ió n (Co rne lis, 2006; De akin y Bro ughto n, 2009). Aunque e l ge no ma de
Agro bac te rium no pre se nta un T3SS para la se c re c ió n de fac to re s de virule nc ia (Wo o d
e t al., 2001; Go o dne r e t al., 2001), o tro s mie mbro s de Rhizo biac e ae si lo s a lbe rgan,
sie ndo é sto s re spo nsable s de la se c re c ió n de las pro te ínas No ps (no dulatio n o ute r
pro te ins) y de o tras que de se nc ade nan la re spue sta de fe nsiva hipe rse nsitiva de la
planta (De akin y Bro ughto n, 2009). Lo s T3SS so n induc ib le s po r flavo no ide s ve ge ta le s y
ne c e sitan de No dD para su e xpre sió n (Vipre y e t al., 1998). El T3SS y las pro te ínas No p
CAPÍTULO I- Introducción general
13
pue de n te ne r una influe nc ia neg ativa , po sitiva o ne utra e n la simbio sis (Marie e t al.
2001; 2003). En a lg unas e spe c ie s las pro te ínas No ps suprimie ro n la re spue sta inmune de
la planta durante e l pro c e so de no dulac ió n (Bartse v e t. al., 2004).
El siste ma de se c re c ió n de tipo IV (T4SS) e s e l únic o c apaz de translo c ar ADN y
pro te ínas de ntro de la c é lula e uc ario ta ho spe dado ra . El mo de lo de e studio de T4SS ha
sido e l que a lbe rg a A. tume fac ie ns, de b ido a que fue e l prime ro e n se r ide ntific ado y
c arac te rizado po r se r re spo nsable de la translo c ac ió n de l c o mple jo nuc le o pro te ic o
que c o ntie ne e l ADN-T y de la c o lo nizac ió n ge né tic a de la c é lula ve ge ta l
ho spe dado ra (ve r se c c ió n Me c anismo de virule nc ia de Ag ro bac te rium). Se pro po ne
que lo s T4SS han e vo luc io nado de siste mas de c o njugac ió n bac te riano s. Lo s mayo re s
c o mpo ne nte s de l T4SS so n VirB2-VirB11 y VirD4. El c o mple jo multíme ro po se e tre s
sube struc turas: e l ho mo multíme ro de re c lutamiento de l sustrato , un c anal de
translo c ac ió n que atravie sa la me mbrana e xte rna y un filame nto e xtrac e lular unido a
la supe rfic ie de la c é lula e uc ario ta (pilus c o njug ativo o pilus de transfe re nc ia )
(Casc a le s y Christie , 2003). Lo s sustrato s po se e n una se c ue nc ia se ñal e n e l e xtre mo C-
te r y mo tivo s inte rno s para su translo c ac ió n. La e ne rg ía para e l pro c e so de transpo rte
e s pro vista po r la hidró lisis de l ATP (Figura 1.4e ).
El siste ma de se c re c ió n de pro te ínas tipo V (T5SS) e stá c o mpue sto po r pro te ínas
llamadas auto transpo rtado re s de bido a que e l do minio C-te r fo rma un barril de ho jas β
c o n e l po te nc ia l de fo rmar un po ro a travé s de l c ual e l do minio pasa je ro N-te r traslo c a .
Co mo se me nc io nó , lo s sustrato s so n translo c ado s a l e spac io pe riplasmátic o a travé s
de l siste ma Se c o de l siste ma TAT (Figura 1.4f). Estudio s re c ie nte s sug ie ren que pro te ínas
ac c e so rias fac ilitarían la translo c ac ió n a travé s de la me mbrana e xte rna (Be rnste in,
2007; Dautin y Be rnste in, 2007). Un g ran núme ro de sustrato s so n se c re tado s a travé s de
T5SS e inc luye n fac to re s de virule nc ia c o mo adhe sinas e n e l fito pató ge no E.
c hrysanthe mii (Ro jas e t al., 2004). Este siste ma no ha sido c arac te rizado e n
Rhizo biac e ae hasta e l mo me nto , sin e mbargo e n la se c ue nc ia ge nó mic a de A.
tume fac ie ns se ha identific ado un putativo T5SS c uya re le vanc ia aún no ha sido
de te rminada (Wo o d e t al., 2001; Go o dne r e t al., 2001; Pre sto n e t al., 2005).
El siste mas de se c re c ió n de pro te ínas tipo VI (T6SS) ha sido ide ntific ado y
c arac te rizado re c ie nte me nte . Co nstituye un inye c tiso ma pare c ido s a la c o la de lo s
fag o s c o n e l po te nc ia l de transpo rtar pro te ínas e fe c to ras dire c tame nte a l c ito plasma
de la c é lula ho spe dado ra de la misma mane ra que lo s T3SS y T4SS (Le iman e t al., 2009)
(Figura 1.4g ). El T6SS e s ne c e sario para la virule nc ia de Ag ro bac te rium, y e s re que rido
para una e fic ie nte c o lo nizac ió n de las ra íc e s e n e spe c ie s c o mo Rhizo bium y
Me so rhizo bium. Se ha pro pue sto un mo de lo que inc luye una c hape ro na
c ito plasmátic a c o n ac tividad ATPasa , un c anal que fo rma un pue nte e ntre la
CAPÍTULO I- Introducción general
me m
e n e
se c u
al., 2
1.9
ac tiv
pro te
me m
siste m
pro te
c é lul
2003
e xtra
que
Figura
bac te
Siste m
inte rna
ho spe
c o mp
e n gris
mbrana inte
e l e xtre mo
e nc ia se ña
007) (Figura
Sistema d
Lo s T1SS
vidad de AT
e ína de fusi
mbrana e xte
ma tripartito
e ínas sustra
a e n un p
). Esta o rg a
ac e lular sin
e l sustrato r
1.4: Esque
e rias Gram
ma Tipo III. e
a bac te rian
e dado ra . En
o ne nte s de
s e l pe ptido
rna y e xte rn
(Shrivastav
al e n e l e xtre
a 1.4g ).
de Secreció
S e stán fo r
TPasa pe rte
ó n de me m
e rna (OMP,
o fo rma un
ato s so n se c
aso y sin in
anizac ió n p
c o ntac to c
re c o no c e a
e ma de lo s
ne g ativas.
e - Siste ma T
na . ME: Me
n c o lo r am
e me mbran
o se ñal. Fig u
na bac te ria
a y Mande
e mo N-te r p
ón de Prote
rmado s po
e ne c ie nte a
mbrana (MF
, o ute r me m
n c ana l c o
c re tadas a
nte rme diario
pe rmite la e
c o n e l pe ri
a la pro te ína
dife re nte s
a - Siste ma
Tipo IV. f - S
e mbrana e x
marillo se m
na, e n rojo
ra adaptad
ana y un pil
e , 2008). La
para su tran
ínas Tipo 1 (
r una pro t
a la supe rfa
P, me mbra
mbrane pro
o ntinuo de
travé s de
o s pe riplasm
e xc lusió n de
plasma. Exi
a ABC que
siste mas de
a Se c . b-
Siste ma Tipo
xte rna bac
mue stran lo
e l filame nto
da de Tsai-T
us c o n pro t
as pro te ína
nslo c ac ió n.
(T1SS)
te ína de la
amilia ABC (
ne fusió n pr
o te in) (Figu
translo c ac
las do s me
mátic o s (De
e c o mpue s
istiría una a
inte rac c io n
e se c re c ió n
Siste ma TA
o V. g - Siste
te riana . MH
o s c o mpo ne
o , e n ve rde
ie n Tse ng , 2
CAPÍ
te ínas fo rma
as e xpo rtad
(Wu e t al.,
a me mbra
(ATP binding
ro te in) y un
ra 1.5). El e
c ió n a l e xte
e mbranas q
e le pe la ire ,
to s dire c ta
aso c iac ió n
na c o n la p
de pro te ín
AT. c - Siste
e ma Tipo VI
H: Me mbra
e nte s ATPa
e pro te inas
2009
ÍTULO I- Intro
ado ras de
das c are c e
2008; Pukat
na inte rna
g c asse tte )
a pro te ína
e nsamblad
e rio r c e lula
que de limit
2004; Ande
me nte a l m
o rde nada
ro te ína MFP
nas pre se nte
e ma Tipo II.
. MI: Me mb
na de la c
asa , e n azu
translo c ad
ducción gen
14
po ro s
e n de
tzki e t
c o n
, una
de la
o de l
r. Las
an la
e rse n,
me dio
e n la
P que
e s e n
d -
brana
c é lula
ul lo s
do ras,
neral
15
e s la re spo nsable de re c lutar a l c o mpo ne nte OMP. La unió n de l sustrato e s ne c e saria
para e l e nsamblado de l siste ma tripartito y la inte rac c ió n e ntre e l c o mpo ne nte MFP y
OMP e s e spe c ífic a . La inte rac c ió n e ntre la pro te ína ABC y su sustrato ha sido
de mo strada e n e l c aso de la α-he mo lisina de Esc he ric hia c o li y e l he mó fo ro HasA de
Se rratia marc e sc e ns. (Lé to ffé e t al., 1996, 1994; Ho lland e t al., 2005, Bine t e t al., 1997,
1997a ; Akatsuka e t al., 1997).
La mayo ría de lo s TISS de sc ripto s tie ne un rango de sustrato s muy limitado y se
ha de sc ripto la fa lta de c o mple me ntac ió n e ntre lo s c o mpo ne nte s de dife rente s
e spe c ie s pro bable me nte de bida a la po c a similitud e ntre lo s sustrato s transpo rtado s
(Bine t y Wande rsman, 1995). Estudio s c o n siste mas de se c re c ió n híbrido s mo straro n que
e l c o mpo ne nte ABC e s e l re spo nsable de la e spe c ific idad e n e l re c o no c imie nto de
sustrato s. Lo s sustrato s de lo s TISS no po see n se c ue nc ia se ñal e n e l e xtre mo N-te r y e n
c ambio se pro po ne que te ndrían una se ñal no c livable de amino ác ido s c arg ado s
ne gativame nte se guido s po r vario s amino ác ido s hidro fó bic o s e n lo s último s 60 re siduo s
de l e xtre mo C-te r. La se c ue nc ia se ñal de se c re c ió n se ría e spe c ífic a para c ada
siste ma (Bine t e t al., 1997; De le pe la ire , 2004; Hui e t al., 2000; Ho lland e t al., 2005). Se ha
o bse rvado que la mayo ría de lo s sustrato s de lo s TISS pre se ntan mo tivo s ac ídic o s
c o nse rvado s o RTX (re pe at in to xin) y se ha pro pue sto que e ste mo tivo te ndría la
func ió n de re trasar e l ple g amie nto (Che nal e t al., 2009). Po r e studio s de RMN se ha
mo strado que la re g ió n c o n RTX e s bastante de se struc turada (Izadi-Prune yre e t al.,
Figura 1.5: Esque ma de l T1SS de E. c o li. HlyB e s e l c o mpo ne nte ABC, HlyD e s e l
c o mpo ne nte ABC y To lC e s e l c o mpo ne nte de me mbrana e xte rna . MI: Me mbrana
inte rna . ME: Me mbrana e xte rna . Figura adaptada de Davidso n e t. al., 2008.
CAPÍTULO I- Introducción general
16
1999). El sustrato c o me nzaría a ple garse mie ntras e s translo c ado , de ntro de l
c o mpo ne nte OMP (Fe rnande z y de Lo re nzo , 2001).
1.10 Proteínas accesorias de los T1SS: Proteína de Fusión de Membrana (MFP)
Esta familia de pro te ínas se e nc ue ntra so lo e n bac te rias Gram ne gativas. La
se c ue nc ia amino ac ídic a pre se nta un do minio N-te r hidro fó bic o de anc la je a la
me mbrana inte rna y un do minio C-te r re lativame nte c o nse rvado de inte rac c ió n c o n e l
c o mpo ne nte de me mbrana e xte rna OMP. El re c o no c imie nto de l sustrato po r e l
c o mpo ne nte ABC induc e la inte rac c ió n c o n e l c o mpo ne nte MFP (Lé to ffé e t al., 1996;
Thanabalu e t al., 1998). Hay e vide nc ias de que e l c o mpo ne nte MFP se e nc ue ntra
c o mo o lig ó me ro e n e spira l. Lue go que se fo rma e l c o mple jo de la “translo c asa” ABC-
MFP, e l c o mpo ne nte MFP re c luta e l c o mpo ne nte de me mbrana e xte rna OMP
ase gurando e l c o rre c to e nsamblado de l T1SS (Ande rse n, 2003; Lo be danz e t al., 2007;
Symmo ns e t al., 2009; To uzé e t al., 2004).
1.11 Proteínas accesorias de los T1SS: Proteína de membrana externa (OMP)
La pro te ína más e studiada de e sta familia ha sido To lC de E. c o li. Esta pro te ína
e s c apaz de inte rac c io nar c o n translo c asas de lo s siste mas MDR o c o n las translo c asas
de T1SS (Paulse n e t al., 1997). La e struc tura c rista lina de To lC mo stró se r únic a ,
o rganizada c o mo tríme ro , fo rmando un c anal de 30 Å lo que pe rmitiría e l pasa je de
mac ro mo lé c ulas pro te ic as parc ia lme nte ple g adas y c o n un do minio de α-hé lic e que
se e xtie nde ampliame nte e n e l pe riplasma y que inte rac c io na c o n la translo c asa de
me mbrana inte rna ABC-MFP (Ande rse n, 2003; Ko ro nakis, 2003). La e struc tura c rista lina
de l c o mpo ne nte MFP Me xA fo rmando un c o mple jo c o n To lC y Ac rB (e ste último de la
familia RND) mue stra que Me xA po se e sus e xtre mo s N-te r y C-te r muy c e rc a de la
me mbrana inte rna . Ensayo s de mutag é ne sis y supre sió n sug ie re n que e l e xtre mo C-te r
inte rac c io na c o n e l transpo rtado r de me mbrana inte rna mie ntras que su e xtre mo N-te r
se ría re spo nsable de la o ligo me rizac ió n de l MFP (Elkins y Nikaido , 2003; Ne hme y Po o le ,
2005; Ne hme e t al., 2004).
Se han ide ntific ado dive rso s fac to re s de virule nc ia c o n ac tividad
me ta lo pro te asas, adhe sinas o g lic anasas que so n se c re tado s po r TISS e n lo s
fito pató ge no s Pse udo mo nas. syringae pv to mato , Ralsto nia so lanac e arum, X.
axo no po dis pv. c itri and Xyle lla fastidio sa (De le pe la ire , 2004).
CAPÍTULO I- Introducción general
17
En Rhizo biac e ae se ha de sc ripto e l T1SS PrsDE, c o nse rvado e n rizo bio s muy
e mpare ntado s e ntre sí. En a lg unas c e pas c o mo A34 de R. le gumino sarum bv. vic iae y
R. le gumino sarum bv. trifo lii e s re que rido para e l e stable c imie nto de una simbio sis
e fe c tiva , a pe sar de que no lo e s para la c e pa 3841 de R. le g umino sarum bv. vic iae
(Finnie e t al., 1997; Kró l y Sko rupska , 1997; Kre he nbrink y Do wnie , 2008). La func ió n
pre dic ha de varias de las pro te ínas sustrato de PrsDE e s c o nsiste nte c o n func io ne s
auxiliare s e n la no dulac ió n, c o mo adhe sió n, deg radac ió n de la pare d c e lular, e sc ape
de nó dulo s se ne sc e nte s o mo dulac ió n de l po o l e xtrac e lular de ATP. Russo e t al.
de mo straro n que e l e xo po lisac árido ac ídic o bac te riano (EPS) e s e se nc ia l para la
fo rmac ió n de b io films in vitro y que las pro te ínas se c re tadas po r PrsDE se rían
impo rtante s para la madurac ió n de l b io film. PrsDE se c re ta do s g lic anasas que c livan e l
EPS, PlyA y PlyB, que se rían re que ridas para la sínte sis de una po lisac árido de tamaño
silve stre y para e l e nsamblado de una matriz de b io film típic a (Finnie e t al., 1998; Russo
e t al., 2006). Ade más, e ntre lo s sustrato s se c re tado s se e nc ue ntran las pro te ínas Rap
(Rhizo bium adhe ring pro te ins,), que influirían e n las pro pie dade s de adhe sió n de la
bac te ria ; sin e mbarg o , aún no se c o mpre nde e l ro l que e stas pro te ínas te ndrían e n la
inte rac c ió n c o n la ra íz y e n e l pro c e so de fo rmac ió n de l b io film (Ausme e ss, 2001; Russo
e t al., 2006). En R. le gumino sarum, c e pa A34, e l TISS, PrsDE, ha mo strado se r ne c e sario
para e l pro c e so de c o lo nizac ió n, adhe sió n, fo rmac ió n de b io film y no dulac ió n (Finnie
e t al., 1998; Russo e t al., 2006) (ve r e n Capitulo II, Se c c ió n Siste ma PrsDE de R.
le gumino sarum).
Do wnie e t al., analizaro n la pre se nc ia de T1SS e n e l ge no ma de R.
le gumino sarum c e pa 3841. Ide ntific aro n c uatro T1SS po r similitud de se c ue nc ia , e l
ho mó lo go a PrsDE de la c e pa A34, mo stró se r la vía princ ipal de se c re c ió n de pro te ínas
e n la c e pa 3841. No e nc o ntraro n fe no tipo s aso c iado s a las mutac io ne s e n lo s o tro s tre s
TISS pre dic ho s, ni pro te ínas c uya se c re c ió n e stuvie ra a fe c tada e n las mutantes e n
dic ho s siste mas, lo que sug ie re una re gulac ió n dife re nc ia l de la se c re c ió n o
c o ndic io ne s de c ultivo no e stab le c idas aún para de te c tarlas. Un e studio in-silic o de lo s
sustrato s po sib le s de l siste ma PrsDE e n 3841 le s pe rmitió ide ntific ar 14 pro te ínas
dife re nte s. La se c ue nc iac ió n de l e xtre mo N-te r mo stro que 12 de las pro te ínas
pre dic has e ran de pe ndie nte de l T1SS, PrsDE (3841) para su se c re c ió n. Sie te de e stas
pro te ínas ide ntific adas habían sido de sc riptas c o mo sustrato s de l sistema PrsDE e n la
c e pa A34 (Tabla 1) (Do wnie e t al., 2008).
CAPÍTULO I- Introducción general
18
Proteína Función Cita
No dO Fac to r de no dulac ió n* Finnie e t al., 1997
PlyA Glic anasa aso c iada a me mbrana c e lular* Finnie e t al., 1998
PlyB (RL3024) Glic anasa e xtrac e lular* Finnie e t al., 1998
PlyC (RL3023) Pro bable g lic anasa
RapA2 (pRL100451) Pro bable Adhe sina* Russo e t al., 2006
RapB Pro bable Adhe sina* Russo e t al., 2006
RapC Pro bable Adhe sina* Russo e t al., 2006
RL0790 Pro bab le me ta lo pro te asa Zn de pe ndie nte
RL2961 Pro te ína similar a c adhe rina
pRL90140 Pro te ína c o nse rvada
pRL100309 Pro te ína similar a c adhe rina
RL2412 Pro bable Glic o sil hidro lasa
RL1580 Nuc le ó tido difo sfato kinasa
A pe sar de la impo rtanc ia e n dive rso s pro c e so s fisio ló g ic o s y su influe nc ia e n e l
me c anismo de virule nc ia o de simbio sis que mue stran te ne r lo s T1SS de sc ripto s, la
pre se nc ia y e l ro l de e sto s siste mas e n la fisio lo g ía y virule nc ia de A. tume fac ie ns aún
no han sido e studiadas.
Tabla 1.1: Pro te ínas se c re tadas po r e l TISS, PrsDE, de R. le gumino sarum (3841). Func ió n
pre dic ha e n e l c aso de pro te ínas no e studiadas. Las pro te ínas o rtó lo g as a pro te ínas
ya c arac te rizadas e n la c e pa A34 e stán marc adas c o n un aste risc o y se indic a la c ita
de su de sc ripc ió n e n c ada c aso .
CAPÍTULO I- Introducción general
19
1.12 HIPÓTESIS GENERAL
A. tume fac ie ns e s un fito pató g e no que utiliza me c anismo s dive rso s para
adaptarse tanto a la vida libre e n la rizo sfe ra y e l sue lo c o mo a l e nto rno de l
ho spe dado r ve g e ta l que c o lo niza . La se c re c ió n de pro te ínas a l me dio e xtrac e lular a
travé s de siste mas de se c re c ió n tipo I po dría se r o tra e strate g ia de adaptac ió n de e ste
fito pató ge no , que c o ntribuya a su supe rvive nc ia e n lo s dife re nte s nic ho s que habita .
Ade más, la se c re c ió n de pro te ínas po r T1SS po dría influe nc iar dire c ta o indire c tame nte
la pro gre sió n de la infe c c ió n e n e l ho spe dado r ve ge ta l
OBJETIVOS
El objetivo general de e ste trabajo de Te sis e s e va luar e l ro l de SSTI e n la
fisio lo g ía de A. tume fac ie ns. Se pro po ne ide ntific ar un siste ma de se c re c ió n de
pro te ínas tipo I func io nal e n A. tume fac ie ns y sus po sib le s sustrato s.
CAPÍTULO II:
IDENTIFICACIÓN DE UN SISTEMA DE
SECRECIÓN DE PROTEÍNAS TIPO I EN A.
tumefaciens.
21
CAPÍTULO II: IDENTIFICACIÓN DE UN SISTEMA DE SECRECIÓN DE PROTEÍNAS TIPO I EN A.
tumefaciens.
2.1 INTRODUCCIÓN
2.1.1 Transporte a través de la membrana bacteriana
La me mbrana c e lular bac te riana c o nstituye no so lame nte una barre ra físic a ,
sino que e s una e struc tura dinámic a re spo nsable de la inte rac c ió n e ntra la bac te ria y
e l e nto rno que la ro de a . Nume ro so s e ve nto s fisio ló g ic o s e se nc ia le s o c urre n a nive l de
las me mbranas c o mo la c aptac ió n de nutriente s y e xc lusió n de mac ro mo lé c ulas o
c o mpue sto s tó xic o s. Esto s pro c e so s so n re a lizado s po r pro te ínas e spec ia lizadas e ntre
las que se e nc ue ntran las pro te ínas transpo rtado ras pe rtene c ie nte s a la supe rfamilia
ABC.
2.1.2 Transportadores de la superfamilia ABC
Lo s transpo rtado re s ABC (ATP b inding c asse tte , Hyde e t al., 1990) so n una g ran
supe r-familia de pro te ínas inte gra le s de me mbrana , que ac o plan la hidró lisis de l ATP a l
pasaje de muy dive rso s sustrato s a travé s de me mbranas lipídic as e n c o ntra de
g radie nte de c o nc e ntrac ió n (Kuc hle r y Tho rne r, 1992). La familia de ge ne s que
c o dific an transpo rtado re s ABC e s una de las más ampliame nte distribuidas y e stá
pre se nte e n to do s lo s re ino s e studiado s: Arc hae a , Eubac te ria y Eukarya (Ame s e t al.,
1990; Higg ins, 1992). En bac te rias, lo s transpo rtado re s de la supe r-familia ABC e stán
invo luc rado s e n dive rso s pro c e so s me tabó lic o s, no dulac ió n, virule nc ia y pato gé ne sis y
c o ntribuye n a la re siste nc ia a antib ió tic o s y dro gas o bse rvada e n bac te rias pató ge nas
(Davidso n y Che n, 2004; Lube lski e t al., 2007). Dado e l g ran impac to que e sto s
transpo rtado re s tie ne n e n la fisio lo g ía bac te riana , sus disfunc io ne s sue le n te ne r e fe c to s
de le té re o s.
Lo s transpo rtado re s ABC se divide n e n do s g rande s supe r-familias basadas e n la
dire c c ió n de l transpo rte (Fath y Ko lte r, 1993; Saurin e t al., 1999; Davidso n e t al., 2008)
Lo s importadores ABC e stán pre se nte s só lo e n pro c ario tas y de pe nde n de pro te ínas
e xtrac ito plasmátic as ac c e so rias (Shuman y Panag io tidis, 1993). Lo s exportadores ABC
e n c o ntraste , re c lutan sus pro te ínas sustrato dire c tame nte de l c ito plasma o de la c ara
inte rna de la b ic apa lipídic a de la me mbrana inte rna c e lular (Pittman e t al., 2005).
Lo s transpo rtado re s ABC e stán fo rmado s po r do s do minio s de unió n a
nuc le ó tido (NBD; Nuc le o tide Binding Do main) y do s do minio s transme mbrana (TMD;
Trans Me mbrana Do main), c ada uno de e sto s do minio s dime rizan y fo rman un c anal
22
po r do nde lo s sustrato s so n translo c ado s (Saurin e t al., 1999). Lo s do minio s NBD
c o mparte n vario s mo tivo s e struc turale s impo rtante s para la func ió n de transpo rte que
e stán c o nse rvado s e ntre impo rtado re s y e xpo rtado re s (Sc hne ide r y Hunke , 1998). El
mo tivo Walke r A (o P-lo o p ; Walke r e t al., 1982) e stá pre se nte tambié n e n o tras
pro te ínas c o n ac tividad de ATPasa , e l mo tivo LSGGQ (tambié n c o no c ido c o mo C-lo o p
o ABC signature ; Ame s e t al., 1990; Higg ins e t al., 1988); e l mo tivo Walke r B (Walke r e t
al., 1982) c o o rdina e l a taque nuc le o fílic o a l ATP me diado po r una mo lé c ula de H2O; e l
Q-lo o p (Jo ne s y Ge o rge , 2002) e stá e n c o ntac to c o n la inte rfase de l do minio TMD
transmitiendo c ambio s c o nfo rmac io nale s; e l D-lo o p inte rvie ne e n e l c o ntac to e ntre las
do s inte rfac e s de lo s NBD; e l A-lo o p pro ve e re siduo s de inte rac c ió n c o n e l nuc le ó tido y
e l mo tivo Switc h que c o ntribuye e n la re ac c ió n c ata lític a (Ambudkar 2006; Saurin e t
al., 1994). Varias e struc turas de do minio s NBD han sido de te rminadas y mue stran una
c o nfo rmac ió n c o nse rvada . Esto s do minio s pre se ntan sus mo tivo s c o nse nso a la re g ió n
de la inte rfac e c o mpartida y de e sta fo rma se ge ne ran do s do minio s de unió n a ATP.
Esta o rganizac ió n pe rmite la unió n e hidró lisis c o o pe rativa de l ATP. Lo s NBDs de lo s
transpo rtado re s ABC c rista lizado s pe rmane c e n e n c o ntac to me diado po r su e xtre mo
N-te r e n pre se nc ia o ause nc ia de ATP (Jo ne s y Ge o rg e , 2002, 2004; Davidso n, 2002;
Davidso n y Malo ne y, 2007; Za itse va e t al., 2006; Mo o dy y Tho mas, 2005; Linto n y Higg ins,
2007; Re e s e t al., 2009; Lo c he r, 2009).
En c o ntraste c o n lo s do minio s NBD, lo s do minio s TMD varían no table me nte e n su
se c ue nc ia primaria , lo ng itud, arquite c tura y núme ro de se gme nto s transme mbrana
(Ho lland y Blight, 1999). Esta dive rsidad pare c e re lac io narse c o n la dive rsidad de
sustrato s translo c ado s. Lo s TMD so lo c o mparten similitud de se c ue nc ia si translo c an e l
mismo o muy similare s sustrato s e n la misma dire c c ió n a travé s de la me mbrana
(Ho lle nste in e t al., 2007; Saurin e t al., 1994; Dawso n e t al., 2007).
Lo s análisis filo ge né tic o s re a lizado s mue stran que lo s do minio s ABC se
e spe c ia lizaro n te mpraname nte e n las do s subdivisio ne s princ ipale s, impo rtado re s y
e xpo rtado res, pro bab leme nte ante s de la se parac ió n de lo s tre s re ino s: Arc haea ,
Eubac te ria y Eukarya . De bido a e sta subdivisió n te mprana y a la impo rtanc ia que
dic ho s transpo rtado re s pre se ntan e n lo s o rganismo s e studiado s, las se c ue nc ias
g lo ba le s e starían muy c o nse rvadas. Lo s e uc ario tas pro bable me nte adquirie ro n e sto s
transpo rtado re s de las bac te rias simbió tic as que so n anc e stro s pro bable s de o rg ane las
c e lulare s (Saurin e t al., 1999; Davidso n e t al., 2008).
2.1.3 Importadores de la super-familia ABC
Lo s impo rtado re s de la familia ABC, de pe nde n de la pre se nc ia de pro te ínas
ac c e so rias de unió n a sustrato , e n Gram-ne gativas so n pro te ínas pe riplasmátic as o
CAPÍTULO II- Introducción
23
PBP, (pe riplasmic b inding pro te in). Las PBPs une n sustrato c o n a lta a finidad y lo
pre se ntan a l transpo rtado r ABC (Shuman y Panag io tidis, 1993; van de r He ide y
Po o le man, 2002).
Lo s impo rtado re s ABC pre se ntan una o rganizac ió n g e né tic a de l tipo o pe ró n,
e stán fo rmado s po r do s do minio s NBD que pro ve e n la e ne rg ía ne c e saria para la
re ac c ió n de transpo rte y do s do minio s TMD. Esto s do minio s se aso c ian y fo rman e l
c anal po r do nde e l sustrato e s translo c ado . En lo s impo rtado re s lo s do minio s NBD y ABC
e stán c o dific ado s e n dife re nte s c ade nas po lipe ptídic as que se e nsamblan
po ste rio rme nte fo rmando e l c anal c o mple to . En e l mismo o pe ró n se e nc ue ntra
c o dific ada tambié n la pro te ína de unió n a sustrato (PBP) ne c e saria para e l pro c e so de
transpo rte (Saurin e t al., 1999; Davidso n e t al., 2008).
La e struc tura c rista lina de 3 impo rtado re s ABC ha sido de sc ripta y re ve la un
arre g lo similar de lo s do minio s NBD, pe ro lo s do minio s TMD pre se ntan una arquite c tura
no re lac io nada c o n un to ta l de 10 a 20 se g me nto s transme mbrana a e xc e pc ió n de
una hé lic e c o nse rvada que transmite c ambio s c o nfo rmac io nale s (Lo c he r e t al., 2002;
Pinke tt e t al., 2007; Ho lle nste in e t al., 2007 a ; Dawso n y Lo c he r, 2006, 2007). La
dive rsidad de arquite c turas de lo s do minio s TMD e studiado s se re fle ja e n las dife re nte s
e struc turas y ple gamie nto s de sc ripto s para sus pro te ínas de unió n a sustrato s y e stas
dife re nc ias se re lac io nan c o n la c antidad y re lac ió n que hay e ntre lo s sustrato s que
impo rtan. Se han de sc ripto varias subfamilias de pro te ínas de unió n a sustrato c o n
sig nific ativas dife re nc ias e n e struc tura y mo tivo s. (Davidso n y Malo ne y, 2007; Dawso n e t
al., 2007; Jo ne s y Ge o rge , 2002; Mo ure z e t al., 1997).
A pe sar de que e l 15 % de ge no ma de A. tume fac ie ns c o dific a transpo rtado re s
de la familia ABC, la pre se nc ia de impo rtado re s ABC ha sido muy po c o e studiada a
e xc e pc ió n de l siste ma invo luc rado e n la virule nc ia ChvE-GguAB (Huang e t al., 1990).
La unió n de l sustrato a la PBP, ChvE, de e ste impo rtado r de g luc o sa-ga lac to sa , dispara
una se ñal c uya re spue sta e s la e xpre sió n de ge ne s de virule nc ia . Se ha identific ado ,
ade más, un o pe ró n que c o dific a ge ne s c o n ho mo lo g ía a impo rtado re s ABC
(attA1A2BCDEFGH), las mutante s e n e ste siste ma so n avirule ntas y pre se ntan adhe sió n
muy re duc ida o nula a c é lulas ve g e ta le s (Matthysse e t al., 1996). Re c ie nte me nte se ha
de sc ripto un impo rtado r de tric arbo xilato s, ac tCB, re primib le po r DMSO e induc ib le po r
c itrato c uya e xpre sió n e s re gulada po r un siste ma de do s c o mpo ne nte s c o dific ado río
arriba e n e l ge no ma (Liu e t al., 2008).
CAPÍTULO II- Introducción
24
2.1.4 Exportadores de la super-familia ABC
Esto s transpo rtado re s transpo rtan pe que ñas mo lé c ulas de sde e l c ito plasma
hac ia e l e spac io pe riplasmátic o c o n una e le vada ve lo c idad de transpo rte . La
impo rtanc ia de l ro l que e sto s e xpo rtado re s tie ne n se e vide nc ia e n varias vías
b io sinté tic as y me tabó lic as durante la b io sínte sis de LPS. En e sta vía , unde c apre nil
po líme ro s so n transpo rtado s po r e l e xpo rtado r ABC, Wzm-Wzt, hac ia e l pe riplasma
mie ntras que e l KDO-Lípido A e s e xpo rtado po r e l e xpo rtado r MsbA. La translo c ac ió n
de l LPS hac ia e l pe riplasma e s me diada po r pro te ínas ABC de no minadas Lpt que
fo rman un transpo rtado r. En e l pe riplasma, la pro te ína WaaL liga e l po lisac árido c o n e l
KDO-lípido A. Lue go las pro te ínas LptDE so n ne c e sarias para la translo c ac ió n de l LPS
maduro a l me dio e xtrac e lular (Zho u e t al., 1998; Davidso n e t al., 2008).
Lo s e xpo rtado re s ABC, a l igual que lo s impo rtado re s, e stán fo rmado s po r 4
do minio s e n to ta l, 2 do minio s NBD y 2 do minio s TMD. El do minio NBD e s ho mó lo g o y
b ie n c o nse rvado e ntre lo s impo rtado re s y e xpo rtado re s ABC. En c o ntraste c o n lo s
impo rtado re s ABC, e l do minio TMD de e sto s e xpo rtado re s c o ntie ne un patró n
c o nse rvado de 12 hé lic e s transme mbrana que pro truye n ampliame nte e n e l
pe riplasma y pre se ntan ade más una c avidad c e ntra l hidro fílic a (Saurin e t al., 1999;
Davidso n e t al., 2008). Lo s análisis filo ge né tic o s pro po ne n que la familia de
e xpo rtado res ABC se divide e n do s subfamilias de ac ue rdo c o n la o rganizac ió n
g e né tic a que e sto s transpo rtado re s pre se ntan. La subfamilia A1 c o ntie ne
princ ipa lme nte pro te ínas re lac io nadas c o n la e xpo rtac ió n de un amplio rang o de
sustrato s y c uyo do minio TMD e sta fusio nado po r su e xtre mo N-te r a l e xtre mo C-te r de l
do minio NBD. La subfamilia A2 c o ntie ne princ ipa lme nte pro te ínas c uyo do minio NBD
no e stá fusio nado a l do minio TMD, so n pro te ínas invo luc radas e n la e xpo rtac ió n de
po lisac árido s y de he mo a l e spac io pe riplasmátic o y pro te ínas que c o ntiene n do s
do minio s NBD ho mó lo go s fusio nado s y e stán implic adas e n la re siste nc ia a antib ió tic o s
(Saurin e t al., 1999; Davidso n e t al., 2008).
2.1.5 Sistemas tripartitos de transporte
Lo s siste mas tripartito s de transpo rte e stán fo rmado s po r un e xpo rtado r de la
familia ABC, una pro te ína MFP y una pro te ína OMP. En bac te rias Gram ne gativas lo s
siste mas tripartito s e stán invo luc rado s e n la se c re c ió n de varias mo lé c ulas c o mo
pé ptido s, lípido s, dro gas hidro fó bic as, po lisac árido s y pro te ínas, inc luye ndo e nzimas
hidro lític as, bac te rio c inas, lantib ió tic o s, fac to re s de c o mpe te nc ia y to xinas c o mo la α-
he mo lisina de E. c o li (Mo ussato va e t al., 2008, Bine t y Wande rsman, 1995; Yo ung y
Ho lland, 1999; Otto y Go tz, 2001). Do s siste mas tripartito s han sido ampliame nte
CAPÍTULO II- Introducción
25
e studiado s: lo s T1SS (De le pe la ire y Wande rsman, 1991) y lo s Siste mas de e flujo de
dro gas (Ale kshun y Le vy, 2007).
Lo s siste mas de e flujo e stán invo luc rado s e n la re siste nc ia a dro gas y c o nfie re n
un fe no tipo MDR (Multiple Drug Rre sistanc e ) (Go uld, 2008; Li y Nikaido , 2004; Po o le ,
2005). Alguno s siste mas de e flujo so n se le c tivo s para un sustrato dado , pe ro la mayo ría
so n c apac e s de e xpo rtar una g ran varie dad de c o mpue sto s no re lac io nado s
e struc tura lme nte y c o nfie re n así re siste nc ia a múltiple s dro gas (Li y Nikaido , 2004; Lage ,
2003). Se ha de sc ripto que e sto s siste mas tie ne n un ro l impo rtante e n la so bre vive nc ia
de las bac te rias e n pre se nc ia de c o mpue sto s pro duc ido s po r sus ho spe dado re s y e n la
c o mpe te nc ia po r un nic ho e c o ló g ic o (Piddo c k e t al., 2006). El c o mpo ne nte ABC de
me mbrana inte rna de las bo mbas de e flujo sue le pre se ntar do s do minio s NBD
fusio nado s y do s do minio s TMD fusio nado s, po r e ste mo tivo que se ha pro pue sto que
surg ie ro n de la duplic ac ió n gé nic a de un lo s transpo rtado re s que pre se ntan un
do minio NBD fusio nado a l do minio TMD (Davidso n e t al., 2008; Murakami, 2008). Se han
de sc ripto 2 bo mbas de Eflujo Ame AB-Ame C e Ife AB e n A. tume fac ie ns. El siste ma
Ame AB e stá invo luc rado e n e l e flujo de β-lac támic o s. El transpo rtado r Ife AB e s
re spo nsable de l transpo rte c ume stro l a l me dio e xtrac e lular, aume ntando la re siste nc ia
de Agro bac te rium a e ste flavo no ide pre se nte e n lo s e xudado s de ra íc e s y po r lo tanto
c o ntribuye ndo a la supe rvive nc ia de e ste fito pató ge no e n la rizo sfe ra (Pe ng y Ne ste r,
2001; Palumbo e t al., 1998).
Otro siste ma tripartito de sc ripto e s e l T1SS invo luc rado e n la se c re c ió n de
pro te ínas a l me dio e xtrac e lular (Ve r e n de ta lle e n Capítulo I, Se c c ió n: Siste ma de
Se c re c ió n de Pro te ínas Tipo I (T1SS); Se c c ió n: Pro te ínas ac c eso rias de lo s T1SS: Pro te ína
de Fusió n de Me mbrana (MFP) y Se c c ió n: Pro te ínas ac c e so rias de lo s T1SS: Pro te ína de
me mbrana e xte rna (OMP)). Lo s c o mpo ne nte s de lo s siste mas tripartito s y las
e xo pro te ínas sustrato s sue le n e star c o dific adas adyac e nte s e n e l g e no ma, lo que e s
c o nsiste nte c o n la a lta e spe c ific idad que lo s TISS tie ne n (Saurin e t al., 1999; Davidso n e t
al., 2008; Ho lland e t al., 2005; Bine t e t al., 1997). La únic a e xc e pc ió n c o no c ida hasta
aho ra e s e l T1SS de Ne isse ria me ning itidis; e n e ste siste ma e l c o mpo ne nte ABC y e l
c o mpo ne nte MFP e stán c o dific ado s se parado s e n e l g e no ma, aunque ambo s se
e nc ue ntran flanque ado s po r se c ue nc ias de e le me nto s ge né tic o s mó vile s (Wo o ldridge
e t al., 2005). El ge n de la pro te ína OMP pue de no fo rmar parte de l o pe ró n que
c o dific a a l T1SS (Eswaran e t al., 2004; De le pe la ire , 2004; Misra y Bavro , 2009).
CAPÍTULO II- Introducción
26
2.1.6 Secreción mediada por el TISS, PrsDE, en R. leguminosarum
El ge no ma de la c e pa 3841 de Rhizo bium le gumino sarum bv. vic iae ha sido
c o mple tame nte se c ue nc iado (http:/ / www.sange r.ac .uk/ Pro je c ts/ R_le gumino sarum)
(Yo ung e t al., 2006) mie ntras que se de sc o no c e e l c o rre spo ndie nte a la c e pa
8401pRL1JI (A34), que ha sido c e pa mo de lo e n muc ho s e studio s de nue stro g rupo y
o tro s g rupo s de inve stigac ió n. A34 po se e un plásmido simbió tic o a ltame nte
transmisib le pRL1JI (200 Kb) que apo rta ge ne s de no dulac ió n y fijac ió n de nitró ge no y
lo s de te rminante s para la pro duc c ió n de una bac te rio c ina me diana (Ore snik e t al.,
1999). Se ha de sc ripto que pRL1JI c o nfie re c apac idad de no dular arve ja (Pisum
sativum) e n c e pas ho spe dado ras de o tras e spe c ie s ve ge ta le s c o mo R. le gumino sarum.
bv. phase o li o R. le gumino sarum bv. trifo lii (Do wnie e t al., 1983).
En la c e pa A34 se ha ide ntific ado y c arac te rizado la translo c asa ABC/ MFP de l
T1SS, PrsDE (Finnie e t al., 1997). En c o ntraste c o n la mayo ría de lo s TISS de sc ripto s, PrsDE,
de R. le gumino sarum, c epa A34, e s re spo nsable de la se c re c ió n de varias pro te ínas de
dife re nte s tamaño s y func io ne s, c o mo la pro te ína No dO, c apaz de fo rmar po ro s e n
me mbranas, las g lic anasas β1-4 PlyA y PlyB y adhe sinas de la familia Rap (Rhizo bium
adhe ring pro te in) (Finnie e t al., 1997, 1998; Russo e t al., 2006). Las pro te ínas se c re tadas
po r PrsDE partic iparían e n la madurac ió n de las e struc turas de b io film o bse rvadas in
vitro (Russo e t al., 2006; Fujishige e t al., 2006).
Finnie e t al. o bse rvaro n un fe no tipo ple io tró pic o e n la c e pa mutante de l
c o mpo ne nte ABC de no minado PrsD. La mutante prsD::Kanr (A412), fue c apaz de
invadir e l pe lo radic ular e induc ir la fo rmac ió n de nó dulo s de fijac ió n de nitró ge no ,
pe ro e sto s nó dulo s a pe sar de c o nte ne r bac te ro ide s, fue ro n de c o lo r b lanc o y
pre se ntaro n muy ba ja e fic ie nc ia de fijac ió n de nitró g e no atmo sfé ric o . A412 pre se ntó
un fe no tipo pe gajo so e n plac a y visc o so e n c ultivo s líquido s pro duc ido po r la
pro duc c ió n de c ade nas de l EPS de mayo r lo ng itud. Ade más, la mutante prsD fue
inc apaz de se c re tar varias pro te ínas a l medio e xtrac e lular y no pre se ntó ac tividad
e xtrac e lular de g lic anasa e n plac as c o nte nie ndo c arbo xime tilc e lulo sa c o mo sustrato
mo de lo (Finnie e t al., 1997). Po ste rio rme nte , lo s mismo s auto re s c o nfirmaro n que e l
siste ma PrsDE se c re ta las g lic anasas PlyA y PlyB, re spo nsable s de l pro c e samie nto de l
e xo po lisac árido ac ídic o (EPS) que no so n ne c e sarias para e l e stab le c imie nto de
simbio sis e fe c tivas e ntre Rhizo bium y su ho spe dado r. En lugar de pre se ntar e l mo tivo
no napé ptido RTX de unió n a c a lc io , c arac te rístic o de vario s sustrato s e studiado s de
TISS, pre se ntan die z c o pias de un nue vo mo tivo he ptapé ptido (Finnie e t al., 1998). PlyB
e s c apaz de difundir más a llá de l límite de la c o lo nia , mientras que PlyA pe rmane c e
CAPÍTULO II- Introducción
27
adhe rida a la supe rfic ie c e lular. Ade más, las g lic anasas PlyA y PlyB ne c e sitan e ntrar e n
c o ntac to c o n e l e xo po lisac árido de supe rfic ie bac te riana para su ac tividad
(Zo rre guie ta e t al., 2000).
CAPÍTULO II- Introducción
28
2.1.7 Objetivos específicos
• Estudiar la pre se nc ia de TISS e n Agro bac te rium tume fac ie ns.
• Analizar la c o mple me ntac ió n func io nal he te ró lo ga de l fe no tipo s de se c re c ió n
de la g lic anasa PlyB de R. le g umino sarum y de l fe no tipo no muc o so me diada po r e l
siste ma ide ntific ado .
• Estudiar la c o mple me ntac ió n he teró lo g a de la se c re c ió n de pro te ínas e n R.
le gumino sarum.
• De finir po sib le s sustrato s de l siste ma ide ntific ado .
29
CAPÍTULO II: IDENTIFICACIÓN DE UN SISTEMA DE SECRECIÓN DE PROTEÍNAS TIPO I EN A.
tumefaciens.
2.2 RESULTADOS
2.2.1 Identificación de un TISS en A. tumefaciens. Método de screening
Co n e l o b je tivo de ide ntific ar un T1SS que pudie ra te ne r un ro l adaptativo e n A.
tume fac ie ns se re a lizó una e strate g ia de c o mple me ntac ió n func io nal he te ró lo ga de
c e pas mutante s de l siste ma de se c re c ió n tipo I PrsDE de R. le g umino sarum bv. vic iae
8401 pRL1JI (A34). Para e llo , una b ib lio te c a ge nó mic a pro ve nie nte de A. tume fac ie ns
(C58 bv. 1) (g e ne rada e n e l labo rato rio J. A. Do wnie de Jo hn Inne s Ce nte r, No rwic h,
UK) fue transfe rida po r c o njugac ió n tripare nta l a la mutante de Rhizo b ium, A412
(prsD::Tn5) (Finnie e t al, 1997) y se re a lizó un sc re e ning de 800 transc o njugante s
e va luando la c apac idad de re e stab le c e r la se c re c ió n de β1,4 g lic anasas (PlyA y PlyB).
Esta ac tividad se ana lizó me diante un e nsayo e n plac a c o nte nie ndo e l sustrato
mo de lo c arbo xime tilc e lulo sa (CMC) y po ste rio r tinc ió n de l sustrato c o n ro jo c o ng o . La
c e pa silve stre A34 induc e la fo rmac ió n de un ha lo de ac laramie nto de bajo de la
c o lo nia po r la de gradac ió n de unio ne s g luc o sídic as β 1,4. En c ambio , e sta ac tividad
se e nc ue ntra muy disminuida e n las c e pas mutante s A412 (prsD::Tn5) y A755 (prsE::Ω
Spe c R) a fe c tadas e n lo s c o mpo ne nte s ABC o MPF de l T1SS PrsDE, re spe c tivame nte
(Finnie e t al, 1998). Me diante e ste e nsayo , se ide ntific ó e l c ó smido pIJ7760 (Figura 1-a )
c apaz de re staurar la ac tividad de g lic anasas e n A412. El c ó smido pIJ7760 fue
purific ado e intro duc ido e n E. c o li po r transfo rmac ió n, y “re tro -transfe rido ” a las
mutante s de se c re c ió n de Rhizo bium. El análisis de la ac tividad de g lic anasas c o n e l
e nsayo e n plac a Y-CMC c o nfirmó la re staurac ió n de l fe no tipo se c re to rio de la
ac tividad de β1,4 g lic anasa e n A412 y A755 (Figura 2.2.1 b y c ). Po r o tra parte , pIJ7760
transfe rido a la c e pa silve stre A34, c o nfirió un aume nto e n la ac tividad g lic anasa , e n
c o mparac ió n c o n la misma c e pa que no po rta e l c ó smido pIJ7760 (Figura 1c ).
Las c o lo nias de la c e pa silve stre de Rhizo b ium A34 pre se ntan un fe no tipo
muc o so . El fe no tipo de las c o lo nias de las c e pas A412 prsD y A755 prsE tambié n e s
muc o so ; sin e mbargo se c arac te riza po r se r muy pe ga jo so de bido a l aume nto
c o nside rable de l largo de las c ade nas de l e xo po lisac árido e xtrac e lular (EPS). Este
aume nto e s o c asio nado po r la ause nc ia de EPS-g lic anasas que pro c e san a l EPS ante s
de se r libe rado a l me dio e xtrac e lular (Finnie e t al., 1997; Finnie e t al., 1998; Russo e t al.,
2006). En pre se nc ia de l c ó smido pIJ7760, las mutante s de Rhizo bium A412 prsD y A755
prsE pre se ntaro n un fe no tipo no pe ga jo so y c o n similar visc o sidad a l o bse rvado e n la
c e pa silve stre A34 (dato no mo strado ).
30
La c o mple me ntac ió n he te ró lo ga de la se c re c ió n de g lic anasas y de l fe no tipo
muc o so silve stre sug ie re la pre se nc ia de a l me no s un T1SS de A. tume fac ie ns
c o dific ado e n e l c ó smido pIJ7760 que se ría func io nal e n R. le g umino sarum.
2.2.2 Análisis bioinformático de posibles sistemas ABC contenidos en el cósmido
pIJ7760
La se c ue nc ia nuc le o tídic a de l fragme nto c lo nado e n e l c ó smido pIJ7760
pro ve nie nte de la b ib lio te c a ge nó mic a de A. tume fac ie ns C58, fue analizada po r
se c ue nc iac ió n. Para e llo , se ge ne raro n o c ho fragme nto s de re stric c ió n Ec o RI de l
c ó smido pIJ7760, que fue ro n subc lo nado s e n e l plásmido pBlue Sc ript y lue go
se c ue nc iado s parc ia lme nte utilizando lo s prime rs T7 y SP6 c o nte nido s e n e l ve c to r
(Se rvic io de Se c ue nc iac ió n de la Fundac ió n Instituto Le lo ir). Mie ntras se re a lizaba e ste
e nfo que se hizo públic a la se c ue nc ia g e nó mic a c o mple ta de A. tume fac ie ns C58 lo
que fac ilitó c o nside rable me nte e l e studio de la re g ió n c lo nada e n pIJ7760
(de pts.washingto n.e du/ agro / ).
Figura 2.2.1: Ensayos de complementación heteróloga de la secreción de
glicanasas β 1,4. 1a- Aislamie nto de l c ó smido pIJ7760 pro ve nie nte de una
b ib lio te c a po r c o mple me ntac ió n he te ró lo ga de la se c re c ió n de g lic o sidasas e n la
mutante A412 prsD de R. le gumino sarum. 1b- Co mple me ntac ió n de la mutante
A412 (prsD::Tn5) y 1c- de la mutante A755 (prsE::Spe c ). 1d- transc o njug ante de la
c e pa silve stre (A34). pIJ7761: Otro c ó smido e nsayado e n R. le g umino sarum
pro ve nie nte de la b ib lio te c a g e nó mic a de A. tume fac ie ns
1-c 1-d
CAPÍTULO II- Resultados
31
El análisis de las se c ue nc ias nuc le o tídic as de lo s subc lo ne s o bte nido s pe rmitió
ide ntific ar a l fragme nto ge nó mic o c lo nado e n pIJ7760 e n una re g ió n de 27,198
Kilo base s (Kb) de l c ro mo so ma lineal de A. tume fac ie ns C58 c o mpre ndida e ntre las
base s 418313 y 445511 de la se c ue nc ia g e nó mic a public ada
(de pts.washingto n.e du/ agro / ) (Fig ura 2.2.2, Tabla 2.2.1).
Orf Nomenclatura usada en este
trabajo de tesis Función predicha en la anotación
genómica
Atu3399
2 hidroxiácido deshidrogenasa
Atu3398
Acetilornitina desacetilasa
Atu3397
Proteína hipotética conservada
Atu3396
PBP de transportador ABC (Fe3+)
Atu3395
TMD de transportador ABC (Fe3+)
Atu3394
NBD de transportador ABC (Fe3+)
Atu3393
Pseudoazurina
Atu3392
Metiltransferasa SAM
Atu3391 AhuB PBP de transportador ABC (Fe3+)
Atu3390 AhuT PBP de transportador ABC (hierro)
Atu3389 AhuV TMD de transportador ABC (hierro)
Atu3388 AhuU NBD de transportador ABC (Fe3+)
Atu3387 HlaS Factor Sigma (ECF σ)
Atu3386 HlaI Factor antisigma (ECF anti σ)
Atu3385 HlaR Receptor de hemo
Atu3384 Hla Proteína hipotética conservada
Atu3383 AspD Secreción de rhizobiocina
Atu3382 AspE Proteína de la familia de HlyD
Atu3381
Regulador transcripcional de la familia de LysR
Atu3379
TMD de transportador ABC (péptidos)
Atu3378
TMD de transportador ABC (oligopéptidos)
Atu3377
NBD de transportador ABC (péptidos)
Tabla 2.2.1: Orf c o dific ado s e n e l c ó smido pIJ7760. Ge ne s pre dic ho s y func ió n pre dic ha
e n la ano tac ió n ge nó mic a (de pts.washingto n.e du/ ag ro / ).
CAPÍTULO II- Resultados
Homólogo a PrsD de R.
leguminosarum
(51% de Atu3397
Atu3396
Atu3394 Atu3392
Atu3391 Atu3390Atu3389
Atu3387
Atu3386 Atu3385 Atu3383 Atu3382
Atu3379
Atu3377
(51% de identidad)
Atu3399
Atu3398
Atu3396
Atu3395 Atu3393
Atu3391 Atu3390 Atu3389
Atu3388
Atu3386 Atu3385
Atu3384
Atu3383 Atu3382
Atu3381 Atu3378
Atu3377 Atu3399
Homólogo a PrsE de R.
leguminosarum
(41% de id tid d)identidad)
Figura 2.2.2: Esquema de los 22 orf presentes en pIJ7760. Se mue stran lo s o rf pre se nte s e n la se c ue nc ia de l c ó smido pIJ7760 que fue c apaz de
re staurar la se c re c ió n de g lic anasas e n las mutante s de l siste ma de se c re c ió n PrsDE de R. le gumino sarum, A412 prsD y A755 prsE. La fle c ha
turque sa c o rre spo nde al o rf que c o dific a una pro te ína ho mó lo ga a PrsD de Rhizo bium (A34). La fle c ha c e le ste c o rre spo nde a l o rf que c o dific a
CA
P
una pro te ína ho mó lo g a a PrsE de Rhizo bium (A34). Se de ta llan lo s po rc e ntaje s de ide ntidad e n c ada c aso (Pro grama BLASTp). La ano tac ió n y
pre dic c ió n de func ió n e s la de sc ripta e n la pág ina we b de Agro bac te rium (www.Agro bac te rium.o rg ). Esque ma re a lizado usando e l pro grama
VECTOR NTI.
PÍTULO
II- Res
32
ultad
os
33
El e studio de lo s g e ne s c o nte nido s e n e sta re g ió n pe rmitió ide ntific ar 22 marc o s
de le c tura abie rto s c o mple to s (o rf; ope n re ading frame ) de no minado s Atu3378 a
Atu3399 (de pts.washingto n.e du/ agro / ) (Fig ura 2.2.2; Tab la 2.2.1). La c o mparac ió n de
las se c ue nc ias traduc idas de e sto s o rfs a travé s de l pro grama Blastp c o n e l banc o de
dato s de pro te ínas c arac te rizadas (Swispro t) mo stró que uno de e llo s (Atu3383)
c o dific aría po r un o rtó lo go a PrsD de R. le gumino sarum (c e pa A34) pre se ntando un
52% de ide ntidad y 69% de similitud de se c ue nc ia amino ac ídic a . Río aba jo de e ste o rf,
pro bable me nte fo rmando un o pe ró n, se ubic a o tro o rf, Atu3382, c uyo pro duc to e s
ho mó lo go a PrsE de R. le gumino sarum (c e pa A34) (41% ide ntidad y 63% de similitud de
se c ue nc ia amino ac ídic a ) (Figura 2.2.2). El análisis de ta llado de las se c ue nc ias
nuc le o tídic as y amino ac ídic as usando lo s pro g ramas VECTOR NTI y Co nse rve d
Do mains (www.nc bi.nlm.nih.go v/ Struc ture / c dd/ wrpsb .c g i) mo stró que e l pro duc to de
Atu3383 c o ntie ne un do minio NBD y TMD fusio nado s e n una misma c ade na
po lipe ptídic a . La pro te ína c o dific ada po r e ste o rf tie ne 615 amino ác ido s (aa ) de
lo ng itud y pe rte ne c e a la sub-familia A1 de e xpo rtado re s ABC (Saurin e t al., 1999;
Davidso n e t al., 2008). El c o dó n sto p de Atu3383 se supe rpo ne parc ia lme nte c o n e l
c o dó n de inic io de Atu3382 que c o dific a un c o mpo ne nte MFP de 437 aa de lo ng itud,
indic ando que po drían se r parte de una misma unidad transc ripc io na l. Estas
o bse rvac io ne s sug ie re n que e l lo c us fo rmado po r e sto s do s ge ne s c o dific aría una
translo c asa de un T1SS que se ría c apaz de c o mple me ntar la se c re c ió n de la s
g lic anasas e n la mutante prsD y prsE de R. le g umino sarum. De no minamo s aspD a l ge n
Atu3383, po r c o dific ar e l c o mpo ne nte ABC y aspE a Atu3382 po r c o rre spo nde r a l ge n
de l c o mpo ne nte MFP.
Se de be ac larar que ade más de AspD-AspE, se ide ntific aro n de ntro de la
re g ió n c lo nada e n pIJ7760, o tro s tre s po sib le s siste mas transpo rtado re s de la
supe rfamilia ABC (Figura 2.2.3):
Sistema Transportador 1: Atu3379 (TMD), Atu3378 (TMD) y Atu3377 (NBD).
Sistema Transportador 2: Atu3388 (NBD), Atu3389 (TMD), Atu3390 (PBP) y Atu3391 (PBP).
Sistema Transportador 3: Atu3394 ( NBD), Atu3395 (TMD) y Atu3396 (PBP)
(La sig la TMD indic a transme mbrane do main; NBD, nuc le o tide b inding do main; PBP,
pe riplasmic b inding pro te in).
CAPÍTULO II- Resultados
Sistema 3 Sistema 2 T1SS Sistema 1
Atu Atu Atu Atu Atu Atu
PBP PBP PBP TMD TMD TMD TMD NBD NBD MFP aspE
ABC asp
NBD
Atu Atu 3396
Atu 3395
Atu 3394
Atu 3390
Atu 3389
Atu 3388 Atu
3384 Atu
3383 Atu
3382 Atu
3378 Atu
3379 Atu
3391 Atu 3377
Figura 2.2.3: Sistemas de transportadores ABC identificados en el cósmido pIJ7760. En e l e sque ma se re sa ltan lo s o rf que c o dific an po sib le s
transpo rtado re s ABC y pro te ínas ac c e so rias, indic ando sus c o mpo ne nte s (Pro g rama BLASTp). Flechas verdes: o rf c o dific an pro te ínas
pe riplasmátic as de impo rtado re s ABC (PBP). Flechas naranjas: o rf de pro te ínas c o n do mino TMD de transpo rtado re s ABC (TMD). Flechas
amarillas: o rf de pro te ínas c o n do minio s NBD de transpo rtado re s ABC (NBD). Flecha turquesa: o rfs que c o dific an una pro te ína ho mó lo ga a
PrsD de R. le gumino sarum. Este o rf ha sido de no minado aspD y pre se nta un do minio TMD fusio nado a un do minio NBD (ABC). Flecha
celeste: o rf c uyo pro duc to e s ho mó lo go a la pro te ína PrsE de R. le gumino sarum. Este o rf ha sido de no minado aspE (MFP). El pro duc to de l
CA
PÍT
o rf Atu3384 (flecha roja), río arriba de l putativo siste ma aspD,E e s c andidato a se r sustrato de AspDE e n A. tume fac ie ns (ve r te xto ).
Esque ma re a lizado usando e l pro grama VECTOR NTI.
ULO
II- Resu
lt
34
tad
os
35
Un análisis de ta llado de las se c ue nc ias de lo s pro duc to s de dic ho s o rf usando
lo s pro gramas Co nse rve d Do mains (www.nc bi.nlm.nih.go v/ Struc ture / c dd/ wrpsb .c g i) y
VECTOR NTI re ve ló que e n e l prime r siste ma ABC putativo , e l pro duc to de l g e n Atu3377
c o dific a un do minio NBD y lo s ge ne s Atu3378 y Atu3379 c o dific an un do minio TMD
c ada uno de e llo s (Figura 2.2.3). Al e star lo s dife re nte s do minio s TMD y e l do minio NBD
c o dific ado s e n dife re nte s c ade nas po lipe ptídic as, dic ho siste ma c o rre spo nde ría a un
putativo siste ma impo rtado r ABC (Saurin e t al., 1999; Davidso n e t al., 2008). La distanc ia
inte rg é nic a e ntre e l c o dó n sto p de Atu3378 (TMD) y e l c o dó n de inic io de Atu3377
(NBD) e s nula indic ando que po dría tratarse de un o pe ró n
(de pts.washingto n.e du/ agro / , fig ura 2.2.4). Las PBP de pe ndie nte s de e ste siste ma de
c aptac ió n ABC se e nc ue ntran río abajo de l c o mpo ne nte NBD, pe ro no e stán
c o nte nidas e n e l c ó smido pIJ7760. Lo s g e ne s de e ste lo c us fo rmarían un o pe ró n
(de pts.washingto n.e du/ agro / ).
El se gundo siste ma ABC e stá c o dific ado po r lo s ge ne s Atu3388 (NBD) y Atu3389
(TMD); las PBP de e ste siste ma e starían c o dific adas po r Atu3390 y Atu3391 (Figura 2.2.3).
Las se c ue nc ias se supe rpo ne n parc ia lme nte e ntre e l c o dó n sto p de Atu3389 (TMD) y e l
c o dó n de inic io de Atu3388 (NBD) indic ando que po dría tratarse de un o pe ró n
(de pts.washingto n.e du/ agro / , figura 2.2.4). Al e star lo s do minio s NBD y TMD e n
dife re nte s c ade nas po lipe ptídic as, se trataría de un impo rtado r de la supe r familia
ABC.
Lo mismo o c urre c o n e l te rc e r siste ma ABC, c o dific ado po r lo s ge ne s Atu3394
(NBD) y Atu3395 (TMD) e n dife re ntes c ade nas po lipe ptídic as, lo que implic a que se
trataría de un impo rtado r de la supe r familia ABC. La PBP de l siste ma se ría Atu3396
(Figura 2.2.3). Las se c ue nc ias nuc le o tídic as se supe rpo ne n parc ia lme nte e ntre e n
c o dó n sto p de Atu3395 (TMD) y e l c o dó n de inic io de Atu3394 (NBD) indic ando que
pro bable me nte se trate de un o pe ró n (de pts.washingto n.e du/ agro / , figura 2.2.4).
Po r lo tanto , lo s tre s siste mas e starían invo luc rado s e n la impo rtac ió n de
nutrie nte s u o tro tipo de mo lé c ulas y no e n la se c re c ió n de pro te ínas. En c o njunto ,
e stas e vide nc ias sug ie re n que e l lo c us que c o ntie ne a Atu3382 y Atu3383 (aspE y aspD
re spe c tivame nte ), se ría e l únic o c andidato re spo nsable de la c o mple me ntac ió n de la
mutante prsD de Rhizo bium.
La pre dic c ió n de o pe ro ne s e n la pág ina de Agro bac te rium de la Unive rsidad
de Washingto n mue stra que aspDE fo rmaría una unidad transc ripc io nal inde pe ndie nte
que inc luiría , ade más a l ge n que se e nc ue ntra río arriba (Atu3384) que c o dific a po r
CAPÍTULO II- Resultados
una
de q
c ue n
de
(c sb l
e nc o
Fig
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la r
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lo s
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ge
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Utilizando
o ntrado s e n
gura 2.2.4: P
o babilidad
o re ) pe rte ne
re lac ió n fun
ndic a la p
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n pIJ7760 fo r
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pro babilidad
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l sitio we b d
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re dic c ió n
Che e t al., 2
de dato s VIM
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de operones
g e n A y e l
mismo o pe
lo s g e ne s y
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e sté n ligado
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ba jo de c ad
DI: Distanc i
de Agro bac
ngto n.e du/ a
nsc ripc io na
lac ió n func
e s similar
2006).
MSS se pre d
dade s trans
s en pIJ776
ge n B (ge n
e ró n te nie nd
e l agrupam
a de que lo
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no tac ió n g
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c te rium (de p
ag ro / , figur
lme nte fue r
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r e n la
dic e que lo s
sc ripc io na le
0. Lo s sc o re
ne s re pre se
do e n c ue n
mie nto de lo
o s g e ne s f
indic a la m
c io nalme nt
ge né tic a de
e o pe ró n qu
ic a . ST: sist
pts.washing
a 2.2.4). Las
ro n c a lc ula
o s g e ne s y e
base de
s siste ma de
e s inde pe nd
e s (punta je s
e ntado s a a
nta la distan
o s g e ne s. U
lanque ante
me no r pro ba
e . En e l e sq
e c ada o rf.
ue no fo rma
e ma de tra
g to n.e du/ ag
CAPÍT
s pro babilid
das te nie nd
e l ag rupam
e dato s
e transpo rte
die nte s e n f
s) re pre se nt
ambo s lado
nc ia inte rg é
Un sc o re sim
e s e sté n lig
abilidad de
que ma se in
. Se inc luye
arían parte
anspo rte . F
g ro / )
TULO II- Resul
36
dade s
do e n
mie nto
UBER
e ABC
fo rma
tan la
o s de l
é nic a ,
milar a
gado s
e que
ndic a
e n lo s
de la
Figura
ltados
37
similar a la de sc ripta en e l sitio we b de Agro bac te rium, pe ro hay una disc re panc ia e n
c uanto a la pre dic c ió n de l o pe ró n que c o dific a a l putativo T1SS aspDE. En dic ha base
de dato s, la unidad transc ripc io nal pre dic ha e staría fo rmada po r aspD y aspE (Atu3382
y Atu3383) y no e staría inc luida e n e l mismo o pe ró n e l g e n de la pro te ína c o dific ada
río arriba (Atu3384) (no mo strado ). En e ste c aso , las pro babilidade s fue ro n c a lc uladas
te nie ndo e n c ue nta la distanc ia inte rgé nic a y la c o nse rvac ió n de la o rganizac ió n
ge né tic a e n o tro s ge no mas bac te riano s basándo se e n c luste rs o rtó lo go s COG (c luste r
o f o rtho lo go us g ro up o f pro te ins) y e n la o nto lo g ía g é nic a GO (g e ne o nto lo gy) (Princ e
e t al., 2005, 2005a ; www.mic ro be so nline .o rg / o pe ro ns/ gnc 176299.html).
En la pág ina de Bio Cyc , Agro Cyc (b io c yc .o rg / AGRO/ NEW-IMAGE? type =GENE-
IN-CHROM-BROWSER&o bje c t=ATU3383), se pre dic e n las vías me tabó lic as primarias y
se c undarias pro bab le s e n las que un g e n o g rupo de ge ne s partic iparían, basándo se
e n la o nto lo g ía gé nic a . De e sta manera , se pre dic e que Atu3382-Atu3383-Atu3384
fo rmarían una unidad transc ripc io nal; sin e mbarg o , no se pudo asignar a e ste o pe ró n
una vía me tabó lic a pro bable e n la que po dría e star implic ado , dada la fa lta de
o rto lo g ía de e ste c luste r ge né tic o c o n o tro s ge no mas bac te riano s inc luido s e n la base
de dato s.
Para c o nfirmar la similitud to po ló g ic a y func io nal de AspD (Atu3383) c o n PrsD
de R. le gumino sarum se ana lizaro n lo s mo tivo s c o nse rvado s usando e l pro grama
Co nse rve d Do mains (www.nc bi.nlm.nih.go v/ Struc ture / c dd/ wrpsb .c g i). Se
de te rminaro n, ade más, lo s do minio s hidro fó bic o s transme mbrana de AspD utilizando e l
pro grama TMHMM (Pre dic tio n o f transme mbrane he lic e s in pro te ins;
www.c bs.dtu.dk/ se rvic e s/ TMHMM/ ). El do minio NBD de Atu3383 pre se nta lo s mo tivo s
Walke r A y Walke r B c arac te rístic o s, ade más de l mo tivo “signature ” de pro te ínas ABC.
Po r o tro lado , e l do minio TMD de AspD po se e 3 se gme nto s hidro fó bic o s c o n 6 paso s
transme mbrana (no mo strado ). Co mo se me nc io nó e n la intro duc c ió n de e ste
c apítulo , dic ha o rganizac ió n de me mbrana e stá c o nse rvada e n lo s e xpo rtado re s de la
supe r-familia ABC. El análisis de la pro te ína c o dific ada po r Atu3382 mo stró la pre se nc ia
de un do minio de anc la je a me mbrana inte rna c arac te rístic o de las pro te ínas de la
familia MFP (no mo strado ).
Un análisis similar de las pro te ínas de lo s o tro s tre s siste mas c o dific ado s e n
pIJ7760 c o nfirmó que se trataría de impo rtado re s de la familia ABC. En e fe c to , Atu3378
y Atu3379 de l prime r siste ma ABC, pre se ntan 6 do minio s transme mbrana c ada uno
(TMD). En e l se gundo siste ma ABC, Atu3389 pre se nta 9 do minio s TMD y lo mismo o c urre
c o n e l te rc e r siste ma ABC, Atu3395 (no mo strado ). Esta o rganizac ió n to po ló g ic a se
o bse rva e n lo s impo rtado re s de la supe r-familia ABC c uyo s do minio s TMD so n variable s.
CAPÍTULO II- Resultados
38
Se re a lizó un e studio c o mparativo a line ando las se c ue nc ias pro te ic as
traduc idas de lo s do minio s NBD de lo s po sib le s transpo rtado re s ABC c o nte nido s e n
pIJ7760 y o tras pro te ínas e xpo rtado ras e impo rtado ras de la súpe r-familia ABC ya
c arac te rizadas de dive rso s mic ro o rganismo s usando e l pro grama Clusta lW
(www.e b i.ac .uk/ To o ls/ c lusta lw2/ inde x.html) (Tabla 2.2.3) para c o nstruir un c lado grama
(Figura 2.2.5).
Proteína Especie bacteriana Molécula Transportada Cita
PrsD R. l. bv. viciae 3841 Exportador de múltiples proteínas Krehenbrink y Downie, 2008
PrsD R. l. bv. viciae A34 Exportador de múltiples proteínas Finnie et. al., 1997
PrsD R. l. bv. trifolii Exportador de exopolisacáridos Król y Skorupska, 1997
PrsD S. meliloti Endo-1,3-1,4-beta-glicanasa York y Walker, 1997
Atu3383 A. tumefaciens Homólogo a PrsD (A34) en pIJ7760 Esta tesis
AprD P. fluorescens Exportador de lipasa Duong et. al., 1994
HasD S. marcescens Exportador de Hemóforo HasA Létoffé et. al., 1994
AprD P. fluorescens Exportador de Proteasa Guzzo et. al., 1991
LipB S. marcescens Exportador de Lipasa Akatsuka et. al., 1995
PrtD E. chrysantemy Exportador de Metaloproteasa Létoffé et. al., 1990
HlyD E. coli Exportador de Hemolisina HlyA Nicaud et. al., 1986
RhaT
R. l. bv. trifolii
Importador de Rhamnosa
Richardson et. al., 2004
HmuV B. japonicum Importador de Hemo Nienaber et. al., 2001
FecE E. coli Importador de Citrato Férrico Staudenmaier et. al., 1989
OppD S. typhimurium Importador de oligopéptidos Hiles et. al., 1987
NikD E. coli Importador de Níkel Navarro et. al., 1993
gguA A. tumefaciens Importador de galactosa Kemner et. al., 1997
Atu3377 A. tumefaciens Homólogo a importador en PIJ7760 Esta tesis
Atu3388 A. tumefaciens Homólogo a importador en PIJ7760 Esta tesis
Atu3394 A. tumefaciens Homólogo a importador en PIJ7760 Esta tesis
Tabla 2.2.3: Pro te ínas utilizadas en la c o nstruc c ió n de l c lado grama. Se de ta lla e l
o rganismo a l que pe rte ne c e n, la mo lé c ula transpo rtada y la c ita b ib lio g ráfic a .
CAPÍTULO II- Resultados
39
El a line amie nto de las se c ue nc ias y e l c lado g rama c o nfirman que lo s
transpo rtado re s ide ntific ado s e n e l c ó smido pIJ7760 se agrupan e n do s tipo s, uno
inc luye a lo s impo rtado re s de la familia ABC, c o mo e s e l c aso de Atu3388, Atu3394 y
Atu3377 y e l o tro c o ntiene a lo s e xpo rtado re s de la familia ABC c o mo AspD (Atu3383)
(Figura 2.2.5).
Lo s T1SS sue le n c o dific ar e n e l mismo o pe ró n que lo c o ntie ne , o e n su c e rc anía ,
a su(s) pro te ína (s) sustrato . Río arriba de aspDE se e nc ue ntra e l o rf Atu3384 c uyo
pro duc to no pre se nta una similitud signific ativa de se c ue nc ia amino ac ídic a (BLASTp) o
nuc le o tídic a (BLASTn) c o n pro te ínas de func ió n c o no c ida . El pro duc to de Atu3384 se
pre dic e c o mo una pro te ína hipo té tic a c o nse rvada e n e l sitio we b de Agro bac te rium
(de pts.washingto n.e du/ agro / ) y so lo pre se nta ho mo lo g ía (27 % de identidad y 42% de
similitud de se c ue nc ia amino ac ídic a ) c o n una pro te ína hipo té tic a , ano tada c o mo de l
tipo he mo lisina que une c a lc io , c o dific ada e n e l c ro mo so ma de S. me lilo ti (SMc 04206).
En la misma líne a , la búsque da de do minio s c o nse rvado s usando e l pro grama
Co nse rve d Do mains (www.nc b i.nlm.nih.g o v/ Struc ture / c dd/ wrpsb .c g i) mo stró que
Atu3384 no pre se nta do minio s c o nse rvado s c o n pro te ínas ya c arac te rizadas. Sin
e mbargo , e l análisis de mo tivo s c o nse rvado s usando e l pro grama Mo tif Sc an (hits.isb -
sib .c h/ c g i-b in/ PFSCAN) re ve ló que Atu3384 pre se nta do s mo tivo s de N-Glic o silac ió n
Figura 2.2.5: Cladograma de transportadores. Arbo l filo ge né tic o de lo s transpo rtado re s
de la supe rfamilia ABC pre se nte s en pIJ7760 y de o tro s que ya han sido c arac te rizado s.
Las ramas agrupan las se c ue nc ias que c o rre spo nde n a impo rtado re s y e xpo rtado re s
de la supe r-familia ABC (c o rc he te s ro jo s). Se re sa ltan lo s o rf c o dific ado s e n pIJ7760 que
ag rupan c o n impo rtado re s ABC (Atu3388, Atu3394 y Atu3377) (e n amarillo ) y e l o rf
Atu3383 que agrupa c o n e xpo rtado re s de la supe r-familia ABC (e n fuc sia ). (Pro g rama
Clusta lW).
CAPÍTULO II- Resultados
40
e ntre las po sic io ne s 48-51 y 76-79un do minio de he mo lisina que une c a lc io (pro te ína
e xtrac e lular) e n e l e xtre mo C-te rminal (C-te r), e ntre lo s re siduo s 149 y 166. Atu3384 no
pre se nta se c ue nc ia se ñal de se c re c ió n e n su e xtre mo N-te rminal (N-te r) (Signal Pe ptide
Pre dic tio n, bmbpc u36.le e ds.ac .uk/ pro t_analysis/ Signal.html) re fo rzando la hipó te sis
que se ría sustrato de l siste ma T1SS AspDE. De no minamo s Hla a la pro te ína c o dific ada
po r e l o rf Atu3384.
En c o njunto , lo s re sultado s o bte nido s po r c o mple me ntac ió n func io nal
he te ró lo ga c o n e l c ó smido pIJ7760 y e l análisis b io info rmátic o de l fragme nto
ge nó mic o de A. tume fac ie ns pre se nte e n e l c ó smido sug ie re n que lo s ge ne s Atu3383
(aspD) y Atu3382 (aspE) de l c ro mo so ma line al de A. tume fac ie ns c o dific arían
c o mpo ne nte s de un T1SS e n A. tume fac ie ns. El análisis in silic o re a lizado sug irió ade más
que aspD y aspE fo rmarían una unidad transc ripc io nal que inc luiría a l o rf hla
c o dific ado río arriba de aspDE.
2.2.3 AspDE es el responsable de la complementación heteróloga
Co n e l o b je tivo de c o nfirmar que e l siste ma aspDE de A. tume fac ie ns e s e l
re spo nsable de la c o mple me ntac ió n func io nal he te ró lo g a de las mutante s prsD y prsE
de R. le g umino sarum, inic ia lme nte se c lo nó e n e l ve c to r pIJ1891 un fragme nto
amplific ado po r PCR de 4,178 Kb que c o ntie ne a l c lúste r hla-aspDE inc luye ndo 215
pare s de base s río arriba de l inic io de transc ripc ió n de hla (c o nstruc c ió n pHDE-LH). Esta
c o nstruc c ió n, fue transfe rida po r c o njugac ió n tripare nta l a las mutante s A412 prsD y
A755 prsE. Co ntrariame nte a lo e spe rado , pHDE-LH no fue c apaz de c o mple me ntar la
se c re c ió n de las g lic anasas ni e l fe no tipo muc o so s silve stre de las c o lo nias mutante s
de l siste ma T1SS PrsDE de R. le g umino sarum.
Co mo se gunda e strateg ia se g e ne raro n dive rsas c o nstruc c io ne s po r de le c ió n
de fragme nto s de l c ó smido pIJ7760 (Figura 2.2.6 a ). La c o nstruc c ió n pFC102, de riva de
la de le c ió n de l fragme nto Xho I de 8202 pare s de base s (pb ) y re ligac ió n de l c ó smido ,
e liminando e l c luste r hla-aspDE. La de le c ió n inc luye 863 pb río arriba de l inic io de hla
hasta 3450 pb río abajo de l c o dó n sto p de aspE. Para o bte ne r la c o nstruc c ió n pFC89
se subc lo nó e n e l c ó smido pIJ1891 un frag me nto KpnI de 5583 pb de rivado de l
c ó smido pIJ7760. Esta c o nstruc c ió n c o ntie ne 30 pb río arriba de l inic io de hla , e l c luste r
hla-aspDE , Atu3381y parte de Atu3380 (1640 pb río aba jo de l c o dó n sto p de aspE). La
c o nstruc c ió n pFC101 se o btuvo subc lo nando un fragme nto de 5,316 pb de rivado de la
dig e stió n de pFC89 c o n SalI y KpnI e n e l ve c to r pBBR1MCS (Ko vac h e t al., 1994). En e ste
c aso , fue ro n de le c io nadas 240 pb río arriba de hla y c o ntie ne lo s g e ne s c o dific ante s
de l T1SS AspDE y e l ge n Atu3381c o mple to s.
CAPÍTULO II- Resultados
F
Atu3398 Atu3395 Atu3393 Atu3389 Atu3387
Atu3385 aspD aspE
Atu3381 Atu3379
Atu3378 pIJ7760
Figura
2.2.6
Atu3399 Atu3397 Atu3396 Atu3394 Atu3391 Atu3390 Atu3388 hla Atu3380 Atu3392
Atu3386
a
DELECIONADO
pFC102
pFC89
pFC101 CA
PÍÍTULO
II- Resu
41
pFC93
ultad
os
Cep
Fenot
pro te
LysR
Bam
aspD
b-
Tabla
Figu
g e n
verd
ama
ABC
tran
pro p
hipo
pro g
g lic a
Co m
R. le
pa A412
tipo +++
El ge n A
e ína c o n a
aún no c ar
Finalme n
HI de 2112
D y c o mple
a 2.2.4
ura 2.2.6: E
ne radas pa
des: o rf que
arillas: o rf q
C. Flechas n
nspo rtado r A
pue stas. Fle
o té tic as. Fle
grama VEC
anasas de
mple me ntac
e gumino saru
A412+pIJ77
---
Atu3381 c o n
lta similitud
rac te rizado s
nte , la c o n
2 pb y re lig
tame nte a
Estudio de
ra analizar
e c o dific an
que c o dific
naranjas: o
ABC. Flech
echas roja
echa turque
CTOR NTI.
la c e pa
c ió n he te ró
um.
A41pFC1
A41pFC1
760 A412+p
++
nte nido e n
a putativo
s e n varias e
nstruc c ió n p
gac ió n de l
l g e n aspE.
la funcio
la c o mple
pro te ínas
c an pro te ína
o rf que c o d
as grises: o
as: o rf que
esa aspD. Fl
b- Co mp
mutante
ó lo ga de l fe
12 102
12 101
pFC102 A41
++
las c o nstruc
o s ac tivado
e spe c ie s de
pFC93 e s d
la c o nstruc
. Esta c o nst
onalidad d
e me ntac ió n
ho mo lo gas
as ho mo lo g
dific an pro t
o rf que c o
e c o dific an
echa celes
ple me ntac ió
A412 prsD
e no tipo silve
A412 pIJ7760
A412 pFC93
12+pFC89 A
--
c c io ne s pFC
o re s transc ri
e pro te o bac
de rivada la
c ió n e limin
truc c ió n c o
el sistema
n de A412
a PBP de
g as a do m
te ínas ho mo
dific an pro
n pro te ína
ste: aspE. Es
ó n he te ró lo
de R. le g
e stre no pe
A412
A412 pFC89
A412+pFC93
+++
C89 y pFC1
ipc io na le s d
c te rias.
a de le c ió n
ando parc
o ntie ne 30 p
AspDE. a
prsD y A7
transpo rtad
inio s NBD d
o lo g as a d
o te ínas c o n
as ho mo lo g
sque ma re a
o ga de la
gumino saru
ga jo so e n l
CAPÍTUL
2
9
A412+pFC1
+++
01 c o dific a
de la famil
de l frag m
ialme nte a
pb río arrib
a-Co nstruc c
755 prsE. Fle
do r ABC. Fle
de transpo r
do minio s TM
n o tras func
gas a pro t
a lizado usan
a se c re c ió
um. Tabla
a c e pa A4
LO II- Resulta
42
101
a una
ia de
me nto
l ge n
a de l
c io ne s
echas
echas
rtado r
MD de
c io ne s
te ínas
ndo e l
n de
2.2.4:
12 de
dos
43
ge n hla y las 1314 pb inic ia le s de l ge n aspD. El e sque ma c o n las c o nstruc c io ne s
re a lizadas se mue stra e n la fig ura 2.2.6 a .
Cada una de e stas c o nstruc c io ne s fue transfe ridas po r c o njugac ió n tripare nta l
a la mutante A412 prsD de R. le gumino sarum y se ana lizó la ac tividad de g lic anasas
e xtrac e lulare s e n CMC-agar (Fig ura 2.2.6 b ). La c o nstruc c ió n pFC89 fue la únic a c apaz
de re staurar la de gradac ió n de CMC e n la mutante de se c re c ió n de R. le gumino sarum
A412 prsD. Esta c o nstruc c ió n c o ntie ne lo s ge ne s hla aspD y aspE c o mple to s. Ade más,
c o ntie ne a l ge n Atu3381.
La c o mple me ntac ió n de la se c re c ió n de las g lic anasas o bse rvada a l transfe rir
pFC89 (hla-aspDE c o mple to ) fue ac o mpañada de la re staurac ió n de l fe no tipo
muc o so silve stre e n las c o lo nias mutante s A412 prsD. Las de más c o nstruc c io ne s fue ro n
inc apac e s de re c upe rar e l fe no tipo no pe g ajo so de las c o lo nias. (Tabla 2.2.4).
To madas e n c o njunto , e stas o bse rvac io ne s so n c o nsiste nte s c o n la ide a que lo s
pro duc to s de lo s ge ne s aspD y aspE so n re spo nsable s de la c o mple me ntac ió n de la
se c re c ió n de PlyA y PlyB. La fa lta de c o mple me ntac ió n de prsD c o n la c o nstruc c ió n
pFC101 po dría de be rse a la ause nc ia de ac tividad pro mo to ra de la transc ripc ió n rio
arriba de aspDE, mie ntras que e n pFC89, la transc ripc ió n de aspDE e staría pro mo vida
po r e l pro mo to r de lac Z de l ve c to r pBBR1MCS. Para c o rro bo rar e sta hipó te sis, se
re a lizó la búsque da de pro mo to re s usando lo s pro g ramas Pro mSc an (mo lb io l-
to o ls.c a / pro msc an/ ) y BPROM de So ftbe rry (linux1.so ftbe rry.c o m/ be rry.phtml) que no
e vide nc iaro n la e xiste nc ia de pro mo to re s de pe ndie nte s de l fac to r sigma 70, Rpo D río
arriba de hla o aspDE. Esto sug ie re que e l o pe ró n po dría e star g o be rnado po r fac to re s
sig ma que re spo ndan a c o ndic io nes ambie nta le s e spe c ífic as o po r a lgún pro mo to r
a le jado de l c luste r. Alte rnativame nte , la e xpre sió n de l o pe ró n po dría se r de pe ndie nte
de l re sto de lo s ge ne s a lbe rgado s e n pIJ7760.
2.2.4 Complementación de otras proteínas PrsDE dependientes y secreción de Hla en
el contexto heterólogo
Se ha de sc ripto que e l T1SS PrsDE se c re ta dive rsas pro te ínas a l me dio
e xtrac e lular e n la c e pa A34 de R. le gumino sarum (Finnie e t al., 1997; Russo e t al., 2006).
Es de e spe rar, po r lo tanto , que e l siste ma AspDE de Ag ro bac te rium tambié n re staure
la se c re c ió n de o tras pro te ínas e xtrac e lulare s de pe ndie nte s de l siste ma PrsDE e n e l
mo de lo he te ró lo go de R. le gumino sarum. Se analizó me diante g e le s SDS-PAGE e l pe rfil
de se c re c ió n de pro te ínas e xtrac e lulare s R. le g umino sarum o bte nidas de c ultivo s e n
me dio ric o TY y e n fase e xpo ne nc ia l de c re c imie nto de las c e pas mutante s A412 prsD y
A755 prsE y de la c e pa silve stre A34, e n pre se nc ia o ause nc ia de pIJ7760.
CAPÍTULO II- Resultados
de la
A412
las p
2.2.7
E
Fig
leg
prs
(A4
he t
A7
EP7
e st
fle c
de
e xt
no t
c o
En la figu
a c e pa silv
2 prsD y A75
pro te ínas (Ep
a ).
Ep
Ep
Ep
p52,5 y/ o E
P33
P42
P45
gura 2.2.7: P
guminosarum
sD y A755
412pIJ7760,
te ró lo g a de
55 prsE e n
77, EP59 y E
tán pre se nt
c has c o lo r
pIJ7760 (P
trac e lular d
table me nte
mo P33, P38
ura 2.2.7a s
e stre A34 y
55 prsE. La p
p145, Ep77,
145
p77
p59
p52
3
2
5
A41pIJ7
Patrón de
m en comp
5 prsE) y
A755pIJ7
e la se c re c i
pre se nc ia
P52,5 y/ o E
e s e n las c
c e le ste se ñ
42, P40 y P
de Rhizo b iu
e disminuida
8 y P42 fue r
e o bse rva e
y las banda
pre se nc ia d
Ep59 y Ep5
12 + A412 7760
secreción
paración c
las transco
7760 y A
ió n de pro t
de l c ó smid
p52). Ade m
c e pas de Rh
ñalan las pr
P33). La fle
um, c e pas
a e n pre se
ro n ide ntific
e l pe rfil de
as que se e
de pIJ7760 re
52,5 y/ o Ep5
A755 + A pIJ7760
de proteína
on las mut
onjugantes
A34pIJ7760)
e ínas e n las
do pIJ7760
más se o bse
hizo bium e
ro te ínas c uy
e c ha naranj
s A34, A41
e nc ia de pI
adas po r de
pro te ínas e
e nc ue ntran
e stauró la s
52) e n las m
A755 A34 pIJ776
as en la c
antes de se
contenien
). Se o bs
s mutante s
indic adas
e rvó la pre se
n ause nc ia
ya se c re c ió
ja a la de r
12 y A755
IJ7760 (P38
e gradac ió n
e xtrac e lular
n ause nte s
se c re c ió n d
mutante s pr
1 8 6 4 3 2
+ A34 60
cepa silvest
ecreción d
ndo el có
se rva c o m
de Rhizo b iu
c o n fle c ha
e nc ia de pr
de l c ó smid
ó n se ve so l
e c ha indic a
, c uya se
). Las pro te
n de EDMAN
CAPÍTU
e s c arac te r
e n las mut
de a l me no s
rsD y prsE (F
175 83
62
48
33
25
P38
tre (A34) d
erivadas (A
ósmido pIJ7
mple me nta
um A412 pr
as ro jas (EP
ro te ínas que
do pIJ7760.
o e n pre se
a una pro t
c re c ió n se
e ínas indic a
N.
ULO II- Result
44
rístic o
ante s
s 4 de
Fig ura
e R.
A412
7760
c ió n
rsD y
P145,
e no
. Las
nc ia
e ína
e ve
adas
ados
45
Ade más, e n pre se nc ia de pIJ7760, se o bse rvan tre s pro te ínas (P33, P42 y P45)
que no e stán pre se nte s e n e l pe rfil de pro te ínas e xtrac e lulare s de la c e pa silve stre A34
o de las mutante s A412 prsD y A755 prsE. Más aún, la banda P33 e s muy abundante y
mayo ritaria e n e l pe rfil de pro te ínas e xtrac e lulare s de las c e pas de Rhizo bium que
po rtan pIJ7760 (Fig ura 2.7 a ). Estas pro te ínas fue ro n se nsib le s a l tratamie nto c o n
pro te inasa K 0,2% (p/ v) durante 2 ho ras a 370C, de sc artando que P33, P42 y P45 fue ran
pro duc to de a lguna c o ntaminac ió n c o n lipo po lisac árido s o e xo po lisac árido s (dato no
mo strado ).
Llamativame nte , la se c re c ió n de una pro te ína (P38) que e s muy abundante e n
e l me dio e xtrac e lular de A34, A412 prsD y A755 prsE, e stuvo muy disminuida o ause nte
e n A34 que po rta pIJ7760 (Figura 2.2.7).
Se re a lizó la se c ue nc iac ió n de l e xtre mo N-te r de P42, P38 y P33 po r
de gradac ió n de EDMAN. La transfe re nc ia a me mbrana de PVDF de la pro te ína P45 no
re sulto e fic ie nte y po r e ste mo tivo no se pudo se c ue nc iar po r e ste mé to do . La
c o mparac ió n de lo s e xtre mo s N-te rminale s de c ada pro te ína c o n la base de dato s
c o rre spo ndie nte a lo s g e no mas se c ue nc iado s de R. le gumino sarum (c e pa 3841) y A.
tume fac ie ns (c e pa C58) (pro g rama Blastp, a justando paráme tro s a se c ue nc ias muy
c o rtas) indic ó que :
• El pé ptido P42 a line a c o n lo s e xtre mo s N-te r de varias flage linas pe rte ne c ie nte s a A.
tume fac ie ns y de R. le gumino sarum 3841. Dado que e l análisis de las se c ue nc ias de l
c ó smido pIJ7760 no pe rmitió ide ntific ar ge ne s c o dific ante s de pro te ínas similare s a
flag e linas, se de sc arta que e ste pé ptido pro ve ng a de Agro bac te rium. Po r o tro lado ,
e l pé ptido P42 pre se ntó un 66 % de ide ntidad amino ac ídic a c o n lo s e xtre mo s N-
te rminal de tre s flage linas hipo té tic as de R. l. vic iae 3841: la flage lina C de 311 aa y
un PM 32 KDa (RL4729); la flage lina A2 de 303 aa de lo ng itud y un PM pre dic ho de
31 KDa (RL0720) y la flage lina B (RL0719) de 302 aa y un PM pre dic ho de 31 KDa
(ExPASy, http:/ / www.e xpasy.c h/ to o ls/pi_to o l.html) (Tabla 2.2.5, P42).
• El pé ptido P38 a line a c o n e l e xtre mo N-te r de una putativa flage lina B de R.
le gumino sarum 3841 (RL4729) c o n un 77% de ide ntidad (ExPASy,
http:/ / www.e xpasy.c h/ to o ls/pi_to o l.html) (Tab la 2.2.5, P38).
• El pé ptido P33 mo stró 100% de ide ntidad c o n e l e xtre mo N-te r de la se c ue nc ia
amino ac ídic a pre dic ha de l o rf Atu3384 de A. tume fac ie ns. Co mo se me nc io nó
pre viame nte , Atu3384 c o dific a la pro te ína Hla y e stá lo c a lizado río arriba de l o pe ró n
aspDE de A.tume fac ie ns C58 y e sta pre se nte e n e l fragme nto c lo nado e n e l
c ó smido pIJ7760. Hla e s una pro te ina de 251 aa de lo ng itud y un pe so mo le c ular
CAPÍTULO II- Resultados
46
pre dic ho de 25,7 KDa. El pe so mo le c ular apare nte de Hla e n lo s ge le s SDS-PAGE fue
apro ximadame nte 7 KDa mayo r a l pre dic ho po r lo s análisis in silic o (ExPASy,
http:/ / www.e xpasy.c h/ to o ls/pi_to o l.html) (Tab la 2.2.5, P33).
Péptido Secuencia
obtenida Comentarios % de identidad
aminoacídica Predicción Alineamiento
P42 TSIIT(T)XAAAH
3 ρmoles secuenciados.
Las asignaciones entre paréntesis son
tentativas. La X significa que no se encontró aa
asignable para esa posición.
RL0719 R.l 3841 66% identidad
RL0720 R.l 3841 66% identidad
RL4729 R.l 3841 66% identidad
FlaC 311aa 32,215 KDa
FlaA2 303 aa 31,499 KDa
FlaB 302 aa 31,047 KDa
P38 TSINT(T)XAAAD
9 rmoles secuenciados. 6 pmoles de una
cadena que empieza con metionina.
Las asignaciones entre paréntesis son
tentativas. La X significa que no se encontró aa
asignable para esa
RL4729 R.l 3841 77% identidad
FlaB 302 aa 31,047 KDa
P33 XTTIQLTQS
7 rmoles secuenciados. La X significa que no se encontró aa asignable
para esa posición.
1 TSII TTXA A 9 P40 1 TSI+ TTX A A 2 TSIL TNNA A 1 0 RL0719
1 TSIITTX A A 9 P40 1 TSI+ T A A 2 TSILTNV A A 1 0 RL0720
1 TSI ITTXA A 9 P40 1 TSI+ T A A 2 TSINTNNA A 10 RL4729
1 TSINTTX A A 9 P38 1 TSINT A A 2 TSINTNNA A 10 RL0729
2 TTIQ LTQ S 9 P35 1 TTIQ LTQ S 3 TTIQ LTQ S 10 Atu3384
Tabla 2.2.5: Degradación de EDMAN de las bandas de 33, 38 y 42 kDa. Las bandas
c o rre spo ndie nte s a las pro te ínas P33, P38 y P42 ide ntific adas e n SDS-PAGE 12% fue ro n
e xtra ídas y se c ue nc iadas po r de gradac ió n de EDMAN. P38: Pro te ína pe rte ne c ie nte a
Rhizo bium c uya se c re c ió n se ve disminuida e n pre se nc ia de l c ó smido pIJ7760. P33 y
P42: Pro te ínas ause nte s e n las c e pas de Rhizo bium c uya se c re c ió n se o bse rva so lo e n
pre se nc ia de l c ó smido pIJ7760. Se de ta lla la se c ue nc ia pe ptídic a o bte nida e n la
de g radac ió n de EDMAN, la c antidad de mue stra se c ue nc iada , la a line ac ió n c o n e l
e xtre mo N-te r de las pro te ínas que pre se ntaro n similitud e n la base de dato s
(Pro grama Blastp, a justando parame tro s a se c ue nc ia c o rta ), la pre dic c ió n de func ió n
y e l a line amie nto de l pé ptido c o n la pro te ína ide ntific ada . Lo s núme ro s e n e l
a line amie nto de las se c ue nc ias re pre se ntan la po sic ió n de lo s aa e n las c ade nas
pe ptídic as. R.l: Rhizo bium le g umino sarum
CAPÍTULO II- Resultados
47
Las se c ue nc ias N-te r de P38, P42 y de o tras flage linas public adas so n similare s.
Te nie ndo e n c ue nta que las c antidade s se c ue nc iadas so n bastante dife re nte s (9
pic o mo le s (pmo le s) para P38 y 3 pmo le s para P42 y ade mas, e n e l análisis de l pé ptido
P38, se o bse rvó la c o ntaminac ió n c o n una pro te ína que c o mie nza c o n me tio nina , e s
po sib le que la asig nac ió n de lo s amino ác ido s teng a a lgún e rro r y que P38 y P42 se an
la misma pro te ina (Susana Linske n, c o munic ac ió n pe rso nal). La pre se nc ia de las
bandas adic io nale s e n lo s me dio s e xtrac e lulare s de las c e pas po rtado ras de l c ó smido
po dría de be rse a la e xpre sió n dife re nc ia l de flage linas e n las c e pas de Rhizo bium e n
pre se nc ia de pIJ7760 o que P42 y P38 se an la misma pro te ína que sufre a lg una
mo dific ac ió n po st-traduc c io na l e n pre se nc ia de l c ó smido pIJ7760.
Se analizó e l patró n de se c re c ió n de pro te ínas e n pre se nc ia de pIJ7760 e n e l
c o nte xto ge né tic o ho mó lo g o ; para e llo e l c ó smido pIJ7760 fue transfe rido po r
c o njug ac ió n tripare nta l a la c e pa silve stre de Agro bac te rium tume fac ie ns C58. Las
pro te ínas e xtrac e lulare s de la c e pa silve stre C58 y la transc o njug ante que po rta
pIJ7760 (C58 pIJ7760) pro ve nie nte s de c ultivo s e n me dio ric o TY o me dio mínimo Y se
ana lizaro n me diante SDS-PAGE. No se o bse rvaro n mo dific ac io ne s e n e l patró n de la s
pro te ínas e xtrac e lulare s de A. tume fac ie ns e n pre se nc ia o ause nc ia de pIJ7760 e n
ambas c o ndic io ne s nutric io nale s (Ve r Capitulo 4, Se c c ió n 4.2.3 y no se mue stra ). Esto
indic a que la fue rte se c re c ió n de Hla dirig ida po r pIJ7760 no e s pro mo vida e n e l
c o nte xto de A. tume fac ie ns.
Co n e l o b je tivo de de te rminar si la se c re c ió n he te ró lo g a de a ltas c antidade s
de Hla o c urría e n o tras bac te rias Gram ne gativas no e mpare ntadas, se transfirió po r
c o njug ac ió n tripare nta l e l c ó smido pIJ7760 a la c e pa Dh5α de Esc he ric hia c o li y se
ana lizó e l pe rfil de pro te ínas e xtrac e lulare s e n c o ndic io ne s similare s a las usadas e n
Rhizo bium, e s de c ir, e n me dio TY. En la Figura 2.2.8 b , se o bse rva que e l pe rfil de
pro te ínas e xtrac e lulare s de E. c o li no se vé mo dific ado po r la pre se nc ia de l c ó smido
pIJ7760.
Co n e l o b je tivo de de te rminar si la se c re c ió n he te ró lo g a de a ltas c antidade s
de Hla o c urría e n o tras bac te rias Gram ne gativas no e mpare ntadas, se transfirió po r
c o njug ac ió n tripare nta l e l c ó smido pIJ7760 a la c e pa Dh5α de Esc he ric hia c o li y se
analizó e l pe rfil de pro te ínas e xtrac e luares e n c o ndic io ne s similare s a las usadas e n
Rhizo bium, e s de c ir, e n me dio TY. En la Figura 2.2.8, se o bse rva que e l pe rfil de pro te ínas
e xtrac e lulare s de E. c o li no se vé mo dific ado po r la pre se nc ia de l c ó smido pIJ7760.
CAPÍTULO II- Resultados
e xpre
utiliza
c o m
le gum
iii) la
aum
sustra
2.2.5
AspD
e stud
(que
pFC8
c o rre
sustra
Figu
de p
e n l
pIJ7
Dh5
Estas o b
e sió n de hl
ada e n lo s e
Lo s re sul
ple me ntar
mino sarum,
a e xpre sió n
e ntada e n
ato de AspD
Hla es su
Co n e l f
DE y no de
dió e l pe rfil
e c o ntie ne h
89 (y no A4
e spo ndió a
ato de AspD
C5pIJ7
(T
175
83
62
48
33
ura 2.2.8: An
pIJ7760 cult
a c e pa silv
7760. b- No
5α que po rta
bse rvac io ne
a e n pIJ77
e nsayo s.
tado s de sc
la se c re c ió
, ii) la pre se
de una p
la c e pa A
DE e n Ag ro b
ustrato del s
fin de c o nf
a lg ún o tro
de las pro
hla-aspDE)
412 pFC93)
la pro te ína
DE.
C58 (Y)
58 + 7760 TY)
nálisis del se
tivada en m
ve stre de A
se o bse rva
a e l c ó smid
e s sug ie re n
60 e s fue rte
c ripto s e n e
ó n de o tras
nc ia de pI
ro te ína e xt
A34. Co mo y
bac te rium.
istema Asp
irmar que l
T1SS que p
te ínas e xtra
y e n A412
se c re tó c a
a Hla de A.
C58 (TY)
ecretoma en
medio TY. a-
A. tume fac ie
se c re c ió n
o pIJ7760.
n que la
e me nte ac
e sta se c c ió n
pro te inas d
J7760 a lte ra
trac e lular c
ya se pro p
DE
la se c re c ió
pudie ra e sta
ac e lulare s e
pFC93 (qu
ntidade s c o
tume fac ie n
n A. tumefa
- No se o bse
e ns C58 y
dife re nc ia l
ac tividad
c tivada e n
n indic an q
de pe ndie n
a e l pe rfil d
c o dific ada
uso , e sta p
n de Hla e
ar c o dific ad
e n A412 qu
ue c o ntie ne
o nside rable
ns. Esta e vid
aciens y E. c
e rva se c re c
la c e pa C5
de pro te ína
pro mo to ra
la c e pa A3
que : i) pIJ77
te s de l siste
e flag e linas
e n pIJ7760
pro te ína e s
e s de pe ndie
do e n R. le g
ue po rta e l
e só lo hla c
e s de P33 (F
de nc ia indic
coli en prese
c ió n dife re n
58 c o nte nie
as e n E. c o l
CAPÍT
a que dirig
34 de Rhizo
760 e s c apa
e ma PrsDE
s de Rhizo b
(Hla ) e stá
c andidata
e nte de l sis
gumino saru
plásmido p
c o mple to ).
Figura 2.2.9
c aría que H
encia o aus
c ia l de pro
e ndo e l c ó
li Dh5α y la
TULO II- Resul
48
ge la
o bium
az de
de R.
ium y
muy
a se r
te ma
m, se
pFC89
A412
) que
Hla e s
sencia
te ínas
smido
c e pa
ltados
a la
o tras
lado
se c re
Co m
pFC9
(Mat
Fing e
tripsin
MALD
Figur
no d
de l
EP59
Rhizo
pFC8
MAL
En la Fig
se c re c ió n d
s pro te ínas s
, c o mo se
e tó a ltas c
mo se e spe r
93 (Fig ura 2.
La c o nfi
trix Assiste d
e rprint). En
na ; de e sta
DI-TOF. El an
ra 2.2.9: SDS
de pFC89 y
as pro te ína
9) (fle c has
o bium c uya
89. La fle c h
LDI-TOF) y se
ura 2.2.9 se
de EP77 y E
se c re tadas
había o bs
c antidade s
raba , las ba
.2.9).
irmac ió n d
d Lase r De s
e ste aná lis
a mane ra ,
ná lisis de la
S-PAGE 12%
pFC93. Se
as de pendie
ve rde s). La
a se c re c ió n
ha ro ja mu
e c re tada so
o bse rva , a
EP59 e n pre s
e n pre se nc
se rvado e n
de P38, q
andas dife r
e la ide nti
so rptio n Io
sis, las pro t
se g e ne ra
se c ue nc ia
175
83
62
48
33
25
A
% de protein
o bse rva la
e nte s de l s
a fle c ha na
n no se ve
e stra la pro
o lo e n pre se
ade más, la c
se nc ia de p
c ia de pIJ77
n A412 pIJ7
ue c o rre sp
re nc ia le s e s
FIGURA
dad de la
nizatio n- Ti
te ínas fue ro
n pé ptido s
amino ac íd
A412 pFC93
A412
nas extrace
c o mple me
siste ma PrsD
aranja se ña
e mo dific ad
o te ína de A
e nc ia de l sis
c o mple me n
pFC89, sin e
760 c o mo E
7760, la tra
o nde a un
stuvie ro n au
2.2.9
s pro te ínas
me Of Flig
o n e xtraida
que so n s
dic a de Hla
3 A412
pFC89
elulares de c
e ntac ió n de
DE e n e l m
ala la pro te
da e n pre s
Ag ro bac te r
te ma AspD
ntac ió n de
e mbarg o , n
P52/ EP52.5
ansc o njug an
na flag e lina
use nte s e n
s se re a lizó
ght) y PMF
as de l ge l
so me tido s a
mue stra só l
EP77
EP59
Hla (P33)
cepa A412
e la se c re c
o de lo he te
e ína P38 p
e nc ia de l
rium, Hla (c
DE a lbe rg ad
CAPÍT
A412 e n c u
no se de te c
y EP145. Po
nte A412 p
a de Rhizo b
A412 que
po r MALD
F (Pe ptide
y dig e ridas
a la té c nic
o tre s re sidu
en presenc
ió n de a lgu
e ró lo go (EP
e rte ne c ie nt
a c o nstruc
c o nfirmada
do e n pFC89
TULO II- Resu
49
uanto
c taro n
o r o tro
pFC89
bium.
po rta
DI-TOF
Mass
s c o n
c a de
uo s
cia o
unas
77 y
te a
c ió n
po r
9.
ltados
50
c livable s po r tripsina y se ge ne ra un so lo fragme nto tríptic o de tamaño ade c uado para
se r analizado po r MALDI-TOF (infe rio r a 4000 Dalto ns) (Fig ura 2.2.10) (pro g rama MS-
DIGEST; http:/ / pro spe c to r.uc sf.e du/ pro spe c to r/ c g i-b in/ msfo rm.c g i? fo rm=msdig e st). La
fa lta de un mayo r núme ro de re siduo s c livables po r tripsina e n la se c ue nc ia de Hla
ge ne ra c o mo inc o nve nie nte que e l sc o re (punta je e n la asignac ió n po r PMF) se a muy
ba jo o , inc lusive , no se a signific ativo ; sin e mbargo , la pre se nc ia de l pic o de 1390
Dalto ns e n e l e spe c tro o bte nido de la mue stra P33 pro ve nie nte de A412 prsD pFC89,
mue stra que la únic a pro te ína pre se nte e n la banda ana lizada e s Hla (Silvia Mo re no de
Co lo nna , c o munic ac ió n pe rso nal) (Fig ura 2.2.10).
Peptido (m/ z)(mi)
Daltons
(m/ z)(av)
Daltons Inicia termina
Secuencia
1 5648,7912 5652,2602 1 62
(-)MATTIQLTQSSSDLIGYLNGWTSGFGSTYGA
FYDAQTSSLATTTIDPNTTYEAWGDGSSGGK(G)
2 5632,7963 5636,2608 63 118
(K)GIVMSGALQYSQGNLTGSVDSIVLGTG
YSQSTSGIAVSQQELLIDPDSAYSLAGAR(D)
3 1389,7736 1390,6323 119 130 (R)DLLDLAVYQLAR(F)
4 12280.7851 12288.3230 131 251
(R)FGSLAGFYDYFAATGTVIEDTAASNTLTGFAGADTFV
FSGGNDVVQAGPTGTYGYQDGTDTLDVSAWGATSVD
DLLWYNDNGNAVILSATDTSVSITLNGVDANVLDASDFI
FASALALAA(-)
MATTIQ LTQ SSSDLIG YLNG WTSG FG STYG AFYDAQ TSSLATTTIDPNTTYEAWG DG SSG
G KG IVMSG ALQ YSQ G NLTG SVDSIVLG TG YSQ STSG IAVSQ Q ELLIDPDSAYSLAG AR
DLLDLAVYQ LARFG SLAG FYDYFAATG TVIEDTAASNTLTG FAG ADTFVFSG G NDVVQ
AG PTG TYG YQ DG TDTLDVSAWG ATSVDDLLWYNDNG NAVILSATDTSVSITLNG VDA
NVLDASDFIFASALALAA
Figura 2.2.10: Digestión tríptica de Hla. Se c ue nc ia amino ac ídic a de Hla , las le tras ro jas
subrayadas y e n ne grita re pre se ntan lo s re siduo s amino ac ídic o s do nde c o rta la
e nzima tripsina .
Tabla 2.2.6 Pé ptido s ge ne rado s durante la dige stió n tríptic a de Hla . Se de ta lla la
se c ue nc ia y las masas de c ada pé ptido (mi: mo no iso tó pic o ; av: pro me dio ).
CAPÍTULO II- Resultados
pe rfil
de h
de l v
fo rm
c e pa
de pe
la mo
las c
c o rre
c o ns
Tamp
P42.
aso c
que
sig nif
sug ie
e nc u
ho m
Figu
ban
po r
pe r
tríp
Lo s me n
l e xtrac e lula
hla apsDE, q
ve c to r pI18
aría parte
as A34 y A
e nde nc ia d
o dific ac ió n
e pas de R.
Es impo r
e spo ndie nte
struc c io n pF
po c o se de
Esto mue st
c iado a la p
la se c re c i
fic ativame n
e re n que e x
ue ntra aso c
ó lo gas o bse
ura 2.2.11: E
nda c o rre sp
r la c e pa A4
rfil mue stra
tic o de Hla
no re s nive le
ar de Rhizo b
que e n pFC
891. Estas
de un o pe
A412 c o ntie
de l c o ntexto
de la se c re
le g umino sa
rtante re sa l
e a la fla
FC89, c o ntra
e te c taro n la
tra que e xi
pre se nc ia d
ió n de Hla
nte me no re
xiste una de
c iada a la
e rvadas e n
Espe c tro de
po ndie nte a
412 prsD po
un únic o p
susc e ptib le
e s de se c re
bium e n A4
C89 e staría
o bse rvac io
e ró n mayo r
e ne n e l c ó
o g e nó mic o
e c ió n de pr
arum.
ltar que no
age lina de
ariame nte a
as bandas q
ste a lgun e
de l c ó smido
a e n pre se
s a lo s o bse
e pe nde nc ia
mo dific ac i
las c e pas d
e masa o bte
a la pro te ín
o rtado ra de
pic o inte nso
e de análisis
e c ió n de Hl
412 pFC89 p
pro mo vida
o ne s apo ya
c uya máxi
ó smido pIJ7
o e n e l que
ro te inas he
o se o bse rv
e Rhizo bium
a lo o bse rva
que apare c
e fe c to ne g
o pIJ7760 (F
e nc ia de l
e rvado s e n
a de l c o nte
ió n de la s
de R. le gum
e nido de la
na de apro x
e la c o nstruc
o de 1390
s po r MALDI
la y la c o m
po dría de be
a po r e l pro
an la ide a
ima e xpre s
7760 c o mp
hla-aspDE
te ró lo g as y
vó una dism
m e n las
ado e n pre s
e n so lo e n p
gativo e n la
Fig ura 2.2.9)
la c o nstruc
pre se nc ia
e xto ge nó m
se c re c ió n d
mino sarum u
a banda de
ximadame n
c c ió n pFC8
Dalto n c o r
-TOF.
mple me nta
e rse a una
mo to r de la
que e l c
ió n se o bse
ple to . Ade m
se e nc ue nt
y ho mó lo g a
minuc ió n de
c e pas po
se nc ia de l c
pre se nc ia d
a se c re c ió n
). Po r o tro l
c c ió n pFC8
de pIJ7760.
mic o e n e l q
de pro te ina
utilizadas.
e 35 KDa (P3
nte 33 KDa
89 de l ge l S
re spo ndie n
CAPÍT
c ió n parc ia
me no r e xpr
ac Z pro ve n
luste r hla-a
e rva c uand
más habría
tra , e n c ua
s o bse rvad
e la banda
o rtado ras d
c ó smido pIJ
de pIJ7760,
n de la flag
ado , se o b
89 e s a n
. Esto s re sult
que hla-aspD
as he te ró lo g
33). Se e xtra
(P33) se c re
SDS-PAGE 12
te a l fragm
TULO II- Resul
51
al de l
re sió n
nie nte
aspDE
do las
a una
nto a
as e n
a P38
de la
J7760.
P45 y
ge lina
bse rvó
ive le s
tado s
DE se
gas y
a jo la
e tada
2%. El
me nto
ltados
52
2.2.6 Estudio del contexto genético de hla-aspDE
Lo s re sultado s ante rio re s mue stran que Hla e s se c re tada e n fo rma mayo ritaria
e n e l c o nte xto he te ró lo go de R. le gumino sarum (c e pa A34), mie ntras que e n A.
tume fac ie ns (c e pa C58) no se de te c ta su se c re c ió n, inc lusive e n pre se nc ia de l
c ó smido pIJ7760. Esta dife re nc ia po dría de be rse a a lgún me c anismo re g ulato rio
dife re nc ia l e ntre Agro bac te rium y Rhizo b ium.
En prime r lugar se analizó e l c o nte xto g e né tic o de l siste ma hla -aspDE y se
ide ntific ó río arriba de hla -aspDE un o rf c uyo pro duc to se ría un re c e pto r de he mo
(Atu3385) (Tab la 2.2.1, ve r e n de ta lle Capitulo III, Se c c ió n 3.2.4). Río arriba de e ste ge n
se e nc ue ntran g e ne s que c o dific an un ECF (Extrac e llular Fac to r) σ (Atu3387) y un ECF
anti-σ (Atu3386) de me mbrana inte rna que po drían e star invo luc rado s e n la c aptac ió n
de c o mpue sto s que c o ntie ne n hie rro (Tab la 2.2.1, ve r ade más Capitulo III, Se c c ió n
3.2.1). Río arriba de é sto s ge ne s e n e l mismo se ntido de transc ripc ió n se e nc ue ntra
c o dific ado un siste ma de transpo rte ABC fo rmado po r Atu3388 y Atu3389, c uyas PBPs
(pe riplasmic b inding pro te ins) so n Atu3390 y Atu3391. La ano tac ió n ge nó mic a pre dic e
que e ste siste ma ABC e staría invo luc rado e n la c aptac ió n de hie rro de sde e l
pe riplasma hac ia e l c ito plasma bac te riano y e s ho mó lo g o a siste mas de c aptac ió n de
hie rro de sc ripto s e n varias e spe c ie s bac te rianas (pro g rama BLAST, Link:
http:/ / b last.nc bi.nlm.nih.go v/ Blast.c g i).
Curio same nte , e n 1998 de Luc a e t. al. re po rtaro n que e n la c e pa A34 de R.
le gumino sarum (8401 pRL1JI) a lguno s ge ne s de re spue sta a hie rro , e ntre o tro s, se
e xpre san e n fo rma c o nstitutiva de bido pro bab le me nte a una mutac ió n anc e stra l e n e l
plásmido simbió tic o pRL1JI (de Luc a e t al., 1998). Po r e ste mo tivo re c o nstruye n la c e pa
transfirie ndo pRL1JI que no po se e la mutac ió n anc e stra l a la c e pa A31 (c e pa
iso gé nic a a A34 que no po se e e l plásmido pRL1JI) (We xle r e t al., 2001; de Luc a e t al.
1998). Esta nue va c e pa (J251) re spo nde a la c o nc e ntrac ió n de hie rro c o mo o tras
bac te rias e mpare ntadas.
El fe no tipo / ge no tipo de A34 de sc ripto pre viame nte , e l c o nte xto ge né tic o de
hla aspDE (ve r también Capítulo III, Se c c ió n 3.1.4) y la o bse rvac ió n que Hla no e s
de te c tada e n A. tume fac ie ns e n las mismas c o ndic io ne s de c ultivo , sug ie re n que la
se c re c ió n de Hla po dría re spo nde r a la c o nc e ntrac ió n de hie rro e xtrac e lular.
2.2.7 Identificación de otros T1SS codificados en el genoma de A. tumefaciens
Co mo se de sc rib ió a l c o mie nzo de e ste c apítulo , so lo un c ó smido , pIJ7760,
pro ve nie nte de la b ib lio te c a g e nó mic a de A. tume fac ie ns fue c apaz de re staurar e l
fe no tipo se c re to rio e n las c e pas mutante s de l siste ma PrsDE de R. le g umino sarum. Sin
CAPÍTULO II- Resultados
53
e mbargo , po r e studio s in-silic o de l ge no ma de A. tume fac ie ns c e pa C58, se de te rminó
que A. tume fac ie ns C58 a lbe rg a o tras translo c asas ABC-MFP que fo rmarían parte de
siste mas tipo I de se c re c ió n de pro te ínas.
Para e llo , se busc aro n to das las pro te ínas ho mo lo g as a PrsD de R.
le gumino sarum e n e l ge no ma de Agro bac te rium (Blastp) y se se le c c io naro n aque llas
que e staban c o dific adas adyac e nte s a una pro te ína de la familia MFP. Se c o nfirmó
que c ada pro te ína ho mo lo ga a PrsD pre se nte lo s do minio s NBD y TMD fusio nado s e n
una so la c ade na po lipe ptídic a y que pre se nte n lo s mo tivo s c arac te rístic o s Walke r A,
Walke r B y ABC signature c o n lo s pro gramas Co nse rve d Do mains y Mo tif Sc an
(www.nc b i.nlm.nih.go v/ Struc ture / c dd/ wrpsb .c g i; myhits.isb -sib .c h/ c g i-b in/ mo tif_sc an).
Se busc aro n do minio s c o nse rvado s e n la se c ue nc ia amino ac ídic a de lo s po sib le s
sustrato s de c ada uno de lo s siste mas c o n e l pro grama Co nse rve d Do mains
(www.nc b i.nlm.nih.go v/ Struc ture / c dd/ wrpsb .c g i). Lo s mo tivo s c o nse rvado s se
e studiaro n c o n e l pro grama Mo tif Sc an (myhits.isb -sib .c h/ c g i-b in/ mo tif_sc an) y la
pre se nc ia de se c ue nc ias se ñal de se c re c ió n fue analizada c o n e l pro g rama Signal
Pe ptide Pre dic tio n (bmbpc u36.le e ds.ac .uk/ pro t_analysis/ Signal.html). La pre dic c ió n
de o pe ro ne s fue analizada e n la pág ina de o pe ro ne s pre dic ho s para Agro bac te rium
(de pts.washingto n.e du/ agro / o pe ro ns/ c 58all6jan08/ que ry_o pe ro n_display.html).
De e sta mane ra , se identific aro n o tro s tre s putativo s ABC-MFP de T1SS e n e l
ge no ma de A. tume fac ie ns C58, ade más de AspDE.
TISS-1:
Co rre spo nde a l siste ma de se c re c ió n c o n mayo r similitud de se c ue nc ia a PrsDE
de R. le gumino sarum. Este siste ma e staría fo rmado po r lo s o rf Atu4413 y Atu4414 que
c o dific an lo s c o mpo ne nte s ABC y MFP re spe c tivame nte e n e l c ro mo so ma line a l de A.
tume fac ie ns C58. Atu4413 tie ne 583 aa y pre se nta 55% de ide ntidad y 72% de similitud
de se c ue nc ia c o n PrsD de R. le gumino sarum c e pa A34. Atu4414 tie ne 434 aa y
pre se nta 44% de ide ntidad y 63% de similitud de se c ue nc ia amino ac ídic a c o n PrsE de
R. le g umino sarum c e pa A34.
El o rf río arriba de e ste siste ma, Atu4412, c o dific a una pro te ína de 1937 aa
pro pue sta c o mo Rhizo bio c ina / RTX to xina e n la ano tac ió n ge nó mic a . No pre se nta
mo tivo s señal de se c re c ió n e n e l e xtre mo N-te r y pre se nta vario s do minio s
c o nse rvado s: un do minio de pe ptidasa M10 -Se rra lisina re lac io nado a la se c re c ió n a
travé s de las me mbranas de me ta lo pro te asas, un do minio se rina / tre o nina fo sfatasa, un
do minio de VCBS de sc ripto para pro te ínas pe rte ne c ie nte s a las e spe c ie s Vibrio ,
Co lwe llia , Bradyrhizo bium, y She wane lla que po dría e star implic ado e n la adhe sió n y
CAPÍTULO II- Resultados
54
vario s do minio s de RTX to xina de pro te ínas que une n c a lc io , c arac te rístic o de sustrato s
de T1SS. Pre se nta ade más 25 mo tivo s de he mo lisinas que une n c a lc io . Atu4412
pre se nta ho mo lo g ía a varias pro te ínas pro pue stas c o mo RTX to xinas,
me ta lo fo sfo e ste rasas y he mo lisinas pe ro e n to do s lo s c aso s so n pro te ínas hipo té tic as.
La pro babilidad de que Atu4412 pe rte ne zc a a l putativo o pe ró n fo rmado po r Atu4413 y
Atu4414 e s de l 47%. La figura 2.2.12 a , mue stra la o rganizac ió n de e ste c luste r g e né tic o .
TISS-2:
Está fo rmado po r lo s o rf Atu2705 y Atu2706 que c o dific arían lo s c o mpo ne nte s
ABC y MFP re spe c tivame nte , lo c a lizado s e n e l c ro mo so ma c irc ular de A. tume fac ie ns
C58. Atu2705 tie ne 577 aa de lo ng itud y pre se nta 54% de ide ntidad y 70% de similitud
de se c ue nc ia amino ac ídic a c o n PrsD de R. le gumino sarum c e pa A34. Atu2706 tie ne
437 aa y pre se nta 55% de ide ntidad y 73% de similitud de se c ue nc ia amino ac ídic a c o n
PrsE de R. le gumino sarum c e pa A34.
Río aba jo de Atu2706 se e nc ue ntra e l o rf Atu2707; la pro te ína c o dific ada po r
e ste o rf tie ne 317 aa y e s pre dic ha c o mo rhizo bio c ina (Rzc ). Pre se nta 36% de
ide ntidad y 46% de similitud c o n Rzc A c o dific ada po r pRL1JI de R. le g umino sarum bv.
trifo lii c e pa 248 (Ore snik e t al., 1999). Las rhizo bio c inas de sc riptas e n Rhizo bio s so n
bac te rio c inas se c re tadas po r sistemas TISS, tie ne n ho mo lo g ía c o n RTX to xinas y
he mo lisinas y se aso c ian a la supe rvive nc ia o c o mpe te nc ia de l rhizo b io e n vida libre .
Rzc A tie ne ac tividad de bac te rio c ina c a lc io de pe ndie nte . La mutante rzc A se
e nc ue ntra a fe c tada en la c o mpe te nc ia po r la o c upanc ia de l nó dulo . Atu2707 no
pre se nta se c ue nc ia se ñal para su se c re c ió n e n e l e xtre mo N-te r (c o mo se pre dic e
para pro te ínas se c re tadas po r TISS), tampo c o pre se nta do minio s c o nse rvado s e n su
se c ue nc ia amino ac ídic a pe ro c o ntie ne 4 re pe tic io ne s de mo tivo de he mo lisinas que
une n c a lc io . Esto s mo tivo s tie ne n un núme ro variab le de re pe tic io ne s e n tánde m que
c o nsiste n e n 9 aa ric o s e n g lic ina , ác ido aspártic o y asparrag ina , c arac te rístic as de
sustrato s de T1SS c o mo la pro te ína No dO. Curio same nte , e l o pe ró n pre dic ho e stá
fo rmado po r Atu2706 y Atu2705 y no inc luye a Atu2707 (pro babilidad de 13%) a pe sar
de se r e sta pro te ína un pro bable sustrato de e ste T1SS. La fig ura 2.2.12 b , mue stra la
o rganizac ió n ge né tic a de e ste po sib le T1SS inc luye ndo a l g e n de la bac te rio c ina .
TISS-3:
La translo c asa de e ste siste ma de se c re c ió n e s e l que pre se nta me no s similitud
c o n PrsDE de R. le gumino sarum. Está c o dific ado e n e l c ro mo so ma line a l po r Atu3322 y
Atu3323 (ABC y MFP, re spe c tivame nte ). Atu3322 tie ne 551 aa y pre se nta 35% de
ide ntidad y 55% de similitud de se c ue nc ia amino ac ídic a c o n PrsD de R. le gumino sarum
CAPÍTULO II- Resultados
55
c e pa A34. Atu3323 tie ne 452 aa de lo ng itud y pre se nta 32% de ide ntidad y 51%
de similitud de se c ue nc ia c o n PrsE de R. le gumino sarum, c e pa A34.
La pro te ína c o dific ada río aba jo y po sib le sustrato e s Atu3324. Este o rf c o dific a
una pro te ína hipo té tic a de 164 aa y pre se nta similitud c o n varias pro te ínas hipo té tic as
de pro te o bac te rias c uya func ió n no ha sido c arac te rizada. No pre se nta se c ue nc ia
se ñal e n su e xtre mo N-te r (c o mo e n lo s TISS) y tampo c o tie ne do minio s o mo tivo s
c o nse rvado s. El o pe ró n pre dic ho de e ste T1SS inc luiría a l o rf Atu3324 c o n una
pro babilidad de l 44%. En la fig ura 2.2.12 c , se mue stra la o rg anizac ió n de e ste c luste r
ge né tic o .
Figura 2.2.12: a - T1SS-1 de A. tumefaciens. Flecha turquesa: o rf ho mó lo go a PrsD de R.
le g umino sarum c e pa A34. Co mpo ne nte ABC. Flecha celeste: o rf ho mó lo go a PrsE de
R. le g umino sarum c e pa A34. Co mpo ne nte MFP Flecha roja: Pro te ína hipo té tic a ,
po sib le sustrato de l siste ma. b - T1SS-2 de A. tumefaciens. Flecha turquesa: o rf
ho mó lo go a PrsD de R. le g umino sarum c e pa A34. Co mpo ne nte ABC. Flecha celeste:
o rf ho mó lo go a PrsE de R. le gumino sarum c e pa A34. Co mpo ne nte MFP Flecha roja:
Pro te ína hipo té tic a , po sib le sustrato de l siste ma. c - T1SS-3 de A. tumefaciens. Flecha
turquesa: o rf ho mó lo go a PrsD de R. le g umino sarum c e pa A34. Co mpo ne nte ABC.
Flecha celeste: o rf ho mó lo go a PrsE de R. le gumino sarum c e pa A34. Co mpo ne nte
MFP Flecha roja: Pro te ína hipo té tic a , po sib le sustrato de l siste ma. Esque ma re a lizado
usando e l pro grama VECTOR NTI. R.l.: Rhizo b ium le g umino sarum
CAPÍTULO II- Resultados
56
Inic ia lme nte se pro puso analizar la po sib le func ió n de e stas translo c asas de TISS
a travé s de la g e ne rac ió n de mutante s po r inse rc ió n de c ase te s de re siste nc ia a
antib ió tic o s. Sin e mbargo , Agro bac te rium o fre c e g ran dific ultad e n la o bte nc ió n de
re c o mbinante s do ble s (Ne ste r, c o munic ac ió n pe rso nal; Le e , 2006). Las o bse rvac io ne s
in silic o indic an que e stas translo c asas junto c o n un c o mpo ne nte OMP e starían
invo luc radas e n la se c re c ió n de bac te rio c inas y/ o pro te ínas de la familia de
he mo lisinas, c uya func ió n po dría se r c o nfe rir ve nta jas c o mpe titivas po r e l nic ho
e c o ló g ic o .
CAPÍTULO II- Resultados
57
CAPITULO II: IDENTIFICACIÓN DE UN SISTEMA DE SECRECIÓN DE PROTEÍNAS TIPO I EN
Agrobacterium tumefaciens.
2.3 CONCLUSIONES Y DISCUSIÓN
El a islamie nto de un T1SS de A. tume fac ie ns me diante la e strateg ia de
c o mple me ntac ió n func io nal he te ró lo g a de la se c re c ió n de las g lic anasas e n las
mutante s de l T1SS de R. le g umino sarum pe rmitió a islar un c ó smido , pIJ7760, c apaz de
re staurar la se c re c ió n de e stas pro te ínas. Ade más, pIJ7760 fue c apaz de
c o mple me ntar la se c re c ió n de a l me no s o tras c uatro pro te ínas de pe ndie nte s de PrsDE
e n R. le gumino sarum. El subc lo nado , se c ue nc iac ió n parc ia l de lo s fragme nto s
pro ve nie nte s de pIJ7760 y po ste rio r ide ntific ac ió n de la re g ió n e n e l ge no ma de A.
tume fac ie ns, mo stró la pre se nc ia de c uatro pro te ínas de la supe rfamilia ABC. Esto no
e s so rpre nde nte dado que A. tume fac ie ns po se e e n to ta l 153 transpo rtado re s ABC
c o mple to s ade más de a lgunas subunidade s hué rfanas, más de l do b le de
transpo rtado re s ABC que lo s que se e nc ue ntran e n o tras bac te rias c uyo s ge no mas han
sido se c ue nc iado s. Esta partic ularidad po dría re fle jar la ne c e sidad de transpo rtado re s
de a lta a finidad para la adquisic ió n de nutrie nte s e n lo s ambie nte s a ltame nte
c o mpe titivo s de la rizo sfe ra y e l sue lo (Wo o d e t al., 2001; Go o dne r e t al., 2001).
A pe sar de habe r c uatro putativo s siste mas que c o ntiene n transpo rtado re s ABC
e n pIJ7760, lo s análisis in-silic o apo rtaro n e vide nc ias de la pre se nc ia de un únic o T1SS
e n pIJ7760 a l que llamamo s AspDE; e s de c ir, aspD (Ag ro bac te rium se c re tio n pro te in D)
a l ge n que c o dific a e l c o mpo ne nte ABC y aspE (Ag ro bac te rium se c re tio n pro te in E) a l
ge n de l c o mpo ne nte de fusió n de me mbranas. El a line amie nto de se c ue nc ias
pro te ic as de transpo rtado re s c arac te rizado s e n o tras e spe c ie s bac te rianas junto c o n
las se c ue nc ias pro te ic as traduc idas de lo s putativo s transpo rtado re s ABC c o dific ado s
e n pIJ7760, mo stró que AspD agrupa c o n pro te ínas invo luc radas e n la se c re c ió n de
pro te ínas, mie ntras que las o tras tre s pro te ínas ABC agrupan c o n pro te ínas
invo luc radas e n la c aptac ió n de nutrie nte s. Po r subc lo nado de pIJ7760 y
c o mple me ntac ió n func io nal he te ró lo ga se c o nfirmó que aspDE e s re spo nsable de la
re staurac ió n de la se c re c ió n de las g lic anasas y de l fe no tipo muc o so o bse rvado en las
mutante s A412 (prsD::Tn5) y A755 (prsE::Spe c r) de R. le g umino sarum.
Po r o tro lado , pIJ7760 tambié n c o nfirió a Rhizo bium la c apac idad de se c re tar
Hla e n fo rma mayo ritaria . Es más, utilizando una e strate g ia de c o mple me ntac ió n
he te ró lo ga se de mo stró que la pro te ína Hla e s sustrato de AspDE. Sin e mbarg o , su
pre se nc ia no se de te c tó e n e l me dio e xtrac e lular de A. tume fac ie ns inc lusive e n
pre se nc ia de l c ó smido pIJ7760. En e l traba jo de Ro se n e t. al., lo s auto re s re po rtan un
mapa de re fe re nc ia b idime nsio nal de las pro te ínas to ta le s de A. tume fac ie ns c e pa
58
C58. En e l análisis pro te ó mic o se ide ntific aro n po r e spe c tro me tría de masa to do s lo s
spo ts pre se nte s. Para e llo , Agro bac te rium fue c ultivada e n un me dio sa lino mínimo (H4)
a 25oC y c o se c hada e n fase e xpo ne nc ia l de c re c imie nto . Lo s re sultado s no mo straro n
la pre se nc ia de AspD o AspE (Ro se n e t al., 2004) po r lo que e s po sib le que e stas
pro te ínas só lo se e xpre se n e n de te rminadas c o ndic io ne s de c ultivo . En e l análisis
pro te ó mic o no se inc luye n las pro te ínas se c re tadas, de mane ra que no se pue de n
o bte ne r c o nc lusio ne s re spe c to a Hla .
La fue rte se c re c ió n de Hla indic a que , c o ntrariame nte a lo que o c urre e n A.
tume fac ie ns, e l siste ma AspDE (y Hla ) se e xpre saría e n fo rma c o nstitutiva e n R.
le gumino sarum A34. A pe sar de la c e rc anía filo ge né tic a , e s po sib le que e xista a lg ún
me c anismo de re gulac ió n dife re nc ia l e ntre A. tume fac ie ns y la c e pa utilizada (A34) de
R. le g umino sarum.
Po r o tro lado , la fa lta de c o mple me ntac ió n he te ró lo ga o bse rvada e n
pre se nc ia de pFC101 y HDE-LH (no mo strado ), sug ie re que no habría un pro mo to r que
dirija la transc ripc ió n de aspDE río a rriba de hla-aspDE (ni aspDE). Ade más, lo s análisis
in-silic o no pre dic e n la pre se nc ia de pro mo to re s e n dic has reg io ne s. Una po sibilidad e s
que la e xpre sió n de aspDE e n pFC89 (que c o mple me nta las mutante s) e stuvie ra
me diada po r e l pro mo to r de lac Z pre se nte e n e l ve c to r pIJ1891. Ade más, la se c re c ió n
de Hla e n R. le gumino sarum A412 pFC89 (ac o tada só lo a l siste ma hla -aspDE) e s
disc re ta , e n c o ntraste c o n lo s nive le s muy a lto s de se c re c ió n de Hla o bse rvado s e n
pre se nc ia de pIJ7760. Este re sultado sug ie re que habría una de pe nde nc ia de la
e xpre sió n de hla-aspDE de l c o nte xto ge né tic o e n e l que se e nc ue ntra , apo yando la
ide a de que e ste lo c us po dría fo rmar parte de un c luste r de ge ne s (o unidad
transc ripc io na l) de mayo r tamaño .
En e l pe rfil de pro te ínas e xtrac e lulare s de las c e pas transc o njugante s de R.
le gumino sarum, e n pre se nc ia de pIJ7760, se ve no to riame nte disminuida una flage lina
de apro ximadame nte 38 KDa. Este e fe c to no se o bse rva e n pre se nc ia de pFC89, lo
que sug ie re que de pe nde de l c o nte xto de hla -aspDE e n pIJ7760. El c o nte xto g e né tic o
de hla -aspDE e n pIJ7760 a fe c taría o mo dularía la se c re c ió n de pro te ínas ho mo lo gas
(Hla ) y/ o he te ró lo gas (flage linas) e n e l ho spe dado r he te ró lo go Rhizo bium. Se pue de
sug e rir que e ste e fe c to no e staría aso c iado a l putativo ac tivado r transc ripc io nal de la
familia de LysR, Atu3381, ya que e ste ge n se e nc ue ntra c o nte nido tanto e n pIJ7760
c o mo e n pFC89 (Figura 2.2.6).
Hasta e l mo me nto re sulta so rpre nde nte la ause nc ia de se c re c ió n de Hla e n la
c e pa silve stre C58 de A.tume fac ie ns po rtado ra de l c ó smido pIJ7760 (Figura 2.2.8 a ).
Este re sultado sug ie re un e fe c to re g ulato rio po sitivo so bre e l siste ma AspDE, o bse rvable
CAPÍTULO II- Conclusiones y Discusión
59
so lo e n e l c o nte xto ge né tic o de l c ó smido pIJ7760 y utilizando e l mo de lo he te ró lo go de
Rhizo bium, ya que no se o bse rva c uando se a isla (c lo nado ) e l siste ma aspDE y su
sustrato Hla e n pFC89. Las o bse rvac io ne s public adas po r de Luc a e t al., y We xle r e t al.
sug ie re n que A34 pre se nta e xpre sió n c o nstitutiva de ge ne s no rmalme nte re gulado s po r
la c o nc e ntrac ió n de hie rro e xtrac e lular e n o tras e spe c ie s bac te rianas (de Luc a e t al.,
1998, We xle r e t al., 2001). Estas o bse rvac io ne s, la so bre e xpre sió n de Hla e n A34 pe ro su
ause nc ia e n e l me dio e xtrac e lular de A. tume fac ie ns e n idé ntic as c o ndic io ne s de
c ultivo (inc lusive e n pre se nc ia de pIJ7760), sug ie re n que la e xpre sió n de a lguno s ge ne s
de A. tume fac ie ns, prese nte s e n pIJ7760 c o mo Hla , po dría e star re gulada po r la
c o nc e ntrac ió n de hie rro e xtrac e lular. Esto s re sultado s sug ie re n, ade más, que la c e pa
de Rhizo bium (A34) usada c o mo silve stre e n e l a islamie nto de l c ó smido pIJ7760 y c o mo
c e pa de re fe re nc ia ac tualme nte e s e n re a lidad una c e pa mutante .
A pe sar de que A. tume fac ie ns a lbe rga o tro s tre s putativo s T1SS só lo se a isló un
c ó smido (que c o ntie ne aspDE) c apaz de c o mple me ntar e n fo rma he te ró lo ga la
se c re c ió n de pro te ínas e n las c e pas mutante s de R. le g umino sarum. Este he c ho po dría
de be rse a la e spe c ific idad de sustrato s que lo s T1SS sue le n te ne r, sie ndo AspDE e l únic o
siste ma de se c re c ió n de pro te ínas tipo I c apaz de re c o no c e r lo s sustrato s de l siste ma
PrsDE de R. le gumino sarum. AspDE de A. tume fac ie ns e s po te nc ia lme nte pro misc uo ,
c o mo lo e s PrsDE de R. le gumino sarum, dada la c apac idad de re staurar la se c re c ió n
de a l me no s 4-5 de las pro te ínas sustrato de l siste ma PrsDE, ade más de la pro pia Hla .
No hay que de sc artar que e l sc re e ning de la b ib lio te c a ge nó mic a de A. tume fac ie ns,
no haya sido a saturac ió n o que lo s c luste rs de g e ne s no e sté n bie n re pre se ntado s.
Tampo c o se pue de de sc artar que la e xpre sió n de dic ho s TISS re quie ra de a lg una
c o ndic ió n de c ultivo partic ular. En e l futuro se rá inte re sante e xplo rar e l ro l de e sto s
siste mas e n e l c ic lo de vida de A. tume fac ie ns.
CAPÍTULO II- Conclusiones y Discusión
CAPÍTULO III:
CONTEXTO GENÉTICO Y REGULACIÓN DE
Hla-AspDE EN EL HOSPEDADOR
HETERÓLOGO DE R. LEGUMINOSARUM.
61
CAPITULO III: CONTEXTO GENETICO Y REGULACIÓN DE HLA-AspDE EN EL HOSPEDADOR
HETERÓLOGO DE R. LEGUMINOSARUM.
Lo s re sultado s de l c apítulo ante rio r mue stran una se c re c ió n pro mine nte de la
pro te ína Hla e n e l ho spe dado r he te ró lo g o R. le gumino sarum c e pa A34, que
de pe nde ría e n g ran me dida de l c o nte xto ge nétic o e n e l que se e nc ue ntra hla aspDE.
Se o bse rvó que río arriba de hla , se e nc ue ntran ge ne s pro bable me nte implic ado s e n
la c aptac ió n de hie rro y/ o he mo . En c o ntraste c o n lo que se o bse rva e n R.
le gumino sarum A34, no se o bse rva se c re c ió n de e sta pro te ína e n la c e pa silve stre de
A. tume fac ie ns e n las mismas c o ndic io ne s de c ultivo . Alg ún e fe c to de re gulac ió n
dife re nc ia l re prime la se c re c ió n de Hla e n A. tume fac ie ns y/ o la induc e e n R.
le gumino sarum. En líne a c o n e sta hipó te sis, la c e pa A34 pre se nta un c o mpo rtamie nto
anó malo y la e xpre sió n de ge ne s que re spo nde n a hie rro , e ntre o tro s, se ve de s-
re primida . Se Pro po ne que e l lo c us hla aspDE fo rmaría parte de un c luste r de ge ne s
func io nalme nte re lac io nado s, que e staría invo luc rado e n la c aptac ió n de hie rro o
he mo . Se pro puso inve stigar la re lac ió n que e xiste e ntre la re g ulac ió n de la
ho me o stasis de l hie rro y la re g ulac ió n de la e xpre sió n de hla e n e l ho spe dado r sustituto
Rhizo bium. En prime r lugar se de sc rib irán las c arac te rístic as ge ne rale s de l me tabo lismo
de l hie rro y la re g ulac ió n de su ho me o stasis e n bac te rias.
3.1 INTRODUCCIÓN
3.1.1 Importancia del hierro para los microorganismos
El hie rro e s un nutrie nte e se nc ia l para la mayo ría de lo s mic ro o rganismo s
e studiado s (We inbe rg , 1997). En la natura le za , e ste me ta l de transic ió n se pre se nta e n
do s e stado s re do x: Fe 2+ y Fe 3+, y a su ve z pue de ado ptar distinto s e stado s spin. El
po te nc ia l re do x de l Fe 2+/ Fe 3+ e stá c o mpre ndido e ntre -300 y +700 mV, de pe ndie ndo
de l ligando . Estas c arac te rístic as hac e n de l hie rro un c ata lizado r a ltame nte ve rsátil; sin
e mbargo , su func io nalidad de pe nde de su inc o rpo rac ió n a pro te ínas. El hie rro pue de
e star e n fo rma mo no o b inuc le ar c o mo c o fac to r de pro te ínas, y pue de tambié n
fo rmar parte de lo s c o mple jo s Fe -S o de l g rupo he mo (Andre ws e t al., 2003). Esto s
g rupo s jue gan un pape l impo rtante e n las re ac c io ne s re do x y fo rman parte de
mo lé c ulas c lave s c o mo lo s c ito c ro mo s e n lo s que lo s g rupo s Fe -S y he mo partic ipan e n
la transfe re nc ia e le c tró nic a ac tuando c o mo c e ntro s c ata lític o s. Las pro te ínas que
c o ntie ne n he mo y Fe -S c o mo c o fac to r e stán invo luc radas e n varias vías me tabó lic as
c lave s, c o mo la sínte sis de pirimidinas y ác ido s g raso s, e l c ic lo de lo s ác ido s
tric arbo xílic o s, pro te c c ió n c o ntra e l e stré s o xidativo o nitro sativo (c a ta lasas,
pe ro xidasas y o xige nasas), fijac ió n de nitró ge no (nitro ge nasas), pro duc c ió n y c o nsumo
de hidró g eno (hidro ge nasas), fo to sínte sis (c lo ro fila ), re spirac ió n y me tano gé ne sis
62
(c o mple jo de shidro g e nasa de mo nó xido de c arbo no ) e ntre o tro s (Cro sa , 1997;
Ratle dge y Do ve r, 2000; Kö ste r, 2001).
Si b ie n e l hie rro e s un e le me nto muy abundante e n la natura le za , e n
c o ndic io ne s ae ró bic as y pH 7 se o xida a Fe 3+ fo rmando c o mple jo s hidró xido s (Fe 2O3-
nH2O). En e ste e stado de o xidac ió n e l hie rro e s a ltame nte inso luble (10-18 a pH ne utro ) y
de ja de se r b io dispo nib le para lo s mic ro o rganismo s (Andre ws e t al., 2003). Las bac te rias
po se e n varias e strateg ias que le s pe rmite n pro ve e rse de hie rro , c o mo la disminuc ió n
de l pH que so lubiliza lo s ó xido s fé rric o s, la re duc c ió n de l io n fé rric o a io n fe rro so y la
utilizac ió n de que lante s de io n fé rric o . El uso de que lante s ya se an unido s a la
supe rfic ie c e lular o se c re tado s a l me dio e xtrac e lular, so n las e strate g ias que han
ado ptado la mayo ría de lo s mic ro o rg anismo s para la c aptac ió n de hie rro (Gue rino t,
1994). Las bac te rias ne c e sitan una c o nc e ntrac ió n de hie rro c o mpre ndida e ntre 10-6 y
10-8 M y la limitac ió n de la dispo nibilidad de hie rro a fe c ta e l c re c imie nto de la mayo ría
de las e spe c ie s bac te rianas e studiadas. Es po r e llo que e n las bac te rias pató ge nas la
adquisic ió n de hie rro e s uno de lo s princ ipa le s paso s para su de sarro llo de ntro de l
ho spe dado r (Chianc o ne e t al. 2004).
La limitac ió n de hie rro e s, ade más, un fac to r muy impo rtante e n la infe c c ió n
bac te riana c o mo se ñal ambie nta l que ge ne ra la e xpre sió n de fac to re s de virule nc ia
(Litwin y Calde rwo o d, 1993). Nume ro so s traba jo s mue stran la influe nc ia de la
insufic ie nc ia de hie rro e n la e xpre sió n de ge ne s de virule nc ia c o mo e n la to xina I de
Esc he ric hia c o li (Calde rwo o d y Me kalano s, 1987), la to xina difté ric a to xA de
Co ryne bac te rium diphthe riae (Bo yd e t al. 1990) y la e xpre sió n de la he mo lisina e n de
Ae ro mo nas hydro phila y de Vibrio Cho le rae (Sha e t al. 2001; Sto e bne r, 1998). En Vibrio
vulnific us y Myc o bac te rium tube rc ulo sis la habilidad de adquirir hie rro e s de te rminante
e n la pato gé ne sis (Ro drigue z y Smith, 2006).
3.1.2 El hierro y el estrés oxidativo
A pe sar de se r un nutrie nte e se nc ia l e l hie rro e s a ltame nte to xic o de ntro de la
c é lula y e n c o ndic io ne s ae ró bic as induc e la fo rmac ió n de radic a le s libre s de o xíg eno
(EROs) c o mo radic a le s hidro xilo (OH*), anio ne s supe ró xido s (O2-) y pe ró xido s (RO2) a
travé s de las re ac c io ne s de Fe nto n y Habe r-We iss (To uati, 2000). Estas EROs pue de n
dañar lípido s, pro te ínas y ADN po r o xidac ió n y po r e ste mo tivo que la bac te ria de be
e liminarlas ante s de que c ause n daño s c e lulare s signific ativo s (Hansbe rg , 2002). En la
re ac c ió n de Fe nto n se fo rma e l radic a l hidro xilo (*OH), a ltame nte re ac tivo e n lo s
siste mas b io ló g ic o s. Existe n me c anismo s de de fe nsa utilizado s po r las bac te rias para
CAPÍTULO III- Introducción
63
e vitar e ste daño o xidativo me diado s po r la e xpre sió n de c ata lasas/ pe ro xidasas y
po sib le s re duc tasas a lquilo -hidro xilasas (Manc a e t al., 1999).
Po r lo e xpue sto , e l mante nimie nto de la ho me o stasis de hie rro e s e se nc ia l para
la supe rvive nc ia de lo s mic ro o rganismo s. Lo s me c anismo s de c aptac ió n,
a lmac e namiento y utilizac ió n de hie rro e stán a ltame nte re gulado s. Hay pro fundo s
c ambio s e n la fisio lo g ía bac te riana de pe ndie nte s de la c o nc e ntrac ió n e xtrac e lular de
hie rro . Existe un de lic ado ba lanc e e ntre paráme tro s ambienta le s y fisio ló g ic o s que
ac túan e n fo rma po sitiva o ne gativa induc iendo y re primie ndo ge ne s invo luc rado s e n
e l me tabo lismo de l hie rro .
3.1.3 Regulación del metabolismo del hierro
El paradigma de la re gulac ió n me diada po r hie rro e s Fur, inic ia lme nte de sc ripto
e n E. c o li (Hantke , 1981) y Salmo ne lla typhimurium (Ernst e t al., 1978). Fur e s un re pre so r
transc ripc io na l que une Fe 2+ y ac túa c o mo re gulado r g lo bal de re spue sta a la
c o nc e ntrac ió n de hie rro e xtrac e lular. En insufic ie nc ia de hie rro , Fur pie rde a su
c o fac to r me tá lic o y de e sta mane ra pe rmite la transc ripc ió n de ge ne s de c aptac ió n,
utilizac ió n y a lmac e namiento de hie rro . El re guló n de Fur e s bastante amplio e inc luye
ge ne s c uya e xpre sió n se ve induc ida y o tro s en lo s que se ve re primida ; e ntre e llo s se
e nc ue ntran g e ne s invo luc rado s e n la c aptac ió n de hie rro y de he mo , sínte sis de
fac to re s de virule nc ia y re siste nc ia a c o ndic io ne s ác idas (Sto jiljko vic e t al., 1994;
Mc Hugh e t al., 2003, Vasil e t al., 1999).
En α-pro te o bac te rias la re gulac ió n de la ho me o stasis de l hie rro e s d ife re nte a la
e studiada e n γ-pro te o bac te rias. Fur ha sido e studiado e n R. le gumino sarum (We xle r e t
al., 2003, Diaz-Mire le s e t al., 2004), S. me lilo ti (Chao e t al., 2004; Pla te ro e t al., 2004) y A.
tume fac ie ns (Kitphati e t al., 2007) y se ha re po rtado que su ro l e n la re spue sta a hie rro
e s me no r. Jo hnsto n e t al. re a lizaro n un e studio filo ge né tic o de re gulado re s de
re spue sta a hie rro e n α-pro te o bac te rias y mo straro n que e n la familia
Bradyrhizo biac e ae , Fur pe rmane c e c o mo re g ulado r g lo bal de re spue sta a hie rro y
apare c e ade más e l re gulado r g lo bal IrrA. Sin e mbarg o , e n la familia Rhizo biac e ae , Fur
e s un re g ulado r de re spue sta a la c o nc e ntrac ió n e xtrac e lular de mag ne sio y la
re gulac ió n me diada po r hie rro se ría lle vada a c abo po r o tro s re gulado re s (Jo hnsto n e t
al., 2007). En rizo bia le s, la re gulac ió n me diada po r hie rro e s lle vada a c abo po r lo s
re gulado re s RirA e IrrA (Jo hnsto n e t al., 2007). Esto s re gulado re s re spo nde rían e n
parale lo a la dispo nib ilidad intrac e lular de he mo y po sib le me nte tambié n a la
dispo nib ilidad de g rupo s Fe -S y sus c o nse c ue nc ias fisio ló g ic as. Esto s he c ho s
CAPÍTULO III- Introducción
c o rre
2006
3.1.4
al. 20
ngam
re pre
hie rro
afinid
me c
dife re
le gum
e nc u
pre se
re gu
c o nt
e n
a lma
me ta
pro d
Figur
e n Rh
e lac io nan d
; Yang e t al
Regulaci
RirA e s u
002; 2005), S
m e t al., 20
e so r transc r
o pe ro c ua
dad po r e l A
anismo de
e nc iándo se
mino sarum
ue ntra a fe c
e nta do s p
lado a ni
inuac ió n) (T
la re g ulac
ac e namie nt
abo lismo de
duc c ió n de
ra 3.2.1: Esq
hizo biale s. I
dire c tame nt
l., 2006; Sma
ión mediad
n re gulado
S. me lilo ti (C
009), pe rte n
ripc io nal qu
ando e ste
ADN y pe rm
e ac c ió n d
e e n e l c o
pre se nta u
c tada . Co m
pro mo to re s
ve l transc r
To dd e t al.
c ió n de g
to intrac e lu
e l hie rro no
e xo po lisac á
que ma de la
mage n to m
te c o n la c
a ll e t al, 200
da por RirA
o r g lo ba l de
Chao e t al.,
ne c e a la f
ue une un c
me tal e s e
mitie ndo la t
de RirA e s
o fac to r que
un c re c imie
mo o c urre
que c o nt
ripc io nal ta
2002). Al ig
ge ne s dire c
ular de hie
o e s e vide n
árido s (Cha
a re gulac ió
mada de Jo
c o nc e ntrac i
08).
e re spue sta
2005; Viguie
familia de f
c luste r de F
e sc aso , RirA
transc ripc ió
s se me jant
e une c ad
nto disminu
c o n Fur, R
tro lan e n f
ambié n po
gual que e n
c tame nte
e rro pe ro ta
nte , c o mo
ao e t al., 200
n de la tran
o hnsto n e t a
ió n de hie rr
a hie rro e n
e r e t al., 200
fac to re s de
Fe -S e n c o n
A pie rde su
ó n de lo s ge
te a l me c
a uno . La
uido a pe sa
RirA e stá s
fo rma dua
o r e l re gu
n e l c aso de
re lac io nad
ambié n ge
g e ne s de
05).
nsc ripc ió n g
al., 2007.
ro e xtrac e lu
R. le gumin
05) y A. tum
e transc ripc
ndic io ne s d
c o fac to r d
e ne s b lanc o
anismo me
c e pa mut
ar de que la
uje to a au
l su transc
ulado r g lo b
e Fur, RirA e
do s c o n la
e ne s c uya
func ió n me
g e né tic a m
CAPÍTULO
ular (To dd e
o sarum (To
me fac ie ns (N
c ió n Rrf2 y e
e sufic ienc
disminuye nd
o (Figura 3.1
e diado po
tante rirA d
a simbio sis
uto rre g ulac
c ripc ió n. Rir
bal IrrA (v
e stá invo luc
a c aptac ió
re lac ió n c o
e tabó lic a
e diada po r
O III- Introduc
64
e t al.,
dd e t
Ng o k-
e s un
ia de
do su
.1). El
o r Fur
de R.
no se
ió n y
rA e s
ve r a
c rado
ó n y
o n e l
y de
r RirA
cción
65
3.1.5 Fenotipo relacionado al hierro de la cepa A34 de R. leguminosarum
de Luc a e t al. re po rtaro n que la c e pa de R. le g umino sarum A34 (8401 pRL1JI)
pre se nta e xpre sió n c o nstitutiva de l o pe ró n fhuCDB invo luc rado e n la c aptac ió n de l
side ró fo ro vic ibac tina y mo straro n que e n dic ha c e pa la pre se nc ia de l plásmido
simbió tic o pRL1JI re prime la e xpre sió n c o nstitutiva de Fur (de Luc a e t al., 1998), a pe sar
de que de spué s We xle r e t al. (2003) y Diaz-Mire le s e t al. (2004) de mo straro n que e n A34
Fur e stá invo luc rado e n la re spue sta a la c o nc e ntrac ió n de magne sio . Ye o man e t al.,
mo straro n a l año siguie nte que A34 pre se nta , ade más, transc ripc ió n re lativame nte a lta
e n sufic ie nc ia de hie rro de l ge n rpo I (Ye o man e t al., 1999). Po ste rio rme nte We xle r e t al.,
re po rtaro n que vario s ge ne s invo luc rado s e n la sínte sis y c aptac ió n de l side ró fo ro
vic ibac tina y e n la c aptac ió n de he mo se e xpre san e n fo rma c o nstitutiva , inc luso e n
c o ndic io ne s de sufic ie nc ia de hie rro . El c o mpo rtamie nto anó malo y ple io tró pic o
pare c e se r de pe ndie nte de la pre se nc ia de l plásmido simbió tic o pRL1JI mo tivo po r e l
que re c o nstruye n la c e pa transfirié ndo le e l plásmido pRL1JI sin la mutac ió n anc e stra l
(We xle r e t al., 2001). Po r o tro lado , aunque e l fe no tipo de re spue sta a hie rro fue
c o mple me ntado c o n una c o pia silve stre de rirA, se de mo stró que la mutac ió n
anc e stra l no a fe c taría a l ge n rirA e ndó ge no . Lo s auto re s pro pusie ro n que A34 adquirió
una mutac ió n e n a lgún re gulado r aún de sc o no c ido que a fe c ta vario s c arac te re s
re lac io nado s c o n la c aptac ió n de hie rro (To dd e t al., 2002; Jo hnsto n, c o munic ac ió n
pe rso nal).
Se ha e stab le c ido e n Rhizo bium que RirA pre se nta , e n a lguno s de lo s ge ne s que
re gula , una se c ue nc ia c o nse nso río arriba de l inic io de transc ripc ió n, e sta se c ue nc ia e s
c o no c ida c o mo mo tivo IRO (iro n-re spo nsive o pe rato rs). Mutac io ne s e n lo s mo tivo s IRO
anulan la re pre sió n me diada po r RirA, pe ro hay dife re nc ias e n e l c o mpo rtamie nto de
lo s pro mo to re s e studiado s que induc e a pe nsar e n la e xiste nc ia de a lg ún o tro fac to r
re gulato rio que influe nc ie la c apac idad de RirA de re gular la e xpre sió n de unidade s
transc ripc io nale s e spe c ífic as (Ye o man e t al., 2004). En c ambio , e n Sino rhizo bium, e l
aná lisis in silic o de la e xpre sió n gé nic a de pe ndie nte de RirA no le s pe rmite a lo s auto re s
e stable c e r una se c ue nc ia c o nse nso de re c o no c imie nto po r RirA (Chao e t al., 2005).
Re c ie nte me nte se ha de sc ripto que una mutante e n un ho mó lo go a RirA de A.
tume fac ie ns pre se nta de fic ienc ias e n la tumo rige ne sis, lo c ual que po dría de be rse a la
mayo r se nsibilidad a o xidante s y a la disminuc ió n de la induc c ió n de lo s ge ne s de
virule nc ia virB y virE (Ng o k-ngam e t al., 2009). Sin e mbargo , e l re guló n de RirA e n
Agro bac te rium no ha sido de te rminado fe hac ie nte me nte a la fe c ha .
CAPÍTULO III- Introducción
3.1.6
hie rro
prime
de in
re pre
unido
e l m
pre se
dispa
re c o
al., 2
lo c a
2006
mo st
se c u
alma
bio sín
re sist
2006
Figu
e n
Regulaci
En la fam
o pe rte ne c
e ra ve z e n
nsufic ie nc ia
e so r transc r
o a l ADN re
e dio , se vu
e nta do s si
ara la de gra
Se ha
no c imie nto
2006). Habrí
lizac ió n de l
). IrrA ha s
trado te ne
e nc ias ICE
ac e namie nt
nte sis de he
te nc ia a e s
).
ura 3.2.2: Es
Rhizo biale s.
ión mediad
milia Rhizo bi
c ie nte a la
B. japo nic u
de hie rro (
ripc io nal qu
gulando la
ue lve ine sta
itio s de dif
adac ió n de
e stable c id
o de IrrA c o
a re gulac ió
mo tivo ICE
ido tambié
e r un ro l p
. El re g uló n
to de hie rro
e mo , b io gé
tré s o xidati
que ma de
. Imag e n to
da por IrrA
iac e ae se h
familia de
um c o mo u
Hamza e t a
ue e n c o n
transc ripc ió
able y se d
e re nte a fin
e IrrA (Qi e t a
do e n B.
no c ida c o m
ó n po sitiva o
E e n la re g ió
é n de sc ripto
primario c o
n de IrrA in
o , me tabo l
é ne sis de g r
vo (Sing le to
la re g ulac ió
o mada de R
ha de sc ripto
Fur, de no
n re pre so r d
al. 1998). En
ndic io ne s d
ó n g e né tic a
de grada (Fi
nidad de in
al., 1999, Ya
. japo nic u
mo mo tivo
o ne gativa
ó n pro mo to
o e n R. le g
o mo re pre
nc luye ge n
ismo e ne rg
rupo s Fe -S,
o n e t al., 20
ó n de la tra
Ro dio no v e t
o o tro re gul
minado IrrA
de la sínte s
B. japo nic u
e insufic ien
a , pe ro c ua
igura 3.1.2)
nte rac c ió n
ang e t al., 2
um una
ICE (iro n c o
me diada p
ra de lo s g e
gumino sarum
e so r transc r
ne s invo luc
g é tic o , c ic lo
ge ne s de
010; Rudo lp
ansc ripc ió n
t al., 2007.
ado r g lo ba
A. IrrA fue
is de he mo
um IrrA e s u
nc ia de hie
ando hay he
. Se ha mo
c o n he mo
005, 2006).
se c ue nc ia
o ntro l e le me
po r IrrA de p
e ne s re gula
m (To dd e t
ripc io na l d
rado s e n l
o de ác ido
c aptac ió n
ph e t al., 20
ge né tic a m
CAPÍTULO
al de re spue
ide ntific ado
o e n c o ndic
n ac tivado
e rro pe rma
e mo pre se n
o strado que
o y he mina
c o nse nso
e nt) (Rudo l
pe ndie ndo
do s (Yang e
t al., 2006)
de pe ndie nte
a c aptac
o s tric arbo x
de side ró fo
006; Yang e
me diada po
O III- Introduc
66
e sta a
o po r
c io ne s
r y un
ane c e
nte e n
e IrrA
a que
o de
ph e t
de la
e t al.,
y ha
e de
c ió n y
xílic o s,
o ro s y
e t al.,
o r IrrA
cción
IrrA.
trans
inc lu
e n p
c o nc
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e ntre
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pe rm
e vide
que
Capi
me n
y c o d
Po r o
AhuU
c o ns
ge ne
e l c it
Figur
de h
2006
Tambié n
Lo s g ene s
sc ripc ió n y
sive de l mis
para le lo se
c e ntrac ió n
lac ió n dua l
Ro dió no
e o tro s re g u
e rminan in-si
e ro de α-pr
mite pre de c
e nc ia e xpe
lo s ge ne s
itulo II, Fig u
c io nó e n e l
dific aría un
o tro lado río
U y AhuV
stituye n e l si
e s po drían e
to plasma (C
ra 3.2.3: Re d
ie rro pro pu
.
n ha sido de
e n e sto s c
e stán invo
smo re gulad
e nsando y
de hie rro
me diada p
v e t al. re a l
ulado re s g l
ilic o las se c
ro te o bac te
c ir lo s ge ne s
rime nta l c o
Atu3385, A
ura 2.2.2) se
Capítulo II,
re c e pto r d
o arriba de h
c uyas PBP
ste ma de t
e star invo luc
Capitulo II, F
d c o mbinad
e sta para r
e mo strada
c aso s pre se
o luc rado s e
do r RirA, mo
y re spo ndie
(To dd e t a
po r lo s re g u
izaro n un a
o bale s (Ro
ue nc ias IRO
e rias y las c
s que se rían
o nfirmó sus r
Atu3388 y A
e rían re g ula
, Se c c ió n 2.
de he mo a l
hlaR se ubic
so n Atu33
ranspo rte 2
c rado s e n l
Figura 2.2.2,
da de re gul
rizo bio s. Figu
la re gulac i
e ntan mo tiv
e n pro c e so
o tivo po r e l
e ndo a la
al., 2006).
lado re s RirA
nálisis b io inf
dio no v e t a
O e ICE para
c o mparan c
n re g ulado s
re sultado s. E
Atu3389 (pr
ado s po r R
.2.6, e l ge n
que de no m
c arían lo s g e
390 y Atu33
2 que ide nti
a c aptac ió
tab la 2.2.1
ac ió n, me d
ura adapta
ó n g e né tic
vo s IRO e I
o s c o mo la
que se po
as c o nse c u
En la figura
A e IrrA e n R
fo rmátic o d
al., 2006). E
a to das las
c o n lo s ge n
s po r RirA e
En A. tume f
re se nte s e n
RirA (Ro dio n
Atu3385 se
minamo s Hl
e ne s Atu338
391, de no m
fic amo s e n
ó n de hie rro
).
diada po r R
ada de Ge l
a dual me d
CE río arrib
a sínte sis de
stula que Ir
ue nc ias fisi
a 3.1.3 se
R. le g umino s
de lo s re g ulo
En e ste aná
bac te rias p
no mas pub
e IrrA y e n a
fac ie ns lo s a
n e l c ó smid
no v e t al.,
e nc ue ntra
aR (Capitul
88 y Atu338
minadas Ah
pIJ7760 (Fi
de sde e l p
irA e IrrA, de
fand, Sing a
CAPÍTULO
diada po r R
ba de l inic i
e c lúste r F
rrA y RirA ac
o ló g ic as d
e sque mati
sarum.
o ne s de RirA
álisis, lo s au
pe rte ne c ie n
blic ado s. Est
a lg uno s c as
auto re s pre d
do pIJ7760)
2006). Co m
río arriba d
lo II, Tabla 2
89, de no min
huT y AhuS
gura 2.2.3).
pe riplasma h
e la ho me o
apo re , 17-18
O III- Introdu
67
RirA e
io de
e -s e
c túan
de la
za la
A, IrrA
uto re s
nte s a l
to le s
so s la
dic e n
(Ve r
mo se
de hla
2.2.1).
nado s
S que
Esto s
hac ia
o stásis
8 July
cción
68
3.1.7 Otros reguladores de la expresión genética relacionados con hierro
De ntro de l c luste r aso c iado a hla aspDE de R. le gumino sarum se ide ntific ó río
arriba de HlaR (po sib le re c e pto r de he mo ) un lo c us que c o dific aría para un siste ma
ECF σ/ anti-ECF σ de no minado s HlaSI (Capitulo II, Se c c ió n 2.2.6, Figura 2.2.2, Tab la 2.2.1).
Muc ho s siste mas de c aptac ió n de hie rro y he mo se e nc ue ntran re g ulado s po r fac to re s
σ de de privac ió n de hie rro . Esto s siste mas han sido muy e studiado s e n Esc he ric hia c o li,
Se rratia marc e sc e ns y Pse udo mo nas ae rug ino sa y e stán fo rmado s po r un fac to r anti-
sig ma (ECF anti-σ,) de me mbrana inte rna que pre se nta un do minio pe riplasmátic o de
inte rac c ió n c o n e l re c e pto r invo luc rado e n la c aptac ió n de la fue nte de hie rro y un
do minio c ito plasmátic o que re c luta a l fac to r sigma (ECF σ) (Biville e t al., 2004; Be are e t
al., 2003; Missiakas y Raina , 1998). Cuando e l re c e pto r inte rac c io na c o n su sustrato
e spe c ífic o , induc e un c ambio c o nfo rmac io na l e n e l do minio pe riplasmátic o de l ECF
anti-σ de me mbrana inte rna ; e ste c ambio c o nfo rmac io nal e s transduc ido a l
c ito plasma pe rdie ndo la inte rac c ió n c o n e l ECF σ c ito plasmátic o que se aso c ia
e nto nc e s c o n la RNA po lime rasa y dirige la transc ripc ió n de l o pe ró n de c aptac ió n de
hie rro que c o ntiene e spe c ífic ame nte a e se re c e pto r (Buc hanan, 2005). Lo s fac to re s
ECF σ y ECF anti-σ e stán c o dific ado s e n un mismo o pe ró n y se e nc ue ntra río arriba de l
o pe ró n que re gula (Biville e t al., 2004). Este me c anismo ase g ura la e xpre sió n de
de te rminado s siste mas de c aptac ió n de c o mpue sto s que c o ntie nen hie rro so lo e n
pre se nc ia de l sustrato e spe c ífic o . En E. c o li la transc ripc ió n de lo s fac to re s ECF anti σ y
ECF σ de de privac ió n de hie rro , Fe c RI, e s re gulada po r e l re g ulado r g lo bal de
re spue sta a hie rro Fur. Esto s fac to re s se han e nc o ntrado aso c iado s a re c e pto re s de
c itrato fé rric o (Buc hanan, 2005) y de he mo / he mina e n bac te rias c o mo E. c o li,
Pse udo mo nas ae rug ino sas y Se rratia marc e sc e ns (Me ttric k e t al., 2009; Biville e t al.,
2004; Oc hsne r e t al., 1996).
Nume ro so s trabajo s de sc ribe n la influe nc ia de re g ulado re s de quó rum se nsing
de la familia de LuxR/ LuxS e n la e xpre sió n de ge ne s re lac io nado s c o n la c aptac ió n de
hie rro , he mo y he mina , c o mo po r e je mplo e n Po rphyro mo nas g ing ivalis (Jame s e t al.,
2006; Wu e t al., 2009) y o tras e spe c ie s bac te rianas c o mo S. me lilo ti y P. ae rug ino sa
(Ho ang e t al., 2004; Og le sby e t al., 2008). Po r o tro lado se han re po rtado muy dive rsas
c o ndic io ne s ambie nta le s, ade más de la de privac ió n de hie rro , que mo straro n
influe nc iar la e xpre sió n de ge ne s re lac io nado s c o n la c aptac ió n de hie rro , e ntre e llas
se inc luye n la c o nc e ntrac ió n de o xíge no (Wyc ko ff e t al., 2009; Enc he va e t al., 2009), la
te mpe ratura (Battisti e t al., 2006) y d isminuc ió n de pH (He llwe g e t al., 2009).
CAPÍTULO III- Introducción
69
3.1.8 Objetivos específicos,
En base a los antecedentes descriptos en las secciones anteriores y a las
observaciones descriptas en el capítulo II, se plantearon los siguientes objetivos:
• Infe rir más a justadame nte la po sib le func ió n de Hla AspDE po r análisis in silic o
de l c luste r que lo c o ntie ne .
• Estab le c e r las c o ndic io ne s de e xpre sió n de hla aspDE e n e l c o nte xto
he te ró lo go de R. le g umino sarum.
• Estudiar la de pe nde nc ia de la se c re c ió n de Hla e n R. le gumino sarum c o n lo s
re g ulado re s RirA e IrrA
70
CAPITULO III: CONTEXTO GENETICO Y REGULACIÓN DE HLA-AspDE EN EL HOSPEDADOR
HETERÓLOGO DE R. LEGUMINOSARUM.
3.2 RESULTADOS
3.2.1 Comparación de la organización genética del cluster asociado a hla aspDE
con otros clusters de genes involucrados en la captación de hemo.
Se de c idió lle var a c abo un análisis in silic o de ta llado de l c luste r que ro de a a
hla aspDE c o n e l fin de de te rminar más a justadame nte la similitud y sinte nía c o n o tro s
g rupo s de ge ne s que e sté n invo luc rado s e n la c aptac ió n de hie rro o de c o mpue sto s
que fo rman c o mple jo s c o n hie rro . En e ste se ntido , se o bse rvó una distribuc ió n similar de
lo s ge ne s aso c iado s a hla aspDE (Capitulo II, Se c c ió n 1.2.6) a la de siste mas de
c aptac ió n de he mo a travé s de he mó fo ro s de Se rratia marc e sc e ns, Erwinia c aro to va ,
Ye rsinia pe stis, Y. e nte ro c o litic a , P. ae rug ino sa y P. fluo re c e ns (Figura 3.2.1). El
paradig ma de c luste rs de g e ne s invo luc rado s e n la c aptac ió n de he mo de e sta
familia he mó fo ro s fue de sc ripto e n Se rratia marc e sc e ns. En e sta bac te ria e l he mó fo ro
HasA e s se c re tado po r e l siste ma tipo I HasDE. Po r o tro lado , e l re c e pto r HasR de S.
marc e sc e ns, lue go de unirse a HasA unido a su sustrato (he mo ) transduc e una se ñal a
lo s fac to re s ECF σ y ECF anti σ (HasI y HasS, re spe c tivame nte ) que a fe c ta la e xpre sió n
de lo s ge ne s b lanc o inc luido HasR (Biville e t al., 2004). De aho ra e n más se de no mina
c luste r hla al g rupo de ge ne s aso c iado a hla aspDE. Lo s ge ne s hlaS y hlaI (c o dific ante s
de ECF σ y ECF anti σ, re spe c tivame nte ), hlaR y aspDE c o nse rvan la sinte nía c o n
o pe ro ne s invo luc rado s e n la c aptac ió n de lo s he mó fo ro s de la familia HasA y, e n to do s
lo s c aso s, la pro te ína Hla e s sinté nic a a l he mó fo ro HasA. Llamativame nte , Hla y HasA
no pre se ntan similitud de se c ue nc ia amino ac ídic a . La dife re nc ia e ntre a lguno s de
e sto s g rupo s de ge ne s y e l de Ag ro bac te rium e s que lo s o pe ro ne s de Y. pe stis, Y.
e nte ro c o litic a y S. marc e sc e ns inc luye n ade más una pro te ína de la familia To nB (HasB)
re spo nsable de e ne rg izar e l pro c e so de transpo rte a travé s de la me mbrana e xte rna
bac te riana . Po r o tro lado , e n P. fluo re c e ns, P. ae rug ino sa y E. c aro to va tambié n e stá
pre se nte e l ge n que c o dific a un c o mpo ne nte de me mbrana e xte rna ho mó lo go a To lC
que c o mple taría e l siste ma de se c re c ió n tipo I (Fig ura 3.2.1).
Po r aná lisis in silic o se o bse rvó que Ag ro bac te rium a lbe rgaría e n o tra re g ió n de l
ge no ma (de ntro de l c ro mo so ma line a l) un o rf que c o dific aría una pro te ína To nB
(Atu0163) que e staría de ntro de un o pe ró n que inc luye o tro s do s o rf que c o dific arían
las pro te ínas ac c e so rias ExbB (Atu0161) y ExbD (Atu0162). Es po sib le que e n A.
tume fac ie ns, e l c o mpo ne nte To lC de me mbrana e xte rna (y re c lutado po r AspDE), e sté
c o dific ado po r Atu2552 (pre se nte e n o tra re g ió n de l ge no ma), ya que e s e l únic o
siste m
4.3.1
siste m
pro p
e xtra
3.2.2
ho m
Figur
tume
e n S.
pe stis
(http
e l c lu
ho mó lo g
ma c o mple
).
Las se m
mas de c a
po ne que e
ac e lular.
Identifica
Po r Blast
ó lo g o y sint
ra 3.2.1: Co
e fac ie ns (A.
. marc e sc e
s (Y.p) e
p:/ / www.pa
uste r Hla de
g o a To lC
e to de c ap
e janzas de
ptac ió n de
e l c luste r h
ación de un
t se identific
té nic o a l c lu
o mparac ió n
. t.) c o n c l
ns (S.m), P.
Y. e nte ro
ste ur.fr/ re c h
e A. tume fac
ide ntific ado
tac ió n de
e la o rg ani
e he mo me
hla po dría
n cluster de
c ó e n e l pa
uste r hla. El
n de la o rg
luste rs invo l
ae rug ino sa
o c o litic a (
he rc he / RAR
c ie ns.
o e n C58.
hie rro o he
izac ió n g e
e diado s po
e star invo
genes sinté
arie nte c e rc
c lúste r de S
g anizac ió n
uc rado s e n
a (P.a), P. fl
(Y.e ). Figur
R/ RAR2004/
Esto s c o mp
e mo (Ve r C
né tic a hlaI
o r he mó fo ro
o luc rado e n
énico a hla
c ano S. me
S. me lilo ti c o
g e né tic a d
n la c aptac
fluo re sc e ns
ra adapta
Mbbac t-e n
po ne nte s c
Capitulo IV,
S hlaR hla
o s apo yan
n la c apta
en Sinorhizo
lilo ti (c e pa
o ntie ne un o
de l c o nte xt
c ió n de lo s
(P.f), E. c ar
ada de l I
n.html)a la q
CAPÍTU
c o mple taría
Disc usió n,
aspDE c o
la hipó te sis
ac ió n de h
obium melil
1021) un c
o pe ró n fo rm
to de Hla d
he mó fo ro s
ro to vo ra (E.
nstituto Pa
que se le ag
ULO III- Resul
71
an un
Fig ua
o n lo s
s que
he mo
loti
c lúste r
mado
de A.
HasA
.c ), Y.
aste ur
g re go
ltados
72
lo s ge ne s SMc 04203-SMc 04204 que c o dific an un putativo ECF σ y putativo ECF anti-σ
que pre se ntan 39% y 44% de ide ntidad de se c ue nc ia amino ac ídic a re spe c tivame nte
c o n HlaI y HlaS de A. tume fac ie ns. Río aba jo de e sto s o rf se e nc ue ntra un putativo
re c e pto r de he mo , SMc 04205 que pre se nta 38% de ide ntidad de se c ue nc ia
amino ac ídic a c o n HlaR. Río aba jo de SMc 04205 se e nc ue ntra un o rf que c o dific a una
pro te ína hipo té tic a SMc 04206, pro pue sta c o mo he mo lisina e n la ano tac ió n ge nó mic a
de S. me lilo ti. La pro te ína pre dic ha po r e ste o rf e s 26% idé ntic a a nive l de se c ue nc ia
amino ac ídic a c o n Hla . Smc 04206 e s la únic a pro te ína de la base de dato s (pro g rama
BLAST) que pre se nta similitud de se c ue nc ia pro te ic a signific ativa c o mparada c o n Hla .
Río aba jo de Smc 0406 se e nc ue ntra un putativo siste ma de se c re c ió n tipo I (ABC-MFP)
c o dific ado po r lo s ge ne s SMc 04207-SMc 04208 que pre se ntan 67% y 64% de ide ntidad
de se c ue nc ia amino ac ídic a c o n aspD y aspE, re spe c tivame nte (Fig ura 3.2.2 a y b ).
3.2.3 Presencia de motivos de reconocimiento a IrrA y RirA en el cluster hla
Para de te rminar una po sib le re lac ió n e ntre la e xpre sió n de hla aspDE y po sib le s
me c anismo s de re g ulac ió n de la ho me o stasis de l hie rro / he mo , se analizó la pre se nc ia
e n e l c luste r hla de mo tivo s de re c o no c imie nto de lo s re gulado re s de re spue sta a
hie rro RirA e IrrA de sc riptas e n R. le gumino sarum (Ro dio no v e t al., 2006).
Utilizando e l pro g rama BLASTp se ide ntific aro n do s se c ue nc ias que po drían se r
re c o no c idas po r e l re g ulado r g lo bal de re spue sta a hie rro RirA de R. le g umino sarum, 55
pare s de base s río arriba de l inic io de transc ripc ió n de l putativo re c e pto r de he mo
Atu3385 (HlaR). Tambié n se ide ntific aro n se c ue nc ias de re c o no c imiento de RirA 132
pare s de base s río arriba de hlaIS (siste ma ECF σ / ECF anti σ, HlaS, Atu3386 y HlaI,
Atu3387) (Fig ura 3.2.2 a ) (Ve r tambié n Capítulo I, Se c c ió n 2.2.6). Se ide ntific ó ade más,
un po sib le mo tivo de re c o no c imiento de RirA, 63 pare s de base s ante s de l inic io de
transc ripc ió n de lo s ge ne s Atu3388 (AhuU) y Atu3389 (AhuV) (que c o dific an un putativo
siste ma ABC de c aptac ió n de hie rro que se ide ntific ó c o mo siste ma de transpo rte 2),
c uyas PBPs e starían c o dific adas po r Atu3390 (AhuT) y Atu3391 (AhuB) (Capítulo I,
Se c c ió n 2.2.2). Curio same nte , e sta re g ió n intragé nic a tambié n pre se ntó un mo tivo de
re c o no c imie nto de l re gulado r IrrA ubic ado 89 pare s de base s ante s de l inic io de
Atu3391. Estas e vide nc ias sug ie re n que e ste siste ma de impo rtac ió n po dría e star suje to
a una re gulac ió n dual me diada po r lo s re g ulado re s RirA e IrrA (Figura 3.2.2 a ).
CAPÍTULO III- Resultados
Figura 3.2.2: Análisis del contexto genético del sistema aspDE y presencia de motivos regulatorios rirA e irrA. a- Esque ma de
ge ne s c o dific ado s e n pIJ7760, lo s ge ne s Atu3388 y Atu3389, de no minado s AhuU y AhuV c uyas PBP so n Atu 3390 y Atu3391,
de no minado s AhuT y AhuS c itado s e n la se c c io n 3 1 6 fo rman e l siste ma de transpo rte 2 se ñalado e n la figura 2 2 3 de l Capitulo
CA
PÍTU
de no minado s AhuT y AhuS, c itado s e n la se c c io n 3.1.6, fo rman e l siste ma de transpo rte 2 se ñalado e n la figura 2.2.3 de l Capitulo
II. Se de ta lla la ide ntidad de se c ue nc ia c o n pro te ínas ya c arac te rizadas y la pre se nc ia de mo tivo s de re c o no c imie nto de lo s
re g ulado re s RirA e IrrA. b - Esque ma de l lo c us ho mó lo go y sinté nic o c o dific ado e n e l g e no ma de S. me lilo ti c e pa 1021. Se
de ta lla e l po rc e ntaje de ide ntidad que pre se nta c ada ge n c o n las ge ne s pre se nte s e n pIJ7760 Esque ma re a lizado usando El
ULO
III- Resu
lt
73
de ta lla e l po rc e ntaje de ide ntidad que pre se nta c ada ge n c o n las ge ne s pre se nte s e n pIJ7760. Esque ma re a lizado usando El
VECTOR NTI.
tad
os
74
La búsque da de se c ue nc ias de re c o no c imie nto de l re gulado r RirA e n e l c luste r
sinté nic o de S. me lilo ti mo stró do s mo tivo s de re c o no c imie nto a l re g ulado r RirA
ubic ado s e n fo rma similar a la de l c luste r hla de Agro bac te rium. Un mo tivo RirA se
ubic a 34 pb rio arriba de l pro bab le re c e pto r de he mo SMc 04205 y e l o tro mo tivo se
ubic a 170 pb rio arriba de l pro bable ECF σ, SMc 04203 (Figura 3.2.2 b ).
3.2.4 Análisis bioinformático de HlaR
Se ha de no minado HlaR (“R” po r re c e pto r) a la pro te ína c o dific ada po r e l ge n
que se e nc ue ntra río arriba de hla (Capítulo I, Se c c ió n 2.2.6). HlaR pre se nta e n su
se c ue nc ia amino ac ídic a un 27% de ide ntidad y 41% de similitud c o n HasR de S.
marc e sc e ns. HlaR e s pro pue sta c o mo re c e pto r de he mo e n la ano tac ió n g e nó mic a ;
sin e mbargo , e l mo tivo RYDXY que pre c e de a l mo tivo FRAP/ NPNL pre sente e n dive rso s
re c e pto re s de he mo , difie re e n un amino ác ido de l c o nse nso y e l mo tivo de re c e pto re s
de he mo FRAP/ NPNL no se e nc ue ntra c o nse rvado e n su to ta lidad. Esto s mo tivo s
(FRAP/ NPNL y RYDXY) e stán implic ado s e n la unió n a he mo e n lo s re c e pto re s de
he mó fo ro s e studiado s (Brac ke n e t al., 1999), sin e mbargo se han de sc ripto re c e pto re s
de he mo que no pre se ntan e sto s mo tivo s, c o mo e l re c e pto r ShmR de S. me lilo ti
(Battisto ni e t al., 2002). HlaR pre se nta 41% de similitud c o n HasR de S. marc e sc e ns
(re c e pto r de l he mó fo ro HasA). La búsque da de o tro s mo tivo s c o nse rvado s usando e l
pro grama Mo tif Sc an mo stró que HlaR pre se nta una se c ue nc ia se ñal para su
translo c ac ió n a l pe riplasma a travé s de l siste ma de se c re c ió n TAT e ntre lo s re siduo s 1-
45; pre se nta , ade más, una e xte nsió n e n e l e xtre mo N-te r que po dría e star invo luc rada
e n la inte rac c ió n c o n siste mas ECF σ y ECF anti σ de siste mas de c aptac ió n de he mo
(Lé to ffé e t al., 2005; Braun y Endriss, 2007). Adic io nalme nte , HlaR pre se nta tre s do minio s
de inte rac c ió n c o n To nB (Braun, 1995), c arac te rístic a que se o bse rva e n HasR de S.
marc e sc e ns (Le fé vre e t al., 2008).
Se re a lizó un a line amie nto de HlaR c o n pro te ínas tipo HasR de sc riptas e n dive rso s
pató ge no s y se c o nstruyó un filo g rama utilizando e l pro g rama Clusta lW. En e l filo g rama
se mue stra la re lac ió n filo ge né tic a e ntre HlaR (Atu3385) y lo s re c e pto re s HasR que
pre se ntan una e xte nsió n N-te r re g ulato ria e n S. marc e sc e ns, Pse udo mo nas y Ye rsinia
(Figura 3.2.3, Tab la 3.2.1). Esto sug ie re que HlaR po dría se r un re c e pto r de he mo .
CAPÍTULO III- Resultados
75
Pro te ína Espe c ie Bac te riana Mo lé c ula Transpo rtada Cita
HasR S. marc e sc e ns He mó fo ro HasA Lé to ffé e t. al., 1994
HasR E. c aro to va He mó fo ro HasA Be ll e t. al., 2004
HasR Y. pe stis He mó fo ro HasA Ro ssi e t. al., 2001
HasR Y. e nte ro c o litic a He mó fo ro HasA Tho mso n e t. al., 2006
HasR P. ae rug ino sa He mó fo ro HasA Oc hsne r e t. al., 2000
HasR P. fluo re sc e ns He mó fo ro HasA Ide i e t. al., 1999
HmuR B. japo nic um He mo Nie nabe r e t. al., 2001
He mR Y. e nte ro c o litic a He mo Tho mso n e t. al., 2006
ShuA S. dyse nte riae He mo Burkhard y Wilks, 2007
HutA V. c ho le rae He mo He nde rso n y Payne , 1994
HmbR N. me ning itidis He mo Le wis e t. al., 1999
Hg bA H. influe nzae He mo Co pe e t. al., 2000
HmuR P. g ing ivalis He mo Simpso n e t. al., 2000
HlaR A. tume fac ie ns
CAPÍTULO III- Resultados
Tabla 3.2.1: Proteínas utilizadas en la construcción del filograma. Se de talla la e spe c ie a
la que pe rte ne c e c ada pro te ína , la mo le c ula transpo rtada po r c ada re c e pto r y la c ita
b ib lio gráfic a .
Figura 3.2.3: Filograma de receptores de hemo. Se utilizó la base de dato s de Swiss-pro t
para o bte ne r las se c ue nc ias de lo s re c e pto re s de he mo y de he mófo ro s ya
c arac te rizado s e n o tras e spe c ie s bac te rianas.
3.2.5
secre
la c o
re spo
la pr
influe
c ó sm
c are
hie rro
o b je t
re g io
pro te
c uan
la sín
simb
e n p
po sib
Figu
lo s p
o bse
pro t
Análisis de
eción de Hl
El e fe c to
o nc e ntrac ió
o nde n a e st
re se nc ia de
e nc ia de pR
mido pIJ776
c e de pRL
o (de Luc a
tivo de e st
o ne s reg ula
e ínas se c re
ndo fue ro n
nte sis y se c re
ió tic o de R.
RL1JI de Rh
ble me nte d
ura 3.2.4: Se
patro ne s de
e rva la pre
te ínas e xtra
e la influenc
a.
o de de sre g
ó n de hie r
te e stímulo
e l plásmido
RL1JI e n la
60 a la c e p
1JI y se c o
a e t al., 199
udiar la se
ato rias y pr
tadas dife r
c ultivadas
e c ió n e xac e
. le g umino s
hizo bium qu
e ge ne s lo s
ecreción de
e pro te ínas
e se nc ia de
c e lulare s d
cia del plásm
g ulac ió n de
ro e xtrac e l
de sc ripto e
o simbió tic o
se c re c ió n d
pa de R. le g
o mpo rta no
98; We xle r e
c re c ió n de
ro mo to ras
re nc ia lme nt
e n me dio r
e rbada de
sarum y sug
ue a fe c ta la
e ndó g e no
e proteínas
e xtrac e lula
las flag e lin
e ambas c e
Flagelinas de
Rhizobium
mido simbió
e la e xpre sió
lular c o mo
e n la c e pa A
o pRL1JI (de
de Hla , se t
g umino saru
rmalme nte
e t al., 2001)
e Hla e n su
pre se nte s
te e ntre A3
ric o TY (Figu
Hla se ve a
g ie re la pre s
a transc ripc i
o s que se e n
en medio r
are s e ntre A
nas pe rte ne
e pas. A31pI
A
pIJ
ótico pRL1JI
ó n de a lg un
así de g e
A34 de R. le
e Luc a e t
ransfirió po
um A31 que
e n la re sp
). Se e lig ió
e nto rno g
e n e l c lust
31 y A31 tr
ura 3.2.4). E
a fe c tada po
se nc ia de a
ió n de g e ne
nc ue ntran d
rico TY. No
A31 transc o
ec ie nte s a
IJ7760: A31
TY
A31
7760 A31
I de R. legum
no s g e ne s q
ene s que n
e g umino sar
al., 1998).
r c o njugac
e e s iso g é n
pue sta a la
e l c ó smido
e né tic o ho
te r hla . No
ransc o njuga
Este re sultad
o r la mutac
a lg ún re gul
e s c o dific a
de sre gulado
se o bse rva
o njug ante p
Rhizo bium
transc o njug
97
66
45
30
CAPÍTU
minosarum
que re spo nd
no rmalme nt
um de pe nd
Para e stud
ió n tripare n
nic a a A34
insufic ie nc
o pIJ7760 c
o mó lo go c o
o se de te c
ante de pIJ
do c o nfirma
ió n de l plás
ado r c o difi
do s e n pIJ7
o s e n A34.
n dife re nc ia
pIJ7760 y A3
e n e l pe r
gante pIJ77
ULO III- Resul
76
en la
de n a
te no
de de
iar la
nta l e l
pe ro
ia de
c o n e l
o n las
c taro n
J7760
a que
smido
c ado
7760 y
as e n
31. Se
fil de
760.
ltados
de H
utiliza
me d
pre se
mayo
c o nf
pro te
AhuU
(Figu
c uan
Figu
2,2D
c e p
se c
e sp
pro t
pe rt
pro t
pIJ7
A c o ntin
Hla re spo nd
ando un qu
io TY e n pre
e nc ia de l
o ritaria de
irmada c o
e ína pe ripla
UV (Atu3388
ura 3.2.5, A
ndo e s c ultiv
Ausenc
Hla (
ura 3.2.5: P
Dipiridilo (in
pa A31 tra
re tadas di
e c tro me tria
te ínas flag
te ne c ie nte s
te inas Atu3
7760.
uac ió n, se e
de a la c o n
ue lante de
e se nc ia o a
que lante d
la pro te ín
mo la pro t
asmátic a A
8 y Atu3389)
Ane xo 3.2.1)
vada e n me
ia de flagel
AhuB
(Atu3384)
Proteínas se
suficiencia
nsc o njugan
ife re nc ia lme
a de masa
e lare s e n
s a Rhizo bi
3391 y Hla
e studió si, a
c e ntrac ió n
hie rro . Se a
ause nc ia de
de hie rro ,
na de apro
te ína Hla (
tu3391 (Ah
), y po r o tro
). El patró n
e dio TY (c o n
linas
TY+
A31pI
ecretadas
de hierro).
nte de pIJ
e nte e n la
y mo straro
e l pe rfil e
ium e stan
c o dific ada
a dife re nc ia
de hie rro e
analizaro n la
e 2,2 d ipiridi
la c e pa A
o ximadame
Ane xo 3.2.
uB) pe rte ne
o lado se ve
n de A31 p
ndic io ne s d
+2,2 dipiridil
J7760 A31
por A31 e
Se o bse rva
7760 ause n
a c e pa A
n se r Atu33
e xtrac e lular
ause nte s e
as e n pIJ77
a de lo que
e n la c e pa
as pro te ína
lo . En la figu
A31 pIJ7760
e nte 33 kD
1)). El pe rf
e c ie nte a l s
e n muy dism
pIJ7760 fue
de sufic ie nc
o
97 66 45 30
en presenci
a la se c re c ió
nte s e n la
A31pIJ7760
391 y Hla . S
r de la c e
e n la c e pa
760. A31pIJ7
o c urre e n A
a A31po rtad
s se c re tada
ura 3.2.5 se
0 pre se nta
Da que po
il e xtrac e lu
siste ma de
minuidas pro
similar a l
c ia de hie rro
Flagelinde
Rhizobi
7
6
5
0
ia del que
ó n de varia
c e pa A31
fue ro n id
Se o bse rva
e pa A31.
a A31 c uan
7760: A31
CAPÍTU
A34, la se c re
do ra de l pIJ
as e n c ultiv
o bse rva qu
una se c re
o r Maldi-To
ular inc luye
c aptac ió n
o te ínas flage
de A34 pIJ
o ).
nas
um
elante de h
s pro te ínas
1. Las pro t
e ntific adas
la pre se nc i
Estas flage
ndo e xpre s
transc o njug
ULO III- Resul
77
e c ió n
J7760
o s e n
ue e n
e c ió n
o f fue
a la
n ABC
e lare s
J7760
hierro
e n la
te ínas
s po r
ia de
e linas
sa las
gante
ltados
78
Estas o bse rvac io ne s indic an que : i) la de sre g ulac ió n de hla e s de pe ndie nte de l
plásmido pRL1JI que c o ntiene la mutac ió n anc e stra l y ii) la se c re c ió n de Hla y de AhuB
e n e l ho spe dado r he te ró lo go A31 pIJ7760 (que c are c e de l plásmido simbió tic o pRL1JI)
re spo nde a la c o nc e ntrac ió n de hie rro e xtrac e lular. La se c re c ió n de Hla c o mo
pro te ína mayo ritaria e n e l me dio e xtrac e lular, pare c e e star ac o mpañada de la
disminuc ió n de la e xpre sió n de l re guló n flage lar. Esta o bse rvac ió n e s similar a la
re a lizada e n A34 pIJ7760.
3.2.6 Influencia de los reguladores IrrA y RirA en la secreción de Hla en R.
leguminosarum
Co n e l o b je tivo de e studiar si la se c re c ió n de Hla e n e l c o nte xto he te ró lo g o se
ve a fe c tada po r lo s reg ulado re s g lo bale s de re spue sta a hie rro RirA y/ o IrrA, se analizó
e l pe rfil de pro te ínas e xtrac e lulare s de las c e pas mutante s rirA e irrA de rivadas de la
c e pa silve stre iso gé nic a (bo na fide ) J251 po rtado ra de pRL1JI a las que se le s transfirió
e l c ó smido pIJ7760. Estas c e pas fue ro n c e didas ge ntilme nte po r e l Dr. Jo hnsto n (Univ.
de East Ang lia , UK). La c e pa J251 c o rre spo nde a la c e pa A34 de R. le gumino sarum
8401 re c o nstituida c o n e l plásmido simbió tic o pRL1JI que no po rta la mutac ió n
anc e stra l de sc o no c ida (We xle r e t al., 2001). El c ó smido pIJ7760 fue transfe rido a c ada
una de las c e pas po r c o njugac ió n tripare nta l y se analizó e l pe rfil de pro te ínas
e xtrac e lulare s de c ultivo s e n me dio ric o TY.
A dife re nc ia de lo que o c urrió e n la c e pa A34, no se o bse rvó la se c re c ió n
dife re nc ia l de pro te ínas e n e l c o nte xto de J251 e n c o ndic io ne s de c ultivo ric o
(sufic ie nc ia de hie rro ) (Figura 3.2.6 a ). Esto sug ie re que e l pSym pre se nte e n J251 e s
c apaz de mo dular la e xpre sió n de lo s ge ne s de l c ó smido e n e stas c o ndic io ne s. En
c ambio , e n las mutante s iso g é nic as rirA e irrA transc o njugante s de l c ó smido pIJ7760, se
o bse rvó la se c re c ió n de pro te ínas adic io nale s c uando so n c ultivadas e n las mismas
c o ndic io ne s (sufic ie nc ia de hie rro ). La pro te ína de apro ximadame nte 33 KDa pre se nte
e n lo s me dio s e xtrac e lulare s de ambas mutante s fue ide ntific ada po r Maldi-To f y PMF
c o mo Hla tanto e n e l pe rfil de rirA (Figura 3.2.6 b ) c o mo e n e l de irrA (Fig ura 3.2.6 c )
(Ane xo s 3.2.2 y 3.2.3, Grafic o 3.2.1). Este re sultado indic a que la sínte sis o se c re c ió n de
Hla e n R. le gumino sarum J251 e s re gulada ade más po r RirA e IrrA.
La c e pa mutante rirA mime tiza e n fo rma c o nstitutiva la insufic ie nc ia de hie rro
(Sing le to n e t al., 2010). RirA re primiría e nto nc e s la sínte sis o se c re c ió n de Hla e n
c o ndic ió n de sufic ie nc ia de hie rro . En c ambio , IrrA pue de ac tuar c o mo re pre so r o
ac tivado r transc ripc io nal. La ause nc ia de IrrA mime tiza e n fo rma c o nstitutiva la
c o ndic ió n de sufic ie nc ia de hie rro (IrrA se de grada e n pre se nc ia de he mo lo que
c o rre lac io na c o n la sufic ie nc ia de hie rro ). La c o mparac ió n de la se c re c ió n de Hla e n
CAPÍTULO III- Resultados
sufic i
muta
hie rro
e xpre
b
a-
ie nc ia de h
ante irrA pIJ
o e xiste a lg
e sió n de Hla
b-
Hl
hie rro e ntre
J7760 (pre se
gún re gula
a .
97 66 45 30 20
9 6 4 3 2
la
la c e pa sil
e nc ia de H
do r que a
p
7
6
5
0
0
rirA pIJ776
97 66
45 30 20
lve stre J251
Hla ) mue stra
fe c ta , e n
TY
J251 pIJ7760
J25
rirA 60
TY
pIJ7760 (a
a que e n c
c o njunto c
Flaged
Rhizo
Flagd
Rhizo
ause nc ia de
c o ndic ió n d
c o n la ause
elinas de obium
elinas de obium
CAPÍTU
e Hla ) y la
e sufic ienc
e nc ia de Ir
ULO III- Result
79
c e pa
ia de
rrA la
tados
disc r
e xtra
insufi
se c re
po dr
Rhizo
c
Fih
cu
Se
am
de
dife
ide
flag
am
de
dife
ide
flag
am
La se c re
re ta , e s de c
ac e lulare s c
ic ie nc ia de
e c ió n de Hla
ría se r un in
o bium d ife re
-
ura 3.2.6: a
ltivo rico TY
o bse rva la
mbas c e pas
rirA y rirA
e re nc ia l e n
entific ada p
ge linas pe r
mbas c e pas
irrA e irrA
e re nc ia l e n
entific ada p
ge linas pe r
mbas c e pas
e c ió n de H
c ir, Hla no
c o mo se o b
e hie rro ). E
a e n A34 y
duc to r y e s
e nte a l plás
Hla
a- Proteínas
Y. No se o bs
a pre se nc ia
s. J251pIJ77
+pIJ7760 e
n la c e pa
po r e spe c tro
rte ne c ie nte
s. rirAp IJ776
+pIJ7760 e
n la c e pa
po r e spe c tro
rte ne c ie nte
. irrApIJ7760
la e n las m
re sulta se r
bse rvó e n la
Esta dife re n
e n A31 de a
staría c o difi
mido pRL1J
97
66 .
45
30
20
p
s extracelul
se rva se c re c
a de pro te
60: J251 tra
n condicio
rirA transc
o me tria de
e s a Rhizo b
60 : rirA tran
en condicio
irrA transc
o me tría de
e s a Rhizo b
0: irrA transc
mutante s rirA
la pro te ína
as c e pas A3
nc ia po dría
a lg ún o tro r
ic ado e n e
JI.
irrA
pIJ7760 irr
TY
lares de J25
c ió n dife re n
e ínas flage l
nsc o njugan
ones de cul
c o njug ante
masa c o m
bium e n e l
nsc o njug an
ones de cul
c o njug ante
masa c o m
bium e n e l
c o njugante
A e irrA c u
a mayo ritari
34 (e n sufic
a e xplic arse
re gulado r d
e l c ro mo so m
rA
Fla
Rh
51 y J251+p
nc ia l de pro
lare s pe rte
nte pIJ7760.
ltivo rico TY
e pIJ7760 d
mo Hla . Se o
pe rfil de p
nte pIJ7760.
ltivo rico TY
e pIJ7760 d
mo Hla . Se o
pe rfil de p
e pIJ7760.
uando po rta
ia e n e l pe
c ie nc ia de h
e po r la a
de sc o no c ido
ma o e n a lg
agelinas de
hizobium
pIJ7760 en
o te ínas e ntr
ne c ie nte s
. b- Proteína
Y. Se o bse r
de una pr
o bse rva la p
pro te inas e x
c- Proteína
Y. Se o bse r
de una pr
o bse rva la p
pro te ínas e x
CAPÍTU
an a pIJ77
e rfil de pro t
hie rro ) y A3
ac c ió n so b
o . Este re g u
gún plásmid
condicione
re ambas c e
a Rhizo b ium
as extracelu
rva la se c re
ro te ína que
pre se nc ia d
xtrac e lulare
as extracelu
rva la se c re
ro te ína que
pre se nc ia d
xtrac e lulare
LO III- Result
80
60 e s
te ínas
31 (e n
bre la
ulado r
do de
es de
e pas.
m e n
ulares
e c io n
e fue
de las
e s de
ulares
e c ió n
e fue
de las
e s de
tados
81
Lo s re sultado s o bte nido s apo rtan e vide nc ias de que la se c re c ió n de Hla
re spo nde ría dire c ta o indire c tame nte a IrrA de R. le g umino sarum. La re gulac ió n de la
se c re c ió n de Hla e n re spue sta a IrrARL sug ie re n la e xiste nc ia y func io nalidad de un
re gulado r o rtó lo go e n A. te me fac ie ns que se ría c o dific ado po r Atu0153.
La c e pa A34 ha sido pro pue sta c o mo mutante do nde la e xpre sió n de a lguno s
ge ne s de re spue sta a la c o nc e ntrac ió n de hie rro e xtrac e lular, e ntre o tro s, se ve
a fe c tada . Se ha de sc ripto que la re spue sta a hie rro e n Rhizo biac e ae e s me diada po r
lo s re gulado re s RirA e IrrA. Sin e mbarg o , las dife re nc ias o bse rvadas e n n la se c re c ió n
de Hla e ntre las c e pas A34 y las mutante s rirA e IrrA c uando po rtan a l c ó smido pIJ7760,
mue stran que A34 no e s mutante e n e l re gulado r RirA, e n c o nc o rdanc ia c o n lo s
re sultado s o bte nido s po r To dd e t al. (To dd e t al., 2002) y tambié n mue stran que la
c e pa A34 no e s mutante e n e l re gulado r IrrA.
Co n e l fin de e studiar si e xiste mo dulac ió n de la e xpre sió n de Hla e n
re lac ió n a la pre se nc ia de hie rro e xtrac e lular e n e l c o nte xto J251, se analizaro n las
pro te ínas e xtrac e lulare s de e sta c e pa y de las mutante s irrA y rirA (to das po rtando
pIJ7760) e n pre se nc ia de l que lante de hie rro 2,2 dipiridilo . En e stas c o ndic io ne s se
o bse rvó que e n la c e pa silve stre J251 pIJ7760 se induc e la se c re c ió n (mo de rada) de
do s pro te ínas, una de apro ximadame nte 33 kDa y o tra pro te ína de 38 kDa (Figura
3.2.7 a ). La ide ntific ac ió n po r Maldi To f y PMF pe rmitió de te rminar que la pro te ína de 33
KDa e s Hla y la de 38 kDa, e s AhuB, Atu3391 (Ane xo 3.2.4). Este re sultado nue vame nte
apo ya la ide a que Hla y AhuB, c o dific adas e n pIJ7760, so n se c re tadas e n re spue sta a
la baja c o nc e ntrac ió n de hie rro e xtrac e lular e n e l ho spe dado r he te ró lo go . En c ambio ,
e l pe rfil de pro te ínas e xtrac e lulare s o bse rvado e n las c e pas transc o njugante s rirA e irrA
e n pre se nc ia de l que lante de hie rro (fig ura 3.2.7 b ) se ase me ja a l pe rfil e xtrac e lular
o bse rvado e n las transc o njugante s A34 (e n me dio TY) y A31 e n insufic ie nc ia de hie rro
(me dio TY c o n 2,2 dipiridilo ). La ide ntific ac ió n po r Maldi mo stró que e n ambas c e pas
Hla e s se c re tada e n fo rma pro mine nte . Tambie n se de te c to a la pro te ína AhuB de l
siste ma transpo rtado r 2. Esta o bse rvac ió n apo rta e vide nc ias nue vame nte de que
de be e xistir un induc to r de la se c re c ió n de Hla e n A34 y e n A31 que no ac túa e n J251.
Cuando la se c re c ió n de Hla e s mayo ritaria e n lo s c o nte xto s de rirA e irrA, se
o bse rvó nue vame nte la ause nc ia o disminuc ió n drástic a de las pro te ínas flage lare s de
R. le gumino sarum e n la re g ió n de 36 KDa. Sin e mbarg o , e n la c e pa silve stre
transc o njugante J251 c uando e s c ultivada e n insufic ie nc ia de hie rro se o bse rva la
pre se nc ia de flag e linas e n e l me dio e xtrac e lular.
CAPÍTULO III- Resultados
a-
96
4
3
Figura
condi
pro te
ide nti
pre se
e xtrac
Secre
o bse r
La ide
mayo
Cuan
flage l
irrApI6
TY+ 2,2 d
97 66 . 45 . 30
J251
Ausenciaflagelare
Ausenciaflagelare
a 3.2.7: a-
iciones de
ínas e n la
ific adas po
e nc ia de la
c e lulare s d
eción de p
rva e n las c
e ntific ac ió n
o ritaria junto
ndo la se c
linas pe rte
60: irrA trans
dipiridilo
J251 pIJ7760
Hla
Hla
a de proteins de Rhizob
a de proteins de Rhizob
- Proteínas
e insuficienc
c e pa J251
o r e spe c tro
as flage lina
de ambas
proteínas en
c e pas trans
n po r e spe c
o c o n Atu3
re c ió n de
ne c ie nte s
sc o njugante
Hla
AhuB
Flagelinade
Rhizobium
Flagelinasde
Rhizobium
AhuB
a
a
AhuB
nas bium
nas bium
extracelu
cia de hie
c uando p
o me tría de
as pe rte ne c
c e pas. J2
n medio c
sc o njugante
c tro me tría
391 e n am
Hla e s c o
a Rhizo biu
e pIJ7760.
as
m
lares de J
erro. Se o b
po rta a l c ó
e masa c o
c ie nte s a R
251pIJ7760:
on insuficie
e s pIJ7760 l
de masas m
bas c e pas
o mo pro te í
um. rirApIJ
rirA rirpIJ7
TY
J251 y J25
bse rva la
ó smido pIJ7
o mo Hla y
Rhizo bium
J251 tran
encia de h
a se c re c ió n
mo stró que
mutante s c
ína mayo rit
7760: rirA
rA 7760
irrAp
Y+2,2 dipirid
CAPÍTU
51+pIJ7760
se c re c ió n
7760. Las p
Atu3391.
e n e l pe rf
nsc o njugan
hierro (TY+2
n dife re nc ia
e Hla se se c
c uando po
taria no se
transc o njug
irrA pIJ776
dilo
ULO III- Resul
cultivadas
dife re nc ia l
ro te ínas fue
Se o bse rva
il de pro te
te pIJ7760
2,2 dipiridil)
al de pro te
c re ta e n fo
o rtan a pIJ7
e o bse rvan
gante pIJ7
82
97 66 . 45 . 30 20
ltados
s en
l de
e ro n
a la
e ínas
. b-
). Se
ínas.
o rma
7760.
n las
7760;
3.2.7
sug ie
c apt
he m
c o nt
se c u
las p
c o nd
(Figu
(Apé
pre se
que
3.2.8
En lo
se nsi
e nc u
de g
Fig
he
Hla
Efecto de
Las o bse
e re n que la
tac ió n de h
o g lo bina so
e xto he te ró
ultivaro n e n
ro te ínas e xt
dic io ne s mu
ura 3.2.8). El
é ndic e 3.2.
e nc ia de h
e l c luste r hla
Ensayo h
o s último s añ
ng c o mo E
ue ntran la r
ge ne s de c a
gura 3.2.8: Se
moglobina
a c o mo pro
el hemo en
e rvac io ne s
a re g ió n q
he mo e xtra
o bre la se c
ó lo go de R.
me dio ric o
trac e lulare s
ue stra la ind
análisis de
7). Este re
e mo g lo bina
a e staría in
heterólogo d
ño s se ha de
ExpR/ Sin y
e duc c ió n d
aptac ió n d
ecreción de
como únic
te ína mayo
la secreció
de sc riptas
que inc luye
ac e lular (Fig
c re c ió n de
le gumino sa
o TY e n pre se
s se c re tada
duc c ió n de
Maldi To f n
sultado ind
a e n e l me
nvo luc rado
de producc
e sc ripto en
CbrA e n d
de la e xpre s
de me ta le s;
97
66
45 30 20
J2pIJ7
TY + 2,220 nM H
e proteínas
ca fuente de
o ritaria . J251
ón de Hla en
e n las se c
e a hla-asp
guras 3.2.1 y
que Hla m
arum J251 e
e nc ia de l q
as po r la c e p
e la se c re c
no mo stró la
dic a que l
e dio e xtrac
e n la c apta
ción de Hsl
s. me lilo ti la
dive rso s pro
sió n de ge n
e sto s re g u
51 7760
J251
2 dipiridilo + Hemoglobina
en la cepa
e hierro ext
1pIJ7760: J2
n el context
c c io ne s 3.2.
pDE po dría
y 3.2.2). Se
me diada p
e n pre se nc i
que lante 2,2
pa silve stre
ió n, mayo ri
a pre se nc ia
la se c re c ió
e lular y re fu
ac ió n de he
en presenc
a influe nc ia
o c e so s me t
ne s de l re g
ulado re s pa
a
Hla
a silvestre J2
tracelular. S
251 transc o n
to heterólog
.1 y 3.2.4 d
a e star inv
e studió la
po r e l siste m
ia de pIJ776
2 El análisis p
J251 de Rh
itaria y pro
de flag e lin
ó n de Hla
ue rza la ide
e mo .
cia de pIJ77
de re gulad
tabó lic o s e
uló n flage la
are c e n ac tu
251 cultivad
Se o bse rva
njug ante pIJ
CAPÍTU
go
de e ste c a
vo luc rada e
influe nc ia
ma AspDE
60. Las bac
po r SDS PAG
izo bium e n
mine nte , d
as de Rhizo
re spo nde
e a e n c uan
760.
do re s de qu
e ntre lo s qu
ar y la induc
uar e n e l e s
da en medio
la se c re c ió
J7760.
ULO III- Resul
83
pítulo
e n la
de la
e n e l
c te rias
GE de
e stas
e Hla
o bium
a la
nto a
uó rum
ue se
c c ió n
stado
o con
ó n de
ltados
84
e stac io nario (Ho ang e t al., 2004, 2008; Chao e t al., 2005). Estas e vide nc ias mo tivaro n e l
e studio la pro duc c ió n N-ac il ho mo se rín lac to nas (HSL) e n pre se nc ia o ause nc ia de l
c ó smido pIJ7760 e n la c e pa A34 e n c o mparac ió n c o n la c e pa silve stre bo na fide
iso gé nic a J251. El e nsayo se re alizó e n plac a c o n me dio ric o TY usando
Cro mo bac te rium vio lac e um CV026 c o mo c e pa re po rte ra de la pro duc c ió n de HSL. En
la figura 3.2.9 se o bse rva que e l ha lo de ac il-HSLs se ve aume ntado en las do s c e pas
e n pre se nc ia de l c ó smido pIJ7760. Este re sultado fue sug ie re que a lgún/ o s g e n/ e s
c o dific ado / s e n pIJ7760 e staría a fe c tando po sitivame nte la pro duc c ió n de ac il-HSL de
ba jo pe so mo le c ular (Mc Cle an e t al.1997).
Figura 3.2.9: Ensayo de producción HSL usando C. violaceum como cepa reportera. Se
o bse rva e l aume nto de l ha lo de HSL e n pre se nc ia de l c ó smido pIJ7760. J251+pIJ7760:
J251 transc o njugante pIJ7760. A34+pIJ7760: A34 transc o njugante pIJ7760.
CAPÍTULO III- Resultados
85
3.2.9 Anexos: Tablas c o n lo s pé ptido s identific ado s po r PMF e n Masc o t y la
ide ntific ac ió n pro te ic a pro ve nie nte s de lo s g e le s SDS PAGE e studiado s e n este
c apítulo . La pro te ína Hla (Atu3384) so lo tie ne tre s re siduo s c livab le s po r tripsina e n to da
su mo lé c ula ge ne rando só lo un pé ptido ide ntific ab le po r e sta té c nic a . Se adjunta e n
las Tablas e n las que se o btuvo un sc o re bajo de Masc o t lo s e spe c tro s que c o ntiene n
c o mo banda princ ipal y c asi únic a muy inte nsa la de 1389-1390 que c o rre spo nde a
Atu3384 (Silvia Mo re no de Co lo nna , c o munic ac ió n pe rso nal).
Anexo 3.2.1: Tabla con las proteínas identificadas por Maldi-Tof y PMF en A31 pIJ7760
cultivada en medio TY con 2,2 dipiridilo
Banda Proteína MW
teórico MW
observado Score
MASCOT
% de cobertura de
secuencia Péptidos asignados
L35 Atu3384 25695 35 KDa 86
4%
R.DLLDLAVYQLAR.F
L40 Atu3391 41790 38 KDa 70 18%
R.DVEVNVPVSHVILGEGR.Q R.QIYFLAALDKENPFQHVVGWR.D
K.ENPFQHVVGWR.D K.VGIPLVYVDFR.E
K.KPVVFVER.A K.RPAFTGVQAVK.D
Anexo 3.2.2: Tabla con proteínas identificadas por Maldi-Tof y PMF en la cepa RirA
pIJ7760 cultivada en medio TY
Banda
Proteína
Mw teórico
Mw observado
Score en
Mascot
% de cobertura de
secuencia Péptidos asignados
RirA33 Atu3384 25605 33KDa 88 4% R.DLLDLAVYQLAR.F
Anexo 3.2.3: Tabla con proteínas identificadas por Maldi-Tof y PMF en la cepa IrrA pIJ7760 cultivada en medio TY
Banda
Proteína
Mw teórico
Mw observado
Score en Mascot
% de cobertura de
secuencia Péptidos asignados
IrrA33 Atu3384 25605 33KDa N.S. --- R.DLLDLAVYQLAR.F
CAPÍTULO III- Resultados
Anex
cultiv
Pico
JD38
JD33
Anex
cultiv
Pico
RirAD
RirADD
Espe
SDS-
se c re
pic o
de a
xo 3.2.4: Ta
vada en me
Proteína
Atu3391
Atu3384
xo 3.2.5: Ta
vada en me
o Proteína
40 Atu3391
D33 Atu3384
ectro 3.2.1: E
PAGE 12% l
e tada po r
o inte nso de
aná lisis po r M
bla con pro
edio TY con
MW teórico
41572
26605
bla con pro
edio TY con
MW
teórico o
41790
26605
Espe c tro de
la banda c
la c e pa irrA
e 1390 Dalto
Maldi-To f (Si
oteínas iden
2,2 dipiridil
MW observado
38 KDa
33 KDa
oteínas ide
2,2dipiridilo
MW observado M
38 KDa (M
33 KDa
e masa o bt
c o rre spo ndie
A pIJ7760 c
o n c o rre spo
ilvia Mo re no
ntificadas p
o
Score MASCOT
104
83
entificadas p
o
Score MASCOT
%cob
secu
136 MS/ MS)
3
N.S.
e nido de la
e nte a la p
c ultivada e n
o ndiente a l
o de Co lo nn
por Maldi-To
% de coberturde secuencia
30%
4%
por Maldi-T
% de bertura de uencia
37%
RK
K.DG
---
a banda de
ro te ína de
n me dio TY.
fragme nto
na , c o muni
of en la ce
ra a
Pépt
K.V
R.DL
Tof en la ce
Péptidos
K.KPVK.WLH
K.RPAFTGK.VGIPL
K.ENPFQK.DLDPEA
R.DVEVNVPVR.QIYFLAALDKEK.DGTFDIEQAISGNVHAIWHQFY
R.DLLDLA
e 33 KDa. Se
apro ximad
. El pe rfil m
tríptic o de
c ac ió n pe rs
CAPÍTU
epa J251 pIJ
tidos asignado
VGIPLVYVDFR.E
LLDLAVYQLAR.
epa RirA pIJ
s asignados
VVFVER.A HPDLFK.D GVQAVK.D LVYVDFR.E HVVGWR.D
ATFKELHAR.F VSHVILGEGR.QENPFQHVVGWSLKPDVILMNIDAYNNPYQFVAIQ
AVYQLAR.F
e e xtra jo de
ame nte 33
ue stra un ú
Hla susc e p
so nal).
LO III- Resulta
86
J7760
os
E
F
J7760
Q R.D
AK.T QEIAK.W
e l ge l
KDa
únic o
ptib le
ados
Anex
pIJ77
Banda
IrrAD4
IrrAD3
Espe
SDS-
se c r
mue
de H
pe rs
xo 3.2.6: Ta
760 cultivad
a Proteína
0 Atu3391
3 Atu3384
ectro 3.2.2:
-PAGE 12%
re tada po r
e stra un úni
Hla susc e pt
so nal).
abla con pr
da en medio
Mw teórico obs
41790 4
26605 3
Espe c tro de
la banda c
la c e pa rir
ic o pic o int
ib le de aná
roteínas ide
o TY con 2,2
Mw servado
Sce
Ma
42KDa
33 KDa N
e masa o bt
c o rre spo ndi
rA pIJ7760 c
te nso de 13
álisis po r Ma
entificadas
2 dipiridilo
core en ascot
% cobe
dsecue
55 30
N.S. --
te nido de la
ie nte a la p
c ultivada e
390 Dalto n
a ldi-To f (Silvia
por Maldi-
de ertura de encia
0%
K
K.DG
--
a banda de
pro te ína de
e n me dio TY
c o rre spo nd
a Mo re no d
-Tof y PMF
Péptidos
R.DVEVNVPVK.ENPFQH
K.DGTFDIEQAISK.VGIPL
K.KPVVK.RPAFTG
GNVHAIWHQFYR.FLP
--
e 33 KDa. Se
apro ximad
Y c o n 2,2 d
die nte a l fra
de Co lo nna
CAPÍT
en la cepa
asignados
VSHVILGEGR.QHVVGWR.D LKPDVILMNIDALVYVDFR.E VFVER.A GVQAVK.D YNNPYQFVAIQPLDYK.S
----
e e xtra jo de
dame nte 33
dipiridilo . El
agme nto trí
a , c o munic a
TULO III- Resu
87
a IrrA
Q
AK.T
EIAK.W
e l ge l
3 KDa
pe rfil
ptic o
ac ió n
ultados
Anex
pIJ77
Banda
JH33
Esp
SDS
se c
mu
de
pe r
xo 3.2.7: Ta
760 cultivad
a Proteína
Atu3384
pectro 3.2.3:
S-PAGE 12%
c re tada po r
e stra un ún
Hla susc e pt
rso nal).
abla con pr
da en medio
Mw teórico
26605
Espe c tro d
% la banda c
r la c e pa ri
nic o pic o in
tib le de aná
roteínas ide
o TY con 2,2
Mw observado
33 KDa
de masa o b
c o rre spo nd
irA pIJ7760
te nso de 13
álisis po r Ma
entificadas
2 dipiridilo y
Score en Mascot
74
bte nido de l
ie nte a la p
c ultivada e
390 Dalto n
a ldi-To f (Silvi
por Maldi-T
y 20nM hem
% de cobertura de
secuencia
4%
a banda de
pro te ína de
e n me dio T
c o rre spo nd
ia Mo re no d
Tof y PMF e
moglobina
e Pépt
R.DL
e 33 KDa. S
e apro ximad
Y c o n 2,2 d
die nte a l fra
de Co lo nna
CAPÍTU
en la cepa
tidos asignado
LLDLAVYQLAR.
e e xtrajo de
dame nte 33
dipiridilo . El
agme nto trí
a , c o munic a
ULO III- Resul
88
J251
os
F
e l ge l
3 KDa
pe rfil
íptic o
ac ió n
tados
89
CAPITULO III: CONTEXTO GENETICO Y REGULACIÓN DE HLA-AspDE EN EL HOSPEDADOR
HETERÓLOGO DE R. LEGUMINOSARUM.
3.3 CONCLUSIONES Y DISCUSION
La aso c iac ió n ge né tic a de hla aspDE c o n hlaR (que c o dific a un po sib le
re c e pto r de g rupo s he mo ) y hlaSI (que c o dific a un po sib le siste ma ECF σ y anti σ), la
sinte nía de ge ne s c o n c luste rs invo luc rado s e n la c aptac ió n de he mo a travé s de
he mó fo ro s y la pre se nc ia de un mo tivo RirA sug ie re n que e l lo c us hla aspDE po dría
e star invo luc rado e n la c aptac ió n de hemo e xtrac e lular y que re spo nde ría a la
c o nc e ntrac ió n de hie rro y/ o la pre se nc ia de he mo .
El análisis de la se c re c ió n de Hla e n lo s c o nte xto s A34 (que c o ntie ne la
mutac ió n anc e stra l e n pRL1JI), A31 (que c are c e de pRL1JI) y J251 (c o n pRL1JI que no
c o ntie ne la mutac ió n anc e stra l) de mo straro n que se c re c ió n e xac e rbada de Hla e s
de pe ndie nte de pRL1JI y que e l lo c us hla re spo nde ría además a la c o nc e ntrac ió n de
hie rro e xtrac e lular y e n mayo r me dida a la pre se nc ia de he mo g lo bina
(pro bable me nte po r su grupo he mo ). Po r o tro lado , e l análisis de las pro te ínas
e xtrac e lulare s e n la mutante s iso gé nic as de J251, rirA y irrA, mo stró que ambo s
re gulado re s (RirA e IrrA) de R. le gumino sarum re primirían la se c re c ió n de Hla e n
c o ndic ió n de sufic ienc ia de hie rro .
En e l c o nte xto de la c e pa J251 c ultivada e n insufic ie nc ia de hie rro la se c re c ió n
de Hla no re sultó se r mayo ritaria c o mo o c urre e n e l c o nte xto de la c e pa A34. Este
re sultado sug ie re que e l re gulado r aún no ide ntific ado de l plásmido simbió tic o pRL1JI
e s e l que a fe c ta mayo rme nte la transc ripc ió n o se c re c ió n de Hla . A31 no c o ntie ne e l
plásmido simbió tic o (y po r lo tanto tampo c o a dic ho re gulado r) y sin embargo , so bre -
e xpre sa hla e n c o ndic ió n de insufic ie nc ia de hie rro . Se de sc o no c e la razó n de e ste
fe no tipo pe ro e sta o bse rvac ió n sug ie re que e vide nte me nte e l me c anismo e s aún más
c o mple jo de lo que se pro po ne y que a l me no s de be e xistir un re gulado r adic io na l
(pro bable me nte un ac tivado r) de la se c re c ió n de Hla , c o dific ado e n a lguno de lo s
re plic o ne s dife re nte s a l plásmido simbió tic o , c uya ac tividad pare c e de pe nde r de la
ause nc ia de l re gulado r de l plásmido pRL1JI (mutado e n A34). Este ac tivado r pare c e
induc ir la se c re c ió n pro mine nte de Hla e n A34 y A31 y no pare c e ac tuar e n J251. En e l
c o nte xto de A31, e ste induc to r pare c e re spo nde r a la insufic ie nc ia e xtrac e lular de
hie rro . Una po sib ilidad e s que e l re gulado r no ide ntific ado a lbe rgado e n e l plásmido
simbió tic o (y mutado e n A34) re prima a e ste pro bab le ac tivado r de la e xpre sió n de l
lo c us hla . La se c re c ió n mo de rada de Hla e n J251 e n c o ndic ió n de insufic ie nc ia de
hie rro mue stra que e l re gulado r plasmídic o anc e stra lme nte mutado e n A34 no
re spo nde a la insufic ie nc ia de hie rro .
90
Rhizo bium e s un ho spedado r sustituto va le de ro para e l e studio func io nal de
ge ne s de Ag ro bac te rium. Se pro po ne que la re gulac ió n de la re spue sta a hie rro
me diada po r RirA e staría c o nse rvada e n A. tume fac ie ns y o tras e spe c ie s bac te rianas
(To dd e t al., 2002; Chao e t al., 2005; Jo hnsto n e t al., 2007). Se mo stró que e n R.
le gumino sarum J251, la se c re c ió n de Hla e s re primida e n sufic ie nc ia de hie rro po r e l
re gulado r g lo bal de re spue sta a hie rro RirA. Apo yando e sta ide a , lo s re sultado s in-silic o
mue stran que río arriba de l putativo re c e pto r de he mo HlaR se halla una se c ue nc ia de
re c o no c imie nto IRO (Figura 3.2.2 a ).
Re c ie nte me nte , se ha de sc ripto que e l re gulado r RirA de A. tume fac ie ns re g ula
la e xpre sió n de o tro s ge ne s c andidato s a te ne r un ro l e n la c aptac ió n de hie rro (Ngo k-
Ngam e t al., 2009). En un pro te o ma de re fe re nc ia re a lizado e n Agro bac te rium, se
de sc ribe a l ge n ahuB (Atu3391) c o mo de e xpre sió n c o nstitutiva (Ro se n e t al., 2004). Sin
e mbargo , se de mo stró más tarde que la e xpre sió n de ahuB re spo nde a la
c o nc e ntrac ió n de hie rro e xtrac e lular a travé s de l re gulado r RirA (Ngo k-Ng am e t al.,
2009), e n fo rma similar a lo o bse rvado e n fo rma he te ró lo g a e n e ste trabajo de te sis.
Estas o bse rvac io ne s apo yan la hipó te sis que e l lo c us hla-aspDE pe rte ne c e ría a una
unidad transc ripc io nal mayo r re g ulada e n parte po r RirA e n re spue sta a la
c o nc e ntrac ió n de hie rro y apo rtan nue vas e vide nc ias de que la re g ulac ió n de la
re spue sta a hie rro e staría c o nse rvada e ntre A. tume fac ie ns y o tras e spe c ie s
bac te rianas. AhuB e s una pro te ína pre dic ha c o mo pe riplasmátic a po r lo que re sulta
llamativo e nc o ntrarla e n e l me dio e xtrac e lular de R. le gumino sarum e n vario s de lo s
e nsayo s re a lizado s. Co inc ide nte me nte c o n e stas o bse rvac io ne s, Kre he nbrink y Do wnie
ide ntific aro n pro te ínas e n e l me dio e xtrac e lular de R. le g umino sarum, pre dic has c o mo
pe riplasmátic as (Kre he nbrink y Do wnie , 2008). La se c re c ió n de Hla c o mo pro te ína
mayo ritaria se e nc o ntró ge ne ra lme nte ac o mpañada de la pre se nc ia de AhuB e n e l
me dio e xtrac e lular. Co nside rando que e l o pe ró n que inc luye a AhuT y AhuB de l
siste ma de transpo rte 2 e s dife re nte a l o pe ró n que c o ntie ne a Hla (Figuras 2.2.3,
Capitulo II y Fig ura 3.2.2, Capítulo III), se po dría pro po ne r que la induc c ió n de lo s do s
o pe ro ne s e staría c o o rdinada .
En un análisis transc riptó mic o de una mutante de rirA de S. me lilo ti, se o bse rvó
e n c o mparac ió n c o n la c e pa silve stre iso g é nic a , la induc c ió n de la transc ripc ió n de l
ge n SMc 04206 que c o dific a la pro te ína ho mó lo ga y sinté nic a a Hla , pre dic ha c o mo
putativa he mo lisina que une c a lc io . Po r o tro lado , tambié n se induc e la transc ripc ió n
de SMc 04208, ho mo lo ga a Atu3382, e l c o mpo ne nte MFP de l T1SS AspDE (Chao e t al.,
2005). Esto sug ie re que las pro te ínas ho mó lo gas a Hla y AspE so n re g uladas po r RirA e n
S. me lilo ti. Po r o tro lado , la c o mparac ió n de lo s g e ne s re gulado s po r la c o nc e ntrac ió n
de hie rro c o n lo s ge ne s re g ulado s po r RirA e n la c e pa silve stre de S. me lilo ti mue stra
CAPÍTULO III- Conclusiones y Discusión
91
que e xiste una re spue sta a hie rro inde pe ndie nte de RirA, lo que c o nduc e a lo s auto re s
a suge rir o tro s me c anismo s invo luc rado s e n la re spue sta a la de fic ie nc ia de hie rro e n
Sino rhizo bium (Chao e t al., 2005).
En e l c o nte xto de la mutante rirA c ultivada e n c o ndic ió n de insufic ienc ia de
hie rro se o bse rvó una se c re c ió n no tab le me nte aume ntada de Hla . Este re sultado
e vide nc ia la e xiste nc ia de a lg ún re gulado r dife re nte a RirA que a fe c ta la e xpre sió n o
se c re c ió n de Hla e n insufic ie nc ia de hie rro . El re g ulado r IrrA e s ac tivo e n insufic ie nc ia
de hie rro y su ac tividad no se ve a fe c tada e n la mutante rirA (To dd e t al., 2002), po r
o tro lado , se o bse rvó que IrrA re prime la se c re c ió n/ transc ripc ió n de Hla e n ba jo hie rro
(ve r más ade lante ). Estas e vide nc ias mue stran que e l re gulado r de sc o no c ido que
pro vo c a la so bre e xpre sió n de Hla e n e l c o nte xto de rirA e s dife re nte a IrrA. Este
re gulado r po dría se r e l re g ulado r c o dific ado e n e l plásmido simbió tic o pRL1JI o a lgún
o tro re gulado r de sc o no c ido . Una se c re c ió n tan abundante no se o bse rvó e n la c e pa
silve stre J251 c ultivada e n las mismas c o ndic io ne s, lo que sug ie re que dic ha so bre -
e xpre sió n e s suprimida po r la pre se nc ia de RirA.
RirA no se e nc ue ntra mutado e n la c e pa A34, sin e mbargo no pare c e e je rc e r
su ac c ió n re pre so ra de la transc ripc ió n de Hla Esta o bse rvac ió n sug ie re que la ac c ió n
re gulato ria e je rc ida po r e l re gulado r plasmídic o e s c apaz a fe c tar la ac tividad de RirA.
Esta última hipó te sis se ve re fo rzada po r lo s re sultado s de l labo rato rio de l Dr. Jo hnsto n
que mue stran que e l fe no tipo mutante de A34 se re vie rte c o n e l agre gado de una
c o pia silve stre de l g e n RirA (To dd e t al, 2002)
En la mutante irrA se induc e la se c re c ió n (aunque mo de rada) de Hla e n
c o ndic ió n de sufic ie nc ia de hie rro , indic ando que IrrA re primiría la sínte sis/ se c re c ió n de
Hla e n c o ndic ió n de sufic ie nc ia de hie rro . Este re sultado fue ine spe rado de bido a la
ause nc ia de se c ue nc ias ICE río arriba de l putativo o pe ró n; sin e mbargo , no se pue de
de sc artar un e fe c to indire c to de IrrA so bre la e xpre sió n hla . Re c ie nte me nte se ha
de sc ripto que e l re gulado r IrrA de R. le gumino sarum (IrrARL) no e s de g radado po st-
traduc c io nalme nte a l inte rac c io nar c o n he mo . IrrARL e s dife re nte a l re gulado r IrrA de B.
japo nic um (IrrABJ) ya que c are c e de l e xtre mo re gulato rio N-te r pre se nte e n IrrABJ,
(mo tivo llamado HRM) que e s re spo nsable de la de gradac ió n de pe ndiente de la
pre se nc ia de he mo e n IrrABJ (Sing le to n e t al., 2010). Curio same nte , e n A. tume fac ie ns,
la pro te ína c o dific ada po r e l ge n ho mo lo g o a IrrA, Atu0153, e s ho mó lo g a a l re g ulado r
IrrARL, y c are c e de l e xtre mo re g ulato rio N-te r (pro g rama Blast). IrrARL tie ne
apare nte me nte un ro l primario c o mo re pre so r traduc c io na l y la unió n a he mo
disminuye signific ativame nte su a finidad po r e l ADN; de e sta fo rma, IrrARL de jaría de
e je rc e r su ac c ió n re pre so ra . Po r lo tanto , IrrARL e n pre se nc ia de he mo (e s de c ir,
sufic ie nc ia de hie rro ) po dría de jar de e je rc e r e l e fe c to re pre so r (dire c ta o
CAPÍTULO III- Conclusiones y Discusión
92
indire c tame nte ) so bre la e xpre sió n de l c luste r hla. La se c rec ió n mo de rada de Hla e n
sufic ie nc ia de hie rro po dría de be rse a a lgún re g ulado r c uya ac tividad de pe nde de la
ause nc ia de IrrA y que e staría induc ie ndo la transc ripc ió n de Hla e n sufic ie nc ia de
hie rro . Este re g ulado r se ría dife re nte a RirA ya que RirA mo stro re primir la transc ripc ió n
de Hla e n a lto hie rro .
Po r o tro lado , e n insufic ie nc ia de hie rro se o bse rvó e n e l c o nte xto de la c e pa
irrA una se c re c ió n no table me nte aume ntada de Hla , pro bable me nte de bido a l e fe c to
de a lgún o tro re gulado r que re spo nde a hie rro , c o mo RirA u o tro de sc o no c ido . Este
e fe c to no se o bse rvó e n la c e pa silve stre J251 c ultivada e n las mismas c o ndic io ne s
do nde se c re c ió n de Hla fue disc re ta , indic ando de a lguna mane ra que la so bre -
e xpre sió n de Hla e n insufic ie nc ia de hie rro e s re primida po r IrrA.
Aunque aún no se ha e xplo rado la func io nalidad de l o rtó lo go a IrrA e n A.
tume fac ie ns, c o dific ado po r e l ge n Atu0153, e s po sib le que e l lo c us hla se a re g ulado
po r IrrAAT, e n e l c o nte xto de A. tume fac ie ns.
La c o mparac ió n de l pe rfil de pro te ínas e xtrac e lulare s e n lo s c o nte xto s de las
c e pas A34 e irrA mue stra que A34 tampo c o e s mutante e n e l re g ulado r IrrA. Esto
c o nfirma que la mutac ió n e n A34 a fe c ta o tro re gulado r distinto a IrrA (y RirA c o mo ya
se me nc io nó ). Lo s re sultado s o bte nido s e n e ste trabajo de te sis c o nfirman que la
mutac ió n de A34 se lo c a liza e n a lgún re gulado r de sc o no c ido hasta la fe c ha
c o dific ado e n e l plásmido simbió tic o pRL1JI, c uyo e stimulo disparado r de la ac tividad
no se c o no c e pe ro que influe nc ia la transc ripc ió n de ge nes de re spue sta a hie rro (de
Luc a e t al., 1998; We xle r e t al., 2001; To dd e t al., 2002). La c e pa A34 (8401 pRL1JI) e s
utilizada ac tualme nte c o mo c e pa de re fe re nc ia e n vario s labo rato rio s de dic ado s a l
e studio de aspe c to s g e né tic o s y fisio ló g ic o s de Rhizo bium (Oo no y De niso n, 2010; Li e t
al., 2008; Barr e t al., 2008; Go uld e t al., 2007, 2007 a ). Lo s re sultado s o bte nido s
c o nfirman que la mutac ió n anc e stra l e n A34 pro duc e un fe no tipo ple io tró pic o . Se ría
c o nve nie nte se r prude nte s a la ho ra de o bte ne r c o nc lusio ne s so bre la fisio lo g ía de R.
le gumino sarum a l usar e sta c e pa , so bre to do e n lo que se re fie re a las re spue stas
re gulato rias de la bac te ria a dife re nte s c o ndic io ne s ambie nta le s.
Río arriba de l lo c us g e né tic o que c o ntie ne a hla se e nc ue ntran ge ne s que
c o dific an lo s c o mpo ne nte s de un siste ma ECF σ y ECF anti-σ. De ac ue rdo a l análisis
de sc ripto en la se c c ió n 3.2.1 de e ste c apítulo , e s muy po sib le que e ste siste ma re gule
ge ne s ubic ado s río aba jo , e n e ste c aso hlaR (po sib le re c e pto r de he mo ) y e l lo c us hla
aspDE. En e fe c to , e n e l c o nte xto he te ró lo go de la c e pa J251 (que no c o ntie ne la
mutac ió n anc e stra l) se induc e la se c re c ió n de Hla e n fo rma muy abundante e n
CAPÍTULO III- Conclusiones y Discusión
93
pre se nc ia de he mo e xtrac e lular. Este re sultado sug ie re que e l he mo se ría la mo lé c ula
e spe c ífic a induc to ra de la se c re c ió n de Hla .
En to do s lo s c o nte xto s g e né tic o s analizado s se o bse rvó que c uando la
se c re c ió n de Hla e s mayo ritaria hay a lte rac io ne s e n e l patró n de se c re c ió n y/ o
e xpre sió n de flage linas (disminuc ió n o ause nc ia ) pe rte ne c ie nte s a l re g uló n flage lar de
Rhizo bium. Estas o bse rvac io ne s sug ie re n que la induc c ió n de la se c re c ió n de Hla
(c o mo pro te ína mayo ritaria e n e l me dio e xtrac e lular) po dría e star ac o mpañada de
o tro s c ambio s fisio ló g ic o s bac te riano s. Chao e t al. de sc rib ie ro n que e xiste una
disminuc ió n de la e xpre sió n de ge ne s de l re guló n flage lar e n las c e pas de S. me lilo ti
1021 e n re spue sta a la insufic ie nc ia de hie rro . Se ha de te rminado que e ste he c ho e s
una re spue sta indire c ta a l re g ulado r RirA y se tra taría de un c o mpo rtamie nto
adaptativo a la de fic ie nc ia de hie rro (Chao e t al., 2005).
Muc ho s trabajo s se han public ado s re spe c to a la re gulac ió n ge né tic a
de pe ndie nte de l me c anismo de quó rum se nsing utilizando mutante s e n lo s re gulado re s
de la familia de LuxR/ LuxS y de te c c ió n de qu-ho rmo nas usando c e pas indic ado ras
c o mo C. vio lac e um (Mc Cle an e t al.1997). Sin embarg o , e sto s trabajo s no disc riminan si
e l fe no tipo de las mutante s c o rre spo nde a l me c anismo de l quó rum o a de fic ie nc ias
de l c ic lo de me tilo s ac tivado que ge ne ra c o mo subpro duc to HSL (Winze r e t al., 2003).
Esta o bse rvac ió n c o ndujo a vario s auto re s a po stular que las AI-2 pro duc idas so n, e n
vario s c aso s, e n lug ar de una qu-ho rmo na invo luc rada e n e l me c anismo de quó rum
se nsing , un subpro duc to libe rado de l me tabo lismo c e lular que po dría se r re usado
c o mo me tabo lito (Winze r e t al., 2002; Winze r e t al., 2002a). La pre se nc ia de pIJ7760
pare c e a fe c tar po sitivame nte la pro duc c ió n de HSL e n las c e pas A34 y J251. Esta
influe nc ia po sitiva no c o rre lac io na c o n la se c re c ió n de Hla dado que e n e l c o nte xto
de la c e pa J251 no se c re tan las pro te ínas c o dific adas e n e l lo c us hla e n me dio TY. Este
e fe c to po dría se r me diado po r a lguna o tra pro te ína c o dific ada e n pIJ7760. La
búsque da de ho mo lo g ías de l ge n Atu3392 (c o dific ado e n pIJ7760, ve r Capítulo I,
Re sultado s) e n la base de dato s usando e l pro g rama Blast, mo stró que dic ho ge n
c o dific a una pro te ína similar a me tiltransfe rasas SAM de pe ndie nte s. El aume nto de HSL
o bse rvado e n las c e pas A34 y J251 de R. le g umino sarum c uando po rtan a pIJ7760
po dría c o rre lac io nar c o n una mayo r ac tividad de me tiltransfe rasa que g e ne ra c o mo
subpro duc to AI-2. Sin e mbargo no se pue de de sc artar a lgún e fe c to de pIJ7760 so bre
e l me c anismo de l quó rum se nsing . La pre se nc ia de l c ó smido manifie sta nue vame nte
la mutac ió n ple io tró pic a de la c e pa A34 de bido a que la pro duc c ió n de HSL e n
pre se nc ia de pIJ7760 se e nc ue ntra aume ntada re spe c to a la o bse rvada la c e pa
silve stre J251.
CAPÍTULO III- Conclusiones y Discusión
94
En re sume n, la se c re c ió n de Hla e n e l ho spe dado r he te ró lo go Rhizo bium, y muy
pro bable me nte e n Ag ro bac te rium e staría so me tida a una re d re g ulato ria c o mple ja
que re spo nde parc ia lme nte a la insufic ie nc ia de hie rro y pre se nc ia de he mo a travé s
de lo s re gulado re s RirA e IrrA. Sin e mbargo , la e xpre sió n de hlaR hla aspDE mo stro
re spo nde r princ ipa lme nte a l re g ulado r plasmídic o de sc o no c ido (c uyo e stimulo
disparado r de la ac tividad se de sc o no c e ) y pro bab le me nte se a a fe c tada po r o tro (s)
re gulado r(e s) de sc o no c ido (s). En c o ndic io ne s re stric tivas de hie rro y
fundame ntalme nte e n pre se nc ia de he mo se induc iría la se c re c ió n de Hla me diada
po r AspDE.
CAPÍTULO III- Conclusiones y Discusión
CAPÍTULO IV:
ESTUDIO DEL ROL DEL SISTEMA AspDE Y SU
SUSTRATO, HLA, EN LA FISIOLOGÍA DE A.
tumefaciens.
96
CAPITULO IV: ESTUDIO DEL ROL DEL SISTEMA AspDE Y SU SUSTRATO, HLA, EN LA FISIOLOGÍA DE A. tumefaciens.
4.1 INTRODUCCIÓN
Lo s re sultado s de l c apítulo ante rio r mue stran que la pre se nc ia de hemo e n e l
me dio de c ultivo induc e fue rte me nte la se c re c ió n de Hla e n e l ho spe dado r he te ró lo go
Rhizo bium. Ade más, lo s análisis in silic o indic an que e l lo c us hla aspDE fo rmaría parte
de un c luste r g e né tic o que inc luiría ge ne s que c o dific an un re c e pto r de g rupo s he mo
(HlaR) y lo s fac to re s ECF σ y ECF anti σ invo luc rado s e n se nsar lo s nive le s de hie rro . Estas
e vide nc ias sug ie re n que dic ho c lúste r (hlaIS-hlaR-hla-aspDE) po dría e star invo luc rado
e n la c aptac ió n de he mo e xtrac e lular.
En las pró ximas se c c io ne s se pre se ntará una bre ve de sc ripc ió n so bre la
impo rtanc ia de l he mo , su re lac ió n c o n e l me tabo lismo de l hie rro y lo s me c anismo s de
c aptac ió n de he mo u o tras fue nte s de hie rro .
Las bac te rias se e nc ue ntran re string idas e n hie rro c ualquie ra se a e l nic ho que
habite n, ac e lular, ac uátic o , de ntro de l ho spe dado r o e n la rizo sfe ra , e sta
c arac te rístic a limita la c apac idad de sinte tizar c o fac to re s que c o ntie ne n hie rro c o mo
e l he mo . Las bac te rias han de sarro llado dive rsas e strateg ias que le s pe rmite n adquirir
hie rro y he mo de l me dio e n fo rma de pe ndie nte de e ne rg ía y e n c o ntra de g radiente
de c o nc e ntrac ió n. En c o ndic io ne s anae ró bic as, e l hie rro se e nc ue ntra c o mo Fe 2+, e sta
fo rma e s a ltame nte so luble y difunde libre me nte a travé s de po rinas de la me mbrana
e xte rna y e s transpo rtado a l c ito plasma a travé s de impo rtado re s ABC de io ne s
fe rro so s (Kammle r e t al., 1993). En c o ndic io ne s ae ró bic as, e l Fe 3+ e s transpo rtado y
a lmac e nado e n transfe rrinas (Tf) y lac to fe rrinas (Lf), pro te ínas que une n Fe 3+ c o n a lta
a finidad (Chaste e n y Harriso n, 1999). Muc has bac te rias pató ge nas de mamífe ro s
tie ne n siste mas de c aptac ió n de l hie rro dire c tame nte de Tf y Lf (Wande rsman y
De le pe la ire , 2004; Ratle dge y Do ve r, 2000). De ntro de l ho spe dado r, Una ve z que e l
hie rro ha sido c aptado de ntro de l c ito plasma bac te riano , e l Fe 3+ e s re duc ido a Fe 2+ po r
la ac c ió n de fe rric -re duc tasas, e l Fe 2+ se a lmac e na de ntro de g rande s c o mple jo s
multimé ric o s pro te ic o s llamado s fe rritinas. Las fe rritinas bac te rianas pro te ge n a la
c é lula de la so bre c arga y c o nse c ue nte to xic idad de l hie rro y so n fue nte de hie rro
intrac e lular c uando e ste me ta l e s e sc aso , (Smith, 2004; Andre w e t al., 2003; Carro ndo ,
2003; Andre w, 1998; Yang e t al, 2000; Chianc o ne e t al., 2004).
4.1.1 El hemo como fuente de hierro y/ o protoporfirina
El he mo e s fue nte de hie rro a lte rnativa , pe ro e s a ltame nte tó xic o de bido a que
e s una mo lé c ula hidro fó b ic a que partic io na e n las me mbranas y pro mue ve
97
re ac c io ne s re do x no e nzimátic as (Wande rsman y Sto jiljko vic , 2000; Ryte r y Tyrre ll, 2000).
De bido a su to xic idad, e l he mo no se e nc ue ntra libre de ntro de l ho spe dado r de
bac te rias pató ge nas o simbió tic as sino que e stá c o mple jado a dive rsas pro te ínas
(Came jo e t al., 1998; Asc e nzi e t al., 2005). Entre e stas he mo pro te ínas se pue de
me nc io nar a la he mo g lo bina , he mo g lo b ina-hapto g lo b ina , he mo pe xina , transfe rrinas,
lac to fe rrinas y la le g -he mo g lo bina ve ge ta l. La le g -he mo g lo bina e s re spo nsable de
pro ve e r o xíge no a bac te ro ide s e nc arg ado s de fijar nitró ge no e n lo s nó dulo s ve ge ta le s.
Sin e mbargo , las bac te rias no po see n re c e pto re s e spe c ífic o s para las he mo pro te ínas y
apare nte me nte la mo lé c ula re c o no c ida e s e l he mo que c o ntie ne n. Po r o tro lado , e l
he mo pue de se r libe rado lue go de la deg radac ió n de las hemo pro te ínas po r
pro te asas de supe rfic ie o e xtrac e lulare s (Wande rsman y De le pe la ire , 2004).
Una ve z de ntro de l c ito plasma bac te riano , la e xtrac c ió n de l hie rro c o nte nido
e n e l g rupo he mo pue de o c urrir po r do s me c anismo s dife re nte s. Uno de e sto s
me c anismo s e s me diado po r la ac c ió n de mo no o xig e nasas que ro mpe n e l anillo de
po rfirina libe rando e l hie rro (Puri y O’ Brian, 2006). La re ac c ió n c o mie nza c o n la
re duc c ió n de la he mina (fo rma o xidada de l he mo ) a he mo y e l Fe 2+ e s a lmac e nado
e n bac te rio fe rritinas (Kikuc hi e t al., 2005; Chianc o ne e t a l., 2004; Franke nbe rg -Dinke l,
2004; Carro ndo , 2003). Esta re ac c ió n o c urre e n c o ndic io ne s de ae ro b io sis lo que
implic a que só lo e n e stas c o ndic io ne s e l he mo se rviría c o mo fue nte de hie rro .
Re c ie nte me nte se ha de sc ripto un se g undo me c anismo de e xtrac c ió n de hie rro de l
g rupo he mo e n E. c o li que c o nsiste e n la de sfe rro que latac ió n de l he mo mante nie ndo
e l anillo de po rfirina intac to (Lé to ffé e t al., 2009).
El he mo e s, ade más, fue nte de pro to po rfirina para e spe c ie s bac te rianas que
no po se e n la vía de sínte sis de he mo c o mo Ente ro c o c c us fae c alis, Lac to c o c c us lac tis,
Hae mo philus influe nzae y Po rphyro mo nas g ing ivalis (Winste dt e t al., 2000; Pe de rse n e t
al., 2008; Bro o ijmans e t al., 2009; Vido e t al., 2004; Mo rto n e t al., 2006; 2007; Parro w e t
al., 2009) y tambié n para a lgunas e spe c ie s bac te rianas que si po se e n la vía de sínte sis
c o mple ta c o mo Barto ne lla quintana (Battisti e t al., 2006). En B. quintana se ha
pro pue sto que e l he mo c aptado e n fo rma e xó ge na e s fue nte de hie rro , pe ro ade más
pre c urso r de la sínte sis de e nzimas que usan he mo c o mo c o fac to r (Mye rs e t al., 1972) y
c o mo siste ma de de to xific ac ió n de pe ró xido de hidró ge no (Mye rs e t al., 1969). El
transpo rte de he mo hac ia e l c ito plasma de manda me no s e ne rg ía que la sínte sis de
no vo de l anillo de PPIX (Le wis e t al., 1998). Estudio s ge nétic o s han demo strado que
bac te rias que pre se ntan la vía de b io sínte sis de he mo c o mple ta , transpo rtan de to das
mane ras he mo a l inte rio r c e lular (Mills y Payne , 1995). A pe sar de que aún no se ha
CAPÍTULO IV- Introducción
de sc
e nzim
4.1.2
extra
indire
hie rro
c o m
trans
sustra
Fig
tra
he
re c
me
de
En
libe
a la
c ripto la vía
mas o rtó lo g
Mecanis
acelular al c
El hie rro
e c to s. Lo s m
o e n fo rma
ple jado s. E
spo rtado r A
ato (Figura 4
ura 4.1.1: Es
nspo rtado p
mo g lo b ina
c e pto re s e s
e diante la
pe ndie nte s
e l c ito plasm
e rando e l
amac e nado
a de sínte s
as ne c e sari
smos de ca
citoplasma
o e l he mo p
me c anismo
ió nic a o de
Esto s siste ma
ABC de me
4.1.1).
squema de
po r transfe r
(Hb), hap
spe c ífic o s d
e ne rg ia p
s de PBP rec
ma, e l he m
Fe 3+.El Fe 3+
o e n bac te r
sis de l he m
ias para su
aptación de
pue de n se r
o s de c apta
e hie rro o he
as c o nsiste n
e mbrana in
e mecanism
rrinas (Tf) o
pto g lo bina
de me mbra
pro vista po
c o no c e n a l
o e s de g ra
e s re duc id
rio fe rritinas.
mo e n Ag ro
bio sínte sis (
el hemo, hi
r inc o rpo rad
ac ió n dire c
e mo pro ve n
n básic ame
nte rna de pe
mos de capt
lac to fe rrina
(hp) o he
ana e xte rn
o r e l c o mp
l Fe 2+, Fe 3+ o
dado a b ili
do a Fe 2+
ME: Me mb
o bac te rium
de pts.wash
erro u otros
do s a travé s
ta implic an
nie nte de m
e nte e n un
e ndie nte d
tación direc
as (Lf), e l he
e mo pe xina
na que lo s
ple jo To nB/
o he mo y lo
ve rdina y m
po r la ac c
rana e xte rn
m, e l ge no m
hingto n.e du
s sustratos
s de me c an
n la c aptac
mo lé c ulas q
n re c e pto r
de PBPs qu
cta de hierr
mo libre o t
(Hg ) e s re
transpo rta
/ ExbBD. Imp
o transpo rta
mo nó xido d
c io n de fe r
na . MI: Me m
CAPÍTULO
ma c o dific
/ ag ro / ).
desde el m
nismo s dire c
c ió n de he
ue lo s c o nti
e spe c ífic o ,
e re c o no c
o. El Fe 2+, e
transpo rtad
e c o no c ido s
n a l pe ripl
po rtado re s
an a l c ito pla
de c arbo no
rric -re duc ta
mbrana inte r
O IV- Introduc
98
c a las
medio
c to s o
mo o
iene n
y un
e n a l
e l Fe 3+
do po r
s po r
asma
ABC
asma.
(CO)
asas y
rna .
MI
ME
cción
99
Lo s me c anismo s de c aptac ió n indire c ta implic an la c aptac ió n de hie rro travé s
de side ró fo ro s o de he mo a travé s de he mó fo ro s. En ambo s me c anismo s e l transpo rte
e s ac tivo g rac ias a la inte rac c ió n c o n e l c o mple jo To nB (ve r más ade lante )
(Wande rsman y De le pe la ire , 2004; To ng y Guo , 2009; Ge nc o y De sa i, 1996; Vasil y
Oc hsne r, 1999; Wande rsman y Sto jiljko vic , 2000). La c o e xistenc ia de más de un siste ma
de c aptac ió n de hie rro e s re lativame nte c o mún e n bac te rias (Wande rsman y
Sto jiljko vic , 2000).
Sideróforos: La e strate g ia más ampliame nte distribuida e n lo s mic ro o rganismo s
se basa e n la c aptac ió n indire c ta de hie rro a travé s de la se c re c ió n de side ró fo ro s. Lo s
side ró fo ro s so n c o mpue sto s de ba jo pe so mo le c ular, que que lan hie rro c o n a lta
a finidad pro ve nie nte de fue nte s químic as o c o mple jo s o rgánic o s simple me nte po r
de splazamie nto de l e quilibrio químic o . Lo s side ró fo ro s so lub ilizan a l Fe 3+ hac iéndo lo
dispo nib le para su uso (Clarke e t al., 2001). Lo s ge ne s que c o dific an las e nzimas de la
b io sínte sis de side ró fo ro s e stán re gulado s po r la c o nc e ntrac ió n de hie rro a travé s de Fur
o RirA y ge ne ra lme nte se e nc ue ntran e n e l mismo c lúste r que lo s ge ne s invo luc rado s
e n la c aptac ió n de l fe rri-side ró fo ro (side ró fo ro c o mple jado c o n Fe 3+). En bac te rias
Gram-ne gativas e l c o mple jo fe rri-side ró fo ro e s re c o no c ido e n la supe rfic ie c e lular po r
re c e pto re s de me mbrana e spe c ífic o s que translo c an e l c o mple jo a l pe riplasma,
do nde e s translo c ado a l c ito plasma a travé s de siste mas de transpo rte ABC
de pe ndie nte s de PBPs (Kre wulak y Vo ge l, 2008). En e l c ito plasma la re duc c ió n de Fe 3+
a Fe 2+, pro vo c a la pé rdida de a finidad de l side ró fo ro po r lo que e l c o mple jo se
de shac e , e l side ró fo ro e s re c ic lado y se c re tado a l me dio e xtrac e lular nue vame nte
(Wande rsman y De le pe la ire , 2004; Mie thke y Marahie l, 2007).
Hemóforos: Lo s he mó fo ro s so n pro te ínas e xtrac e lulare s e spe c ia lizadas que
se c ue stran he mo de dive rsas fue nte s y lo lle van a re c e pto re s e spe c ífic o s de la
me mbrana e xte rna (Ghigo e t al., 1997). Do s siste mas que invo luc ran he mó fo ro s han
sido re po rtado s e n bac te rias Gram-ne g ativas; uno se ha de sc ripto só lo e n
Hae mo phylus influe nzae y e stá fo rmado po r e l siste ma HxuABC (he me / he mo pe xin
utilizatio n). El re c e pto r de l siste ma, HxuC, e stá invo luc rado e n la c aptac ió n de he mo
libre , he mo c o mple jado a a lbumina o he mo c o mple jado a he mo g lo bina . HxuABC e s
e l únic o siste ma de sc ripto c apaz de unir he mo pe xina , sin e mbarg o , e l me c anismo
e xac to de adquisic ió n de he mo de l c o mple jo he mo -he mo pe xina aún no se c o no c e
(Hanso n e t al., 1992; Co pe e t al., 1998; 2001; 1995; 1994; 1998; Mo rto n e t al., 2007).
La se gunda c lase de siste mas ha sido ide ntific ada e n varias e spe c ie s
bac te rianas c o mo S. marc e sc e ns (Lé to ffé e t al., 1994; Arno ux e t al., 1999, 2000), P.
CAPÍTULO IV- Introducción
100
ae rug ino sa (Lé to ffé e t al., 2000; 1998), P. fluo re sc e ns (Lé to ffé e t al., 2000; Ide i e t al.,
1999), Ye rsinia pe stis (Ro ssi e t al., 2001) y Y. e nte ro c o litic a (Sto jiljko vic y Hantke , 1992).
Lo s he mó fo ro s de e sto s siste mas so n de la familia HasA (he me ac quisitio n syste m),
c uyo s mie mbro s e stán muy c o nse rvado s. El he mó fo ro HasA de S. marc e sc e ns ha sido
e studiado e n de ta lle (Ce sc au e t al., 2007). Co mo ya se de sc rib ió (Capítulo III, Se c c ió n
3.2.1), lo s ge ne s que c o dific an e l T1SS que se c re ta a l he mó fo ro HasA de S. marc e sc e ns
(HasDEF), e l he mó fo ro (HasA) y e l re c e pto r (HasR) e stán c o dific ado s e n fo rma de
o pe ró n y so n re primido s po r e l re gulado r de re spue sta a hie rro Fur unido a su c o fac to r
Fe 2+ (Wande rsman y De le pe la ire , 2004). Va le e nfatizar que las o bse rvac io ne s de l
c apítulo ante rio r indic an que e l lo c us hla aspDE pe rte ne c e ría a un c luste r de ge ne s
c o n una o rganizac ió n ge nó mic a similar a l c luste r de hasA. Más aún, aunque Hla no
pre se nta una similitud signific ativa c o n HasA, e l ge n hla e s sinté nic o a hasA.
Al igua l que la mayo ría de lo s sustrato s de T1SS, HasA c are c e de una se c ue nc ia
se ñal e n e l e xtre mo N-te r, pe ro po se e una se ñal de se c re c ió n fo rmada po r una α-
hé lic e que te rmina e n un mo tivo c o nse rvado de amino ác ido s c argado s
ne gativame nte se g uido s de vario s re siduo s hidro fó b ic o s e n e l e xtre mo C-te r
(De le pe la ire , 2004). Cuando la síntesis y la se c re c ió n de HasA e stán de sac o pladas, e l
he mó fo ro se plie ga e n e l c ito plasma e inhibe la se c re c ió n de nue vas mo lé c ulas re c ié n
sinte tizadas (De barb ieux y Wande rsman, 2001). HasA de S. marc e sc e ns e s un
mo nó me ro de 19 KDa que une he mo e n e ste quio me tria de uno y c o n una Kd de 10-11
M (De niau e t. al., 2003). Lo s he mó fo ro s de la familia de HasA ade más de unir he mo
libre , e n sus do s e stado s re do x, so n c apac e s de se c ue strarlo de una gran variedad de
sustrato s que inc luye n he mo g lo b ina de vario s o ríge ne s, he mo pe xina , mio g lo bina ,
le ghe mo g lo bina y he mo -a lbumina (Wande rsman y De le pe la ire , 2004). Esta g ran
c antidad de sustrato s sug ie re una transfe re nc ia pasiva de l he mo de sde las pro te ínas
que lo c o ntie ne n a l he mó fo ro , c o mo c o nse c ue nc ia de su mayo r a finidad de unió n
(Lé to ffé e t al., 1999).
4.1.3 Captación mediada por hemóforos: cascada Has
Lo s he mó fo ro s so n re c o no c ido s po r e l re c e pto r e spe c ífic o de me mbrana
e xte rna (HasR e n e l c aso de HasA), a l que le c e de n e l he mo ; e l re c e pto r translo c a e l
g rupo he mo a l pe riplasma. HasR, e s un re c e pto r de pe ndiente de l c o mple jo To nB
(Cwe rman e t al., 2006; Be ne vide z-Mato s e t al., 2008; Le fè vre e t al., 2008) (Fig ura 4.1.2).
To nB transduc e la fue rza pro to n mo triz de sde la me mbrana inte rna hasta la me mbrana
e xte rna bac te riana , e ne rg izando e l transpo rte de distinto s sustrato s (Braun, 1995). El
siste ma pro te ic o To nB pro to típic o e stá fo rmado po r tre s pro te ínas: To nB, y las pro te ínas
CAPÍTULO IV- Introducción
me d
c apa
me m
(Po st
e spe
siste m
trans
PBPs
e spe
ause
Ag ro
Capí
c o m
la me
re c e
Fig
he
En
dir
po
to m
ac c e so ri
iante e l c u
az de atra
mbrana e xte
tle y Kadne r
Lue go d
e c ífic o s ne c
mas de c ap
spo rte hac ia
(ve r Capit
e c ífic ame nt
e nc ia de h
o bac te rium,
ítulo III, Se
po ne nte s A
e mbrana in
Co mo y
pto re s de
gura 4.1.2: E
emóforo Has
e l me dio e
rige a l re c e
o r e l c o mple
mada de W
ias ExbB y
ua l e ste c o m
ave sar e l p
e rna invo lu
r, 2003).
de la tranlo
c e sita se r tra
ptac ió n de
a e l c ito pla
tulo II, Se c
e a l sustrato
hie rro a tr
a travé s d
e c c ió n 3.2.3
ABC que po
nte rna (Fig ur
ya se me nc
he mó fo ro s
Esquema de
sA de S. ma
e xtrac e lular
pto r HasR q
e jo HasB-Ex
Wande rsman
ExbD (Fig
mple jo tran
pe riplasma
c rado e n e
c ac ió n de l
anspo rtado
hie rro o he
asma invo lu
c ió n 2.1.3)
o e n e l pe r
ravé s de l
e RirA e IrrA
3, Figura 3
o drían c ump
ra 4.1.2).
c io nó e n e
s y de he m
e la captac
arcescens. E
HasA c apt
que lo trans
xbDB. ME: M
n y De le pe la
ura 4.1.2).
nsduc e la e
e inte rac t
e l transpo rt
he mo a l p
o a l c ito pla
e mo de sc ri
c ra un siste
(Kre wulak
riplasma. Es
re gulado r
A (Ro dió no v
3.2.2, e l c lu
plir la func ió
e l c apítulo
mo ; pre se n
ción indirec
El he mó fo ro
ta he mo lib
spo rta a l pe
Me mbrana
a ire , 2004.
No e stá d
e ne rg ía , pe
uar físic am
te de l sustr
pe riplasma
sma para s
ipto s, ya se
e ma impo rt
y Vo ge l, 2
to s siste ma
Fur y e n
v e t al., 200
uste r hla a
ó n de transp
ante rio r, H
nta un mo t
cta y activa
o HasA e s se
bre o lo se c u
e riplasma m
e xte rna . MI
de l to do c
ro apare nt
me nte c o n
rato e spe c í
a travé s d
su asimilac i
e an dire c to s
tado r ABC d
2008). Las P
s ABC so n r
α-pro te o b
6). Co mo se
a lbe rg aría
po rtar e l sust
HasR e s ho
tivo c o nse n
a de hemo
e c re tado po
ue stra de h
me diante la
I: Me mbran
CAPÍTULO
c laro e l pro
e me nte To
e l re c e pto
ífic o de l sis
e lo s re c e p
ió n. En to do
s o indire c t
de pe ndie nt
PBPs re c o n
re g ulado s p
bac te rias, c
e de sc rib ió
po sib le s PB
trato a trav
mó lo g o a
nso c o nse r
o mediada
o r e l T1SS, Ha
hemo g lo bin
e ne rg ía pr
na inte rna .
O IV- Introdu
101
o c e so
nB e s
o r de
ste ma
pto re s
o s lo s
to s, e l
te de
no c e n
po r la
c o mo
e n e l
BPs y
é s de
o tro s
rvado
por el
asDEF.
a y se
ro vista
Figura
cción
101
llamado FRAP/ NPL y do s histidinas c o nse rvadas de ntro de l barril (Brac ke n e t al., 1999).
HasR e s, ade más, re c e pto r de hemo libre y de he mo unido a he mo g lo b ina aunque
c o n muc ha me no r e fic ie nc ia que c o mo re c e pto r de l he mó fo ro c o mple jado a he mo
(Ghigo e t al., 1997; Lé to ffé e t al., 2001).
HasA tie ne una c o nstante de a finidad a he mo muc ho mayo r que e l re c e pto r
HasR (Izadi e t al., 1997; Lé to ffé e t al., 1999). Lue go de la inte rac c ió n de HasA-he mo c o n
HasR, la a finidad de HasA po r e l he mo disminuiría ; de e sta mane ra se transfie re e l
sustrato a HasR (Caille t-Saguy e t al. 2006; Izadi-Prune yre e t al., 2006). El c o mple jo To nB
pare c e e star invo luc rado e n dife re nte s paso s que inc luye n la transfe re nc ia de he mo
de sde e l he mó fo ro a l re c e pto r, y de l re c e pto r a l pe riplasma y e n e l re c ic lado / e xpulsió n
de l ho lo he mó fo ro de l re c e pto r (Lé to ffé e t al., 2004) Figura 4.1.3).
El siste ma HasA fue re c o nstituido e n la c e pa mutante e n la sínte sis de po rfirinas
de E. c o li do nde mo stró pro ve e r a la bac te ria de he mo c o mo fue nte de po rfirina
(Ghigo e t al., 1997).
Co mo ya se me nc io nó (Capitulo III, Se c c ió n 3.2.4), e l a line amie nto de las
se c ue nc ias de re c e pto re s de pe ndie nte s de To nB c o mo HasR mue stra que hay una
sub familia de transpo rtado re s que pre se nta un do minio adic io nal e n e l e xtre mo N-te r
(Sc ha lk e t al., 2004; Braun y Mahre n, 2005; Ko e bnik, 2005, Buc hanan, 2005). Este
mmmmmmmmmmmm
Figura 4.1.3: Requerimiento energético de la captación de hemo mediada por el
hemóforo HasA. La inte rac c ió n de ho lo -HasA c o n e l re c e pto r HasR e s inde pe ndie nte
de l c o mple jo HasB-ExbBD (To nB). El transpo rte hac ia e l pe riplasma e s de pe ndie nte
de la e ne rg ía pro vista po r e l c o mple jo HasB-ExbBD. Fig ura to mada de Ce sc au e t al.,
2007.
CAPÍTULO IV- Introducción
do m
e n e
hie rro
y End
o pe r
e t al
ho lo -
de H
al re
do m
III, Se
ECF
3.2.4
Fig
int
Ha
e x
inio inte rac
e l c aso de
o / he mo e n
driss, 2007).
ró n Has, y e
., 2004) (Fig
-HasA inte ra
HasSI. Se ha
e c e pto r pa
inio de inte
e c c ió n 3.2.4
anti σ (HlaI
, Tabla 2.2.1
gura 4.1.4: A
te rac c io nar
asR de se nc a
xte rna . Figur
c c io na c o n
e HasR) ase
pre se nc ia
El agre gad
e stimula 10 v
g ura 4.1.4).
ac c io na c o
de sc ripto q
ra la induc
e rac c ió n c o
4). Po r lo tan
y HasS) de
1 y Fig ura 3.
Actividad d
r c o n apo -H
ade na la in
ra to mada d
Hemo
un siste ma
e g urando
de l sustrato
o de HasA
ve c e s la tra
La c asc ad
o n e l re c e pt
que se re qu
c c ió n de la
o n un ECF a
nto , e s po si
e la me mb
.2.3).
e inducción
HasA y he m
nduc c io n
de Ce sc au
ECF σ y EC
la transc rip
o e spe c ífic o
unido a l he
ansc ripc ió n
a de induc
to r HasR, lo
ie re la trans
a c asc ada
anti σ pare c
b le que Hla
brana inte rn
n de los tre
o libre , pe ro
de la e xpre
u e t al., 2007
CF anti σ de
pc ió n de l
o (Kim e t al.,
e mo induc e
de HasR (R
c c ió n de l sis
o que pe rmi
sfe re nc ia d
a Has (Izad
c e e star c o n
aR inte rac c
na (Capítulo
s ligandos d
o so lo la inte
e sio n de l sis
7.
e me mbran
o pe ró n de
1997; Enz e
e la c asc ada
Ro ssi e t al., 2
ste ma Has s
ite la ac tiva
e he mo de
di-Prune yre
nse rvado e
io ne c o n e l
o s II y III, Se
de HasR. Ha
e rac c io n de
ste ma Has.
CAPÍTULO
a inte rna (H
e c aptac ió
t al., 2000; B
a re gulato ri
2001, 2003;
se inic ia c u
ac ió n e spe
sde e l he m
e t al., 200
n HlaR (Ca
l siste ma EC
e c c io ne s 2
asR e s c apa
e ho lo -HasA
ME: Me mb
O IV- Introdu
103
Has SI
n de
Braun
ia de l
Biville
ando
c ífic a
ó fo ro
06). El
pitulo
CF σ y
.2.6 y
az de
A c o n
brana
cción
104
Objetivos específicos
• Co nstruir la c e pa mutante e n e l c o mpo ne nte ABC de l TISS (aspD) y c o mparar e l
se c re to ma aso c iado c o n e l de la c e pa silve stre iso gé nic a .
• De te rminar la ac tividad de Hla e n A. tume fac ie ns y pro po ne r la vía me tabó lic a
e n la que partic ipa .
• Estudiar las c o ndic io ne s e n las que Hla e s se c re tada e n e l c o nte xto de A.
CAPIFISIO
4.2
4.2.1
Ag ro
po r
inte rr
e spe
e l ve
inte rr
c o ns
ve c to
ge n
c o ns
muta
sig uie
Fig
asp
ITULO IV: EOLOGÍA DE A
Caracter
Co n e l
o bac te rium,
inse rc ió n d
rupc ió n de
e c ífic o s para
e c to r pGEM
rumpido po
struc c ió n pD
o r suic ida p
le ta l dirig id
struc c ió n pD
ante se g e
e nte :
gura 4.2.1: R
pD e n A. tum
ESTUDIO DEAGROBACTE
rización fen
o b je tivo d
se c o nstruy
de un c ass
e l g e n c ro m
a amplific ar
M T-Easy q
o r inse rc ió n
DE-LHSpG.
pSAC o bte n
do po r un
DE-LHspSac
ne ró po r d
Re sume n de
me fac ie ns.
EL ROL DELERIUM TUME
RE
notípica de
de e studiar
yó la c e pa
se tte de re
mo so mal a
rlo po r PCR
que c o nfie
de l c asse tt
El inse rto c
nie ndo la c o
pro mo to r
c se transfir
do ble re c o
e la e strate
(Dr. Euge ne
L SISTEMA EFACIENS.
ESULTADOS
una mutant
r e l ro l de
mutante e
e siste nc ia a
aspD (Atu33
y e l frag me
e re re siste n
e Ω e n un s
c o n aspD::Ω
o nstruc c ió n
que se ind
rió po r c o n
mbinac ió n
e g ia utilizad
e Ne ste r, c o
AspDE Y S
te en el gen
e l sistema A
e n e l c o mpo
al antib ió tic
383). Para
e nto de AD
nc ia a am
sitio únic o d
Ω fue subc
pDE-LHSpS
duc e e n p
njug ac ió n a
ho mó lo g a
a para la g
o munic ac ió
SU SUSTRAT
n aspD
AspDE e n
o ne nte ABC
c o e spe c ti
e llo , se di
N o bte nido
pic ilina . El
de re stric c ió
c lo nado e n
ac . Este ve c
pre se nc ia d
a A. tume fa
a de ac ue r
g e ne rac ió n
ó n pe rso nal)
TO, HLA, E
la fisio lo g ía
C de l T1SS, a
no mic ina (
se ñaro n pr
o fue c lo nad
ge n aspD
ó n g e ne ran
n e l sitio Ps
c to r c o ntien
de sac aro sa
ac ie ns C58
rdo a l e squ
de la mut
).
105
N LA
a de
aspD,
(Ω) e
rime rs
do e n
D fue
ndo la
tI de l
ne un
a . La
8 y la
ue ma
ante
plac
que
Para
e spe
utilizá
14) f
c o rre
(c lo n
utiliza
de m
la e s
muta
ac tiv
c o nt
Fig
lo s
re s
qu
un
c a
mo
Las c o lo
as c o nte nie
han pe rdid
c o nfirmar
e c tino mic ina
ándo lo c o m
fue ro n do b
e spo ndie nte
n 10) para l
ando lo s mis
El siste ma
múltiple s pro
stre c ha re la
ante aspD p
vidad g lic an
e nie ndo c a
gura 4.2.2: C
s pro duc to
siste nte s a e
ue lo s c lo ne
na banda d
asse tte :Ω (2
o le c ular
o nias re siste
e ndo g enta
o la re siste n
c lo ne s mu
a y a sac
mo mo lde c
b le s re c o mb
e a l ge n int
o s siguie nte
smo s prime r
a ho mó lo go
o te ínas, e nt
ac ió n filo ge
po dría se r t
nasa β1,4 (a
arbo xime tilc
Confirmació
o s de PCR o
e spe c tino m
e s 10, 12 y
de 2,9 Kb c
2 Kb) e n e
e nte s a sac
amic ina pa
nc ia a e ste
tante s, se e
aro sa y se
c o n prime rs
b inante s ya
e rrumpido
e s e studio s
rs).
o PrsDE de
re las c uale
e né tic a e n
tambié n re
ade más de
c e lulo sa (CM
ón de la mu
o bte nido s u
mic ina y sac
14 so n do b
c o rre spo ndi
e l c ro mo so m
c aro sa y e
ara se le c c io
antib ió tic o
e xtra jo ADN
e nsib le s a g
e spe c ífic o s
a que se o
po r e l c asse
(que fue c o
R. le gumino
e s se e nc ue
tre Rhizo biu
spo nsable
Hla ). Co n e
MC) c o mo
utante aspD
usando AD
c aro sa 5% y
ble s re c o mb
ie nte a l g e
ma de Ag
e spe c tino mi
o nar lo s c lo
c o dific ado
N ge nó mic o
ge ntamic in
s (Figura 4.6
o btuvo un
e tte Ω (2.9
o nfirmado a
o sarum e s re
e ntran las g
um y Ag ro b
de la se c re
e ste fin, se r
sustrato m
D. Ele c tro fo r
N ge nó mic
y se nsib le s a
b inante s ya
e n aspD (0,
ro bac te rium
ic ina fue ro
o ne s do b le s
o po r e l ve c
o de c o lo n
a y se c o
6). So lo tre s
amplic ó n
kb ), e lig ie n
ade más po
e spo nsab le
lic anasas P
bac te rium,
e c ió n de un
re a lizaro n e
o de lo de la
re sis e n g e l
c o c o mo m
a ge ntamic
que se am
9 Kb) inte rr
m. M: Marc
CAPÍTU
n transfe rid
s re c o mbin
to r (Fig ura 4
nias re siste n
o nfirmó po r
c lo ne s (10
de un tam
do uno de
o r se c ue nc ia
e de la se c re
lyA y PlyB. D
se analizó
na pro te ína
nsayo s e n p
a ac tividad
de ag aro sa
mo lde de c l
c ina . Se o bs
mplific o po r
rumpido c o
c ado r de
ULO IV- Resu
106
das a
ante s
4.2.1).
nte s a
r PCR
, 12 y
maño
e sto s
ac ió n
e c ió n
Dada
ó si la
a c o n
plac a
d β1,4
a de
o ne s
se rva
PCR
o n e l
pe so
ltados
107
g lic anasa . Lo s e nsayo s se re a lizaro n e n me dio mínimo (Y-manito l) c o nte nie ndo CMC,
e n c o ndic io ne s de sufic ie nc ia (Fe Cl3 0,3 M fina l) y de insufic ie nc ia de hie rro (me dio
mínimo Y sin hie rro ag re g ado ). Sin e mbargo , e sto s e nsayo s mo straro n que la c e pa
silve stre (y tampo c o la mutante ) no pre se nta ac tividad e xtrac e lular de g lic anasa e n
las c o ndic io ne s e nsayadas (dato no mo strado ).
4.2.3 Estudio del secretoma de A. tumefaciens en cultivos aeróbicos
Co n e l fin de c o nfirmar que la mutac ió n e n e l g e n aspD de A. tume fac ie ns
a fe c ta la se c re c ió n de Hla (o de o tra pro te ína ) se analizó e l pe rfil de pro te ínas
e xtrac e lulare s de la c e pa silve stre y la mutante c ultivadas e n dife re nte s c o ndic io ne s
de c ultivo y fase s de c re c imie nto . Ade más, e ste e nfo que pe rmitirá e stable c e r las
c o ndic io ne s e n que se e xpre sa e l lo c us hla aspDE y po r lo tanto infe rir su func ió n e n A.
tume fac ie ns.
Cultivo s de la c e pa silve stre C58 de A. tume fac ie ns e n me dio ric o (e n pre se nc ia
o ause nc ia de pIJ7760) no pare c e n se c re tar c antidade s de te c table s de Hla (Capitulo
II, Figura 2.2.8). Lo mismo o c urre c o n la c e pa mutante aspD e n me dio ric o (e n
pre se nc ia o ause nc ia de pIJ7760) (no mo strado ). Sin e mbargo , e sto pue de de be rse a
que la se c re c ió n de Hla só lo se induc e e n de te rminadas c o ndic io ne s de c ultivo . Se
c o mpararo n lo s pe rfile s de pro te ínas e xtrac e lulare s de la c e pa silve stre de A.
tume fac ie ns C58 c o n e l de la mutante aspD::Ω, pro ve nie nte s de c ultivo s e n me dio
ric o , c o ndic io ne s aeróbicas y e n fase exponencial de la c urva de c re c imie nto . En
e stas c o ndic io ne s no se o bse rvó se c re c ió n dife re nc ia l de pro te ínas (no se mue stra ).
Tambié n se analizaro n lo s pe rfile s de pro te ínas e xtrac e lulare s pro ve niente s de c ultivo s
e n dife re nte s me dio s mínimos (me dio mínimo Y, me dio mínimo Y mo dific ado para
Agro bac te rium, me dio mínimo AB, ve r Mate ria le s y Mé to do s) (no se mue stra). Po r o tro
lado , se analizó e l se c re to ma e n me dio mínimo Y mo dific ado a dife re nte s pH (pH 4, 5 ó
7) y e n pre se nc ia de l induc to r de virule nc ia ac e to siring o na. No se o bse rvó se c re c ió n
dife re nc ia l de pro te ínas e ntre la c e pa silve stre C58 y la mutante aspD e n ninguna de
las c o ndic io ne s analizadas (no se mue stra ).
Se ha de sc ripto que muc ho s sustrato s de T1SS une n c a lc io e n e l mo tivo
c o no c ido c o mo RTX (Czuprynski y We lc h, 1995). Se analizó si la ausenc ia de c a lc io
a fe c ta e l pe rfil e xtrac e lular e n me dio ric o TY sin c a lc io agre gado ; sin e mbargo , e n
e stas c o ndic io ne s no se o bse rvaro n dife re nc ias e n e l se c re to ma de la c e pa silve stre y
la mutante aspD (no se mue stra ).
Se ana lizó ade más si la se c re c ió n de Hla o a lgún o tro sustrato de l siste ma AspDE
po dría se r mo dulada po r lo s nive le s de hie rro e n A. tume fac ie ns. Para e llo , se c ultivó la
CAPÍTULO IV- Resultados
para
de d
fé rric
lo s p
las c
pre se
aspD
e xpo
que la
mue s
pro te
ide nt
se c re
Fig
aer
c o o
se c
pIJ
La
a la
ag
Ag
a-
c e pa silv
a Agro bac te
dife re nte s fu
c o 1 mM (W
e rfile s de la
c o ndic io ne s
e nte s e n la
D e n me dio
Se e stud
o ne nc ia l e n
ante no m
stra ) e l ag
e ínas se c re
tific ando p
e tadas po r
ura 4.2.3: A
róbicos en
o massie b lu
c re c io n de
7760) c ultiv
mutante as
a silve stre c
re gado de
ro bac te rium
ve stre C58
e rium c o n o
e nte s de hi
Wage gg y Br
as pro te ínas
s e studiada
re g ió n de 3
Y mo dific ad
dió e l se c r
n me dio ric
me tabo lizab
g reg ado de
e tadas e ntr
po r Maldi-T
ambas c e p
Análisis del p
fase expo
ue pue de
pro te inas e
vada e n me
spD de A.t.
c uando fue
e hie rro (
m.
Y (m)
y la c e pa
o sin hie rro a
e rro : Fe Cl3,
raun; 1981)
se c re tadas
as. La iden
33 KDa mo s
do c o n o sin
re to ma de
c o TY e n pr
le 2,2 dipir
e 2 nM de
re ambas c
To f y PMF l
pas (no se m
perfil de pro
onencial d
e o bse rvars
e n A. tume
e dio s Y mo d
no pre se nt
e c ultivada
(Fe Cl3) (de
mutante a
ag re g ado o
0,37 µM (C
(no se mue
s de la muta
tific ac ió n p
stro que Hla
n hie rro ag r
e las c e pa
re se nc ia (Fi
ridilo (200
e he mo g lo b
c e pas. Esta
as pro te ína
mue stra ).
oteínas extr
de crecimie
e que no
e fac ie ns.c ua
dific ado s c o
to a lte rac io
e n me dio
e re c ha). Y
b
aspD e n m
o utilizando
hao e t al., 2
e stra ). No se
ante y la c
po r Maldi-T
a no e s se c r
re g ado (no
as C58 y a
ig ura 4.2.4)
mM) c o n
b ina , sin o
as o bse rvac
as pre se nte
racelulares
ento. a-
e xiste n dife
ando po rta
o n re spe c to
ne s e n e l p
Y (mo dific
(m): Me
b-
e dio mínim
c o nc e ntra
2005) (Fig ur
e o bse rvaro
e pa silve stre
o f y PMF d
re tada po r
mo strado ).
aspD e n c
o no (no
(Figura 4.2.
o bse rvar dif
c io ne s fue r
e s e n la re g
en A tumef
Me diante
e re nc ias e n
a e l c o smid
o a la c e pa
pe rfil pro te ic
ado ) c o n (
e dio Y mo
CAPÍTU
mo Y mo difi
c io ne s limit
ra 4.2.3) o c
o n dife re nc i
e e n ning un
de las pro t
las c e pas C
.
c ultivo s e n
se mue stra
.4) o sin (n
fe re nc ias e
ro n c o nfirm
gió n de 33
faciens. Cul
SDS-PAGE
n e l patro n
do pIJ7760
silve stre C5
c o c o n re sp
(izquie rda )
o dific ado
ULO IV- Result
108
c ado
ante s
c itrato
as e n
na de
te ínas
C58 o
fase
a ) de l
no se
e n las
madas
3 Kda
ltivos
12%-
n de
(C58
58. b-
e c to
o sin
para
tados
bac t
pro te
ante
pro te
(Figu
aspD
para
4.2.5
e xtra
aspD
se c re
Figu
asp
e sta
pre
e xp
a-
Algunas
te riana (Zo
e ínas aso c i
rio rme nte d
e ína aso c ia
En c o ntr
ura 4.2.3), e x
D e n c ultivo
a Ag ro bac te
).La ide ntif
ac e lular de
D, indic ó la
e tarse a trav
ura 4.2.4: P
pD en cultiv
ado e xpo n
e se nc ia de l
po ne nc ia l d
TY
C58
pro te ínas s
rre guie ta ,
adas a la
de sc riptas,
da a la sup
raste a lo o
xiste n dife re
o s aeróbico
e rium sin ag
fic ac ió n po
la c e pa silv
a ause nc ia
vé s de l siste
Proteínas ex
vos aeróbico
ne nc ia l de l
que lante 2,
de l c re c imie
Y
aspD
se c re tadas
e t a l, 1998
supe rfic ie
pe ro tamp
pe rfic ie e ntre
o bse rvado e
e nc ias e n e
os e n estad
gre gado o
o r MALDI-T
ve stre C58 y
de Hla y
e ma tipo I A
xtracelulare
os. a- Pro te
c re c imien
,2 dipiridilo
e nto .
97
66
45
30 20
po r TISS pe
8). Po r e ste
de la bac
o c o se de t
e la c e pa si
e n fase e xp
e l pe rfil pro t
do estacion
c o n c o nc e
TOF de las
y ause nte s e
y la pre se n
AspDE
es de la ce
e ínas e xtrac
nto . b- Pro
(2,2D (200μ
b
e rmane c e n
e mo tivo ,
c te ria de c
te c tó se c re
ilve stre y la
po ne nc ia l d
e ic o de la
ario e n me
e ntrac io ne s
s pro te ínas
e n e l me dio
nc ia de o tr
epa silvestre
c e lulare s e n
o te ínas e n
M) y he mo g
- TY+2,2D
C58
n aso c iada
se analizar
c ultivo s e n
e c ió n dife re
mutante (n
de l c re c imie
c e pa silve s
e dio mínimo
s limitante s
s pre se nte
o e xtrac e lula
ras pro te ína
e C58 y la
me dio de
me dio de
g lo b ina (20
D+20nM Hb
asp
CAP
s a la supe
ro n tambié
las c o ndic
e nc ia l de a l
no mo strado
e nto bac te
stre y la mu
o Y mo difi
de Fe Cl3 (F
s e n e l m
ar de la mu
as que po
cepa muta
c ultivo TY e
c ultivo TY
nM) e n e st
97
66
45
30
pD
PÍTULO IV- Re
109
e rfic ie
é n las
c io ne s
lg una
o ).
e riano
tante
c ado
Fig ura
me dio
tante
o drían
ante
e n e l
Y e n
tado
sultados
ae ró
AhuB
unió n
re c e
e xte r
de A
e l ho
o ind
re spu
Sin e
C58
que la
4.2.6
se c re
po r M
Figu
cult
e n
silve
(m)
9766 45 30 20
La ide nt
b ic o fase e
B (Atu3391)
n a hie rro
pto r de he
rna de pe nd
AhuB (Atu33
o spe dado r h
.
Lo s e stud
dire c ta mu
ue sta a la p
mbargo , Hl
e n c ultivo s
ante de hie
). En e ste
e tadas po r
Maldi To f c o
ura 4.2.5: Pr
tivos aeróbi
me dio Y (m
e stre C58 fu
: Medio Y m
7 6
5
0
0
Y (m
asp
ific ac ió n po
e stac io naria
(pre se nte
(Capítulo II
mo e n la a
die nte de T
91 mo stró e
he te ró lo g o
dio s so bre lo
ue stran la
pre se nc ia de
a tampo c o
ae ró b ic o s
e rro 2,2 dip
c aso , se o
la c e pa silv
o mo pro te ín
roteínas ext
icos en esta
mo dific ado
ue ro n ide nt
mo dific ado
m) 37μM Fe
D C58 a
o r Maldi-To
a me dio Y (
e n e l c luste
, Figura 2.2
ano tac ió n g
To nB (Figura
e star re gula
de R. le gum
o s me c anism
induc c ió n
e l sustrato e
o fue de te c t
e n e stado
piridilo y dis
o bse rvó un
ve stre pe ro
nas pe rte ne
tracelulares
ado estacio
o . Las pro te
tific adas po
para Agro b
Y (m) 0,37μM Fe
aspD C58
f y PMF de
m) 0.37 uM
e r hla ), que
2.3, Ane xo
ge nó mic a y
a 4.2.5). Co
da po r la c
mino sarum
mo s de c ap
de la e xp
e spe c ífic o (
tada e n e l m
e stac io nar
stintas c o nc
c ambio e
no po r la m
c ie nte s a l re
s de la cep
onario c o n
e ínas se c re t
o r Maldi-To f
bac te rium.
Y (m) -e
aspD C
e las pro te ín
c lo ruro fé rr
e c o dific a p
4.2.1), Atu2
y Atu3687 o
mo se me n
o nc e ntrac ió
ptac ió n de
pre sió n gé n
Ce sc au e t a
me dio e xtra
rio e n me d
c e ntrac io ne
e n e l pe rfil
mutante asp
e guló n flag
a silvestre C
dife re nte s c
tadas dife re
y PMF y se
-Fe
C58
nas dife re nc
ric o mo stró
para una P
2287, pro pu
tro re c e pto
nc io nó , la s
ó n de hie rro
hie rro c o m
nic a de e s
al., 2007; Br
ac e lular de
io ric o TY e
e s de he mo
de pro te ín
pD que fue r
e lar (Ane xo
C58 y la mu
c o nc e ntrac
e nc ia lme nt
e indic an a
AhuB:
Atu0545: Atu0543:
Atu2287: Pre c e pto r dme mbranAtu3687: Rme mbrande pe ndie
CAPÍTU
c ia le s e n c
la pre se nc
PBP de pro b
ue sto c o mo
o r de me mb
sínte sis/ se c re
o e xtrac e lul
o fue nte di
sto s siste ma
aun e t al., 2
la c e pa silv
e n pre se nc i
o g lo bina (F
nas dife re nc
ro n ide ntific
o 4.2.2).
utante aspD
c io ne s de hi
te po r la c
a la de re c h
FlaA FlaB
Pro bable de he mo de
na e xte rna . Re c e pto r dena e xte rna e nte de To nB
ULO IV- Resul
110
c ultivo
c ia de
bable
o o tro
brana
e c ió n
lar e n
re c ta
as e n
2003).
ve stre
a de l
Fig ura
c ia le s
c adas
D en
ie rro
e pa
a . Y
e e
B.
ltados
115
4.2.7 Anexos:
Anexo 4.2.1: Tabla de pro te ínas ide ntific adas po r Maldi To f y PMF e n la c e pa silve stre
C58 c ultivada e n ae ro bio sis e n me dio Y e n c o ndic io ne s de insufic ie nc ia de hie rro e n e l
e stado e stac io nario de c re c imie nto .
Pico Proteína MW
teórico KDa
MW observado
KDa
Score MASCOT
% de cobertura de secuencia
Péptidos asignados
L33
Atu0545 31525 33 164 22%
M.ASILTNNNAMAALSTLR.S R.SIASDLSTTQDR.I
K.VGSASDNAAYWSIATTMR.S K.ALGAVSDALGMGAAK.V
K.TVVSGFVR.D
Atu0543 32967 33 77 18%
K.LVTATEEGVDR.T R.SIGQNMESTQAR.V
M.TSIITNVAAMSALQTLR.S R.VGDASDNAAYWSIATTMR.S
L40 Atu3391 41790 38 55 15%
R.DVEVNVPVSHVILGEGR.Q K.ENPFQHVVGWR.D K.VGIPLVYVDFR.E
K.KPVVFVER.A K.RPAFTGVQAVK.D
L80
Atu2287 80668 80 92 19%
K.SANAAADTPLASQTTAEDIR.K R.VVTLIDNIPVPYFNNFAR.Q
R.IGSGALGGALVLR.T R.IGLTAER.Y
R.LTNNSLYIR.E K.DFIEQYTTSTTLFPGFGGR.G
R.NNVEISGVEAK.V K.DTDTNEFIR.T
R.IQAGVYNLFDR.K K.YWNGVGVR.D
R.DVNPNSVSTVNQPVDFYTEAGR.T
Atu3687 89479 80 60 15%
R.GASGNLTPSQALAAVLAGTGVQSR.F R.NATTLASTSSSIGIVNAEQISDGQIR.S
R.GLFDVEQVEVYR.G R.YENYNEFTHDFYYQVR.G R.ALLSYSFSHDNPAVR.D
K.ELTDTQTVGITYSQGFR.T K.YFVYNDNDIAATLGER.R
CAPÍTULO IV- Resultados
116
Anexo 4.2.2: Tabla c o n pro te ínas ide ntific adas po r Maldi-To f y PMF de c ultivo s
ae ró bic o s e n e stado e stac io nario de las c e pas C58 (pé ptido s XH) y aspD (pé ptido s SH)
c ultivadas e n me dio TY c o n e l ag re gado de 2,2dipiridil y 20 nM de he mo g lo bina .
Pico Proteína MW
teórico MW
observado Score
MASCOT
% de cobertura de
secuencia Péptidos asignados
XH35
Atu0543 32967 33 KDa 279
(MS/ MS) 17%
K.LVTATEEGVDR.T M.TSIITNVAAMSALQTLR.S
K.ALQTQQQLGVQALSIANSNSESILSLFR.-
Atu0545 31637 33 KDa 253
(MS/ MS) 26%
R.SIASDLSTTQDR.I K.VGSASDNAAYWSIATTMR.S K.ALGAVSDALGMGAAK.V
K.TVVSGFVR.D K.ALQTQQQLAIQALSIANSDSQNILSLFR.-
XH33 Atu0543 32967 33 KDa 83 26%
M.TSIITNVAAMSALQTLR.S R.SIGQNMESTQAR.V
R.VGDASDNAAYWSIATTMR.S K.LVTATEEGVDR.T
K.ALQTQQQLGVQALSIANSNSESILSLFR.-
XH38
Atu0543 32967 33 KDa 60 24%
M.TSIITNVAAMSALQTLR.S R.VGDASDNAAYWSIATTMR.S
K.VDTASAGMSSAIDVVK.E K.ALQTQQQLGVQALSIANSNSESILSLFR.-
Atu0545 31637 38 KDa 90 31%
M.ASILTNNNAMAALSTLR.S R.SIASDLSTTQDR.I
K.VGSASDNAAYWSIATTMR.S K.VQEEVSQLLDQLK.S
K.TVVSGFVR.D K.ALQTQQQLAIQALSIANSDSQNILSLFR.-
SH33
Atu0543 32967 33 KDa 303 26%
M.TSIITNVAAMSALQTLR.S R.SIGQNMESTQAR.V
R.VGDASDNAAYWSIATTMR.S K.LVTATEEGVDR.T
K.ALQTQQQLGVQALSIANSNSESILSLFR.-
Atu0545 31637 38 KDa 293 39%
M.ASILTNNNAMAALSTLR.S R.SIASDLSTTQDR.I
K.VGSASDNAAYWSIATTMR.S K.ALGAVSDALGMGAAK.V
K.VQEEVSQLLDQLK.S K.TVVSGFVR.D
R.IDLQSGFADK.L K.ALQTQQQLAIQALSIANSDSQNILSLFR.-
CAPÍTULO IV- Resultados
Anex
c o nd
ASDH
Pico
AXDH33
ASDH33
Espe
apro
que
pic o
Co lo
xo 4.2.3: Id
dic io ne s de
H) c ultivada
Proteína ypéptido
fragmentaen MS/ M
3
Atu3384
Atu0543
Atu0545
3
Atu0545
Atu0543
ectro 4.2.1:
o ximadame
se o btie ne
o s c o rre spo n
o nna , c o mu
de ntific ac ió
e mic ro ae ro
as e n me dio
y do S
MW teórico
4 25605
3 32967
5 31637
5 31637
3 32967
: Espe c tro
e nte 33 KDa
de l únic o f
nde n a flag
unic ac ió n p
ó n po r Ma
o fília e n las
o TY e n pre s
MW observado
33 KDa
33 KDa
33 KDa
35 KDa
35 KDa
o bte nido
a se c re tada
frag me nto g
ge linas que
e rso na l).
ldi-To f y P
s c e pas C5
e nc ia de 2,
Score MASCOT
c
se
----
314 (MS/ MS)
288 (MS/ MS)
113 (MS/ MS)
122 (MS/ MS)
e n la d
a po r la c e
g e ne rado p
e stán pre s
MF de las
58 (pé ptido
,2 dipiridilo y
% de cobertura
de ecuencia
----
30%
K.
39%
K.
21%
22%
dig e stió n tr
e pa C58. El
po r la dig e s
se nte s e n la
s pro te ínas
o s AXDH) y
y 20 nM de
Péptid
R.DLLD
K.LVTR.SIGQR.LVDA
M.TSIITNVR.VGDASD
ALQTQQQLGVM.ASILTNN
R.SIASK.VGSASDNK.ALGAVS
K.VQEEK.TV
R.IDLALQTQQQLAIQ
M.ASILTNNK.VGSASDN
K.SIGTSASFNK.TV
R.SIGQR.VGDASD
K.LVTK.VQER.IGL
R.LVDA
riptic a de
c írc ulo ro j
stió n triptic a
a mue stra (S
CAPÍT
se c re tada
aspD (Pé p
he mo g lo bi
os asignados
DLAVYQLAR.F
ATEEGVDR.T QNMESTQAR.V ADMNEESTR.L VAAMSALQTLR.NAAYWSIATTM
VQALSIANSNSENNAMAALSTLRSDLSTTQDR.I NAAYWSIATTMSDALGMGAAKEVSQLLDQLK.S VVSGFVR.D LQSGFADK.L QALSIANSDSQNNNAMAALSTLRNAAYWSIATTMGENWLVSSANA
VVSGFVR.D QNMESTQAR.V
NAAYWSIATTMATEEGVDR.T EEIGQLQK.Q LQEDFASK.L ADMNEESTR.L
la banda
o se ñala e
a de Hla , lo s
Silvia Mo re n
ULO IV- Resu
117
as e n
ptido s
na
.S MR.S ESILSLFR.- R.S
MR.S K.V
NILSLFR.- R.S
MR.S ATK.T
MR.S
a de
l pic o
s o tro s
no de
ultados
118
Anexo 4.2.4: Ide ntific ac ió n po r Maldi-To f y PMF de las pro te ínas e luídas e n la c o lumna de a finidad de he mina usando e l so bre nadante de A34 transc o njug ante pIJ7760 c ultivada e n me dio TY.
Pico Proteína MW
teórico MW
observado Score
MASCOT % de cobertura de
secuencia Péptidos asignados
AfH33 Atu3384 25695 33 KDa 74 4% R.DLLDLAVYQLAR.F
AfH35 Atu3384 25295 35 KDa 74 4% R.DLLDLAVYQLAR.F
CAPÍTULO IV- Resultados
119
CAPITULO IV: ROL DEL SISTEMA AspDE Y SU SUSTRATO, HLA, EN LA FISIOLOGIA DE
Agrobacterium tumefaciens
4.3 CONCLUSIONES Y DISCUSION
Lo s re sultado s de e ste c apítulo mue stran que Hla e s una pro te ína c o n ac tividad
de he mó fo ro , e s de c ir, una pro te ína e xtrac e lular que tie ne a finidad po r he mo . En
c o njunto , lo s re sultado s pre se ntado s hasta aho ra indic an que Hla se ría se c re tada po r
la translo c asa AspDE de un siste ma tipo I de se c re c ió n de pro te ínas para la c aptac ió n
de he mo e xtrac e lular. Dado que no se han ide ntific ado o rtó lo go s o pro te ínas
c arac te rizadas c o n una similitud sig nific a tiva , Hla re pre se ntaría una nue va familia de
he mó fo ro s. Lo s análisis in silic o de l c o nte xto ge né tic o (Capitulo III, Se c c ió n 3.2.4) junto
c o n lo s antec e de nte s de l siste ma sinté nic o Has (Capitulo III, Se c c ió n 3.2.1, Figura 3.2.1)
pe rmite n pro po ne r c o mo hipó te sis que e l po sib le re c e pto r de he mo HlaR (c o dific ado
río arriba de hla ) partic iparía e n la c aptac ió n de he mo , lue go de inte rac c io nar c o n e l
c o mple jo Hla-he mo , a travé s de un me c anismo similar a l de lo s he mó fo ro s de la familia
de HasA (Capitulo IV, Se c c ió n 4.1.3, Figura 4.1.2, Capitulo II, Se c c ió n 3.2.1, Fig ura 3.2.1).
La ho mo lo g ía de l siste ma AhuUV c o n siste mas de c aptac ió n de he mo y la c o e xpre sió n
de AhuB c o n Hla o bse rvada e n e l c o nte xto he te ró lo g o (Capitulo III, Se c c io ne s 3.2.5 y
3.2.6, fig uras 3.2.5 y 3.2.7 a y b ) pe rmite suge rir que e ste siste ma e staría invo luc rado e n
e l transpo rte de l he mo de sde e l pe riplasma hac ia e l c ito plasma (Figura 4.3.1).
Po r o tro lado , e l mo de lado mo le c ular de las pro te ínas pe riplasmátic as
aso c iadas a siste ma de c aptac ió n ABC AhuUV, AhuT (Atu3390) y AhuB (Atu3391)
usando e l pro g rama Phyre (http:/ / www.sbg .b io .ic .ac .uk/ ~phyre / ), mo stró que ambas
pro te ínas pre se ntan 100% de ho mo lo g ía e struc tura l c o n las pro te ínas pe riplasmátic as
de unió n a he mo , PhuT de P. ae rug ino sa y ShuT de Shige lla dyse nte riae . Estas so n o tras
e vide nc ias que apo yan la hipó te sis que e l c luste r hla e staría invo luc rado e n la
c aptac ió n de he mo e xtrac e lular.
la c e
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e nc ia de he
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2004). Sin e
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o do s.
ura 4.1.2: M
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dio e xtrac e
e pto r HlaR
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rac c ió n de
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re sió n de l
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c ie nc ia de
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t al., 2006, 2
para c o nfirm
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aptac ió n A
ho lo -Hla a
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as c o mo H
2007, Parro w
mar que la
rio ana lizar
o propuesto
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ma e l he mo
AhuUV para
c tiva a l sist
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CAPÍTULO
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9; Turne r e t
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O IV- Conclus
vo s ae ró bic
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maria de Hla
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al. 1998; Vi
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e lulare s po r
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120
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MI
cusión
121
Es po sib le que e xistan o tro s siste mas que c umplan c o n la func ió n de c aptar
he mo e n ae ro bio sis. Co mo se me nc io nó e n la se c c ió n 4.2.3 de e ste c apítulo , e n e l
me dio e xtrac e lular de c ultivo s de C58 e n insufic ie nc ia de hie rro (e stado e stac io nario y
ae ro bio sis) se de te c tó un po sib le re c e pto r de he mo c o dific ado po r e l o rf Atu2287 de l
c ro mo so ma c irc ular de Agro bac te rium. El análisis in silic o mo stro que Atu2287
(de pts.washingto n.e du/ agro / ) pre se nta 48% de ide ntidad y 64% de similitud de
se c ue nc ia amino ac ídic a c o n e l re c e pto r de he mo ShmR de S. me lilo ti (Battisto ni e t al.,
2002). El análisis de l c o nte xto g e né tic o indic a que se tra taría de un re c e pto r hué rfano
sin ge ne s adyac e nte s aso c iado s a la c aptac ió n de hie rro o he mo (no se mue stra ). No
ide ntific aro n o tro s pro bab le s re c e pto re s de he mo ade más de HlaR y Atu2287. El
re c e pto r Atu2287 po dría c umplir la func ió n de c aptar he mo e n ae ro bio sis.
Po r análisis in silic o se de te rminó que e l ge no ma de A. tume fac ie ns a lbe rga un
pro bable re c e pto r hué rfano de fe rri-side ró fo ro s, c o dific ado po r Atu3916 e n e l
c ro mo so ma line al y o tro s c uatro po sib le s g rupo s de ge ne s invo luc rado s e n la
c aptac ió n de hie rro (no se mue stra). El prime ro de e llo s (de l c ro mo so ma line a l) e staría
invo luc rado e n la c aptac ió n de side ró fo ro s de la familia de hidro ximato s y e staría
fo rmado po r un re c e pto r de me mbrana e xte rna Atu4022 y un siste ma de c aptac ió n
ABC c o dific ado po r Atu4023 (PBP), Atu4024 (TMD) y Atu4025 (NBD). El se g undo e stá
a lbe rg ado po r e l plásmido AT y c o dific ado po r ge ne s de un re c e pto r de hie rro -
dic itrato Atu5311 y un siste ma ABC [Atu5312 (PBP), Atu5314 (TMD), Atu5315 (TMD),
Atu5316 (NBD)]. Esta re g ió n también c o dific a : una pro te ína de inte rac c ió n c o n
side ró fo ro s pe rte ne c ie nte a la familia de fe rri-re duc tasas, Atu5313, un siste ma ECF
σ (Atu5309) y un ECF anti σ (Atu5310) y pro te ínas c o n ho mo lo g ía a c itrato sintasas, po r
lo que se pue de hipo te tizar que e ste siste ma e staría invo luc rado e n la c aptac ió n de
hie rro a partir de c itrato fé rric o . El te rc e r siste ma po dría e star invo luc rado e n la
c aptac ió n de fe rric ro mo y e staría fo rmado po r un re c e pto r de fe rric ro mo Atu0409 y un
siste ma de c aptac ió n ABC c o dific ado po r Atu0408 (TMD), Atu0407 (PBP) y Atu0406
(NBD) de l c ro mo so ma c irc ular. Finalme nte , e l c uarto sistema (de l c ro mo so ma line al)
e staría fo rmado po r un re c e pto r (Atu3687), y un siste ma de c aptac ió n ABC c o dific ado
po r Atu3688 (TMD), Atu3689 (TMD), Atu3690 (TMD) y Atu3691 (NBD). Este lo c us inc luiría
un siste ma de ECF σ (Atu3692) y ECF anti σ (Atu3693). Río arriba de e ste o pe ró n se
e nc ue ntran pro te ínas invo luc radas e n la sínte sis de side ró fo ro s po r lo que e ste siste ma
e staría invo luc rado e n la c aptac ió n de hie rro e n e l e stado Fe 3+. El re c e pto r Atu3687
tambié n fue de te c tado e n e l me dio e xtrac e lular de c ultivo s de C58 e n e l e stado
e stac io nario e n insufic ie nc ia de hie rro y ae ro b io sis. Este análisis indic a que e xiste n o tro s
lo c i que po drían e star implic ado s a lte rnativame nte e n la c aptac ió n de hie rro de
dife re nte s fue nte s de hie rro e n ae ro b io sis.
CAPÍTULO IV- Conclusiones y Discusión
122
Co mo ya se me nc io nó , só lo un lo c us e n e l ge no ma de A. tume fac ie ns C58
c o dific a un siste ma To nB-ExbB-ExbD, que se ría e l re spo nsable de e ne rg izar lo s pro c e so s
de transpo rte a travé s de la me mbrana e xte rna (Capitulo III, Se c c ió n 3.2.1), inc luido e l
que invo luc ra a l lo c us hla . Po r o tro lado , e xiste so lo un ge n de la familia de To lC
(Capitulo III, Se c c ió n 3.2.1) que se ría c apaz de inte rac c io nar c o n la traslo c asa AspDE.
Esto e s e n c o ntraste c o n lo que o c urre e n Se rratia , Pse udo mo nas y Ye rsinia, que
c o ntie ne n siste mas e spe c ífic o s para más de un siste ma de transpo rte .
Hla fue de te c tada e n e l me dio e xtrac e lular de c ultivo s de Agro bac te rium
tume fac ie ns C58 o bte nido s e n c o ndic io ne s mic ro ae ró filas e n insufic ie nc ia de hie rro .
Las e vide nc ias b ib lio gráfic as mue stran que la vía de de g radac ió n de l he mo e s
c ata lizada po r mo no o xige nasas de pe ndie nte s de la pre se nc ia de o xíg e no (To ng y
Guo , 2009; Mate ra e t al., 1997). No se han de sc ripto hasta la fe c ha e nzimas c apac e s
de c a ta lizar e sta re ac c ió n e n fo rma anae ró bic a . A pe sar de e llo , so n nume ro so s lo s
trabajo s que se han public ado de sc rib ie ndo que e l he mo e s fue nte de hie rro para
bac te rias e stric tame nte anae ró bic as c o mo Hae mo phyllus y Barto ne lla (Mo rto n e t al.,
2006; Parro w e t al., 2009).
S. me lilo ti a lbe rg a do s po sib le s re c e pto re s de he mo (SMc 02726 y SMc 04205). El
pro duc to de SMc 04205 e s ho mó lo go y sinté nic o a HlaR (Ve r Capitulo III, Se c c ió n 3.2.2,
Fig ura 3.2.2). Se ha de sc ripto que e n c o ndic io ne s limitante s de hie rro , e n pre se nc ia de
he mina c o mo fue nte de hie rro y e n c o ndic io ne s ae ró bic as, se induc e SMc 02726
(ShmR) que se c o mpo rta c o mo una pro te ína que une he mina (Battisto ni e t al., 2002). El
o rtó lo go y sinté nic o a HlaR no pudo se r de te c tado e n e stas c o ndic io ne s. Estudio s
po ste rio re s pe rmitie ro n e stab le c e r que ShmR e s un re c e pto r e se nc ia l para la c aptac ió n
de hie rro a partir de he mo , he mo g lo bina y le g -he mo g lo bina e n c o ndic io ne s de vida
libre (ae ró b ic as). Más aún, la c e pa mutante shmR fue c apaz de no dular y fijar
nitró g e no e n fo rma similar a la c e pa silve stre indic ando que ShmR no e s re que rido
c o mo re c e pto r de he mo o he mo -pro te ínas de ntro de l nó dulo e n c o ndic io ne s
anae ró bic as/ mic ro ae ró filas (Amare lle e t al., 2008). Po dría hipo te tizarse que SMc 04205
(ho mo lo go y sinté nic o a HlaR) se ría e l re c e pto r func io nal de he mo (o pro te ínas que
c o ntie ne n he mo ) e n c o ndic io ne s anae ró bic as o mic ro ae ró filas, de mane ra similar lo
que se pro po ne e n e sta te sis para HlaR.
En insufic ie nc ia de hie rro y pre se nc ia de he mo g lo bina se o bse rvó un pe rfil
dife re nte de flag e linas e n la c e pa silve stre C58 c o mparado c o n la mutante aspD
(Figura 4.2.4 c ). Este c ambio e n e l pe rfil de flage linas se de te c ta e n la c e pa silve stre
C58 y no se o bse rva e n la c e pa mutante aspD (c o mparar figuras 4.2.4 a , b y c ). La
o bse rvac ió n de e xpre sió n dife re nc ia l de flage linas e n e l c o nte xto he te ró lo g o de
Rhizo bium, do nde la e xpre sió n de Hla e s mayo ritaria (Capitulo II, Se c c ió n 2.2.4, Figura
CAPÍTULO IV- Conclusiones y Discusión
123
2.2.7, Capítulo III, Se c c io ne s 3.2.5, 3.2.6 y 3.2.7, Figuras 3.2.5, 3.2.7 (a y b ) y 3.2.8), po dría
e star re lac io nada c o n e stas dife re nc ias e n e l pe rfil de flage linas e ntre la mutante aspD
y la c e pa silve stre C58. Es po sib le que , de a lguna mane ra , la so bre -e xpre sió n o la
ause nc ia de Hla (pe ro e n de te rminadas c o ndic io ne s de c ultivo e n e l c aso de A.
tume fac ie ns) te nga un e fe c to indire c to (a travé s de a lg ún me c anismo de re gulac ió n
supe rio r o g lo bal) so bre la e xpre sió n de flage linas. En S. me lilo ti, se de sc rib ió que e l
me c anismo de quó rum se nsing re g ula la e xpre sió n de flage linas y e n c o nse c ue nc ia la
mo vilidad bac te riana a travé s de lo s re gulado re s de quo rum se nsing ExpR y SinI
(Ho ang e t al., 2004; 2008). Curio same nte , e l análisis transc riptó mic o mo stró que ExpR y
SinI re gulan la e xpre sió n de l ge n ho mó lo go y sinté nic o a Hla , SMc 04206, ade más de l
re c e pto r ho mó lo go a HlaR (SMc 04205) y de l ge n ho mó lo go a aspD, SMc 04207 (Guric h
y Go nzále z, 2009) a pe sar de que SMc 04205 pre viame nte había mo strado no
e xpre sarse e n c o ndic io ne s de vida libre po r Battisto ni e t al. y Amare lle e t al. En varias
e spe c ie s bac te rianas se ha o bse rvado que mutante s e n e l me c anismo de l quó rum
se nsing se ve n a fe c tadas e n e l me tabo lismo de l hie rro o he mo (Wang e t al., 2005; Fo ng
e t al., 2003; Lille y y Bassle r, 2000; Wu e t al., 2009; Ho ang e t al., 2004; Are valo -Fe rro e t al.,
2003; Jame s e t al., 2006). Po dría hipo te tizarse que la e xpre sió n de Hla y de flag e linas
re spo nde n a a lg ún re gulado r g lo ba l e n c o mún de quó rum se nsing e n A. tume fac ie ns.
En P. ae rug ino sa la e xpre sió n de l he mó fo ro HasA (que no e s ho mó lo g o pe ro e s
sinté nic o a Hla ) e s re g ulado po r un me c anismo de quo rum se nsing (Are valo -Fe rro e t al.,
2003).
La se c re c ió n de Hla mo stro re spo nde r a la insufic ie nc ia de o xíge no e n
Agro bac te rium (Figura 4.2.6 de e ste c apítulo ). Se ha de sc ripto que re gulado re s de
anae ro bio sis c o mo Arc B re gulan e n c o njunto c o n e l re gulado r de quó rum se nsing LuxS
la e xpre sió n de ge ne s de c aptac ió n de hie rro y de he mo e n Ac tino bac illus
ac tino myc e te mc o mitans (Fo ng e t al., 2003). Po r o tro lado , se ha re po rtado que e l
re gulado r de anae ro b io sis Arc A re prime anae ró bic ame nte la e xpre sió n de l re g ulado r
Fur y, e n c o nse c ue nc ia , de g e ne s de c aptac ió n de hie rro y he mo (Bo ule tte y Payne ,
2007). En Shige lla re gulado re s de la familia de Arc A y Fnr han mo strado influe nc iar e l
me tabo lismo de l hie rro y he mo (Wyc ko ff e t al., 2009; Bo ule tte y Payne , 2007). Es po sib le
que a lgún siste ma de re gulac ió n de re spue sta a la anae ro bio sis a fe c te la e xpre sió n de l
re gulado r RirA y, e n c o nse c ue nc ia , la se c re c ió n de Hla e n Ag ro bac te rium. Otra
po sibilidad e s que e l lo c us hla e sté so me tido a una re gulac ió n dire c ta induc ida po r
mic ro e ro fília o anae ro bio sis. Curio same nte , e l pro g rama BPROM de So fbe rry
(linux1.so ftbe rry.c o m/ be rry.phtml) ide ntific ó po sib le s mo tivo s de re c o no c imie nto de l
re gulado r NarL y de l re gulado r NarP (100% de ho mo lo g ía ) (Ste wart, 1994; Ste wart e t
al., 2003; Unde n y Bo ngae rts, 1997) e n la re g ió n pro mo to ra de hla (-10 y -35) (Figura
4.3.2). Esto s re gulado re s so n re spo nsable s de la re g ulac ió n de la re spirac ió n a lte rnativa
CAPÍTULO IV- Conclusiones y Discusión
124
usando nitró ge no c o mo ac e pto r final de e le c tro ne s e n E. c o li (Ove rto n e t al.,
2006). En Salmo ne lla e nté ric a , la e xpre sió n de lo s re gulado re s NarL y NarP mo stró e star,
ade más, bajo e l c o ntro l de l re gulado r g lo bal de re spue sta a hie rro Fur (Te ixidó e t a l.,
2010). Se ha pro pue sto que Agro bac te rium albe rgaría re gulado re s Nar func io nale s que
re c o no c e rían dic ho s mo tivo s c o nse nso (Le e e t al., 2003). En e fe c to , un análisis c o n e l
pro grama BLAST mue stra que e l g e no ma de A. tume fac ie ns c o ntie ne a l ge n Atu5267
que pre se nta 60% de similitud de se c ue nc ia nuc le o tídic a c o n narL de E. c o li y a l ge n
Atu0484 que pre se nta 54% de similitud de se c ue nc ia nuc le o tídic a c o n narP de E. c o li
(no se mue stra).
tgc agc c c g tc c c gg agatg aaac gc c ttc gc tac aggac gaaggtacctctataggc c agtaaaggagt
ac ac c tatggc tac c ac aattc aac tgac gc agtc ttc c tccgacctg atc ggttac c tc aac ggttggac g
ag c ggtttc gg ttc g ac c tatgg tg c g ttc tac gac g c tc agac c agc tc tc tc gc c ac c ac c ac c atc g at
c c g aac ac gac c tatg aggc g tgggg c gatggc ag c tc c gg c ggc aagggc atc gtc atgagc ggc g
c tc tgc aatac tc c c agggc aac c tgac gggttc gg tc gac ag c atc g ttc tgggc ac c ggc tac ag c c a
g tc c ac c agc ggc atc gc gg tc agc c ag c aggaac tgc tgatc gac c c tgac agc gc c tattc gc tggc
c gg tgc c c gc g atc ttc tc gatc tc gc c g tc tac c ag c ttgc c c gtttc gg c tc gc tgg c c gg c ttc tatgatta
tttc gc ggc c ac c ggc ac ggtgatc gaggatac gg c tgc c tc c aac ac c c tg ac c ggc tttgc c ggc gc
ggatac c ttc g tattc tc c ggc ggc aac gatg tc g tgc aggc c ggac c gac c ggaac c tac ggc tatc ag
gac ggc ac ggatac gc ttgatg tc tc ggc c tg ggg c gc aac ttc g gtgg ac g atttg ttg tggtataatgata
ac gg aaatgc c g ttatc c tttc c gc aac agac ac g tc c g tc tc c atc ac gc tg aatgg c g tc gatgc aaat
g tac tc g ac gc atc gg ac ttc attttc gc c agc gc attggc gc ttg c c gc g
Figura 4.3.2: Secuencia nucleotídica de Hla. Se inc luye n 76 pb río arriba de l inic io de
transc ripc ió n de Hla . El c o dó n de inic iac ió n de transc ripc ió n se re sa lta c o n le tras
ro jas, la fle c ha ro ja seña la la dire c c ió n de la transc ripc ió n. Las se c ue nc ias 100%
ho mo lo g as a lo s sitio s de re c o no c imie nto de sc ripto s e n E. c o li se e nc ue ntran
subrayadas y se de ta lla e l tipo de re g ulado r arriba de la se c ue nc ia subrayada .
NarP
NarL
AraC
CAPÍTULO IV- Conclusiones y Discusión
125
La c are nc ia de hie rro pro vo c a dire c tame nte una c are nc ia de he mo . Si b ie n
Agro bac te rium c o dific a e n su ge no ma lo s g e ne s ne c e sario s para la sínte sis de he mo
e n c o ndic io ne s ae ró bic as y anae ró bic as, la insufic ie nc ia de hie rro no pe rmite que e sta
vía anabó lic a se c o nc re te . Po r o tro lado , la de manda de g rupo s he mo e n c o ndic io ne s
de mic ro ae ro fília / anae ro bio sis e s muy a lta . El he mo e s re que rido c o mo c o fac to r de lo s
c ito c ro mo s invo luc rado s e n e l pro c e so de re spirac ió n a lte rnativa , que se ac tiva e n
c o ndic io ne s de anae ro bio sis y e n c o ndic io ne s de mic ro ae ro fília c o mo so sté n de la
re spirac ió n a lte rnativa . El he mo e s re que rido , ade más, c o mo g rupo pro sté tic o e n
e nzimas invo luc radas e n la de to xific ac ió n de NO (g lo b inas y he mo g lo b inas) g e ne rado
durante la re spirac ió n usando nitrato c o mo ac e pto r de e le c tro ne s y de e spe c ie s
re ac tivas de o xíg e no ge ne radas durante la re spirac ió n mic ro ae ró bic a (Bo lling e r e t al.,
2001; Fre y y Kallio , 2003, 2005; Po o le , Sudhamsu y Crane , 2009). Una po sib le func ió n de
Hla po dría se r la de pro ve e r de he mo e n fo rma e xó ge na dada la a lta de manda de
he mo e n c o ndic io ne s anae ró bic as o mic ro ae ró filas y la limitac ió n nutric io nal para
sinte tizarlo de no vo . Se ha de sc ripto e n traba jo s transc riptó mic o s y pro te ó mic o s que
e studian e l me c anismo de quó rum se nsing y la re spue sta a mic ro ae ro fília / anae ro bio sis
que la e xpre sió n de he mó fo ro s e s a fe c tada po r re gulado re s de e sto s me c anismo s
(Are va lo -Fe rro e t al., 2003; Wyc ko ff e t al., 2009; Bo ule tte y Payne , 2007).
CAPÍTULO IV- Conclusiones y Discusión
CAPÍTULO V:
OTROS FENOTIPOS ASOCIADOS A LA
MUTACIÓN aspD.
127
CAPITULO IV: OTROS FENOTIPOS ASOCIADOS A LA MUTACION aspD.
5.1 INTRODUCCIÓN
Se han de sc ripto nume ro so s fe no tipo s aso c iado s a las mutac io ne s que a fe c tan
aspe c to s de la ho me o stasis de l hie rro o e l he mo . Esto s fe no tipo s no sue le n e star
apare nte me nte re lac io nado s e ntre sí, ni c o n e l me tabo lismo de l hie rro / he mo . Se sabe
que e stas mutac io ne s pre se ntan e fe c to s ple io tró pic o s de bido a lo s nume ro so s e ve nto s
c e lulare s e n lo s que e sto s c o fac to re s partic ipan. Se ha suge rido e l té rmino “ fe rrimo nas”
para las dife re nte s fue nte s de hie rro ya que re pre se ntan se ña le s químic as que
de se nc adenan nume ro so s pro c e so s fisio ló g ic o s no re lac io nado s e ntre sí (Bric kman y
Armstro ng , 2009).
Al se r e l hie rro un nutrie nte e se nc ia l, su insufic ie nc ia pro vo c a e n muc has
bac te rias una re duc c ió n e n la ve lo c idad de c re c imie nto c o n re spe c to a la c o ndic ió n
de sufic ie nc ia de hie rro (Ca lve r e t al., 1979; Sig e l y Payne , 1982; Hartmann y Braun,
1981). Las mutac io ne s que a fe c tan dire c ta o indire c tame nte la c aptac ió n de
hie rro / he mo se manifie stan c o n una me no r tasa o ause nc ia de c re c imie nto re spe c to a
la c e pa silve stre e n c o ndic ió n de insufic ie nc ia de hie rro . En c ambio , e n c o ndic io ne s de
sufic ie nc ia de hie rro e ste e fe c to no se o bse rva (Chao e t a l., 2005; We xle r e t al., 1998;
Nie nabe r e t al., 2001). La c o nc e ntrac ió n de hie rro e xtrac e lular influe nc ia nume ro sas
vías me tabó lic as apare nte me nte inc o ne xas. Lo s aná lisis transc riptó mic o s y
pro te ó mic o s re a lizado s e n lo s último s año s mue stran que e l re g uló n de lo s re gulado re s
de re spue sta a hie rro no so lo e s bastante amplio , sino que las pro te ínas re g uladas so n
muy dive rsas (Chao e t al., 2005; Pie pe r e t al., 2010).
Se ha de sc ripto la influe nc ia de la c o nc e ntrac ió n de hie rro o he mo e n
nume ro so s pro c e so s fisio ló g ic o s bac te riano s apare nteme nte inc o ne xo s c o n e l
me tabo lismo de l hie rro o he mo . Co mo e je mplo s, la c o nc e ntrac ió n e xtrac e lular de
hie rro a fe c tó e l pro c e so de de snitrific ac ió n (To yo fuku e t al., 2008), la fo rmac ió n de
po lisac árido c apsular e n la supe rfic ie c e lular y la se c re c ió n de e xo pro te ínas e n P.
ae rug ino sa (Kim e t al., 2003). La c o nc e ntrac ió n e xtrac e lular de hie rro pue de , ade más,
influe nc iar e l c re c imie nto bac te riano , la mo vilidad, la fo rmac ió n de b io film, la
e xpre sió n de pro te ínas flage lare s y pro te ínas de c ito c ro mo s (Og le sby e t al., 2008; Dulla
e t al., 2010; Chao e t al., 2005; Wang e t al., 2010). Afe c ta ade más pro c e so s c o mo la
virule nc ia e n bac te rias pató ge nas, la fo to sínte sis, la simbio sis y la e xpre sió n de e nzimas
invo luc radas e n e l me tabo lismo bac te riano (Pie pe r e t al., 2010; Liu e t al., 2010, Xing e t
a l., 2007; Wilks y Burkhard, 2006; Me truc c io e t al., 2009; To dd e t. al., 2005). Po r su parte ,
la c o nc e ntrac ió n e xtrac e lular de he mo a fe c tó e l pro c e so de re spirac ió n ae ró bic a o
128
alte rnativa e n nume ro sas e spe c ie s bac te rianas c o mo Lac to bac illus (Bro o ijmans e t al.,
2008; Pe de rse n e t al., 2008), Hae mo phillus (Whitby e t al., 2009) y Stre pto c o c c us
(Yamamo to e t al., 2006; Yamamo to e t al., 2005) y E. c o li (Ric hard-Fo g al e t al., 2007).
Así c o mo dife re nte s mutac io ne s que a lte ran la ho me o stasis de l hie rro o e l he mo
influye n so bre dive rso s aspe c to s fisio ló g ic o s bac te riano s, o tras mutac io ne s e n vías
me tabó lic as apare nte me nte no re lac io nadas c o n la ho me o stasis de l hie rro a fe c tan la
re gulac ió n o c aptac ió n de hie rro / he mo . Po r e je mplo , la inac tivac ió n de l siste ma de
do s c o mpo ne nte s Fe uPQ, re lac io nado c o n la b io sínte sis de c ito c ro mo s, a fe c tó lo s
me c anismo s de c aptac ió n de hie rro e n Rhizo b ium (Ye o man e t al., 1997). Po r e l o tro
lado , mutante s e n la mo vilidad mo straro n un fe no tipo a lte rado de c aptac ió n de hie rro
y he mo e n Sino rhizo bium (No ga le s e t al., 2010).
Mutac io ne s que a fe c tan la ho me o stasis de la me mbrana tambié n influe nc ian
la c aptac ió n de hie rro e n V. c ho le rae y A. tume fac ie ns (Siko ra e t al., 2009; Klüse ne r e t
al., 2010). Re c iente me nte , Klüse ne r e t al. o bse rvaro n e xpre sió n dife re nc ia l de un subse t
(13%) de pro te ínas, e ntre las c uale s se e nc ue ntran a lgunas invo luc radas e n la
c aptac ió n de hie rro y he mo , e n re spue sta a la ause nc ia de fo sfatidic o lina (PC) e n la
me mbrana de A. tume fac ie ns (Klüse ne r e t al., 2010). Lo s auto re s pro po ne n un mo de lo
de re gulac ió n a nive l de e stabilidad de mARN me diada de lo s ge ne s AhuB, HlaR y
HlaS. Hasta la fe c ha la re g ulac ió n de e ste me c anismo e n Agro bac te rium no ha sido
de sc ripta , sin e mbargo , e n E. c o li e s me diada po r un pe que ño ARN (sARN) no
c o dific ante llamado RhyB (90 nuc le ó tido s). RhyB e je rc e su e fe c to re gulato rio a nive l
po stransc ripc io nal, tie ne una se c ue nc ia c o mple me ntaria a lo s mARNs b lanc o , de e sta
mane ra se apare a fo rmando un ARN do ble c ade na que e s de g radado . (Massé y
Go tte sman, 2002; Massé e t al., 2003). Este tipo de re gulac ió n e stá c o nse rvado e n varias
e spe c ie s bac te rianas, e ntre e llas E. c o li, P. ae rug ino sa , Ne isse ria , S. dyse nte riae y V.
Cho le rae (Wilde rman e t al., 2004; Murphy y Payne , 2007; Duc e y e t al., 2009; Davis e t al.,
2005; Me truc c io e t al., 2009). En P. ae rug ino sa se e nc o ntraro n do s sRNAs, c asi idé ntic o s,
llamado s PrrF. Ade más de lo s ge ne s de a lmac e namie nto de hie rro , lo s PrrFs reg ulan la
re spirac ió n ae ró bic a y anae ró bic a (Vasil, 2007). En V. c ho le rae e l re guló n de RhyB
inc luye g e ne s tie ne n que ve r c o n la mo vilidad, quimio táxis y fo rmac ió n de b io film,
ade más de po rinas de me mbrana e xte rna , siste mas de transpo rte de hie rro y pro te ínas
que c o ntie ne n he mo o c luste rs de hie rro -azufre (Me y e t al., 2005).
Klüse ne r e t al. o bse rvaro n la e xpre sió n de Atu3387 (HlaI) e n re spue sta a la
ause nc ia de PC e n las me mbranas de Agro bac te rium. HlaI c o dific a un ECF σ y fue
ana lizado e n lo s c apítulo s ante rio res. Lo s siste mas fo rmado s po r ECF σ y anti-ECF σ han
mo strado e star invo luc rado s e n nume ro so s pro c e so s fisio ló g ic o s bac te riano s c o mo e l
CAPÍTULO V- Introducción
129
mo nito re o y re spue sta adaptativa a c o ndic io ne s ambie nta le s, virule nc ia , mo vilidad y
transpo rte de io ne s me tá lic o s (Missiakas y Raina , 1998). So n c apac e s de transduc ir una
se ñal de sde la supe rfic ie c e lular hac ia e l c ito plasma (Visc a e t al., 2002; Llamas e t al.,
2008, Po tvin e t al., 2008).
Es po sib le que HlaI re spo nda dire c tame nte o indire c tame nte (a travé s de
sARN) a dive rsas se ñale s ambie nta le s mo dulando la e xpre sió n de g e ne s de l c luste r hla
inc luido hlaR.
CAPÍTULO V- Introducción
130
5.1.1 Objetivos específicos
Estudiar e l impac to de la mutac ió n aspD e n la fisio lo g ía de A. tume fac ie ns
Estudiar e l impac to de la mutac ió n aspD e n la virule nc ia de A. tume fac ie ns
131
CAPITULO V: OTROS FENOTIPOS ASOCIADOS A LA MUTACION aspD
5.2 RESULTADOS
Co mo se me nc io nó , las mutac io ne s que a fe c tan e l me tabo lismo de l hie rro o
de l he mo c o nfie re n fe no tipo s ple io tró pic o s. La mutante aspD pre se ntó a lguno s
fe no tipo s de pe ndie nte s de la c o nc e ntrac ión de hie rro e xtrac e lular y o tro s que se
manife staro n e n fo rma c o nstitutiva .
5.2.1 Crecimiento.
Co n e l o b je tivo de e studiar si la mutac ió n aspD a fe c ta e l c re c imie nto
de pe ndie nte de la c o nc e ntrac ió n de hie rro e n Agro bac te rium se re a lizaro n c urvas de
c re c imie nto midiendo la DO de c ultivo s ae ró bic o s c o n ag itac ió n de la c e pa silve stre
C58 y de la c e pa mutante aspD c ultivadas e n me dio Y mo dific ado para
Agro bac te rium (ve r mate ria le s y mé to do s)(Fig ura 5.2.1).
Se o bse rvó que la c e pa mutante aspD pre se nta me no re s va lo re s de de nsidad
ó ptic a (DO) c o n re spe c to a la c e pa silve stre iso gé nic a C58 e n c ultivo s c o n sufic ie nc ia
de hie rro . Esta dife re nc ia tie nde a minimizarse a las 24 hs de c ultivo do nde la dife re nc ia
de DO o bse rvada para las do s c e pas e s de so lo 0,1 unidad (Figura 5.2.1 a ). Sin
e mbargo , la mutante aspD auto agre ga e n c ultivo s líquido s, e státic o s o c o n ag itac ió n.
Esta auto agre g ac ió n se o bse rva e n fo rma inde pe ndiente de la c o nc e ntrac ió n de
hie rro e xtrac e lular (e ste fe no tipo se rá analizado e n las sig uie nte s se c c io ne s). La
auto agre gac ió n po dría pro vo c ar una sube stimac ió n c o nside rable e n la DO me dida
de l c ultivo líquido .
a-
Crecimiento en medio Y (m) con 0,123 mM de FeCl3 (suficiencia de hierro)
132
En c ultivo s c o n insufic ie nc ia de hie rro la c e pa silve stre C58 disminuye
c o nside rable me nte su c re c imie nto ; e ste e fe c to pare c e no o bse rvarse e n la mutante
aspD (Fig ura 5.2.1 b ).
La c e pa silve stre C58 re spo nde a la insufic ie nc ia de hie rro disminuye ndo su
c re c imie nto c o mo se ha de sc ripto e n o tras e spe c ie s bac te rianas. El e fe c to de la
auto agre gac ió n e n la mutante aspD e n ambas c o ndic io ne s dific ulta la inte rpre tac ió n
de las me didas de DO e n la c e pa mutante aspD.
El c re c imie nto bac te riano e n c o ndic io ne s de insufic ie nc ia de hie rro sue le
re staurarse c o n e l agre gado de l sustrato e spe c ífic o de l siste ma de c aptac ió n func io nal
(Lé to ffé e t al., 1998; Mo rto n y Williams, 1990). Co mo Hla pre se ntó ac tividad de
he mó fo ro (ve r Capitulo IV, Se c c ió n 4.2.6), se e va luó si la mutante aspD e s más se nsible
que la c e pa silve stre a la ause nc ia de hie rro , ag re g ando he mo g lo bina c o mo únic a
fue nte de hie rro . Para minimizar e l e rro r que po dría g e ne rar e l fe no tipo de
auto agre gac ió n c o nstitutiva de la c e pa aspD e l e nsayo se re a lizó e n plac as e n me dio
b-
Figura 5.2.1: Crecimiento de la cepa aspD en comparación con la cepa silvestre
isogénica C58 en cultivos en medio minimo Y modificado para Agrobacterium con
agitación. a- Cre c imiento e n me dio mínimo c o n 0,123 mM de Fe Cl3 agre gado
(sufic ie nc ia de hie rro ). b- Cre c imie nto e n me dio mínimo sin Fe Cl3 ag re gado
(insufic ie nc ia de hie rro ). Las c urvas se re a lizaro n po r c uadruplic ado . El análisis
e stadístic o se re a lizó c o n un ANOVA 2 fac to re s, y Po st Te st Bo nfe rro ni. * p<0.5,
**p<0.01, ***p<0.001
Crecimiento en medio Y (m) sin FeCl3 agregado (insuficiencia de hierro)
CAPÍTULO V- Resultados
133
se misó lido (agar 1.5%). Se se mbraro n diluc io ne s se riadas a l dé c imo de un c ultivo e n
fase e stac io naria de l c re c imie nto de la c e pa silve stre C58 y la c e pa mutante aspD e n
plac as c o n me dio ric o TY, e n e l mismo me dio c o n e l agre gado de l que lante 2,2
dipiridilo o e n me dio ric o TY c o n e l ag re g ado de 2,2 dipiridilo y 20 nM he mo g lo b ina
c o mo fue nte de hie rro (Figura 5.2.2).
Se o bse rvó que e n me dio ric o TY la mutante aspD pre se nta un c re c imie nto
lig e rame nte disminuido re spe c to a la c e pa silve stre C58. Po r o tro lado , la mutante
aspD pare c e se r un po c o más se nsib le a la insufic ie nc ia de hie rro e n c o mparac ió n c o n
la c e pa silve stre . Esta dife re nc ia e s lige rame nte mayo r e n insufic ie nc ia de hie rro y
pre se nc ia de he mo g lo b ina 20 nM, lo c ual po dría indic ar que la c e pa aspD e s más
se nsib le a e stas c o ndic io ne s que la c e pa silve stre . Sin e mbarg o , la c epa silve stre no
re staura su c re c imie nto a lo s nive le s o bse rvado s e n sufic ie nc ia de hie rro c uando se
ag re ga hemo c o mo fue nte de hie rro . Una po sib le inte rpre tac ió n e s que e n
Agro bac te rium e l he mo no e s utilizado e n fo rma e fic iente c o mo fue nte de hie rro e n las
c o ndic io ne s e studiadas.
5.2.2 Fenotipos de superficie bacteriana
Nume ro so s traba jo s han sido pub lic ado s e n lo s último s año s que mue stran que
lo s nive le s de hie rro o he mo influye n so bre dive rso s pro c e so s c o mo la fo rmac ió n de
Figura 5.2.2: Ensayo de crecimiento de las cepas silvestre C58 y la mutante aspD
usando hemoglobina como unica fuente de hierro extracelular. Se utilizaro n
diluc io ne s se riadas a l dé c imo de las c e pas silvestre C58 y la c e pa mutante aspD.
CAPÍTULO V- Resultados
bio fil
ae ru
hie rro
muta
re lac
mínim
a) fo
iso g é
Ag ro
que la
c o m
o bse
e n m
e s re
e n la
e t a
Ag ro
pe líc
a
Fig
iso
me
μM
m e n bac t
g ino sa y e n
o induc e la
ac ió n que a
c io nada a la
Co mo ya
mo Y mo difi
o rma a g re g
é nic a C58.
o bac te rium)
ante 2,2 di
ple me ntar
e rvó que la
me dio Y o TY
spo nsable d
Se ha de
a inte rfase a
al, 2006). S
o bac te rium
c ula de nsa e
aas
a- Me dio ric
gura 5.2.3: A
ogénica C5
e dio mínimo
M Fe Cl3). Y (m
te rias (Olc za
n Burkho lde
a ag re gac
a fe c te la ho
a fo rmac ió n
a se me nc
ic ado para
g ado s en c
Esto s ag re g
) sin hie rr
piridilo (no
e l fe no tip
c e pa transc
Y c o n o sin
de dic ho fe
e sc ripto qu
aire -líquido
Se o bse rvó
e n sufic ie n
e n la inte rf
- spD
c o TY (sufic i
Autoagrega
8. a- Cultiv
o Y mo dific
m): Me dio Y
ak e t al., 20
e ria c e no c e
c ió n bac te r
o me o stasis
n de b io film
io nó , se o b
Ag ro bac te
c ultivo s ae ró
g ado s se o
o ag re g ad
se mue stra
o de auto
c o njug ante
insufic ie nc i
e no tipo (no
e e l hie rro
de vario s e
ó que e n
c ia de hie r
fase a ire -liq
Me dio ric oTY C58
ie nc ia de h
ción de la c
vo s e n me d
c ado para
Y mo dific ad
010; O’ May
e pac ia se h
riana (Be rlu
de l he mo (
ms.
bse rvó que
e rium (no se
ó b ic o s que
o bse rvan ta
do (Fig ura
a ). Se analiz
o ag re g ac ió
e aspD pIJ77
ia de hie rro
se mue stra )
influe nc ia p
e spe c ie s de
me dio m
rro (0,123 m
uido c uand
o a
ie rro )
cepa aspD
dio ric o TY
Ag ro bac te
do para Agr
y e t al., 200
ha de sc ripto
utti e t al., 2
y de l hie rro
la mutante
e mue stra ) o
e no se o bs
ambié n e n
5.2.3 b ) o
zó si e l c ó s
n o bse rvad
760 de jó de
o , indic ando
).
po sitivame n
e Pse udo mo
mínimo de fi
mM) la c e pa
do e s c ultiva
aspD
b- Medio
(insu
en compar
(sufic ienc ia
e rium c o n in
ro bac te rium
09; Alve s e t
o que la c o
2005). Es p
o ) a fe c te a lg
e aspD c ult
o me dio ric o
se rvan e n l
me dio Y (m
TY c o n e
smido pIJ77
do e n la
e fo rmar lo s
o que la mu
nte la fo rma
o nas (Ko za
inido Y m
a mutante
ada e n fo rm
Y (m) c o n 0
ufic ie nc ia d
ración con l
a de hie rro )
nsufic ie nc ia
m.
CAPÍTU
al., 2010).
o nc e ntrac ió
po sib le que
guna pro pi
ivada e n m
o TY (Figura
a c e pa silv
mo dific ado
l agre gado
760 e s c apa
c e pa aspD
auto ag reg
utac ió n e n
ac ió n de b
e t al., 2009
mo dific ado
aspD fo rma
ma e státic a
0,37μM de F
de hie rro )
la cepa silv
. b- Cultivo
a de hie rro
ULO V- Result
134
En P.
ó n de
e una
edad
me dio
a 5.2.3
ve stre
para
o de l
az de
D. Se
gado s
aspD
b io film
; Ude
para
a una
a , que
C58
Fe Cl3
vestre
o s e n
(0,37
tados
no se
silve s
Paste
líquid
mo tiv
la fo
c ultiv
hie rro
c uan
adhe
e stad
so po
inde p
sig nif
a la
bac t
de fic
Figu
e stá
Agr
la p
de
re a
e ro mpe a l
stre fo rma u
e ur (Figura 5
Las dife r
do y e n la
varo n e l e st
rmac ió n de
vando las c
o agre gado
ntific ac ió n s
e ridas y me
dístic o de lo
o rte abió t
pe ndiente m
fic ativame n
silve stre C5
te rias muta
c ie nc ia de h
ura 5.2.4: Fo
átic o s de
ro bac te rium
punta de la
e nsayo . b
lizado po r c
e mpujarla
una pe líc ula
5.2.4 b ).
re nc ias o bs
auto ag re
tudio de la
e b io film. S
c e pas e n m
o , e n c ultiv
se re a lizó p
e dic ió n de l
o s re sultado
ic o hidro f
me nte de
nte mayo r la
58 (Figura 5
ante s aspD
hie rro (Figur
ormación d
las c e pas
m (0,123 mM
pipe ta Pas
- No se o b
c uatriplic ad
a-
c o n la pipe
a de lgada y
se rvadas e n
e gac ió n e n
adhe sió n a
Se re a lizó u
me dio mínim
vo s e státic o
o r tinc ió n c
a abso rban
o s sug ie re q
fó bic o po
la adic ió n
a bio masa a
5.2.5 b1 y b
también
ra 5.2.5 a1 y
de una pelí
s aspD y
M de Fe Cl3,
te ur e mpuja
bse rva e l m
do c o n do s r
aspD
e ta Paste ur
y fác ilme nte
n la pe líc u
ntre la c e p
a so po rte a
una c uantif
mo Y mo dif
s o ag itado
c o n c rista l v
nc ia a 595 n
ue A. tume
o lie stire no
n de hie rr
adhe rida e
b2). En c ult
fue mayo r
y a2).
ícula en la
C58 e n
sufic ie nc ia
ando la pe
mismo e fe c
re pe tic io ne
b-
(Figura 5.2
e a trave sad
la que se
pa mutante
bió tic o c o m
fic ac ió n de
fic ado para
o s, e n plac
vio le ta de la
nm (A595) (F
fac ie ns se a
(PE) e n
ro a l me d
n la c e pa m
tivo s sin ag
r que e n
interfase a
me dio mín
a de hie rro ).
líc ula fo rma
c to e n la c
e s.
C58
.4 a ). En c o
da po r la pu
fo rma e n l
e aspD y la
mo paráme
e la adhe sió
a Agro bac t
c as de múlt
as bac te ria
Figura 5.2.5
adhie re má
c ultivo s
dio Y mo d
mutante asp
itac ió n, la
las silve stre
aire-líquido.
nimo Y m
. a- La fle c
ada hasta e
c e pa silve s
8
CAPÍT
o ntraste , la
unta de la p
a inte rfase
a c e pa silv
e tro para e s
ó n a po lie st
te rium c o n
iple s po c illo
as que que d
a y b ).El a
ás fue rte me n
e n ag ita
dific ado , si
pD c o n re sp
adhe sió n d
e s C58 só l
Cultivo s líq
mo dific ado
ha ne gra se
e l fo ndo de
stre C58. En
TULO V- Resul
135
c e pa
pipe ta
a ire -
ve stre
stimar
tire no
o sin
o s. La
daro n
ná lisis
nte a l
ac ió n
ie ndo
pe c to
de las
o e n
quido s
para
e ña la
l tubo
nsayo
ltados
136
a- Adhesión a poliestireno en medios mínimos sin agitación
a-1. Adhesión en medio Y (m) con 0,123
mM FeCl3 (suficiencia de hierro )
a-2 Adhesión en medio Y (m) sin FeCl3
(insuficiencia de hierro)
b- Adhesión a poliestireno en medios mínimos con agitación
b-1. Adhesión en medio Y (m) con 0,123
mM FeCl3 (suficiencia de hierro )
b-2 Adhesión en medio Y (m) sin FeCl3
(insuficiencia de hierro)
Figura 5.2.5: Adhesión de las cepas C58 y aspD a soporte abiótico poliestireno. Las
c e pas aspD o C58 fue ro n c ultivadas e n me dio mínimo Y mo dific ado para
Agro bac te rium. Las bac te rias anc ladas a l so po rte fue ro n c uantific adas po r tinc ió n
c o n ro jo c o ng o a l 0,001%. a- Adhesión de cultivos sin agitación. a-1- Adhe sió n e n
me dio mínimo c o n 0,123 mM Fe Cl3 (sufic ie nc ia de hie rro ). a-2- Adhesió n e n me dio
mínimo sin Fe Cl3 agre gado (insufic ie nc ia de hie rro ). b- Adhesión de cultivos con
agitación. b-1- Adhe sió n e n me dio mínimo 0,123 mM Fe Cl3 (sufic ie nc ia de hie rro ). b-2-
Adhe sió n e n me dio mínimo sin Fe Cl3 agre gado (insufic ie nc ia de hie rro ). El análisis
e stadístic o se re a lizó c o n un ANOVA 2 fac to re s, y Po st Te st Bo nfe rro ni. * p<0.5, **p<0.01,
***p<0.001. El e nsayo se re a lizó po r triplic ado c o n c uatro re pe tic io ne s
C58 aspD
CAPÍTULO V- Resultados
bac t
Pse u
2005
c o nt
1-4 c
c o lo r
insufi
sufic i
(Figu
e xpli
e stas
bac t
Patriq
(silve
Agro
hie rro
po rc
b).
Figu
c ult
c o n
de
re a l
Dado qu
te riana y
do mo nas (
) se de te rm
e nie ndo ro j
c o mo las qu
En la fig u
r ro jo lige ra
ic ie nc ia de
ie nc ia de
ura 5.2.6 a ).
c ar (a l me n
s c o ndic io n
La ho m
te riana e
quin e t al.,
e stre y muta
o bac te rium
o (0,37μM d
e nta je de a
a-Fe Cl3
ura 5.2.6: Pr
ivadas e n
nte niendo ro
hie rro ). b- M
izó po r c ua
aspD
ue las pro du
lo s pro c e so
(Ko za e t al.
minó la pro d
jo c o ngo 0,
ue se e nc ue
ura 5.2.6 b s
me nte más
hie rro . Mie
hie rro (0,12
. Una mayo
no s parte ) la
e s.
me o stasis y
e n Vibrio y
2008). Se a
ante ) de Agr
c o n sufic ie
de Fe Cl3) e
agar (0,25 %
Me dio míni
3 agre gado de hie
roducción d
plac as c
o jo c o ngo 0
Me dio míni
triplic ado c
D
uc c ió n de c
o s de adh
., 2009; Ude
duc c ió n de
,001%, e l c u
e ntran pre se
se mue stra q
s inte nso qu
e ntras que e
23 mM de
o r pro duc c i
a mayo r ad
la c o nc e
Pse udo mo
nalizó la mo
ro bac te rium
e nc ia de hi
e n c o ndic io
%), lue go de
mo Y sin (insufic ie nc
e rro )
de celulosa
c o n me dio
0,001% a- M
imo Y 0,123
c o n do s re p
C58
c e lulo sa ha
he sió n y f
e e t al., 200
c e lulo sa e
ual e s a fín a
e nte s e n la c
que la c o lo
ue la c o lo nia
e n me dio Y
Fe Cl3) las
ió n de c e lu
dhe sió n a so
e ntrac ió n
o nas (Wyc k
o vilidad ba
m c ultivada
e rro (0,123
o ne s ae ró b
e tre s días d
c ia
C58
0,
a de las ce
minimo Y
Me dio mínim
3 mM Fe Cl3
e tic io ne s.
a mo strado
o rmac ió n
06; Spie rs e
n las c e pas
a po líme ro s
c e lulo sa (Fig
o nia de la c
a de la c e p
mo dific ad
do s c e pas
ulo sa e n ins
o po rte abió t
de hie rro
ko ff e t al.,
ac te riana (sw
as e n me dio
mM de Fe
bic as e n e n
de inc ubac
b- Me dio123 mM de
de
aspD
epas C58 y
Y mo dific a
mo Y sin FeC
3 (sufic ienc i
a fe c tar la
de b io film
e t al., 2003;
s aspD y silv
c o n unio ne
gura 5.2.6 a
e pa aspD s
pa silve stre e
o para Ag r
pare c e n
sufic ie nc ia d
tic o de la m
influe nc ian
2007; Mat
wimming ) e
o mínimo Y m
e Cl3) o c o n
nsayo s e n p
ió n a 28 °C
o mínimo Y c Fe Cl3 (sufic
e hie rro )
C
aspD. Las
ado para
Cl3 agre gad
ia de hie rro
CAPÍT
auto agre ga
e n c e pa
Spie rs y Ra
vestre e n p
e s g lic o sídic
a y b ).
se c o lo re a d
e n c o ndic ió
ro bac te rium
c o lo re arse
de hie rro p
mutante asp
n la mo v
tilla e t al.,
e n ambas c
mo dific ado
insufic ienc
plac as c o n
(Fig ura 5.2
c o n c ie nc ia
C58
c o lo nias fu
Agro bac te
do (insufic ie
o ). El e nsay
TULO V- Resul
137
ac ió n
as de
ane y,
lac as
c as β-
de un
ó n de
m c o n
igual
po dría
pD e n
ilidad
2007;
c e pas
para
ia de
ba jo
.7 a y
ue ro n
e rium
e nc ia
yo se
ltados
de m
la c e
En c o
de m
sufic i
po r s
a-a-
C
MeF
c-
Figu
Agr
hie r
de l
Agr
e ns
En sufic ie
mo vilidad e n
e pa silve stre
o ntraste , la
mo vilidad f
ie nc ia de h
Se e stud
se xtuplic ad
-
C58
e dio mínimoFe Cl3 (sufic ie
ura 5.2.7: En
robacterium
rro ). b- Plac
ha lo de
ro bac te rium
ayo se re a li
enc ia de hi
ntre la c e pa
e C58 re spo
c e pa muta
ue mayo r
ie rro .
dió nue vam
o , inc luye nd
o Y c o n, 0,12e nc ia de hie
nsayo de m
m con 0,25%
c as c o n 0,3
mo vilidad
m sin hie rro
izó po r se xtu
ie rro , no se
a silve stre y
o nde a la in
ante aspD n
a l de la c
e nte la mo
do tambié n
aspD
23 mM erro )
movilidad e
% de agar. a
37 mM de F
d e n plac
ag re g ado
uplic ado c o
o bse rva un
la c e pa m
nsufic ie nc ia
no re spo nd
c e pa silve st
o vilidad re a l
n a la c e pa
b
en placas d
a- Plac as c
Fe Cl3 (insufi
as c o n m
y c o n 0,25%
o n c uatro re
na dife re nc
mutante . En
a de hie rro d
e de la mis
tre y simila
lizando má
a mutante a
C58
Medio mín(insu
b-
de medio m
c o n 0,123 m
c ie nc ia de
me dio míni
% de agar
e pe tic io ne s
c ia signific a
bajo hie rro ,
disminuye nd
sma mane ra
ar a l que a
s re pe tic io n
aspD c o mp
C
nimo Y c o n ufic ienc ia de
minimo Y m
M de Fe Cl3
e hie rro ). c-
imo Y mo
(insufic ie nc
s.
CAPÍTUL
tiva e n lo s
, se o bse rva
do su mo vil
a ya que e
aspD induc
ne s de l e nsa
ple me ntada
C58
aspD
0,37 μM Fe Ce hie rro )
modificado p
3 (sufic ie nc ia
Cuantific a
o dific ado p
c ia de hie rro
LO V- Resulta
138
halo s
a que
lidad.
l ha lo
c e e n
ayo y
a c o n
Cl3,
para
a de
ac ió n
para
o ). El
ados
139
e l c ó smido pIJ7760 para e va luar si se re staura e l fe no tipo silve stre . En me dio c o n
sufic ie nc ia de hie rro las tre s c e pas se mue ve n e n fo rma similar (no mo strado ). En me dio
c o n insufic ie nc ia de hie rro la c e pa c o mple me ntada aspD pIJ7760 re staura e l diáme tro
de mo vilidad a va lo re s similare s a lo s o bse rvado s e n la c e pa silve stre (fig ura 5.2.7 c )
mie ntras que la c e pa aspD pre se nta un ha lo similar a l o bse rvado e n c o ndic ió n de
sufic ie nc ia de hie rro .
La c o mple me ntac ió n de l fe no tipo de mo vilidad e n pre se nc ia de pIJ7760
sug ie re que la mutac ió n aspD se ría re spo nsable de l fe no tipo o bse rvado .
5.2.3 Producción de sideróforos
Te nie ndo e n c ue nta que e l siste ma AspDE e staría invo luc rado e n la c aptac ió n
de he mo a travé s de Hla , se de te rminó si la pro duc c ió n de side ró fo ro s se ve a fe c tada
indire c tame nte e n re spue sta a la mutac ió n aspD. Para e llo , se re a lizó un e nsayo de
pro duc c ió n de side ró fo ro s utilizando CAS (c ro mo azuro l) c o mo indic ado r e n
c o ndic io ne s de c ultivo de fic iente s de hie rro . Este c o lo rante vira a l naranja c uando e l
hie rro e s que lado po r la ac c ió n de lo s side ró fo ro s e xtrac e lulare s.
Se o bse rva e n la fig ura 5.2.8 que e l ha lo naranja a lre de do r de las c o lo nias e s
se me jante , sug irie ndo que la pro duc c ió n de side ró fo ro s no e staría a fe c tada po r la
mutac ió n aspD.
5.2.4 Virulencia
Se ha de sc ripto que lo s T1SS so n impo rtante s para la virule nc ia de muc has
bac te rias pató g e nas (o pató ge nas o po rtunistas) e n las que han sido e studiado s
(Hane ko p e t al., 2006; Guzzo e t al., 1991; Burro ws y Lo , 1992). Po r o tro lado , e s po sib le
que e n a lguna e tapa de l pro c e so de infe c c ió n de A. tume fac ie ns a la planta se a
C58 aspD
Figura 5.2.8: Producción de sideróforos en las cepas aspD y silvestre cultivadas en
insuficiencia de hierro. Las c e pas C58 y aspD fue ro n c ultivadas e n me dio
c o nte nie ndo CAS (Cro mo azuro l) c o mo indic ado r de la ac tividad que lante de
side ro fo ro s e xtrac e lulare s.
CAPÍTULO V- Resultados
ne c e
re spu
de g
tumo
Kalan
pre vi
Se in
e vita
o bse
ino c u
(fig ur
plant
me se
a- Tum
b- Aus
e saria la c a
ue sta a la a
grupo s he mo
o re s e n plan
nc ho e sp .
iame nte e n
no c ularo n e
ar variabilid
e rvan lo s tu
ulac ió n. En
ra 5.2.9 b ).
ta . La ause
e s (no mo st
mores provo
sencia de tu
aptac ió n d
ause nc ia de
o . Se de te r
ntas. El e nsa
e ino c ulan
n me dio mín
e n la misma
dad g e né tic
umo re s de s
n c o ntraste ,
En la figura
e nc ia de tu
trado ).
ocados por
umores en p
de he mo m
e o xíg e no , la
rminó e nto n
ayo se re a liz
ndo una su
nimo Y mo d
planta la c
c a de las
sarro llado s
, la c e pa
a 5.2.9 c se
umo re s e n l
la cepa silv
plantas inoc
me diada po
a baja c o nc
nc e s si la m
zó hac ie ndo
uspe nsió n d
dific ado pa
c e pa silve st
plantas ho
po r la c e
mutante a
o bse rvan l
a mutante
vestre C58
culadas con
o r e l lo c us
c e ntrac ió n
utac ió n asp
o una he rid
de las c e p
ra Ag ro bac
tre C58 y la
o spe dado ra
pa silve stre
aspD fue in
as do s c e p
se mantie n
n la cepa m
hlaIS hlaR
de hie rro y
pD a fe c ta
a c o n un b
as bac te ria
c te rium sin F
a c e pa mut
as. En la fi
e C58 a lo
nc apaz de
pas ino c ulad
ne e n e l tie
mutante asp
CAPÍTU
R hla aspD
la dispo nib
la fo rmac ió
isturí e n ta ll
anas, c ultiv
Fe Cl3 ag reg
tante aspD
gura 5.2.9
o s 45 días
fo rmar tum
das e n la m
e mpo po r v
pD
ULO V- Resul
140
DE e n
ilidad
ó n de
o s de
vadas
g ado .
para
a se
po st-
mo re s
misma
varias
tados
F
c
m
r
Figura 5.2.9:
c e pa silve st
mutante asp
re a lizado po
: Ensayo de
tre C58. b-
pD. c- Fo to
o r c uatriplic
c- C5
e virulencia
Ause nc ia
o de una pla
c ado c o n 3
58
en Kalanch
de tumo re s
anta c o n la
re pe tic io ne
aspD
hoe sp. a- Tu
s e n planta
as do s c e pa
e s.
umo re s de s
as ino c ulad
as ino c ulada
CAPÍTU
arro llado s p
as c o n la c
as. El e nsay
ULO V- Resul
141
po r la
c e pa
o fue
tados
142
CAPITULO V: OTROS FENOTIPOS ASOCIADOS A LA MUTACION aspD.
5.3 CONCLUSIONES Y DISCUSIÓN
Lo s re sultado s de e ste c apítulo mue stran que la mutac ió n aspD pro duc e un
fe no tipo ple io tró pic o que a fe c ta vario s pro c e so s fisio ló g ic o s bac te riano s
apare nte me nte no re lac io nado s e ntre sí. Es de e spe rar que e l fe no tipo aso c iado a una
mutac ió n invo luc rada e n me c anismo s de c aptac ió n de he mo / hie rro se a ple io tró pic a .
Muc has vías me tabó lic as se pue de n ve r a fe c tadas po r de fe c to s e n la c aptac ió n de
hie rro o he mo , po r e je mplo la b io sínte sis de c ito c ro mo s, de l g rupo he mo , de
re gulado re s transc ripc io nale s, e l c ic lo de ác ido s tric arbo xílic o s y sínte sis de pro te ínas
invo luc radas e n la de to xific ac ió n o xidativa (Me truc c io e t al., 2009; Pe de rse n e t al.,
2008; Po o le , 1994; Bo llinge r e t al., 2001). Esto s e fe c to s pue de n a su ve z a lte rar o tro s
pro c e so s fisio ló g ic o s aso c iado s c o mo la re spirac ió n ae ró bic a y a lte rnativa y re spue sta
a stre ss o xidativo (We i e t al., 2006; Dashpe r e t al., 2009; Whitby e t al., 2009; To yo fuku e t
al., 2008).
Se o bse rvó que la c e pa aspD auto ag re g a e n c ultivo s líquido s e státic o s o c o n
ag itac ió n e n fo rma inde pe ndie nte de la c o nc e ntrac ió n de hie rro e xtrac e lular y
nutric io nal (e n me dio ric o o mínimo e n nutrie nte s). El fe no tipo se re staura
c o mple me ntando a la c e pa aspD c o n e l c ó smido pIJ7760 lo que pe rmite sug e rir que
la mutac ió n aspD induc e c ambio s e n la supe rfic ie bac te riana y e n la inte rac c ió n
c é lula -c é lula .
Ce pas mutante s e n la c aptac ió n de hie rro o he mo no so n c apac e s c re c e r a lo s
nive le s o bse rvado s e n las c e pas iso gé nic as silve stre s c uando so n c ultivadas e n
insufic ie nc ia de hie rro (Chao e t al., 2005; Ne pliue v e t al., 2009; Najimi e t al., 2008;
Bric kman y Armstro ng , 2007; Mo uriño e t al., 2004; Wyc ko ff e t al., 2004; Patriquin e t al.,
2008). Se ha de sc ripto que la insufic ie nc ia de hie rro pro vo c a una disminuc ió n e n e l
c re c imie nto bac te riano que se re staura c o n e l agre gado de hie rro o una fue nte de
hie rro c o mo po r e je mplo he mo (Calve r e t al., 1979; Sige l y Payne , 1982; Hartmann y
Braun, 1981). Si AspDE tuvie ra un ro l primario e n la c aptac ió n de hie rro e n las
c o ndic io ne s e nsayadas, de be ría o bse rvarse un me no r c re c imie nto de la c e pa aspD
c o n re spe c to a la c e pa silve stre C58 a l se r c ultivada e n insufic ie nc ia de hie rro , tanto e n
me dio líquido c o mo e n plac a . De bido a que la mutante aspD fo rma agre gado s e n
me dio líquido e n fo rma inde pe ndie nte de la c o nc e ntrac ió n de hie rro , e s pro ble mátic o
re a lizar c o mparac io ne s e ntre la DO de la wt y la mutante . Po r lo tanto , no e s po sib le
de finir si la mutante tiene una de sve ntaja e n c uanto a l c re c imie nto re spe c to a la c e pa
silve stre e n un me dio c o n insufic ie nc ia de hie rro e n me dio s líquido s.
143
En lo s e nsayo s de c re c imie nto re a lizado s e n plac as, la c e pa silve stre C58
pare c e no re staurar su c re c imie nto e n pre se nc ia de he mo g lo b ina c o mo únic a fue nte
de hie rro e xtrac e lular a lo s nive le s o bse rvado s e n sufic ie nc ia de hie rro . Este re sultado
sug ie re que e l he mo no se ría e fic ie nte me nte utilizado c o mo fue nte de hie rro po r la
c e pa silve stre de Agro bac te rium e n las c o ndic io ne s e nsayadas. En e l e nsayo e n plac a ,
la mutante aspD fue más se nsib le a la ause nc ia de hie rro que la c e pa silve stre y fue
aún más se nsib le e n fo rma re la tiva que la c epa silve stre a la ause nc ia de hie rro , e n
pre se nc ia de he mo g lo b ina . Esta o bse rvac ió n sug ie re que la mutante e n e l siste ma de
se c re c ió n de l he mó fo ro Hla , po dría e star e n de sve ntaja c o n re spe c to a la c e pa
silve stre e n c o ndic io ne s re stric tivas de hie rro , c uando se dispo ne de he mo e n e l me dio
e xtrac e lular.
Llamativame nte , la c e pa aspD fo rmó una pe líc ula más de nsa y g rue sa
(c o mparada c o n la c e pa silve stre ) e n la inte rfase a ire -liquido de me dio s de c ultivo s
mínimo s y e státic o s y e n fo rma inde pe ndie nte de la c o nc e ntrac ió n de hie rro
e xtrac e lular. Este e fe c to , a l igua l que la auto ag reg ac ió n, po dría de be rse a dife re nc ias
e n lo s c o mpo ne nte s de la supe rfic ie bac te riana po r a lg ún e fe c to indire c to de
re gulac ió n pro vo c ado po r la mutac ió n e n aspD pe ro e n fo rma inde pe ndiente de la
dispo nib ilidad de hie rro . A la inve rsa , e n V. c ho le rae , e l e stré s e xtrac ito plasmátic o
pro vo c ado po r daño físic o o químic o e n lo s c o nstituye nte s de la me mbrana e xte rna ,
induc e n c asc adas de se ñale s c o mune s que de rivan e n e stré s o xidativo y
de sre gulac ió n de la ho me o stasis de hie rro (Siko ra e t. al., 2009).
Se o bse rvó que e n c o ndic ió n de sufic ienc ia de hie rro , sin ag itac ió n, la c e pa
silve stre de Agro bac te rium y la mutante aspD se adhie re n e n fo rma similar a l so po rte
ab ió tic o po lie stire no . La c e pa silve stre de Ag ro bac te rium d isminuyó su adhe sió n a
so po rte abió tic o c uando la c o nc e ntrac ió n de hie rro fue limitante . Sin e mbargo ,
aunque la mutante tambié n disminuye la adhe re nc ia a tie mpo s c o rto s, se o bse rvó
una mayo r adhe re nc ia a l po lie stire no c o mparada c o n la c e pa silve stre e n c o ndic ió n
de insufic ie nc ia de hie rro a tie mpo s más pro lo ngado s de inc ubac ió n tanto c o n
ag itac ió n c o mo e n c ultivo s e státic o s. Esta mayo r adhe sió n fue c o mparable a la
adhe sió n o bse rvada po r e sta mutante e n c o ndic ió n de sufic ie nc ia de hie rro . Estas
o bse rvac io ne s indic an que la ause nc ia de hie rro induc e e n la mutante a lg una
re spue sta fisio ló g ic a que pro mue ve la fo rmac ió n de un b io film más ro busto que la
c e pa silve stre e n e stas c o ndic io ne s.
Se o bse rvó que mie ntras la c e pa silve stre C58 y la c e pa mutante aspD nadan
e n fo rma similar e n me dio mínimo c o n sufic ie nc ia de hie rro , la c e pa mutante mo stró
te ne r una mo vilidad mayo r que la c e pa wt e n insufic ie nc ia de hie rro . Esta
o bse rvac ió n sug ie re nue vame nte que la fa lta de hie rro induc e e n la mutante una
CAPÍTULO V- Concusiones y Discusión
144
re spue sta fisio ló g ic a dife re nte c o mparada a la c e pa wt. Se pue de o bse rvar a l
c o mparar lo s halo s, que la c e pa wt disminuye su mo vilidad e n bajo hie rro mie ntras que
la mutante no re spo nde de la misma mane ra . Un e fe c to pare c ido a la c e pa silve stre
de A. tume fac ie ns se o bse rvó e n P. ae rug ino sa y V. c ho le rae , ya que las c e pas
silve stre s de ambas e spe c ie s disminuye ro n su halo de mo vilidad e n c o ndic ió n de
insufic ie nc ia de hie rro c o n re spe c to a sí mismas e n sufic ie nc ia de hie rro (Patriquin e t al.,
2008; Me y e t al., 2005).
El análisis de las pro te ínas e xtrac e lulare s e n c o ndic io ne s de insufic ienc ia de
hie rro y pre se nc ia de he mo (Capítulo III, Se c c ió n 4.2.3, figura 4.2.4 c ) mo stró un pe rfil
dife re nc ia l de flage linas e ntre la c e pa mutante y la c e pa silve stre de Agro bac te rium
que fue e vide nte e n e l e stado e stac io nario . Más aún, mie ntras la wt c ambia e l pe rfil de
flag e linas en las distintas c o ndic io ne s, la c e pa mutante aspD pare c e no re spo nde r de
igual fo rma. Estas o bse rvac io ne s po drían e star re lac io nadas c o n la mayo r mo vilidad
o bse rvada de la c e pa mutante aspD c o mparada c o n la mo vilidad de la c e pa
silve stre e n c o ndic io ne s de insufic ie nc ia de hie rro . Una po sib ilidad e s que la mutac ió n
e n aspD induzc a a lg ún e fe c to re gulato rio que pre ve nga que la bac te ria re spo nda
c o mo la c e pa silve stre a la de fic ie nc ia de hie rro .
En líne a c o n e stas o bse rvac io ne s, se ha de sc ripto una re gulac ió n c o nc e rtada
de la e xpre sió n de lo s ge ne s hlaR y hlaIS e studiado s e n e ste trabajo de te sis (Atu3388-
91,) y la e xpre sió n de flage linas e n Ag ro bac te rium (Klüse ne r e t al., 2010).
En c o ndic ió n de insufic ie nc ia de hie rro la c o lo nia de la mutante mo stró un c o lo r
ro jo lige rame nte más inte nso que la c e pa silve stre pro bable me nte de bido a una
mayo r pro duc c ió n de fibrillas de c e lulo sa . Estas fibrillas e stán re lac io nadas c o n la
adhe sió n irre ve rsib le de Ag ro bac te rium a la planta ho spe dado ra y jue gan un ro l c lave
e n e l pro c e so de adhe sió n, c o lo nizac ió n de la c é lula radic ular, fo rmac ió n de b io film y
virule nc ia (Matthysse e t al., 1981, 2005; Matthysse y Mc Mahan, 1998). Una mayo r
pro duc c ió n de c e lulo sa po dría influir e n la adhe sió n y fo rmac ió n de b io films so bre
so po rte s abió tic o s y e n la inte rfase a ire -liquido c ó mo se o bse rvó e n c ultivo s líquido s y
e n e l e nsayo e n plac as de po lie stire no . Sin e mbargo , dado que e l e fe c to o bse rvado
fue sutil y e l ro jo c o ngo no e s un c o lo rante e spe c ífic o de c e lulo sa , se rá ne c e sario
c o nfirmar a travé s de o tro s e nfo que s b io químic o s o ge né tic o s que la mutante aspD
re a lme nte pro duc e mayo re s c antidade s de dic ho po líme ro .
En su c o njunto , la c arac te rizac ió n fe no típic a de la c e pa aspD sug ie re que e sta
mutante no re spo nde a la c o ndic ió n de insufic ie nc ia de hie rro e n fo rma se me jante a
la o bse rvada e n la c e pa silve stre . Otro s fe no tipo s pare c e r se r inde pendie nte s de la
c o ndic ió n de hie rro .
CAPÍTULO V- Concusiones y Discusión
145
Te nie ndo e n c ue nta que e l siste ma AspDE e staría invo luc rado e n la c aptac ió n
de he mo e xtrac e lular a travé s de l he mó fo ro Hla , se analizó si la mutac ió n aspD
pro vo c a la de sre gulac ió n de sistemas de c aptac ió n de hie rro a travé s de side ró fo ro s.
Sin e mbargo , a travé s de un e nsayo e n plac a se o bse rvó pro duc c ió n de side ró fo ro s e s
similar e n ambas c e pas. Nue vame nte , para c o nfirmar que no se induc e n o se re prime n
o tro s siste mas de c aptac ió n de hie rro o c o mpue sto s que une n hie rro se de be rán
re alizar o tro s e studio s más e spe c ífic o s. Lo s side ró fo ro s po drían c o ntribuir a l c re c imie nto
(aunque disminuido ) de la mutante y la wt e n bajo hie rro . En dife re nte s c e pas de A.
tume fac ie ns, inc luida la c e pa C58, se ha de sc ripto la pro duc c ió n de un side ró fo ro
llamado Agro bac tina (Ong e t al., 1979; So no da e t al., 2002; Ro ndo n e t al., 2004).
Mutante s e n la pro duc c ió n de Agro bac tina e n la c e pa C58 pre se ntan un c re c imie nto
disminuido re spe c to a la c e pa silve stre e n me dio s c o n insufic ienc ia de hie rro . El
c re c imie nto disminuido se re staura c o n e l ag re gado de l side ró fo ro purific ado .
Agro bac tina e s e se nc ia l para e l c re c imie nto e n c o ndic ió n de insufic ie nc ia de hie rro
pe ro no a fe c ta la virule nc ia de Agro bac te rium (Ro ndo n e t al., 2004). El análisis de
tumo re s pro vo c ado s po r A. tume fac ie ns, c e pas B6 y A217 mo stró que Ag ro bac tina no
e stá pre se nte e n lo s te jido s tumo rale s (Le o ng y Ne ilands, 1981). Po r o tro lado , c o mo ya
se de sc rib ió e n la disc usió n de l c apítulo IV, e l análisis de l g e no ma de Agro bac te rium
indic ó la pre se nc ia de vario s putativo s siste mas de c aptac ió n de hie rro que e xplic arían
la habilidad de e sta bac te ria para adaptarse a muy dive rsas c o ndic io ne s ambie nta le s.
La c e pa mutante aspD no fue c apaz de induc ir la fo rmac ió n de tumo re s e n
Kalanc ho e sp ., mie ntras la c e pa silve stre indujo la fo rmac ió n de tumo re s e n lo s sitio s
do nde fue ino c ulada . Se pue de pro po ne r que la se c re c ió n de l he mó fo ro po r e l T1SS
AspDE se ría ne c e saria , dire c ta o indire c tame nte , para la pro gre sió n de l pro c e so
tumo ral. Se ha de sc ripto e n varias e spe c ie s bac te rianas (no auxó tro fas de he mo ) que
las mutac io ne s que a fe c tan la c aptac ió n de he mo re sultan se r avirule ntas o de
virule nc ia ate nuada (Bric kman e t al., 2006; Carro ll e t al., 2000; Wo rst e t al., 1995; Le mo s
y Oso río , 2007; Oh e t al., 2009; Hagan y Mo ble y, 2009; Ahn e t al., 2005). Hla po dría se r
c o nside rado un fac to r de virule nc ia intrínse c o . Sin e mbargo , de be to marse e n c ue nta
que la mutac ió n e n aspD e s ple io tró pic a y que la a lte rac ió n de o tro s pro c e so s
fisio ló g ic o s tambié n po drían c o ntribuir a l de fe c to e n la virule nc ia . En e ste se ntido , c abe
ac larar que dive rso s c o mpo ne nte s de me mbrana, c o mo e l EPS, e l LPS, la PC, lo s
g luc ano s c íc lic o s y las flage linas de Agro bac te rium han mo strado se r impo rtante s e n e l
de sarro llo de l pro c e so infe c tivo (Matthysse e t. al., 2008; Tho masho w e t. al., 1987, Marks
e t. al., 1987; Kamo un e t. al., 1989; Me tts e t. al., 1991; Zo rre guie ta e t. al., 1988; Klüse ne r
e t. al., 2009; We sse l e t. al., 2006).
CAPÍTULO V- Concusiones y Discusión
146
Para adaptarse a dife re nte s c o ndic io ne s ambie nta le s, Ag ro bac te rium (c o mo
o tras bac te rias) re spo nde , a travé s de la ac c ió n de re gulado re s g lo ba le s, mo dific ando
dive rsas vías me tabó lic as y fisio ló g ic as. Una mutac ió n g é nic a que a lte ra una po sible
re spue sta a una c o ndic ió n de e stré s pue de a fe c tar o tro s pro c e so s fisio ló g ic o s
ge ne rando fe no tipo s ple io tró pic o s. Re c ie nte me nte se ha de sc ripto que e n la mutante
no pro duc to ra de fo sfatidil c o lina (PC) de A. tume fac ie ns se inhibe la e xpre sio n de
flag e linas, aume nta la pro duc c io n de b io film, disminuye la virule nc ia y e l c re c imie nto
(Klüse ne r e t al., 2010). Esto s e ve nto s e stan ac o mpañado s ade mas de la induc c ió n
c o nside rab le de ahuUVTB (Atu3388 a 3391) que se gún se de sc rib ió , c o dific an po sib le s
siste mas ABC de c aptac ió n de he mo (Capitulo II, Se c c ió n 2.2.2, Figura 2. 3), hlaR
(Atu3385) y hlaS (Atu3387), que c o dific a e l po sib le se nso r de la inte rac c ió n de Hla c o n
su re c e pto r HlaR (Klüse ne r e t al., 2010). El análisis transc riptó mic o de la e xpre sió n de
e sto s g e ne s no c o rre lac io nó c o n e l análisis pro te ó mic o , mo tivo po r e l que e sto s auto re s
po stulan que e xiste re gulac ió n g e né tic a po st-traduc c io na l a nive l de e stab ilidad de
mARN (Klüse ne r e t al., 2010). En lo s e nsayo s he te ró lo go s (ve r Capitulo III, Se c c io ne s 3.2.5
y 3.2.6), la e xpre sió n mayo ritaria de Hla mo stró e star ac o mpañada de la induc c ión de
la e xpre sió n de AhuB y de la inhibic ió n de la pro duc c ió n de flage linas. Po r o tro lado , la
mutante aspD se vió a fe c tada e n e l c re c imie nto , la virule nc ia y vario s aspe c to s
aso c iado s a pro pie dade s de la supe rfic ie bac te riana (adhe sió n, pro duc c ió n de
b io film, mo vilidad). Se po dría suge rir que la mutac ió n que pro vo c a un de fe c to e n la
pro duc c ió n de PC o la mutac ió n en e l ge n aspD induc e n se ñale s input e n re gulado re s
g lo ba le s que e je rc e n un e fe c to similar so bre e l mismo grupo de g e ne s y po r lo tanto
ge ne ran un fe no tipo similar.
Co mo ya se me nc io nó e n e l c apítulo III, se c c ió n 3.2.1, e l siste ma HlaR-Hla -AspDE
po dría e star re gulado po r e l siste ma ECF σ / ECF anti-σ (HlaIS), c o dific ado río arriba de
hlaR. Klüse ne r e t al. re po rtaro n induc c ió n de la e xpre sió n de HlaS e n re spue sta a
a lte rac io ne s e n la c o mpo sic ió n de la me mbrana de Agro bac te rium, aún e n sufic ie nc ia
de hie rro (Klüse ne r e t al., 2010). Po r lo tanto , no se pue de de sc artar la influe nc ia de
HlaS e n lo s fe no tipo s o bse rvado s e n la mutante aspD. Lo s siste mas de ECF σ y ECF anti
σ han mo strado partic ipar e n nume ro so s e ve nto s fisio ló g ic o s bac te riano s, e ntre e llo s, la
fo rmac ió n de b io films, la auto agre gac ió n, la e stab ilidad de la me mbrana , e l
me tabo lismo de l hie rro y la virule nc ia (Do ve r e t al., 2007; He lmann, 2002; Missiakas y
Raina , 2002).
En Pse udo mo nas se ha de sc ripto que la inte rac c ió n de l side ró fo ro pio ve rdina
c o mple jado c o n su sustrato (fe rri-pio ve rdina) ac túa , ade más, c o mo mo lé c ula se ñal
induc ie ndo la se c re c ió n de tre s fac to re s de virule nc ia , pio ve rdina , e xo to xina A y la
CAPÍTULO V- Concusiones y Discusión
147
e ndo pro te asa PrpL. Esta induc c ió n e s me diada po r la c asc ada re gulato ria transduc ida
de sde la supe rfic ie c e lular me diada po r la inte rac c ió n de l re c e pto r de pio ve rdina
FvpA c o n e l ECF anti σ (FvpR) y e l ECF σ (PvdS). Sin e mbarg o , FvpR, e s c apaz de
inte rac c io nar ade más c o n o tro ECF σ (FpvI), fo rmando una c asc ada re g ulato ria
ramific ada (Be are e t al., 2003).
CAPÍTULO V- Concusiones y Discusión
DISCUSIÓN GENERAL
149
DISCUSIÓN GENERAL
5.1 Discusión general
Vario s ha llazgo s de e ste trabajo fue ro n ine spe rado s, lo que e nrique c ió mi Te sis y
pe rmitió c o ntribuir a l c o no c imie nto so bre dive rso s aspe c to s g e né tic o s y fisio ló g ic o s de
A. tume fac ie ns, hasta aho ra po c o e xplo rado s.
La e strateg ia de c o mple me ntac ió n func io nal he te ró lo ga de la se c re c ió n de
g lic anasas, usando la c e pa mutante A412 prsD pe rmitió a islar a l c luste r hla a partir de
una b ib lio te c a g e nó mic a de A. tume fac ie ns, c apaz de re staurar e l fe no tipo se c re to rio
e n e l ho spe dado r R. le gumino sarum. Se de mo stró que e l T1SS, de no minado AspDE, e s
e l re spo nsable de la c o mple me ntac ió n o bse rvada . El sustrato e spe c ífic o de AspDE fue
la pro te ína Hla , c o dific ada río arriba de aspD aspE. Las e vide nc ias in silic o y
e xpe rime ntale s sug ie re n que lo s g e ne s de l T1SS y su sustrato (hla-aspDE) fo rmarían
parte de un c luste r func io nal de ge ne s pro bable me nte invo luc rado s e n la c aptac ió n
de he mo , que inc luye a l pro bable re c e pto r de he mo HlaR c o dific ado río arriba de hla,
a un pro bable siste ma de ECF σ y anti σ (HlaSI), y a un siste ma de transpo rte de
me mbrana inte rna AhuUVTB (ve r figuras 3.2.2 y 4.3.1).
Cuando e l c luste r de g e ne s hla se e xpre só e n e l ho spe dado r he te ró lo g o R.
le gumino sarum (tanto e n la c e pa silve stre c o mo e n las mutante s de se c re c ió n) se
o bse rvó una so bre -pro duc c ió n de Hla y o tro s c ambio s no table s e n e l pe rfil e xtrac e lular
e n me dio s ric o s de c ultivo . Dada la c e rc anía filo g ené tic a e ntre Rhizo bium y
Agro bac te rium, se e spe raba un c o mpo rtamie nto similar e n ambas. Sin e mbargo , e n las
mismas c o ndic io ne s no fue po sib le de te c tar Hla e n e l pe rfil e xtrac e lular de A.
tume fac ie ns, e n pre se nc ia o e n ause nc ia de pIJ7760. Un análisis c uidado so de la
b ib lio g rafía y o tro s e studio s re a lizado s durante e sta te sis de ve ló po ste rio rme nte la
c ausa de e sta dife re nc ia . La c e pa A34 de Rhizo bium (8401 pRL1JI) e s la c e pa silve stre
iso gé nic a de la mutante prsD, utilizada e n e l a islamie nto de pIJ7760. A34 (y sus c e pas
de rivadas mutante s) po se e una mutac ió n anc e stra l e n e l plásmido simbió tic o (pRL1JI)
e n un re gulado r de sc o no c ido (pro bab le re pre so r), se de mo stró que e ste re gulado r no
re spo nde a la c o nc e ntrac ió n de hie rro e xtrac e lular a pe sar de a fe c tar la e xpre sió n de
a lg uno s ge ne s invo luc rado s e n e l me tabo lismo de l hie rro (We xle r e t al., 2001; To dd e t
al., 2002, e ste trabajo de te sis). Sin e mbarg o , e l fe no tipo partic ular de A34 y las c e pas
iso gé nic as de rivadas re sultaro n se r muy ve nta jo sas e n lo s aná lisis he te ró lo go s. A pe sar
de lo s inc o nve nie nte s que e ste he c ho g e ne ró , e n c uanto a l dise ño e xpe rime ntal e
inte rpre tac ió n de lo s re sultado s, la mutac ió n ple io tró pic a de A34 pe rmitió la e xpre sió n
de l c luste r hla e n e l ho spe dado r he te ró lo g o y po r lo tanto la ide ntific ac ió n y po ste rio r
c arac te rizac ió n de l T1SS AspDE de A. tume fac ie ns.
150
Aunque po ste rio rme nte , po r análisis in silic o se ide ntific ó e n e l ge no ma de A.
tume fac ie ns (Go o dne r e t al., 2001; Wo o d e t al., 2001) o tro s TISS, é sto s no fue ro n
aislado s e n e l sc re e ning . Esto po dría de be rse a que e sto s TISS só lo se e xpre san e n
de te rminadas c o ndic io ne s de c ultivo , o a que dic ho s siste mas no so n c apac e s de
re c o no c e r y/ o se c re tar las g lic anasas de R. le gumino sarum.
So rpre sivame nte , se demo stró que la pro te ína Hla tie ne la c apac idad de unir
he mina sug irie ndo fue rte me nte que po dría tratarse de un he mó fo ro . La se c re c ió n de
he mó fo ro s se aso c ia a pató ge no s de mamífe ro s c o mo Po rphyro mo nas, Esc he ric hia ,
Pse udo mo nas, Se rratia y Ye rsinia , g é ne ro s bac te riano s que c aptan hemo e n fo rma
ac tiva de ntro de su ho spe dado r animal (Otto e t al., 1998; Paramae svaran e t al., 2003;
Ro ssi e t al., 2001; Lé to ffé e t al., 1998; Lé to ffé e t al., 1994). Hasta la fe c ha no se había
pro pue sto que e xistie ran he mó fo ro s e n e spe c ie s bac te rianas que inte rac c io nan c o n
plantas. Sin e mbarg o , e ste he c ho no e s tan so rpre nde nte si se tie ne e n c ue nta que se
han de sc ripto varias c lase s de he mo g lo binas ve ge ta le s, ade más de la le g -
he mo g lo bina invo luc rada e n las inte rac c io ne s simbió tic as (Hunt e t al., 2001; So wa e t
al., 1999). Las e vide nc ias e xpe rime nta le s sug ie re n que Hla no te ndría c o mo ro l primario
la c aptac ió n de he mo c o mo fue nte de hie rro . La se c ue nc ia amino ac ídic a de Hla
pre se nta similitud c o n varias pro te ínas hipo té tic as c uya func ió n aún no ha sido
de sc ripta ; po r lo tanto , Hla po dría pe rte ne c e r a una nue va familia de he mó fo ro s. La
sinte nic idad de hlaSI hlaR hla aspDE c o n c luste rs de ge ne s de o tras e spe c ie s
bac te rianas sug ie re que la e strate g ia de c aptac ió n de he mo e staría más
ampliame nte distribuida de lo que se pe nsaba .
La se c re c ió n de pro te ínas me diada po r e l siste ma AspDE mo stró e star suje ta a
una re gulac ió n c o mple ja e n e l ho spe dado r he te ró lo go R. le gumino sarum. Po r un lado ,
se o bse rvó la se c re c ió n e xac e rbada de Hla e n A34, a c ausa de una mutac ió n
anc e stra l e n pRL1JI e n un re gulado r de sc o no c ido . Este re g ulado r se ría e l princ ipa l e n
la je rarquía de re g ulado re s de la se c re c ió n de Hla y e je rc e ría una func ió n re pre so ra
(dire c ta o indire c tame nte ) so bre hla . La utilizac ió n de una c e pa que no c o ntie ne la
mutac ió n anc e stra l e n e l plásmido simbió tic o (J251) o c urada de l mismo (A31) pe rmitió
de te rminar o tro s fac to re s que re g ulan e l c luste r hla e n Rhizo bium. Po r un lado , e n J251,
Hla e stuvo re gulada ne gativame nte po r lo s reg ulado re s g lo bale s de re spue sta a hie rro ,
RirA e IrrA y se o bse rvó que la se c re c ió n he te ró lo ga de AhuB (Atu3391) (Figuras 3.2.5 y
3.2.7) tambié n e staría re gulada ne g ativame nte po r RirA. Más aún, lo s ge ne s ahuB
(Atu3391) y hlaR (Atu3385) pre se ntan e n sus re g io ne s pro mo to ras un mo tivo c o nse nso
c o nse rvado de re c o no c imie nto de RirA. Dado que se ha de sc ripto que Atu3391 (AhuB)
re spo nde a l re gulado r RirA e n Ag ro bac te rium (Ng o k-ngam e t al., 2009), se pue de
pro po ne r que las se c ue nc ias de re c o no c imie nto (bo xe s) de RirA e starían c o nse rvadas
Discusión general
151
e n Rhizo bium y Ag ro bac te rium y que e s po sib le que la sínte sis y/ o se c re c ió n de varias
pro te ínas de l c luste r, inc luida Hla , se an re g uladas po r RirA e n Agro bac te rium.
Si b ie n e l fe no tipo mutante de A34 e s de pe ndie nte de l plásmido pRL1JI,
tambié n se o bse rvó una se c re c ió n e le vada de Hla e n A31 (que e stá c urada de l
mismo ), aunque e n e ste c aso e n re spue sta a la insufic ie nc ia de hie rro (figura 3.2.5).
Esta se c re c ió n pro mine nte no se o bse rva e n la c e pa J251 que po rta a l plásmido pRL1JI
(sin la mutac ió n anc e stra l) aún e n ba jo hie rro (Figura 3.2.7 a ). Esta o bse rvac ió n mue stra
que e l re gulado r plasmídic o no re spo nde a la insufic ie nc ia de hie rro y sug ie re que
e xiste a lgún induc to r c ro mo so mal que ac tuaría c uando e l re g ulado r no e stá pre se nte .
En c o njunto , e stas o bse rvac io ne s pe rmite n e spe c ular c o n la pre se nc ia de a lgún
induc to r de la se c re c ió n de Hla pre se nte e n e sta c o mple ja c asc ada re gulato ria , que
po dría e star c o dific ado e n e l c ro mo so ma o e n a lgún o tro plásmido (distinto a pRL1JI)
de l ge no ma de Rhizo bium. Este induc to r po dría se r re primido po r e l re g ulado r
de sc o no c ido de l plásmido pRL1JI e n la c e pa J251 (figura 3.2.7 a ). Dic ho hipo té tic o
“ induc to r” pare c e re spo nde r dire c ta o indirec tame nte a la insufic ienc ia de hie rro .
Adic io nalme nte , la se c re c ió n de Hla e n R. le gumino sarum se indujo e n pre se nc ia de
he mo g lo bina e n e l me dio e xtrac e lular. Dado que , c o mo se me nc io nó , e l c luste r
c o ntie ne (río arriba de hlaR) g e ne s ho mó lo go s a lo s que c o dific an sistemas ECF σ y ECF
anti σ que re spo nde n a he mo (hlaSI), se pue de e spe c ular que la induc c ió n de Hla
se ría a travé s de un me c anismo σ− anti σ, me diado po r HlaSI.
En Agro bac te rium, la fa lta de hie rro no re sultó se r la princ ipal c o ndic ió n que de te rminó
la se c re c ió n de Hla , tampo c o lo fue la pre se nc ia de he mo g lo bina e n e l me dio
e xtrac e lular. En c ambio , e l análisis de la se c re c ió n de Hla e n dife re nte s c o ndic io ne s de
c ultivo mo stró que hla aspDE re spo nde princ ipalme nte a la fa lta de o xíg e no . En
Agro bac te rium, ade más de la limitac ió n de hie rro y la pre se nc ia de he mo , fue ro n
ne c e sario s ba jo s nive le s de o xíge no para de te c tar la se c re c ió n de Hla . Aunque aún no
fue e va luado , y asumie ndo que e l me c anismo de re g ulac ió n de hla e s similar e n
Agro bac te rium y Rhizo b ium, una po sib ilidad e s que la se ñal de te c tada po r a lg uno de
lo s re gulado re s de hla aún no ide ntific ado s de Rhizo b ium (ve r mas arriba) po dría
re spo nde r a la c o nc e ntrac ió n de o xíge no .
¿De qué manera podrían relacionarse los estímulos de falta de oxígeno y falta
de hierro y/ o hemo? Es de e spe rar que la re g ulac ió n me diada po r la c o nc e ntrac ió n
de he mo y de o xíg e no c o nfluya e n pro c e so s me tabó lic o s que utilizan c o njuntame nte
e stas do s mo lé c ulas. Se ha de sc ripto que e l ag re g ado de he mo a l me dio e xtrac e lular
e stimula la re spirac ió n ae ró b ic a , e n c o ndic io ne s de sufic ie nc ia de hie rro , e n
nume ro sas bac te rias Gram po sitivas y ne g ativas que c are c e n de la vía de sínte sis de
Discusión general
152
he mo c o mple ta c o mo Lac to bac illus, Stre pto c o c c us, Hae mo phillus Salmo ne lla y
Esc he ric hia (Re zaïki e t al., 2004; Yamamo to e t al., 2005; Whitby e t al., 2009; Ellio tt y
Ro th, 1989; O'Ne ill e t al., 1991). La limitac ió n de hie rro / he mo re duc e la e fic ienc ia de la
re spirac ió n e n varias e spe c ie s bac te rianas que po se e n la vía de sínte sis de he mo
c o mple ta c o mo Ne isse ria , Nitro so mo nas y Esc he ric hia (Arc hibald y De Vo e , 1978; We i e t
al., 2006; Hubbard e t al., 1986) y e n P. g ing ivalis la limitac ió n de he mo inhibe la
re spirac ió n anae ró bic a (Dashpe r e t al., 2009). Estas o bse rvac io ne s mue stran que la
dispo nib ilidad de he mo e xtrac e lular influye e n la c apac idad re spirato ria de dive rsas
bac te rias. Po r o tro lado , sug ie re n la e xiste nc ia de me c anismo s re gulato rio s que
c o ne c tan pro bab le me nte la re gulac ió n de la c aptac ió n de he mo y la fac ultad de
re spirar ae ró bic a o anae ró bic ame nte .
La insufic ie nc ia de hie rro pro vo c a c are nc ia de he mo , dada la limitac ió n
nutric io nal para sinte tizarlo . Es pro bable que , e n c o ndic io ne s de limitac ió n de hie rro se
induzc a la c aptac ió n de he mo e n lugar de su sínte sis para e vitar la ac umulac ió n
intrac e lular de pro to po rfirina IX, c o mpue sto a ltame nte tó xic o . La c aptac ió n de he mo
de be ría ac tivarse c uando e l he mo se vue lve un nutrie nte e se nc ia l (de b ido a la
limitac ió n de hie rro o a la impo sib ilidad de sinte tizarlo . El he mo c aptado de l me dio
e xtrac e lular se ria inc o rpo rado e n he mo pro te ínas bac te rianas; e sta hipó te sis e s
c o no c ida c o mo “hipó te sis de se c ue stro de he mo ”. En e spe c ie s c o n la vía de b io sínte sis
de he mo c o mple ta la po sibilidad de sinte tizar e ste c o fac to r de no vo e nmasc ara e l
impac to que la c o nc e ntrac ió n e xtrac e lular de he mo tie ne e n las vías re spirato rias
ae ró bic as o a lte rnativas (Re nie re e t al., 2007; Tiburzi e t al., 2009).
La c o nc e ntrac ió n de o xíg e no e s un fac to r de te rminante de la b io dispo nibilidad
de l hie rro . Po r o tro lado , la c aptac ió n de he mo pue de se r una e strate g ia e n c o ndic ió n
de insufic ienc ia de o xige no que pe rmita e c o no mizar la e ne rg ía que la b io sínte sis de
he mo de manda (O’ Brian y Tho ny-Me ye r, 2002). En varias e spe c ie s bac te rianas se ha
e studiado la influe nc ia de re gulado re s de anae ro bio sis/ mic ro ae ro filia c o mo Fnr y Arc A
e n la e xpre sió n de ge ne s de c aptac ió n de hie rro / he mo (Wyc ko ff e t al., 2009; Bue ttne r
e t al., 2009). En Shig e lla se ha de mo strado que e l re g ulado r de Arc A (de l siste ma de
do s c o mpo ne nte s Arc AB) e s re spo nsable de re primir anae ró bic ame nte la transc ripc ió n
de l re gulado r Fur, re gulado r g lo bal de re spue sta a hie rro (Bo ule tte y Payne , 2007, ve r
disc usió n c apítulo 3). En Po rphyro mo nas la e xpo sic ió n a c o ndic io ne s mic ro ae ró filas
inhibe la c aptac ió n de he mo , mie ntras que la anae ro bio sis induc e su c aptac ió n (Le wis
e t al., 2009). Po dría pro po ne rse que e n Rhizo biac e ae , un re g ulado r de
anae ro bio sis/ mic ro ae ro filia re primiría e n e stas c o ndic io ne s la transc ripc ió n de RirA (ya
que e s é ste e l re gulado r princ ipa l de re spue sta a hie rro e n e sta familia ) y po r lo tanto
se e stimule la c aptac ió n de he mo vía Hla .
Discusión general
153
Lo s dato s o bte nido s e n ambo s c o nte xto s (ho mó lo g o y he te ró lo go ) e n c o njunto ,
y la c e rc anía filo ge nétic a de Ag ro bac te rium y Rhizo bium sug ie re n que la re gulac ió n
de la se c re c ió n de Hla de be ría se r similar e n ambas e spe c ie s. Se po dría hipo te tizar que
e l princ ipal mo dulado r de la se c re c ió n de Hla e n Agro bac te rium se ría un re g ulado r
que re spo nde a la insufic ie nc ia de o xíg e no , o rtó lo g o a a lguno de lo s de sc o no c ido s de
A34. Se ha pro pue sto que A34 pre se nta un fe no tipo mutante de re spue sta a hie rro
(We xle r e t al., 2001; To dd e t al., 2002) (We xle r e t al., 1998). We xle r e t al. mo straro n que
la c e pa A34 pre se nta e xpre sió n c o nstitutiva de g e ne s de c aptac ió n de he mo y de
hie rro , ade más de l ge n rpo I que no rmalme nte no re spo nde a la c o nc e ntrac ió n de
hie rro e xtrac e lular (We xle r e t al., 2001). Curio same nte , e n Y. pe stis y Y.
pse udo tube rc ulo sis, se ha de sc ripto que la re spue sta que se o bse rva e n hipo xia e s
similar a la o bse rvada e n insufic ie nc ia de hie rro (Bai e t al., 2007). El fe no tipo de A34
pue de inte rpre tarse a lte rnativame nte c o mo fe no tipo mutante de re spue sta a la
insufic ie nc ia de o xíge no . Esta po sib ilidad de be rá se r inve stigada e xpe rime nta lme nte .
En dic ho mo de lo , RirA de Rhizo b ium de be ría se r re primido po r e l re gulado r plasmídic o
aún no ide ntific ado e n re spue sta a la anae ro bio sis/ mic ro ae ro filia . Po r e ste mo tivo , e l
ag re gado de una c o pia de l g e ne rirA re stable c e ría e l fe no tipo de re spue sta a hie rro
(To dd e t al., 2002).
¿Como se relacionaría este modelo con los resultados obtenidos en las cepas
J251, rirA e irrA de R. leguminosarum cultivadas en insuficiencia de hierro? Una c e pa
mutante e n la re spue sta a hie rro / he mo pre se ntaría un fe no tipo abe rrante e n
c o ndic ió n de sufic ie nc ia de hie rro ya que e staría e xpre sando e n fo rma c o nstitutiva
ge ne s de c aptac ió n de hie rro po r e je mplo a travé s de side ró fo ro s, de c aptac ió n de
he mo y e stimulando e l c o nsumo de hie rro a lmac e nado e n bac te rio fe rritinas (Ve r
Capitulo 2, Intro duc c ió n). El de sba lanc e e n e l me tabo lismo de l hie rro de las mutante s
e studiadas rirA e IrrA c uando so n c ultivadas e n insufic ie nc ia de hie rro po dría pro vo c ar
una limitac ió n de la c o nc e ntrac ió n de he mo intrac e lular de bido a la inc apac idad de
sinte tizarlo de no vo (po r la insufic ie nc ia de hie rro ) y de bido a la de sre gulac ió n de l
a lmac e namiento de hie rro y he mo . Este he c ho se ría un fac to r limitante e n la b io sínte sis
de c ito c ro mo s invo luc rado s e n la re spirac ió n ae ró bic a o a lte rnativa (Bro o ijmans e t al.,
2009; Han e t al., 1992; Pe de rse n e t al., 2008; Sijpe ste ijn, 1970; Winste dt e t al., 2000; Lo e b ,
1995) y po dría so bre -e stimular la c aptac ió n de he mo a travé s de Hla para satisfac e r
e stas de mandas me tabó lic as. La se c re c ió n pro mine nte de Hla o bse rvada e n las
mutante s rirA y irrA, no se o bse rvaría (ni se o bse rvó e n e ste trabajo de te sis) su pare nta l
iso gé nic a (J251) ya que e l me tabo lismo y a lmac e namie nto de hie rro no se e nc ue ntran
a fe c tado s.
Discusión general
154
¿Cuál sería el rol fisiológico de Hla de acuerdo a las hipótesis planteadas?
Po dría suge rirse que e l ro l fisio ló g ic o de Hla se ría pro ve e r a la bac te ria de g rupo s he mo
para se r inc o rpo rado e n he mo pro te ínas. Co nse nsuando lo s re sultado s o bte nido s e n
Rhizo bium y e n Agro bac te rium, y re inte rpre tando e l fe no tipo de A34 c o mo mutante e n
la re spue sta me diada po r la c o nc e ntrac ió n de o xíge no se po dría pro po ne r que la
se c re c ió n Hla se induc iría e n mic ro ae ro filia / anae ro bio sis.
¿Cómo se relacionaría la captación de hemo mediada por Hla con la
presencia de secuencias de reconocimiento NarL y NarP río arriba del inicio de
transcripción de Hla? En E. c o li, lo s re g ulado re s NarL y NarP so n lo s e fe c to re s
c ito plasmátic o s de lo s siste mas de do s c o mpo ne nte s NarXL y NarQP. Esto s re g ulado re s,
junto a l re g ulado r de l me tabo lismo anae ró bic o Fnr, so n ac tivado re s o re pre so re s
transc ripc io nale s de la re spirac ió n a lte rnativa usando nitrito y nitrato c o mo ac e pto re s
fina le s de e le c tro ne s. El re g ulado r Fnr re spo nde a la insufic ienc ia de o xíg e no y ac tiva la
e xpre sió n de lo s re gulado re s NarXL (Co nstantinido u e t al., 2006; Linc h y Lin, 1996). Se ha
de mo strado me diante e nsayo s he te ró lo g o s que la re spue sta a la limitac ió n de o xíg eno
me diada po r NarL/ NarP e s similar e n Agro bac te rium y E. c o li (Le e e t al., 2003). Estas
e vide nc ias implic an que o rtó lo go s a Nar y NarP e xisten y so n func io na le s e n A.
tume fac ie ns, a pe sar de no habe r sido aún e studiado s y, po r o tro lado , que las
se c ue nc ias de re c o no c imie nto de dic ho s re g ulado re s e staría c o nse rvada e ntre A.
tume fac ie ns y E. c o li. Si Hla e s un he mó fo ro pro ve e do r de g rupo s he mo durante la
re spirac ió n a lte rnativa , se ría e spe rab le que la re g ulac ió n de su se c re c ió n se a
c o nc e rtada c o n la e xpre sió n de g e ne s invo luc rado s e n la re spirac ió n e n c o ndic ió n de
mic ro ae ro filia . Una po sibilidad e s que Hla se a re spo nsable de pro ve e r g rupo s he mo
c uando la c o nc e ntrac ió n de he mo intrac e lular e s ba ja y la po sibilidad de sinte tizarlo
de no vo e s limitada (po r insufic ie nc ia de hie rro ), e n c o nc o rdanc ia c o n la a lta
de manda de he mo e n mic ro ae ro bio sis do nde la re spirac ió n usando nitrato y nitrito
c o mo ac e pto re s fina le s de e le c tro ne s so stie ne la re spirac ió n mic ro ae ró fila usando
o xíge no (Ro c k e t al., 2005; Che n e t al., 2004). Co nsiste nte me nte c o n e sta hipó te sis, la
se c re c ió n de Hla se indujo e n insufic ie nc ia de hie rro y de o xíge no e n Ag ro bac te rium.
Re c ie nte me nte se ha de sc ripto e n Salmo ne lla que e l re gulado r Fur re gula la e xpre sió n
de lo s re gulado re s de re spirac ió n a lte rnativa NarL y NarP a travé s de sARN, e ste nue vo
me c anismo mue stra que Fur re gula ade más de la ho me o stasis de hie rro , la re spirac ió n
usando nitrito y nitrato c o mo ac e pto r de e le c tro ne s (Te ixidó e t al., 2010).
Se rá inte re sante inve stig ar e n e l futuro si e l re gulado r que c o ntiene la mutac ió n
anc e stra l e n la c e pa A34 e s un re gulado r de la familia Fnr que a fe c ta dire c tame nte la
transc ripc ió n de lo s re gulado re s NarL y NarP y, e n c o nse c ue nc ia la transc ripc ió n de
Hla . Si b ien e l plásmido simbió tic o pRL1JI no ha sido se c ue nc iado hasta la fe c ha, e l
Discusión general
155
pSym de la c e pa 3481 (pRL10) a lbe rga un re gulado r de la familia Fnr (pRL100211,
http:/ / www.nc bi.nlm.nih.go v/ ge no me ? Db=ge no me &Cmd=Re trie ve &do pt=Pro te in+Ta
ble &list_uids=19831).
La hipó te sis de que A34 e s mutante e n a lgún re g ulado r de re spue sta a la
limitac ió n de o xige no e stá de ac ue rdo c o n una re g ulac ió n de la se c re c ió n de Hla
c o nse rvada e ntre Agro bac te rium y Rhizo bium y pe rmite c o nse nsuar lo s re sultado s
o bte nido s e n ambas e spe c ie s durante e ste trabajo de te sis.
El fe no tipo o bse rvado e n la mutante aspD e s ple io tró pic o y no se re lac io na
line a lme nte c o n la ause nc ia de hie rro . La c e pa silve stre de A. tume fac ie ns re spo nde a
la de fic ie nc ia de hie rro c o n distinto s c ambio s fisio ló g ic o s; sin e mbargo la c e pa aspD no
pare c e re spo nde r a e sas c o ndic io ne s de la misma mane ra . Se ha e stable c ido e n
nume ro sas bac te rias pató ge nas de e uc ario tas que e l ambiente de ntro de l
ho spe dado r inc luye la ause nc ia de hie rro y de o xíge no y la pre se nc ia de he mo . Po r
e ste mo tivo , e stas se ñale s pue de n se r induc to re s de me c anismo s de virule nc ia (Wilks y
Burkhard; 2007; Litwin y Calde rwo o d, 1993; Bo ule tte y Payne , 2007). Quizás, la fa lta de
inte rac c ió n de Hla (lue g o de unirse a l he mo ) c o n su re c e pto r HlaR e n e l c o nte xto de l
tumo r, no pe rmita se nsar a la mutante aspD que se e nc ue ntra de ntro de l ho spe dado r
Kalanc ho e sp . y po r lo tanto re spo nde r c o n la induc c ió n de lo s ge ne s de virule nc ia . Po r
o tro lado , e l c o nte xto de l tumo r e s anae ró bic o (De e ke n e t al., 2006) y la insufic ie nc ia
de hie rro de l ho spe dado r ge ne ra una c are nc ia nutric io nal de he mo ; una limitac ió n e n
la b io dispo nibilidad de e ste c o fac to r a fe c ta nume ro so s pro c e so s me tabó lic o s, e ntre
e llo s la re spirac ió n, lo c ual de te rmina la supe rvive nc ia bac te riana de ntro de su nic ho
e uc ario ta . Po r lo tanto , e s de e spe rar que c uando A. tume fac ie ns se e nc ue ntra de ntro
de l tumo r, se induzc a una re d re gulato ria que pro mue va la c aptac ió n de he mo
e xtrac e lular a travé s de la se c re c ió n de Hla .
Discusión general
MATERIALES Y MÉTODOS
157
MATERIALES Y METODOS
TÉCNICAS Y ENSAYOS MICROBIOLÓGICO
Condiciones de cultivo y medios
R. le gumino sarum fue c ultivada e n ae ro bio sis e n me dio ric o de tripto na y
e xtrac to de le vadura (TY) (Be ringe r, 1974) o e n me dio mínimo (Y) (She rwo o d, 1970) e n
pre se nc ia de 0.2 % manito l y a 28oC e n ag itac ió n (200 rpm).
A. tume fac ie ns fue c ultivada e n ae ro bio sis e n me dio ric o TY, me dio minimo Y,
me dio minimo AB (The Pro karyo te s, Capitulo 3.1.4) me dio minimo AT (Mo le c ular
Te c hnique s and Me tho ds; www.mo le c ularinfo .c o m) y me dio minimo Y mo dific ado (ve r
mas ade lante ), a 28oC e n ag itac ió n (200 rpm). A. tume fac ie ns fue c ultivada e n
mic ro ae ro filia / anae ro bio sis e n me dio TY o me dio Y mo dific ado . Se armo un dispo sitivo
c o mo se e sque matiza e n e l e sque ma 1. Se utilizaro n plac as de c ultivo de c e lulas
e uc ario tas c o n filtro de 0,45 μM e n la tapa c o nte nie ndo e l me dio de c ultivo (SIGMA-
ALDRICH).
Inic ia lme nte se g ase aro n c o n N2 durante 15 minuto s las plac as c o nte nidas
de ntro de l dispo sitivo , c o n tre s re pe tic io ne s c o n inte rva lo s de 30 minuto s e n ag itac ió n
(200 rpm). Lo s c ultivo s se de jaro n O.N. e n ag itac ió n (200 rpm). Se ino c ularo n 0,5 ml de
un c ultivo e n fase e stac io naria de A. tume fac ie ns e n 50 ml de me dio de c ultivo e n las
plac as y se re pitió e l pro c e dimie nto de g ase o c o n N2 durante 15 minuto s, c o n tre s
Esquema 1: Dispo sitivo dise ñado para e l e studio de las pro te ínas e xtrac e lulare s de
A. tume fac ie ns e n c o ndic io ne s anae ró b ic as
158
re pe tic io ne s c o n inte rvalo s de 30 minuto s e n ag itac ió n (200 rpm). Lo s c ultivo s fue ro n
inc ubado s durante 7 dias a 28 oC c o n ag itac ió n (100 rpm).
Las c e pas de E. c o li fue ro n c ultivadas e n me dio Luria -Be rtani (LB) a 37º C.
Se midió abso rbanc ia de las suspe nsio ne s bac te rianas a 600 nm c o n un
e spe c tro fo tó me tro Ame rsham-Pharmac ia .
Medio Mínimo Y (modificado para A. tumefaciens)
Se pre paró un me dio mínimo Y mo dific ado re spe c to a l de sc ripto po r She rwo o d
(She rwo o d, 1970) e liminando e l suple me nto vitamínic o y e l Fe Cl3 y re e mplazando la
fue nte de c arbo no po r g luc o sa a l 10%.
Medio de Induccion de Virulencia
Se ag re g ó , a l inic io de l c ultivo , Ac e to siringo na (Ac e to syringo ne , 3′,5′-Dime tho xy-
4′-hydro xyac e to phe no ne , SIGMA) disue lta e n EtOH 70% a una c o nc e ntrac io n fina l de
200 mM al me dio Y. La ac e to siringo na se c o nse rvo a – 70 oC.
Para pre parar e l me dio Y, TY o Y mo dific ado só lido s se agre garo n 1,5 g de agar
po r c ada 100 ml de me dio de c ultivo .
Para me dir la ac tividad de g lic anasas e n plac a se suple me ntaro n plac as de
me dio Y (Rhizo bium) o Y mo dific ado (Agro bac te rium) c o n CMC (c arbo xime tilc e lulo sa)
a una c o nc e ntrac ió n fina l de 0,1% ante s de la so lidific ac io n de las plac as.
Se suple me nto c o n Fe Cl3 a l inic io de l c ultivo e n las siguiente s c o nc e ntrac io ne s
fina le s:
Sufic ienc ia de hie rro : 0,2 % ó 37 μM se gún se indic a .
Insufic ienc ia de hie rro : 0,37 μM o sin ag re gado de Fe Cl3 se gún se indic a .
Se uso 2,2 dipiridil (2,2’ Dipyridyl, SIGMA-ALDRICH) disue lto e n H2O milliQ a una
c o nc e ntrac ió n fina l de 200 μM al inic io de l c ultivo . La so luc ió n de 2,2 dipiridil se
c o nse rvó o a 4oC.
Se usó he mo g lo bina bo vina (SIGMA-ALDRICH) disue lta e n H2O milliQ a c o nc e ntrac ió n
fina l de 2 nM, 20 nM o 60 nM se gún se indic a . La so luc ió n de he mo g lo b ina se pre para
nue va c ada ve z y se agre ga a l inic o de l c ultivo .
Materiales y métodos
159
Se uso he mina (FLUKA) disue lta e n 20 mM de NaOH a una c o nc e ntrac ió n fina l
de 2 nM. La so luc ió n de he mo na se pre para nue va c ada ve z y se agre ga a l inic io de l
c ultivo .
Antibióticos utilizados (concentración final µg/ ml)
Conservación de las cepas bacterianas
La c o nse rvac ió n a largo plazo de las c e pas bac te rianas fue re a lizada po r
c o ng e lamie nto rápido de c ultivo s e n fase lo garítmic a tardía e n c rio tubo s,
suple me ntado s c o n g lic e ro l e sté ril a una c o nc e ntrac ió n fina l de 20% (v/ v). Esto s sto c ks
se c o nse rvaro n po r duplic ado a –20º C y a –80º C.
Antib ió tic o So lve nte
Co nc e ntrac ió n final
E. c o li R. le gumino sarum A tume fac ie ns
mg/ ml µg / ml µg / ml µg / ml
Ampic ilina (Amp) 200 (H2O) 400 - -
Clo ranfe nic o l (Cam) 25 (Etano l, Me tano l)
50 50 -
Ge ntamic ina (Ge n) 20 (H2O) 20 10 -
Kanamic ina (Kan) 50 (H2O) 20 20 -
Espe c tino mic ina (Spc ) 100 (H2O) 200 200 200
Estre pto mic ina (Str) 200 (H2O) 20 400 -
Te trac ic lina (Tc ) 5 (Etano l, 70%
Etano l) 10
5 (TY)
2 (Y) -
Rifampic ina (Rif) 10 (H2O) 20 20 20
Materiales y métodos
160
Cepas y plásmidos utilizados:
Tabla 1: Cepas bacterianas
Cepa Características relevantes Origen o ref.
Escherichia coli
DH5α F-φ80dlac ZΔM15 Δ(lac ZYA-arg F)U169 de o R, re c A1, e ndA1
hsdR17(rk- mk+ pho A supE44 λ- thi-1 gyrA96 re lA1. New England
pRK600 Ce pa he lpe r c o njug ac ió n, Tra+, plásmido mo vilizante CmR. New England
pRK2013 Ce pa he lpe r c o njug ac ió n, plásmido mo vilizante KmR Figurski y Helinski, 1979
pIJ7760 Dh5a c o ntenie ndo fragme nto g e nó mic o de A. tume fac ie ns
C58 c lo nado e n e l ve c to r pCP13 Tc R Downie no publicado
Rhizobium leguminosarum bv. viciae
A31 Ce pa silve stre 8401 sin plásmido simbió tic o SmR Lamb e t al., 1985
A31pIJ7760 A31 c o nte nie ndo a l c ó smido pIJ7760 Esta tesis
A34 De rivado de 8401 c o n e l plásmido simbió tic o
pRL1JI SmR Downie e t al., 1983
A34pIJ7760 A34 c o nte nie ndo a l c ó smido pIJ7760 Esta tesis
A412 (prsD) A34 prsD1::Tn5 Finnie e t al., 1997
A412pIJ7760 A412 c o nte nie ndo a l c ó smido pIJ7760 Esta tesis
A755 (prsE) A34 prsE1:: Ω (Spc R) Russo et al., 2006
A755pIJ7760 A755 c o nte nie ndo a l c ó smido pIJ7760 Esta tesis
A412pHDE-LH A412 c o nte nie ndo a hla-aspDE c lo nado po r PCR
e n pIJ1891. Tc R Esta tesis
A412pFC102 A412 c o nte nie ndo pFC102 Esta tesis
A412pFC89 A412 c o nte nie ndo pFC89 Esta tesis
A412pFC101 A412 c o nte nie ndo pFC101 Esta tesis
412pFC93 A412 c o nte nie ndo pFC93 Esta tesis
J251 Ce pa iso g enic a a A34 sin mutac io n anc e stra l Wexler et al., 1998
J251pIJ7760 J251 c o nte nie ndo a l c ó smido pIJ7760 Esta tesis
rirA (J386) J251 rirA::Tn5 Todd et al., 2002
rirApIJ7760 rirA c o nte nie ndo a l c ó smido pIJ7760 Esta tesis
irrA (J386) J251 irrA:: Tn5lac Wexler et al., 2003
irrApIJ7760 irrA c o nte nie ndo a l c ó smido pIJ7760 Esta tesis
Materiales y métodos
161
Agrobacterium tumefaciens
C58 Ce pa silve stre Downie no publicado
58pIJ7760 C58 c o nte nie ndo a l c o smido pIJ7760 Esta tesis
aspD C58 aspD:: Ω (Spc R) Esta tesis
aspDpIJ7760 aspD c o nte nie ndo a l c ó smido pIJ7760 Esta tesis
Plásmido Características relevantes Origen o ref.
pBBR1 MCS Ve c to r de c lo nado (Kovach et. al., 1994)
pJQ200 Plásmido suic ida induc ib le po r sac aro sa
(pSAC)(Ge nR). (Quandt y Hynes, 1993)
pHP45Σ Casse tte de re siste nc ia a e spe c tino mic ina (Ω)
e n pHP45 (Prentki y Krisch, 1984)
pBlueScript Ve c to r de c lo nado ; Co lE1 ApR Stratagene
pGEM-T Easy Ve c to r de c lo nado AmpR Promega
pHDE-LH Fragme nto de PCR c o nte nie ndo lo s ge ne s hla-aspDE
e n pIJ1891. Tc R Esta tesis
pIJ1891 pLAFR3 c o n e l sitio de c lo nado múltiple
de pUC118 (Finnie et al., 1997)
pFC102 de rivado de pIJ7760 c o n fragme nto Xho I de ple tado Esta tesis
pFC89 pIJ1891 c o n fragme nto KpnI (hla-aspDE-Atu3381)
de rivado de pIJ7760 Esta tesis
pFC101 de rivado de pFC89 c o n fragme nto Sal I de ple tado Esta tesis
pFC93 de rivado de pFC89 c o n de le c io n frag me nto BamHI Esta tesis
pGEM T-aspD Fragme nto de PCR de 0.9kb c o rre spo ndie nte a aspD
c lo nado e n pGEM T-Easy Esta tesis
pGEM T-aspD::Ω de rivado de pGEM T- aspD inte rrumpido c o n fragme nto Ω
e n sitio BamHI Esta tesis
pSac-aspD::Ω fragme nto Pst I de rivado de pGEM T-aspD::Ω
subc lo nado e n pJQ200 (pSAC) Esta tesis
Conjugación triparental en placa
Se transfirió e l c ó smido pIJ7760 (c e pa dado ra) a las c e pas de Rhizo bium y
Agro bac te rium (c e pa re c e pto ra) usando una c e pa he lpe r de E. c o li (pRK600 o
pRK2013). Bre ve me nte , e n una plac a de me dio TY-ag ar sin antib ió tic o s, se me zc laro n
las tre s c e pas e n la zo na de c o njugac ió n, mie ntras que e n o tra zo na se c o lo c ó c ada
Materiales y métodos
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c e pa po r se parado (zo na c o ntro l). Se inc ubó e sta plac a durante 24 hs a 28 °C y se
re plic ó a me dio TY-agar c o n lo s antib ió tic o s que pe rmitan la se le c c ió n de las
transc o njugante s de inte ré s. Po ste rio rme nte , se a islaro n las c o lo nias transc o njug ante s y
se c o nse rvaro n e n sto c ks bac te riano s.
Análisis de Crecimiento en placa
Para e studiar e l c re c imie nto e n plac a de la c e pa silve stre y la mutante aspD de
A. tume fac ie ns se sig uió e l pro to c o lo de sc ripto po r Kitphati e t al. (Kitphati e t al. 2007)
Bre ve me nte , diluc io ne s se riadas a l dé c imo de un c ultivo ON fue ro n plaque adas e n
me dio TY o TY+2,2 dipiridilo o TY+2,2dipiridilo +20nM he mo g lo b ina . Las plac as fue ro n
inc ubadas durante 2 dias a 28 oC ante s de se r o bse rvadas.
Curva de crecimiento en cultivo líquido Y
Para e studiar e l c re c imie nto e n medio líquido de la c e pa silve stre y la mutante
aspD de A. tume fac ie ns, se re a lizaro n c urvas de c re c imie nto . Para e llo , c ultivo s e n fase
e stac io naria fue ro n diluido s e n me dio Y o Y sin hie rro agre gado a una OD600 de 0,02
unidade s, e sto s c ultivo s fue ro n inc ubado s a 28 OC c o n ag itac ió n y se midió la DO600 a
dife re nte s tie mpo s (e spe c tro fo tó me tro Ame rsham-Pharmac ia ).
Formación de una película en la interfase medio de cultivo-aire
Las c e pas de A. tume fac ie ns fue ro n c ultivadas e n me dio Y mo dific ado a 28 OC
sin ag itac ió n durante 3 dias ante s de o bse rvar la aparic ió n de una pe líc ula e n la
inte rfase me dio de c ultivo -a ire .
Formación de autoagregados
Las c e pas de A. tume fac ie ns fue ro n c ultivadas e n me dio líquido y se o bse rvó la
fo rmac ió n de auto agre gado s de sde e l prime r dia de c ultivo . Lo s auto ag re gado s
fo rmado s po r la c e pa aspD se o bse rvaro n e n to do s lo s me dio s liquido s usado s e n e ste
traba jo de te sis (TY o TY c o n e l ag re g ado de 2,2 dipiridilo , Y, Y mo dific ado para
Agro bac te rium c o n o sin hie rro agre gado c o n o sin he mo g lo bina agre gada),
partie ndo de un ino c ulo pro ve nie nte de plac a (c o n ansa ) o de me dio liquido (diluc ió n
apro ximada 1/ 100)
Materiales y métodos
163
Ensayo de movilidad
Para e studiar la mo vilidad de las c e pas de A. tume fac ie ns, se pre pararo n plac as
de me dio Y mo dific ado c o n 200 μM de Fe Cl3 agre gado o c o n 0,37 mM de Fe Cl3, y se
ag re g o agar a c o nc e ntrac ió n fina l de 0,25 %. Se ino c ularo n las c e pas silve stre C58 y
aspD hundie ndo un e sc arbadie nte e sté ril e mbe bido e n un c ultivo bac te riano e n
e stado e stac io nario de l c re c imie nto . Las plac as fue ro n inc ubadas a 28 OC y lue go de 2
dias se o bse rvó e l ha lo de mo vilidad fo rmado . El e nsayo se midio c o n re g la
milime trada y se re a lizo po r c uatriplic ado c o n 4 re pe tic io ne s.
Transformacion de E. coli.
Se utilizó e l pro to c o lo SEM para la pre parac ió n y transfo rmac ió n de bac te rias
E.c o li c o mpe te nte s de a lta e fic ie nc ia (Ge ne 96: 23-28, 1990).
Transformación de A. tumefaciens
Transformación de A. tumefaciens por electroporación.
Las bac te rias c o mpe te nte s fue ro n pre paradas y transfo rmadas se g ún e l
pro to c o lo de sc ripto po r We n-jun y Fo rde (She n y Fo rde ; 1989).
Transformación de A. tumefaciens por conjugación triparental en placa.
Es muy difíc il g e ne rar mutante s po r do b le re c o mbinac ió n ho mó lo ga a l
c ro mo so ma de Ag ro bac te rium (Ne ste r, c o munic ac ió n pe rso nal; Le e , 2006; Le e e t al.,
2001). La c e pa C58 de Agro bac te rium fue transfo rmada se gún sug e re nc ias de
labo rato rio de l Dr. Ne ste r (ve r c apitulo 4 Re sultado s fig ura 4.5).
Para ge ne rar la mutante aspD la c o nstruc c ió n aspD::Spec fue transfe rida po r
c o njug ac ió n tripare ntal e n plac a a la c e pa silve stre X126 de Agro bac te rium. Lo s
transc o njugante s se se le c c io naro n c ultivando durante 3 dias a 28 OC e n plac as de
me dio ric o TY c o nte nie ndo e l antib ió tic o de l c asse tte (Espe c tino mic ina), de l ve c to r
(Ge ntamic ina) y e l marc ado r de Agro bac te rium (Rifampic ina). Co lo nias a isladas de lo s
transc o njugante s fue ro n c ultivadas durante 3 dias e n me dio liquido TY sin e l ag reg ado
de antib ió tic o s. Po ste rio rme nte , una a líc uo ta de l c ultivo me nc io nado fue transfe rido a
me dio liquido TY c o n e l agre gado de Sac aro sa 5 % y Espe c tino mic ina para induc ir la
do b le re c o mbinac ió n ho mó lo ga y fue ro n c ultivado s durante 3 dias a 28 OC. Una
a líc uo ta de l c ultivo fue plaque ada e n me dio so lido TY c o nte nie ndo Sac aro sa 5 % y
Materiales y métodos
164
Espe c tino mic ina . En prese nc ia de sac aro sa , se pro duc e la se le c c ió n ne gativa de las
bac te rias que no re c o mbinaro n e l g e n inte rrumpido c o n e l ho mó lo go c ro mo so mal.
Co lo nias a isladas de lo s transc o njugante s fue ro n transfe ridas a plac as TY c o nte nie ndo
ge ntamic ina para se le c c io nar lo s c lo ne s hayan pe rdido la re siste nc ia a l antib ió tic o
c o dific ado po r e l ve c to r. La mutac ió n e n e l ge n aspD fue c o nfirmada po r Co lo ny PCR
y po r PCR usando lo s prime rs DELH rv y fw.
Ensayo de virulencia
A. tume fac ie ns C58 o aspD fue c ultivada e n me dio Y mo dific ado hasta a lc anzar
una DO de 0,8 nm. Una a líc uo ta de c ada c ultivo fue transfe rida c o n una pipe ta
Paste ur a he ridas re a lizadas c o n un bisturí e n ta llo u ho jas de Kalanc ho e sp . La planta
se de jó a tempe ratura ambie nte y se o bse rvó a lo s 90 dias la pre se nc ia o ause nc ia de
tumo re s.
Aislamiento del cósmido pIJ7760
Se utilizó una bib lio te c a de c ó smido s de A. tume fac ie ns C58. Esta b ib lio te c a fue
pre parada e n e l labo rato rio de l Dr. J. Allan Do wnie e n Jo hn Inne s Ce ntre , e n Re ino
Unido a partir de ADN g e nó mic o de C58 dige rido parc ia lme nte c o n Sau3A y c lo nado
y e mpaque tado e n e l sitio BamHI de l ve c to r pCP13 (Tc R) (de rivado de l ve c to r pLAFR1)
que pue de re plic arse e n E. c o li y Rhizo bium sp . (Darzins y Chakrabarty, 1984). Se
c o njug aro n c o lo nias de la b ib lio te c a c o n la c e pa he lpe r pRK600 y A412 (StrR). Se
se le c c io naro n lo s transc o njugante s Tc R StrR. Co lo nias a isladas de lo s transc o njugante s
fue ro n e nsayadas e n plac as Y CMC para de te c tar aque llo s c ó smido s que
c o mple me ntaban la se c re c ió n de g lic anasas e n la mutante A412 prsD.
Ensayo de inhibición del crecimiento bacteriano
Se e studio si la pre se nc ia de l c ó smido pIJ7760 pro vo c aba ac tividad de inhib ic ió n
de l c re c imie nto e n bac te rias filo ge né tic ame nte re lac io nadas c o n Agro bac te rium y
Rhizo bium. Para e llo se inc o c uló la c e pa a usar c o mo indic ado ra de ac tividad
inhibito ria e n me dio TY c o n ag ar 1,5 % ante s de la so lidific ac ió n de l ag ar. Lue g o de
que las plac as so lidific aro n, se ino c uló e n la supe rfic ie c o n un e sc arbadie nte s e sté ril
que pic o una c o lo nia pro ve nie nte de una plac a fre sc a sin antib ió tic o s, a las c e pas A34
o A34pIJ7760. Se analizó la fo rmac ió n de un halo de inhibic ió n de c re c imie nto
a lre de do r de la c o lo nia lue go de 2-3 días de inc ubac ió n a 28 oC.
Materiales y métodos
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ENSAYOS Y TÉCNICAS BIOQUÍMICAS
Cuantificación de la adhesión celular por Cristal Violeta
Se e studio la adhe sió n bac te riana a lo s lado s y base de plac as de c ultivo de
po lie stire no c o n base plana (Co rning Inc o rpo rate d, Co rning , NY, USA). Para e llo ,
a lic uo tas de 200 μl de un c ultivo e n fase e stac io naria de Agro bac te rium c ultivadas e n
me dio Y mo dific ado , suple me ntado o no c o n Fe Cl3, fue ro n ino c uladas e n plac as de
po lie stire no e inc ubadas po r 24 hs o 48 hs a 28 oC c o n o sin ag itac ió n. Las bac te rias no
anc ladas fue ro n re mo vidas me diante tre s lavado s c o n me dio de c ultivo fre sc o .
Mie ntras que las bac te rias adhe ridas fue ro n c uantific adas po r tinc ió n c o n 0.01 % (w/ v)
c rista l vio le ta (Ac ro s Organic s, Ge e l, Be lg ium) (O'To o le e t al., 1999). El e xc e so de c rista l
vio le ta fue re mo vido po r aspirac ió n y tre s lavado s suc e sivo s c o n ag ua. El c rista l vio le ta
unido fue e xtra ído c o n 1 ml de e tano l 96% y c uantific ado po r me dic ió n de la
abso rbanc ia a 600 nm (A600) utilizando po r lo me no s c uatro ré plic as po r mue stra e n un
e spe c tro fo tó me tro Tite rte k Multiskan Plus (Flo w Labo rato rie s Ltd, Ayrshire , Sc o tland UK).
Columna de afinidad de Hemina
La pro te ína Hla fue so me tida a c o lumna de a finidad de he mina para de te rminar
su ac tividad c o mo he mó fo ro . Se usaro n 50 ml de He mina-agaro sa (FLUKA). Co mo
mue stra se uso e l so bre nadante de la c e pa A34pIJ7760 c ultivada e n me dio TY (que
so bre e xpre sa a Hla) durante 3 dias a 28 oC. El c ultivo se c e ntrifugó y e l pe lle t
bac te riano fue de sc artado . El so bre nadante re sultante se c o nc e ntró 100 ve c e s
usando e l c o nc e ntrado r Vivaspin (GE He althc are ) siguie ndo e l pro to c o lo suge rido po r
e l fabric ante . La mue stra se inc ubó c o n la re sina de hemina-ag aro sa durante 30
minuto s a te mpe ratura ambie nte . Lue go de una bre ve c e ntrifugac ió n (20 se g undo s) se
de sc artó e l so bre nadante y se lavó la re sina 1 ve z c o n PBS 1% Trito n X-100, lue g o se
lavó 1 ve z c o n ag ua milliQ Trito n X100 1% y fina lme nte se lavó 1 ve z c o n c o n agua
milliQ. De spué s de c e ntrifugar 20 se gundo s se de sc artó e l so bre nadante nue vame nte .
Fina lme nte se agre garo n 50 ml de buffe r de pro te ínas SDS-DTT, se ag itó y se inc ubó a
100 OC durante 10 minuto s. Se c e ntrifugó 10 minuto s y e l so bre nadante fue se mbrado
e n ge l de SDS-PAGE 12%.
Preparación de proteínas extracelulares
Las c e pas de R. le gumino sarum, A. tume fac ie ns y E. c o li fue ro n c ultivadas e n
dife re nte s me dio de c ultivo c o n o sin agre gado s de fue nte s de hie rro o c a lc io , 2,2
dipiridilo , ac e to siring o na y/ o he mo g lo b ina o he mina hasta a lc anzar una de nsidad
ó ptic a (OD600nm) de 0.6 (Finnie e t al., 1997). Cuando se e studiaro n las pro te ínas
se c re tadas e n e l e stado e stac io nario lo s c ultivo s fue ro n inc ubado s hasta a lc anzar una
Materiales y métodos
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DO600 de 1,8-2. En e l análisis de pro te ínas e xtrac e lulare s e n mic ro ae ro filia / anae ro bio sis
lo s c ultivo s a lc anzaro n una DO600 de 0,3 0,4. Lue go de la inc ubac ió n lo s c ultivo s fue ro n
c e ntrifugado s a 8000 rpm (So rvall SCL-1500 ro to r) durante 1h a 4 oC. Las pro te ínas
e xtrac e lulare s de l so bre nadante libre de c é lulas fue ro n pre c ipitadas ON (o ve r nig ht)
c o n 10 % TCA a 4 oC. Lue go de c e ntrifugar, las pro te ínas fue ro n re suspe ndidas e n
buffe r de pro te ínas SDS-DTT y analizadas po r SDS-PAGE 12 %.
El e studio de las pro te ínas e xtrac e lulare s se re a lizó me diante e le c tro fo re sis (SDS-
PAGE) 12% sig uie ndo las instruc c io ne s de l fabric ante (MINI-PROTEAN 3 Ce ll, BIO-RAD).
Lue go de la e le c tro fo re sis, las pro te ínas fue ro n te ñidas c o n una so luc ió n de Co o massie
Brillant Blue R250 (0.1 % (p/ v) e n MeOH 40 % y 10 % ac é tic o ) y de c o lo radas c o n una
so luc ió n 7 % ác ido ac é tic o , 20 % Me OH.
Transferencia a membrana de PVDF
Algunas pro te ínas fue ro n transfe ridas a me mbrana de PVDF para se c ue nc iar su
e xtre mo N-te r. Lue g o de la e le c tro fo re sis de las mue stras e n g e l SDS–PAGE 12 % La
transfe re nc ia de pro te ínas e xtrac e lulare s a me mbrana de PVDF se re a lizó seg ún
instruc c io ne s de l fabric ante (MINI-PROTEAN 3 Ce ll, BIO-RAD). Las pro te ínas transfe ridas
se tiñie ro n c o n Ro jo Po nc e au S (0,1% e n ác ido ac é tic o 1%) y se de c o lo raro n c o n H2O.
La banda de inte ré s fue c o rtada de la me mbrana. La se c ue nc iac ió n de l e xtre mo N-te r
e stuvo a c argo de la Dra . Susana Linske ns, de l Labo rato rio Nac io nal de Inve stig ac ió n y
Se rvic io s e n Pé ptido s y Pro te ínas (Co nic e t, UBA) de l Instituto Lanais-Pro de la Fac ultad
de Farmac ia y Bio químic a de Bue no s Aire s.
Tratamiento de proteínas extracelulares con proteinasa K
Para e studiar la c o ntaminac ió n de pro te ínas e xtrac e lulare s c o n e xo po lisac árido s
se trataro n las mue stras c o n Pro te inasa K 0.2 % (p/ v) e n Tris HCl 10 mM pH 6.8
(c o nc e ntrac ió n fina l) durante 2 hs a 37oC. La pro te inasa K (SIGMA) e s una
se rinpro te asa no e spe c ífic a c o n a lta ac tividad e spe c ífic a .
Tinción con rojo congo al 0.001 %
A partir de c o lo nias a isladas, se se mbró c o n un e sc arbadie nte s e sté ril la c e pa a
e studiar e n plac as Y mo dific ado -agar c o nte nie ndo 0.001 % de ro jo c o ngo . Se inc ubó
durante 72 hs a 28oC, hasta o bte ne r un diáme tro apro piado de c re c imie nto
bac te riano (de 1 c m apro x.). El ro jo c o ngo a l 0.001 % se e mple a para de te c tar (1-4) β-
D-g luc o piranó sido s se c re tado s, princ ipalme nte la c e lulo sa . Las c o lo nias pro duc to ras
de fibrillas de c e lulo sa adquie re n c o lo rac ió n ro ja , mie ntras que las que no pro duc e n
e ste po lisac árido so n de c o lo r b lanque c ino (Ausme e s e t al., 1999; Spie rs e t al., 2003).
Materiales y métodos
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Ensayo de actividad de glicanasas/ degradación de CMC en placa
Co lo nias a isladas de las bac te rias a e studiar fue ro n se mbradas e n plac as de
me dio Y suple me ntadas c o n CMC 0,1%. Se inc ubaro n durante 72 hs, hasta o bte ne r un
diáme tro apro piado de c re c imie nto bac te riano . Po ste rio rme nte se lavaro n las
bac te rias de la plac a c o lo c ando ag ua de stilada (no e sté ril). Se c ubrió la supe rfic ie de l
ag ar c o n 6 ml de una so luc ió n de Ro jo Co ng o 0.15 % (p/ v), y se de jó e n ag itac ió n
durante 15 minuto s a te mpe ratura ambie nte . Se de sc artó e l c o lo rante y se e njuagó
c o n 1 M NaCl, durante 5 minuto s (c o n ag itac ió n). Finalme nte se fijó e l c o lo rante
e mple ando ác ido ac é tic o 5%, ag itando durante 5 minuto s. El c o lo rante c ambia de l
c o lo r ro jo a l azul vio lác e o , pe rmane c ie ndo inc o lo ra la zo na do nde se de g radó la
CMC. La ac tividad g lic o lític a bac te riana se de te c ta c o mo fa lta de c o lo rac ió n o
ac laramie nto de la tinc ió n c o n Ro jo Co ngo e n la zo na de c re c imie nto bac te riano .
Produccion de HSL (Homo serin lactonas)
Se utilizó e l pro to c o lo de sc ripto po r Mc Cle an e t al. (Mc Cle an e t al., 1997)
Bre ve me nte , c o lo nias a isladas de bac te rias a e studiar c o mo pro duc to ras de HSL
fue ro n se mbradas c o n un e sc arbadie nte e sté ril so bre una c apa de me dio TY
c o nte nie ndo la c e pa indic ado ra Chro mo bac te rium vio lac e um. Las HSL induc e n la
pro duc c ió n e n C. vio lac e um de un pigme nto , vio lac e ina , que se manifie sta c o mo un
halo vio le ta a lre de do r de la c o lo nia pro duc to ra de HSL (Mc Cle an e t al.1997).
Producción de sideróforos
Se e studió la pro duc c ió n de side ró fo ro s e n las c e pas silve stre y aspD de
Agro bac te rium. Se usó e l pro to c o lo de sc ripto po r Sc hwyn y Ne ilands (Sc hwyn y
Ne ilands, 1987). Bre ve me nte , se pre paran plac as c o nte nie ndo me dio Y sin e l
ag re gado de hie rro e n pre se nc ia de CAS (Cro mo azuro l) (Fluka). Co lo nias a isladas so n
transfe ridas de plac as fre sc as c o n un e sc arbadie nte e sté ril y la plac a se c ultiva
durante 3 dias a 28oC. Cuando un que lante c o mo un side ro fo ro se c re tado re mue ve e l
Fe 3+ de l c o mple jo , e l c o lo r de l me dio vira de l azul a l naranja a lre de do r de la c o lo nia
pro duc to ra e vide nc iado su pre se nc ia .
Materiales y métodos
168
TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR
Manipulación y análisis del ADN. Geles de agarosa. Secuenciación.
El aná lisis y manipulac ió n de l ADN plasmídic o y g e nó mic o me diante re stric c ió n,
las ligac io ne s y c lo nado s se re a lizaro n de ac ue rdo a lo de sc ripto e n Sambro c k, 1989.
La se parac ió n de lo s fragme nto s o bte nido s po r re stric c ió n, amplific ac ió n y e xtrac c ió n
de ADN g enó mic o o plasmídic o fue re a lizada me diante e le c tro fo re sis e n g e le s de
ag aro sa (0.8 y 1.2 % (p/ v)) c o nte nie ndo 1-2 μg / ml de Bro muro de Etidio (Sambro o k,
1989). El pe rfil de bandas o bte nido fue fo to grafiado e n un siste ma dig ita l de
adquisic ió n de imáge ne s. La se c ue nc iac ió n se lle vó a c abo e n e l se rvic io de
se c ue nc iac ió n auto mátic a de la FIL c o n lo s kits Big Dye Te rminato r Che mistry (v1.0) de
Applie d Bio syste ms, e n un se c ue nc iado r ABI 377. El análisis de las se c ue nc ias se re a lizó
c o n e l pro g rama Chro mas Lite , ve rsió n 2.0 de Te c hne lysium Pty Ltd.
Las dige stio ne s c o n e nzimas de re stric c ió n se re alizaro n e n c ada c aso sig uie ndo
e l pro to c o lo de sc ripto po r e l fabric ante . Las ligac io ne s se re a lizaro n usando T4 ADN
lig asa pro vista po r la FIL. Las ligac io ne s e n e l ve c to r pGEM T-Easy se re a lizaro n se gún
pro to c o lo de sc ripto po r e l fabric ante (Pro me g a). Las purific ac io ne s de ADN de a lta
c a lidad para se c ue nc iac ió n o para c lo nado s se re a lizaro n usando e l kit WIZARD
(Pro me ga) o re a lizando lisis a lc a lina . Las pre parac io ne s de ADN de rutina se re a lizaro n
me diante minipre p STET.
Identificación de proteínas mediante MALDI-TOF Y PMF (Matrix Assiste d Lase r De so rptio n
Io nizatio n- Time Of Flight y Pe ptide Mass Frige rprint)
Algunas pro te ínas fue ro n identific adas po r e spe c tro me tría de masa (MS o
MS/ MS). Para e llo , lue g o de la c o rrida de las pro te ínas e n ge le s SDS-PAGE, la banda
c o rre spo ndie nte a la pro te ína a ide ntific ar fue e sc indida de l ge l c o n un b isturí b ie n
limpio , e l pro c e so se lle vo a c abo c o n g uante s para e vitar c o ntaminar las mue stras
pro te ic as. Las mue stras fue ro n analizadas e n e l se rvic io de CEQUIBIEM (Ce ntro de
Estudio s e n Químic a y Bio lo g ia Mo le c ular po r Espe c tro me tria de Masa) a c arg o de la
Dra . Silvia Mo re no de Co lo nna de la FCEN, UBA.
Preparación de ADN plasmídico de E. coli. Miniprep STET
Se c ultivaro n las bac te rias po r 16 hs. e n 2 ml de LB c o n antib ió tic o s. Se
traspasaro n las bac te rias a un tubo de po lipro pile no de 1.5 ml. Se c e ntrifugaro n
máxima ve lo c idad po r 30 se g undo s, lue go se de sc artó e l so bre nadante . Se
re suspe ndió e l pe lle t c o n pipe ta e n 200 μl de STET. Se agre garo n 20 μl de liso zima
(10mg / ml), se me zc ló po r inve rsió n, y se inc ubó 5 minuto s a te mpe ratura ambie nte . Se
Materiales y métodos
169
c o lo c ó la mue stra e n agua hirvie ndo (100°C) durante 1 minuto e xac to . Se c e ntrifugó
15 minuto s a te mpe ratura ambie nte . Se re mo vió e l pe lle t c o n un e sc arbadie nte s e sté ril.
Se agre gó igual vo lume n de iso pro pano l y se de jó a te mperatura ambie nte 15 min. Se
c e ntrifugó 5 min. a te mpe ratura ambie nte , y se de sc artó e l so bre nadante . Se lavó e l
pe lle t c o n 200 μl de e tano l 70 %. Se re suspe ndió e l pe lle t e n ag ua milliQ e sté ril
Buffe r STET
8 % sac aro sa
50 mM EDTA pH 8
50 mM Tris-HCl pH 8
0.5 % Tritó n X-100
Liso zima 10 mg / ml (a lmac e nar a –20oC)
Preparación de ADN plasmídico de E. coli para secuenciar. Miniprep por lisis alcalina
Se c ultivaro n las bac te rias ON a 37 oC e n e l me dio LB c o n e l antib ió tic o
c o rre spo ndie nte . Se transfirió la suspe nsió n bac te riana a un tubo e ppe ndo rf y se
c e ntrifugó a máxima ve lo c idad 30 se gundo s. Se de sc artó e l so bre nadante . Se
re suspe ndió b ie n e l pe lle t e n 200 µl GTE. Se ag re g ó 10 µl liso zima (50 mg / ml) y se
inc ubó a tempe ratura ambie nte po r 10 minuto s. Se agre garo n 300 µl de 0.2 N NaOH/ 1
% SDS (re c ié n pre parado ), y se me zc ló po r inve rsió n. Se inc ubó 5 minuto s e n hie lo . Se
ne utra lizó la so luc ió n ag re g ando 300 µl de 3M Ac OK pH 4.8 frío , se me zc ló po r inve rsió n,
y se inc ubó 5 minuto s e n hie lo . Se c e ntrifug ó 10 minuto s a te mpe ratura ambie nte . Se
transfirió e l so bre nadante a tubo limpio . Se agre garo n 2 µl de RNasa A (10 mg / ml) y se
inc ubó a 37 oC po r 20 minuto s. Se e xtra jo e l so bre nadante c o n 400 µl de c lo ro fo rmo .
Se me zc ló y se c e ntrifugó 1 minuto para se parar las fase s. Se transfirió la fase ac uo sa a
tubo limpio . Se pre c ipitó e l ADN agre gando un vo lume n de iso pro pano l y
c e ntrifugando 10 minuto s a te mpe ratura ambie nte . Se de sc artó e l so bre nadante . Se
lavó e l pre c ipitado c o n un vo lume n de e tano l 70 %. Fina lme nte se de jó se c ar e l pe lle t y
se re suspe ndió e n TE e sté ril (15 µl).
Soluciones:
GTE 50 mM D-Gluc o sa
25 mM Tris-HCl pH 8
10 mM EDTA pH8
0.5 % Tritó n X-100
Materiales y métodos
170
Preparación de ADN genómico de A. tumefaciens
A partir de un c ultivo inic iado r de 5 ml e n me dio TY inc ubado durante 72 hs a 28
oC (e n fase e stac io naria), se re a lizó una diluc ió n 1:100 e n 50 o 100 ml de TY.
Se c ultivó ON a 28 oC o hasta una OD600 = 0.5. Se c e ntrifugaro n las c é lulas a 8000 rpm
durante 5 minuto s 4 oC (So rvall, ro to r SS-34, c ó digo 05) y se c o nse rvó e l pe lle t.
Se usaro n tubo s plástic o s de 30 ml para So rvall e sté rile s.
Lavados: Se re a lizaro n lo s sig uie nte s lavado s de l pe lle t c e lular, re suspe ndie ndo y
c e ntrifugando e ntre c ada uno apro x. 5 minuto s. Se lavó do s ve c e s c o n 5 ml de TE 20-
0.1 % sarc o sil. Se lavó do s ve c e s c o n 5 ml de TE 20. Se re suspe ndie ro n las c é lulas e n 1ml
de TE-25 % sac aro sa .
Lisis: Se transfirie ro n a tubo s c ó nic o s c o n tapa a ro sc a o e ppe ndo rf y se sig uie ro n lo s
sig uie nte s paso s:
1. Se agre garo n 30 µl de liso zima (50 mg / ml) y 400 µl de EDTA 0.25 M a las c é lulas e n
TE-25 % sac aro sa (1 ml). Se me zc ló po r inve rsió n.
2. Se inc ubó a 37 oC po r 10 minuto s.
3. Se agre garo n 2 ml de ag ua milliQ y 200 µl de SDS 10 %.
4. Se agre garo n 50 µl de RNAsa (10 mg / ml).
5. Se me zc ló e inc ubó a 37 oC durante 15 minuto s.
6. Se ag re g aro n 50 µl de pro te inasa K (10 mg / ml), se me zc ló e inc ubó durante 5
minuto s a 37 oC.
7. Se e xtra jo c o n un vo lúme n igua l de fe no l: c lo ro fo rmo (apro x: 4 ml). Se c e ntrifugó a
4 oC, 5000 rpm po r 15 minuto s. Se transfirió la fase supe rio r (ac uo sa) a un tubo
limpio . Se re pe tió e l pro c e so hasta que la inte rfase que dó limpia .
8. Se e xtra jo c o n igual vo lúme n de c lo ro fo rmo : a lc o ho l iso amílic o (24:1) y se transfirió
la fase supe rio r (ac uo sa ) a un tubo limpio .
Precipitación con Etanol:
Se ag re garo n 1/ 9 vo lúme n (300 µl) de ac e tato de po tasio 3 M pH 4.8 (o de so dio )
y se me zc ló po r inve rsió n. Se ag re garo n 2 vo lúme ne s de e tano l abso luto (6 ml), y se
me zc ló po r inve rsió n. Se c e ntrifugó po r 10 minuto s a máxima ve lo c idad. Se lavó e l
pe lle t c o n e tano l 70 % (500 µl) y se c e ntrifugó 10 minuto s a máxima ve lo c idad. Se re tiró
to do e l e tano l, y se de jó se c ar e l pe lle t. Se re suspe ndió e n vo lume n apro piado de
buffe r TE.
Materiales y métodos
171
Soluciones:
RNAsa 10 mg / ml
Liso zima 50 mg / ml
Pro te inasa K 10 mg / ml
EDTA 0.25 M pH 8
Fe no l:Clo ro fo rmo (1:1)
Clo ro fo rmo : a lc o ho l iso amílic o (24:1)
SDS 10 % (e n agua milliQ e sté ril)
Sarc o sil 10 % (e n agua milliQ. auto c lavar)
NaCl 5 M (e n agua milliQ. auto c lavar)
TE20: 50 mM Tris, 20 mM EDTA, 1 M NaCl (pH 7). Para 100 ml: 5 ml de 1 M Tris HCl pH 7; 8
ml 0.25 M EDTA pH 8; 20 ml 5 M NaCl; 67 ml agua milliQ. (auto c lavar)
TE20-0.1 % sarcosil: Ag reg ar 300 µl de sarc o sil 10 % a 30 ml de TE 20.
TE: 10 mM Tris, 1 mM EDTA. Para 20 ml: 200 µl de 1 M Tris HCl pH 8; 80 µl 0.25 M EDTA pH 8
lle var a vo lúme n c o n agua milliQ (auto c lavar).
TE-25 % sacarosa: En 10 ml TE agre gar 2.5 g de sac aro sa (auto c lavar).
Amplificación de secuencias nucleotídicas mediante PCR (Reacción en Cadena
de la Polimerasa)
La amplific ac ió n de g e ne s po r PCR se re a lizó usando o lig o nuc le ó tido s
e spe c ífic o s dise ñado s e n base a se c ue nc ias public adas de lo s ge ne s de inte ré s. Se usó
la e nzima Taq po lime rasa pro vista po r la FIL o la e nzima Pfu po lime rasa (Pro me ga)
se gún suge re nc ias de l fabric ante . Lo s pro duc to s o bte nido s fue ro n se c ue nc iado s y
c lo nado s e n e l ve c to r pGEM–T e asy (Pro me ga) siguie ndo e l pro to c o lo suge rido po r e l
fabric ante .
Ciclos de PCR. En todas las PCR realizadas se utilizó el mismo protocolo:
• 1 c ic lo de 94o C durante 5 minuto s.
• 35 c ic lo s de : 94o C durante 2 minuto s; (To hibridac ió n de l o ligo nuc le ó tido ) o C
durante 1 minuto ; 72o C durante 1 minuto .
• 1 c ic lo de 72o C durante 8 minuto s.
Materiales y métodos
172
Colony PCR
Para c o nfirmar la mutac ió n aspD::Spe c se e mple ó c o mo mo lde ADN to ta l
pro ve nie nte de c o lo nias transc o njug ante s de A. tume fac ie ns e spe c tino mic ina
re siste nte s y ge ntamic ina se nsib le s. Co n un e sc arbadie nte s e sté ril se pic ó la c o lo nia
de inte ré s y se re suspe ndió e n 50 μl de ag ua milliQ e sté ril. Esta suspe nsió n fue so me tida
durante 5 minuto s a 94º C y lue g o fue c e ntrifugada a 10000 rpm po r 30 se g undo s. Se
utilizaro n 5 μl de l so bre nadante c o mo fue nte de ADN mo lde e n la re ac c ió n de
amplific ac ió n de sc ripta pre viame nte .
Oligonucleótidos utilizados
No mbre Se c ue nc ia de 5´ a 3´ TM
T7 GTAATACGACTCACTATAGGGC 51,9OC
T3 AATTAACCCTCACTAAAGGG 49,3OC
SP6 ATTTAGGTGACACTATAGAATAC 47,3OC
HDE-LH GCTTCGTTTCGCCGTCAA 56,4OC
DEL-H rv CGTCACCGCCATATTGCTA 55,0OC
DE-LH fw GGACTTCATTTTCGCCAGC 54,5OC
DE-LH int1 rv GGTGGTGATGTCAGCCGC 59,3OC
DE-LH int1 fw GCCGCTCGTCAACCGCAT 61,7OC
DE-LH int2 rv GCTCATCCAGACGCTTGG 56,2OC
DE-LH int2 fw CCATATCGGTTATCTGCC 49,7OC
Clonado del locus hla-aspDE.
Se dise ñaro n prime r e spe ífic o s para amplific ar po r PCR un frag me nto de 4,178
Kba que c o ntiene a l c lúste r Hla-aspDE inc luye ndo 215 pare s de base s río arriba de l
inic io de transc ripc ió n de Hla (prime rs HDE-LH fw y DE-LH rv). Este frag me nto fue
c lo nado e n e l plásmido pGEM T-Easy (Pro me g a), subc lo nado e n e l sitio No tI de l ve c to r
pBlue Sc ript SK (Stratag ene ) y fina lme nte subc lo nado e n e l ve c to r de ba jo núme ro de
c o pias pIJ1891 (Staskawic z e t. al., 1987). La c o nstruc c ió n fue c o nfirmada po r dig estió n
e nzimátic a usando las e nzimas No tI y se c ue nc iac ió n. La fide lidad de la se c ue nc ia
c lo nada se e studió utilizando lo s prime rs HDE-LH, DE-LH (fw y rv), DE-LH int 1 (fw y rv) y
DE-LH int 2(fw y rv). Esta c o nstruc c ió n, de no minada pHDE-LH fue transfe rida po r
Materiales y métodos
173
c o njug ac ió n tripare nta l a las c e pas mutante s de R. le gumino sarum A412 prsD y A755
prsE.
Subclonado de pIJ7760
Construcción pFC102 (hla-aspDE depletado de pIJ7760): El c ó smido pIJ7760 fue
dig e rido c o n la e nzima de re stric c ió n Xho I. Esta e nzima c o rta 863 pare s de base s rio
arriba de Hla y 3450 pare s de base s rio de bajo de aspE. Po ste rio rme nte se ligó e n ba ja
diluc ió n para favo re c e r e l re ligado de l plásmido e xc luye ndo e l fragme nto de 8202 pb
que c o ntie ne a lo s ge ne s hla , aspD, aspE, Atu3381, Atu3380 y Atu3379. La c o nstruc c ió n
fue c o nfirmada po r re stric c ió n e nzimátic a y transfe rida po r c o njug ac ió n tripare nta l a la
c e pa A412 de R. le gumino sarum 8401 pRL1JI.
Construcción pFC89 (hla-aspDE): El c ó smido pIJ7760 fue dig e rido c o n la e nzima KpnI
que ge ne ra un frag me nto de 5583 pb que c o ntie ne a lo s g e ne s hla , aspD, aspE y e l o rf
Atu3381. Esta e nzima c o rta 30 pb río arriba de l inic io de transc ripc ió n de hla y te rmina
1640 pb lue g o de l c o dó n sto p de aspE, e n e sta c o nstruc c ió n e stá inc luído ade más e l
ge n c o dific ado río abajo de aspE, Atu3381. El fragme nto fue purific ado y ligado e n e l
sitio KpnI de l ve c to r pIJ1891. La c o nstruc c ió n fue c o nfirmada po r re stric c ió n e nzimátic a
usando la e nzima KpnI. La c o nstruc c ió n fue transfe rida po r c o njug ac ió n tripare nta l a la
c e pa A412 de R. le gumino sarum 8401 pRL1JI.
Construcción pFC101 (aspDE): La c o nstruc c ió n pFC89 fue dige rida c o n la e nzima SalI
que e xc luye las prime ras 240 pb de hla y c o rta e n e l ve c to r pIJ1891. Po r pro ble mas de
inc o mpatib ilidad c o n las e nzimas de re stric c ió n utilizadas, e l fragme nto de re stric c ió n
de 5316 pb c o nte nie ndo parc ia lme nte la se c ue nc ia de hla pe ro a lo s ge ne s aspD,
aspE y Atu3381 c o mple to s, fue ligada e n e l sitio SalI de l ve c to r pBBR1 MCS (Ko vac h e t.
al., 1994). En e sta c o nstruc c ió n e sta inc luído ade más e l ge n c o dific ado río aba jo de
aspE, Atu3381. La c o nstruc c ió n fue c o nfirmada po r re stric c ió n e nzimátic a y transfe rida
po r c o njug ac ió n triparenta l a la c e pa A412 de R. le gumino sarum 8401 pRL1JI.
Construcción pFC93 (hla): La c o nstruc c ió n pFC89 fue dige rida c o n la e nzima BamHI
que c o rta 530 pb río aba jo de l inic io de transc ripc ió n de aspD y e n e l ve c to r pIJ1891.
Po ste rio rme nte se ligó e n ba ja diluc ió n para favo re c e r e l re ligado e xc luye ndo un
frag me nto de 2112 pb c o nte nie ndo parc ia lme nte a l ge n aspD y a l ge n aspE
c o mple to . La c o nstruc c ió n se inic ia 30 pb río arriba de l ge n hla e inc luye las prime ras
1314 pb de l ge n aspD y fue c o nfirmada po r re stric c ió n e nzimátic a . La c o nstruc c ió n fue
transfe rida po r c o njugac ió n tripare nta l a la c e pa A412 de R. le g umino sarum 8401
pRL1JI.
Materiales y métodos
174
Generación de la mutante de gen aspD: Se inte rrumpió e l ge ne s aspD me diante la
inse rc ió n de un c asse tte (fragme nto Ω) de 2 kb de re siste nc ia a l antib ió tic o
e spe c tino mic ina . Para e llo , e l ge n aspD fue amplific ado po r PCR usando lo s prime rs
DELH rv y DELH fw. El fragme nto fue c lo nado e n e l ve c to r pGEM T-Easy (Pro me ga)
ge ne rando la c o nstruc c ió n pGEM T-Easy aspD. El fragme nto Ω de l ve c to r pPH45Ω
(Pre ntki y Krisc h, 1984) que c o nfie re re siste nc ia a e spe c tino mic ina (Spc ) fue dige rido
c o n la e nzima BamHI. La c o nstruc c ió n pGEM T-Easy aspD po se e un únic o sitio de
re stric c ió n para la e nzima BamHI que inte rrumpe la se c ue nc ia nuc le o tídic a de aspD.
Esta c o nstruc c ió n fue d ige rida c o n la e nzima BamHI y ligada c o n e l fragme nto Ω
dig e rida c o n BamHI ge ne rando la c o nstruc c ió n pGEM T-Easy aspD::Ω. La c o nstruc c ió n
fue c o nfirmada po r PCR usando lo s prime rs de l ve c to r (SP6 y T7). El ge n aspD
inte rrumpido c o n e l frag me nto Ω fue c o rtado de l ve c to r pGEM T-Easy c o n la e nzima
PstI, la dige stió n fue so me tida a e le c tro fo re sis e n ge l de ag aro sa 1% y e l fragme nto
aspD::Ω fue purific ado de l g e l y ligado e n e l sitio PstI de l ve c to r pJQ200. La
c o nstruc c ió n fue c o nfirmada po r re stric c ió n e nzimátic a y po r se c ue nc iac ió n usando
lo s prime rs DE-LH int2 (fw y rv).
Secuenciación parcial de pIJ7760 mediante subclonado en pBlueScript
El c ó smido pIJ7760 fue dige rido c o n la e nzima Ec o RI. La e nzima Ec o RI fue
inac tivada po r c a lo r y lo s pro duc to s de la dig estió n fue ro n ligado s e n masa e n e l sitio
Ec o RI de l ve c to r pBlue Sc ript. E. c o li fue transfo rmada c o n la ligac ió n e n masa
pre parada me diante Sho c k té rmic o (Pro to c o lo SEM). Se c o nfirmó e n ge le s de agaro sa
1% que to do s lo s frag me nto s de la re stric c ió n e nzimátic a de pIJ7760 hayan sido
c lo nado s e n e l plásmido pBlue Sc ript. Lo s c lo ne s fue ro n se c ue nc iado s parc ia lme nte
usando lo s prime rs T7 y T3 para ubic ar e l frag me nto c lo nado e n pIJ7760 e n e l g e no ma
de A. tume fac ie ns C58.
Análisis bioinformático
La se c ue nc ia g e nó mic a de Agro bac te rium se o btuvo de l sitio we b de
Agro bac te rium (de pts.washingto n.e du/ agro / ). Lo s siguie nte s pro gramas fue ro n
utilizado s para e studiar las se c ue nc ias nuc le o tídic as y pro te ic as:
Operon prediction: Predicción de operones:
Sitio web de Agrobacterium:
de pts.washingto n.e du/ agro / o pe ro ns/ c 58a ll6jan08/ que ry_o pe ro n_display.html
Base de datos UBER:
c sb l.bmb.uga .e du/ ube r
Materiales y métodos
175
Base de datos VIMSS:
www.mic ro be so nline .o rg / o pe ro ns/ gnc 176299.html
Conserved Domains: Búsqueda de dominios conservados:
www.nc bi.nlm.nih.g o v/ Struc ture / c dd/ wrpsb .c g i
AgroCyc: Predicción de vías metabólicas en las que podría estar implicado un gen:
bio c yc .o rg / AGRO/ NEW-IMAGE? type =GENE-IN-CHROM-BROWSER&o bje c t=ATU3383
Motif Scan: Búsqueda de motivos conservados:
hits.isb -sib .c h/ c g i-b in/ PFSCAN
TMHMM: Predicción de dominios transmembrana:
www.c bs.dtu.dk/ se rvic e s/ TMHMM/
ClustalW: Alineamiento de secuencias y cladograma:
www.e b i.ac .uk/ To o ls/ c lusta lw2/ inde x.html
Signal Peptide Prediction: Predicción de secuencias señal en proteínas:
bmbpc u36.le e ds.ac .uk/ pro t_ana lysis/ Sig nal.html
Búsqueda de secuencias promotoras:
PromScan: mo lb io l-to o ls.c a / pro msc an/
BPROM (Sofberry): linux1.so ftbe rry.c o m/ be rry.phtml
ExPASy: Predicción de peso molecular:
http:/ / www.e xpasy.c h/ to o ls/ pi_to o l.html
Mascot: Análisis de espectrometría de masa y PMF de proteínas:
www.matrixsc ie nc e .c o m/ se arc h_fo rm_se le c t.html
MS DIGEST: Anólisis de digestión tríptica teórica de proteínas:
http:/ / pro spe c to r.uc sf.e du/ pro spe c to r/ c g i-b in/ msfo rm.c g i? fo rm=msdige st
BlasT: Comparación de secuencias nucleotídicas y proteicas:
http:/ / b last.nc bi.nlm.nih.go v/ Blast.c g i
Materiales y métodos
BIBLIOGRAFÍA
177
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