IDENTIFICACIN Y CARACTERIZACIN BIOQUMICA, MORFOLGICA Y MOLECULAR DE MICROORGANISMOS CULTIVABLES ASOCIADOS A

LA RIZOSFERA Y AL SUSTRATO DE PLANTAS DE VAINILLA

CLAUDIA LUCA LVAREZ LPEZ

Tesis de Maestra presentada para optar al ttulo de Magster en Ciencias-Geomorfologa y Suelos

Director

MAURICIO MARN MONTOYA, Ph.D.

Codirector

WALTER OSORIO VEGA, Ph.D.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE MEDELLN

FACULTAD DE CIENCIAS 2012

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Los abajo firmantes certificamos que hemos ledo este documento y que, en nuestra

opinin, es satisfactoria en calidad, profundidad y competencia como Tesis para el

grado de Magister en Ciencias - Geomorfologa y Suelos.

Comit de evaluadores:

_________________________________________ Jurado 1

_________________________________________ Jurado 2

_________________________________________

Director

_________________________________________

Codirector

iii

DEDICATORIA

A mis hijitas Sofia y Susana que son lo ms lindo de mi vida, por toda la paciencia,

amor y comprensin que tuvieron durante estos aos de estudio.

A mi esposo Walter a quien amo, respeto y admiro. Gracias por tus enseanzas, y por

ser un ejemplo a seguir.

A mis padres por todo el amor, apoyo y acompaamiento que recib durante este

proceso.

iv

RECONOCIMIENTO

Esta investigacin fue financiada por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de

Colombia a travs del proyecto Cultivo e Industrializacin de la Vainilla en Colombia

Contrato No. 082-2008V6151-3701 de la Universidad Nacional de Colombia sede

Medelln en convenio con CORANTIOQUIA y la empresa BIOANDES Ltda.

v

AGRADECIMIENTOS

Quiero agardecer a Mauricio Marn, mi profesor, no slo por haber sido un excelente

gua en este trabajo, sino por su apoyo, sus enseanzas, su dedicacin y amistad.

Gracias por todo lo que pude aprender, no slo en aspectos acadmicos sino de calidad

humana.

Al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural por la financiacin del proyecto

Cultivo e industrializacin de la vainilla en Colombia del cual hace parte este trabajo.

Y a las entidades que de una u otra manera participaron para que este proyecto fuera una

realidad.

A la profesora Mara Claudia Dez por su liderazgo y apoyo en la ejecucin del

proyecto.

A la profesora Olga Montoya y su equipo del laboratorio de Microbiologa por el apoyo

en apartes de esta investigacin.

A Carolina Santa y dems compaeros del laboratorio de Biologa Celular y Molecular

por su ayuda en diferentes fases de la investigacin.

A mis compaeros de la maestra por su apoyo moral y su amistad.

A Walter, por su paciencia, por sus valiosos aportes para enriquecer este proyecto y por

su dedicacin a las nias mientras yo adelantaba mis estudios.

vi

RESUMEN

El cultivo de la vainilla (Vanilla planifolia) es altamente promisorio en Colombia; sin embargo,

poco se conoce acerca de su manejo nutricional y mucho menos sobre el uso de

microorganismos benficos con potencial biofertilizante. Este estudio se plante con el objetivo

de evaluar la actividad in vitro de microorganismos rizosfricos de plantas de vainilla, en

procesos de transformacin de nutrientes tales como amonificacin, solubilizacin de fosfatos

orgnicos e inorgnicos, degradacin de celulosa y fijacin biolgica de nitrgeno. Los

microorganismos se aislaron en medios de cultivo selectivos y se clasificaron en los siguientes

grupos funcionales a partir de pruebas in vitro: celulolticos (CEL), proteolticos/amonificantes

(PROT), fijadores de nitrgeno atmosfrico (FBN) y solubilizadores de fosfato orgnico (FIT) e

inorgnico (PSM). De los aislamientos originalmente obtenidos, se seleccion para la

identificacin molecular, al menos una cepa de cada tipo morfolgico diferenciable en cada

medio, siendo evaluadas 44 cepas bacteriales y 8 micticas. La identificacin taxonmica de los

aislamientos de hongos se realiz con base en la amplificacin de las regiones ITS1-5.8S-ITS2

del ADNr. Para el caso de las bacterias se amplific la subunidad pequea (16S) del ADNr. Los

CEL ms eficientes fueron los hongos Penicillium griseofulvum y Aspergillus fumigatus, los

PROT fueron identificados como bacterias del complejo Bacillus cereus y Serratia sp. Los FBN

fueron tres cepas de Pseudomonas koreensis, en los cual se confirm la presencia del gen nifH.

El ms sobresaliente FIT fue un hongo de la especie Plectosphaerella cucumerina. Los PSM

ms efectivos correspondieron a dos bacterias, una filogenticamente relacionada con el gnero

Serratia y la otra identificada como Pseudomonas koreensis. Se realiz una confirmacin

fenotpica de la identidad de aquellos microorganismos que resultaron ms eficientes en las

diferentes pruebas in vitro, mediante series bioqumicas, para el caso de las bacterias, y

observaciones morfolgicas para los hongos. Los resultados de esta investigacin sugieren que

existe un alto potencial para desarrollar biofertilizantes a partir de los microorganismos

rizosfricos de vainilla, que redunden en el mejoramiento de la nutricin, el crecimiento y la

sanidad vegetal de los cultivos comerciales de esta especie en Colombia.

Palabras clave: celulolticos, proteolticos, -amonificantes, microorganismos solubilizadres de

fosfato, fijacin asimbitica de nitrgeno.

vii

MOLECULAR, BIOCHEMICAL, AND MORPHOLOGICAL IDENTIFICATION OF MICROORGANISMS ASSOCIATED TO THE

RHIZOSPHERE AND SUBSTRATE OF VANILLA PLANTS

ABSTRACT

The cultivation of vanilla (Vanilla planifolia) is highly promising in Colombia; however, little is

known about the management of the crop, specifically in regard to its nutrition, and even less is

known about the effects of beneficial rhizosphere microorganisms, which have the potential to

serve as biofertilizers. This study concerned the in vitro evaluation of these microorganisms as

functional groups to determine their potential use as biofertilizers. The microbes were isolated

in selective media for functional groups such as cellulolytic (CEL), proteolytic/amonifiers

(PROT), organic (FIT) and inorganic phosphate solubilizers (PSM), and asymbiotic nitrogen

fixing bacteria (FBN). After isolation and purification, DNA was extracted from 52 microbial

isolates in order to proceed with molecular identification based on ITS and 16S rDNA

sequencing for fungi and bacteria, respectively. The results indicated that the most effective

CEL were Penicillium griseofulvum and Aspergillus fumigatus. Those significant for their

activity as PROT were identified as bacteria belonging to the Bacillus cereus complex and

Serratia sp. Among the FBN there were three isolates belonging to Pseudomonas koreensis that

stood out as being abundant and fast-growing in the selective medium; moreover, it was

confirmed that the gen nifH was present in these isolates and was responsible for this activity.

The most efficient FIT was a fungus phylogenetically related to Plectosphaerella cucumerina.

Finally, the most effective PSM corresponded to two bacteria, one of which is phylogenetically

related to the genus Serratia and the other to the genus Pseudomonas koreensis. The abundance

and diversity of rhizosphere microorganisms found was significant; furthermore, some of the

microorganisms showed high potential to be used as biofertilizers that could serve to improve

the nutrition, growth and health of vanilla plants.

Keywords: cellulolytic, proteolytic, amonifyers, phosphate solubilizers, asymbiotic N2-fixers.

viii

TABLA DE CONTENIDO

Pg.

Reconocimiento..... iv

Agradecimientos v

Resumen. vi

Abstract....................................................................................................... ......... vii

Lista de Tablas...... x

Lista de Figuras. xii

Anexos. xv

CAPITUO 1. INTRODUCCIN.. 1

1.1. Objetivos.. 3

1.1.1. Objetivo general....... 3

1.1.2. Objetivos especficos. 3

1.2. Referencias... 3

CAPITULO 2. MARCO TERICO 5

2.1. Generalidades del cultivo de vainilla........ 5

2.2. Microorganismos asociados a la nutricin de plantas.......... 9

2.2.1. Ecologa de los microorganismos promotores del

crecimiento de las plantas....... 9

2.2.2. Mecanismos de promocin del crecimiento en las plantas....... 10

2.3. Grupos funcionales de microorganismos..... 12

2.3.1. Microorganismos celulolticos.. 12

2.3.2. Microorganismos Proteolticos-amonificantes.. 14

2.3.3. Microorganismos solubilizadores de fosfato..... 15

2.3.4. Bacterias fijadoras de nitrgeno atmosfrico...... 17

2.3.5. Microorganismos asociados a las races de orqudeas.... 19

2.4. Identificacin molecular de microorganismos. 22

2.5. Mtodos basados en el uso de cidos nucleicos... 26

2.5.1. Hibridizacin molecular..... 27

2.5.2. Tcnicas basadas en PCR... 28

2.5.3. PCR en tiempo real. 29

2.6. Referencias... 30

ix

Pg.

RESULTADOS.. 47

CAPITULO 3. IDENTIFICACIN MOLECULAR

DE MICROORGANISMOS ASOCIA