DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

LICENCIATURA EN BIOLOGÍA EXPERIMENTAL

REPORTE FINAL DEL PR YECTO DOCENTE DE INVESTIGACIÓN:

IDENTIFICACIÓN DE cDNAS INVOLUCRADOS EN LA RECUPERACIÓN DE LA INFECCIÓN DEL VIRUS DEL JASPEADO, EN PLANTAS

TRANSGÉNICAS DE TABACO.

LAURA ALONDRA ORTEGA DE SANTIAGO

MÉXICO, D.F. MAYO 2008

O

1

2 2

Con la aprobación de los asesores:

aboratorio de Fisiología, Bioquímica y Biología Molecular de Plantas. Departamento de Ciencias de la Salud. CBS UAM-Iztapalapa

es Asesor Externo. Laboratorio de Interacciones Planta-Virus Departamento de Ingeniería Genética CINVESTAV Campus Guanajuato

Dra. Laura Josefina Pérez Flores Asesor Interno. L

Dra. Laura Silva Rosal

IND 3 4

1.1 LOS ORGANISMOS

4

plantas. 4 1.1 4

4 hospedero celular. 5

5 s jaspeado del tabaco. 5

RESPUESTA DE LA PLANTA ANTE LA INFECCIÓN VIRAL. 6 Re viral. 7

7 8 8

1.2.1.2.2 Proteínas relacionadas a la patogénesis (PR) 9 iamiento postranscripcional. 10

a (SAR). 12 AN 13

ólogo a SAR8.2c. 14 una proteína parecida a extensina. 14

8, sin homología conocida. 15 ENERAL. 16

4. ICULARES. 16 5. 16 6. 17 7. 17

17 tores 18

19 7 RNA y Northern blot. 20 7.5 20

8. RE 21 8.1 21

o, mediante el método de transformación de 21

PCR en colonia de las células de A. tumefaciens con los genes insertos. 21 Explantes coinoculados. 22 Aparición de brotes enraizados y desarrollo de plantas diferenciadas. 23

8.3 Extracción de RNA y ensayo de Northern blot. 24 8.4 Inoculación de plantas de tabaco con VJT. 25

7. DISCUSIÓN. 26 9. CONCLUSIÓN. 28 10. PERSPECTIVAS. 29 11. BIBLIOGRAFÍA. 29

ICE 1. INTRODUCCIÓN.

GENERALIDADES DE LOS VIRUS (LOS VIRUS YVIVOS)

1.1.1 Virus de .2 Potyvirus.

cas. 1.1.2.1 Característi1.1.2.2 Replicación en un 1.1.2.3 Ecología/Patología. 1.1.2.4 Viru

1.2 1.2.1 sistencia a la infección

1.2.1.1 Resistencia innata. 1.2.1.2 Resistencia específica.

1.2.1.2.1 Resistencia gen/gene.

1.2.1.2.3 Silenc1.2.1.3 Resistencia sistemática adquirid

TECEDENTES. 2.1 Gen 34, hom2.2 Gen 30, homólogo a2.3 Gen 1

3. OBJETIVO G OBJETIVOS PART HIPÓTESIS. ESTRATEGÍA. METODOLOGÍA

7.1 Material biológico 7.2 Construcción de vec7.3 Transformación mediada por A. tumefaciens.

.4 Extracción de Inoculación de plantas de tabaco. SULTADOS Construcción de vectores

8.2 Transformación de plantas de tabacexplantes de hoja.

8.2.18.2.2 8.2.3

3

1 INTRODUCCIÓN. . S DE LOS VIRUS (LOS VIRUS Y LOS ORGANISMOS VIVOS)

s, bacterias iones de su s por éstos

eto. Entre el nosticadas en el reino de las plantas provocadas por la invasión

de patógenos, se encuentran las virales. a viva para variedad de o de RNA;

l caso de los virus de plantas, pueden entrar a la planta por distintos medios ya sea de forma mecánica o utilizando vectores como insectos, infectando distintos órganos desde hojas, raíz o granos de polen.

1.1.2 Potyvirus al consta de

rus, Ipomovirus, Macluravirus, Tymovirus, Tritimovirus, Bymovirus. Los Potyvirus representan al mayor género de virus vegetales de la familia Potyviridae, e infectan un gran ran lan , tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas en la mayoría de

1.1.2.1 Características a o cápside es alargada ro de 12-15

El genoma de los potyvirus es monopartita, se compone de una cadena sencilla de RNA 9.4-10.3 kb de polaridad positiva, es decir, el RNA genómico viral funciona directamente como molde de transcripción sin necesidad de retrotranscribirse a DNA. Lleva en su extremo 5’ una proteína conocida como proteína unida al genoma del virus VPg (por sus siglas en inglés Viral Protein

1.1 GENERALIDADE1.1.1 Virus de plantas.

Se sabe que hay una gran cantidad de patógenos, entre los cuales se encuentran hongoy virus, que al atacar a los organismos vivos pueden causar enfermedades, alteracdesarrollo y hasta la muerte. Las plantas como otros organismos vivos, son afectadopatógenos, pudiendo causar múltiples daños tanto a nivel celular y organismo complgran número de enfermedades diag

Los virus son entes autorreplicantes que requieren la maquinaria de una célulmultiplicarse, ya sea animal, vegetal o bacteriana. Los virus presentan una amplia morfología; de composición genética pueden ser de cadenas sencillas o dobles de DNAasí como divergentes en los mecanismos de entrada y de replicación. En e

Dentro de los múltiples virus que atacan plantas se encuentra la familia Potyviridae, la cuseis géneros: Potyvi

go de p tas hospederaslas regiones climáticas.

Los viriones de los potyvirus consisten de una cadena de RNA y una cubierta proteicconformando una estructura filamentosa no envuelta por cubierta lipídica. La cápside con simetría helicoidal, filamentosa, flexible con una longitud de 680-900 nm y diametnm.

4

genome) y en el extremo 3’ un poli A (de 20 a 60 adenosinas), que le confiere la característica de

o de lectura polipéptido

ealizado por s funcionales y

estructurales. Se cree que la traducción del genoma sigue un mecanismo independiente de Cap.

1.1.2.2 Replicación en un hospedero celular de RNA sub-ar funciones netrar en la s partículas

iliza energía y moléculas de la célula que infecta. Posteriormente los virus sintetizados en la célula infectada, se dispersan a lo largo de la planta, mediante la red de vasos conductores del floema.

edades que , lo que les

cultivos de tas para forraje, árboles frutales y

plantas ornamentales. La infección potyviral puede resultar en mosaicos, moteados, necrosis, clorosis o interrupción del crecimiento de la planta infectada, efectos adversos en la cantidad y

El virus del jaspeado del tabaco (VJT) es un potyvirus, con las características que los distinguen: filamentosos, flexibles de simetría helicoidal, longitud de 730-750nm, diámetro de 12-13 nm, de genoma monopartita, de sentido positivo y cadena sencilla de RNA de aproximadamente 10,000 nucleótidos. En el extremo 5’ tienen una VPg y en el extremo 3’ una región poli A.

actuar como RNAm. El RNA potyviral se encuentra cubierto por monómeros de proteína y tiene un marcabierto (ORF, por sus siglas en inglés: open reading frame) que codifica para un gran(340-370 kDa; 3,000 aminoácidos), que mediante mecanismos de autoprocesamiento rtres proteinasas codificadas por el mismo potyvirus, genera de 8 a 9 proteína

El genoma se replica en el citoplasma. En los potyvirus no se ha demostrado presencia genomico en células infectadas durante la transcripción. Los viriones pueden proporcionde ayuda a otros virus dependientes durante la replicación (ICTVdB, 2006). El virus al pecélula vegetal, se replica y sintetiza las proteínas que requiere para generar nuevavirales, para ello ut

1.1.2.3 Ecología/patología

Este grupo de virus es muy importante en patología debido a la multiplicidad de enfermocasionan. Se caracterizan por ser transmitidos en forma eficiente por vectores áfidospermite diseminarse rápidamente, en general, pueden infectar a la mayoría de losimportancia económica, incluyendo cereales, legumbres, plan

calidad de hojas, frutos o semillas producidas (Brunt, 1996; ICTVdB, 2006)

1.1.2.4 Virus Jaspeado del Tabaco

5

El RNA genómico tiene un solo marco abierto de lectura ORF (por sus iniciales en inglés) y expresa les maduros. sion protein

sable de procesar la mayor parte de la poliproteína producida por el

smisión son persistente,

es decir no requieren un virus auxiliar para la transmisión (Hull, 2002; Urcuqui-Inchimaa et al., 2001).

ue incluye la volvimiento del ácido nucleico, traducción de proteínas

élula-célula,

de acuerdo a la interacción que se presente entre el virus y la planta.

tible, cuando la planta es resistente y el patógeno a. recimiento y

ha visto que la planta eventos de mbios en la

expresión de genes, contrarrestando los daños que provoca el ingreso del agente extraño. ad, como un denominada uirida, SAR)

que se induce en los tejidos alejados del punto de entrada del patógeno. La HR involucra una serie de cambios bioquímicos complejos en y cerca del sitio de infección. Tales como cambios en el flujo iónico, activación de cascadas de señalización, alteraciones en los niveles de transcritos expresados (incluyendo genes que codifican enzimas de la vías fenólica, peroxidasas,

inicialmente una poliproteína que se procesa proteolíticamente en nueve productos viraLa proteína de 49 kDa del VJT, codificada por el cistrón llamado NIa (por Nuclear IncluA), es una proteínasa responvirus durante su ciclo de replicación. El virus es transmitido mediante un vector o inoculación mecánica. Los vectores de traninsectos de la familia Aphididae, con más de 10 especies y se transmite de una forma no

1.2 RESPUESTA DE LA PLANTA ANTE LA INFECCIÓN VIRAL Para completar su ciclo de vida, los virus experimentan un proceso de múltiples pasos qentrada de las células vegetales, desenvirales, replicación del material genético, ensamblaje de nuevos viriones, movimiento cmovimiento sistemico y movimiento planta-planta.Cuando un virus penetra una célula vegetal, pueden desencadenarse varias respuestas

Se dice que hay una interacción incompaavirulento, por lo tanto el patógeno no crece y no se desarrolla la enfermedad en la plantEn la interacción compatible, la planta es susceptible y el patógeno virulento, hay cdispersión del patógeno. Se desarrolla la enfermedad. Existen múltiples estudios de la interacción de la planta con los patógenos y seatacada por patógenos no permanece indiferente, sino que desencadena una serie derespuesta que pueden ir desde la secreción de sustancias, síntesis de moléculas o ca

En los organismos vegetales las respuestas identificadas ante señales de patogenicidsistema defensivo, pueden ser reacciones de defensa local en el punto de infección, reacción hipersensible o HR, o de una respuesta sistémica (resistencia sistémica adq

6

glucanasas y quitinasas, así como de glicoproteínas ricas en hidroxiprolinas), formación de oxido nítrico, lares. Estos

n de ciertas o de muerte

l propósito de contener la infección. (Nimchuk, 2003; Kang, 2005; Reignault y Sancholle, 2005; Keen 1992)

1.2.1 Resistencia a la infección viral Las formas de resistencia que se pueden encontrar en una interacción planta-patógeno, se pueden estudiar de acuerdo a su origen en:

cia

1.2.1.1 Resistencia innata. Puede ser expresada potencialmente por las plantas antes de cualquier contacto entre ellas y sus

epas (razas, ad de planta

sistencia en ue todos los

miembros individualmente o líneas de especies de plantas son resistentes a todas las razas de un tipo de resistencia más común en la resistencia de las

preexistente gión externa

de la pared celular) o a nivel bioquímico: metabolismo secundario y proteínas antimicrobianas o péptidos, defensinas (Reignault y Sancholle, 2005). En ciertos casos el fenómeno esta asociado con una HR visible o necrosis macroscópica invisible de las células del huésped, en muchos casos, sin embargo, no hay respuesta hipersensible en las

moléculas tales como especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés), acumulación de fitoalexinas citotóxicas, depósitos de callos y lignina en las paredes celucambios, conllevan a la alteración en las actividades celulares con la participacióhormonas que participan en la defensa. Como resultado, se desencadena un mecanismcelular programada en las células infectadas con e

Resistencia innata. Resisten específica.

Resistencia adquirida (Király, 2007).

patógenos. Este tipo de resistencia se puede presentar de dos formas: resistencia no específica (general), en la cual una variedad de plantas es resistente a algunas especies patogénicas o algunas cbiotipos, patovares) de un patógeno, y de resistencia específica, en el cual, una variedpuede resistir la infección de uno o algunas cepas patogénicas. Dentro de la resistencia no específica, se encuentra la más grande y durable forma de replantas la resistencia innata generalizada (nonhost resistance), la cual se refiere a q

patógeno dado. A pesar de que, este es elplantas, hay pocos trabajos publicados tratando de explicar el mecanismo de defensaen la resistencia innata. Tales defensas pueden ocurrir a nivel anatómico (cutícula o re

7

plantas infectadas. Además los síntomas asociados con la muerte celular y necrosis de tejidos especies reactivas de oxígeno (ROS) dañinas o los mismo

ROS pueden atacar directamente al patógeno.

ión un genotipo de la planta susceptible de una u

Se pueden tener varios tipos de mecanismos de la resistencia específica. El primero de ellos es la resistencia extrema, en el cual no hay replicación, ni dispersión del virus de la célula inicialmente

lleva a cabo ioquímicos y do al virus o

podría estar asociado a un mecanismo que involucra el reconocimiento y degradación de RNA foráneo mediante silenciamiento genético postranscripcional (PTGS) (Re anch 07).

eno y a sus enes R, fue ostrado que de plantas, oomycetes, ayoría de los

genes R reconoce uno, o en casos limitados dos, moléculas específicas derivadas del patógeno, genética en odificada por

Sin embargo, este simple modelo no ha sido aplicado a casi ningún par R-Avr examinado, únicamente se ha demostrado en dos casos de resistencia a bacterias y un caso de resistencia fúngica. Un modelo más sofisticado de interacción R-Avr involucra el complejo comprendido entre R-proteína contenedora. La “hipótesis guarda”, originalmente propuesta por Van der Biezen y Jones

puede ser a causa de la formación de

1.2.1.2 Resistencia específica. Este tipo de resistencia ocurre cuando en una relacotra manera exhibe resistencia al genotipo de un patógeno.

infectada, no esta asociada con HR. La muerte o el retención del patógeno viral se rápidamente en las plantas infectadas, antes del desarrollo de HR. Los mecanismos bmoleculares no son conocidos. No se sabe que esta inhibiendo, conteniendo o matanpatógeno en plantas resistentes extremas y

ignault y S olle, 2005, Király, 20

1.2.1.2.1 Resistencia gen/gen Este término se refiere a la interacción genética de los genes avr derivados del patógcorrespondientes genes de resistencia (R) en plantas. La resistencia mediada por los gdemostrada originalmente por el trabajo de H.H. Flor (1955). Desde entonces, se ha demlos genes R rigen las interacciones planta-patógeno en la gran variedad de hospederosdirigiendo respuestas a una gran diversidad de patógenos incluidos bacterias, fungis,nematodos, virus e insectos. La resistencia mediada por los genes R es específica; la m

codificadas por los genes avr. Inicialmente la interpretación mecánica más sencilla de laeste sistema es que las proteínas R son el receptor para un ligando, una proteína Avr cel patógeno. (Nimchuk, 2003)

8

(1998), postula que las proteínas R (guardas) están asociadas constitutivamente con proteínas al guardian, da alterar la ctivación del

inicia la cascada de señalizaciones que culminan en la respuesta de resistencia. (Soosar et

inante que desencadene la resistencia mediada por un gen R dado. La permanencia de los genes avr en poblaciones patógenas se debe en gran parte, al hecho de que éstos pueden actuar como factores

el patógeno)

eteniendo el ógeno. Sin embargo, aún en ausencia de un reconocimiento específico, el

ndo que se

El reconocimiento mediado por los genes R en la mayoría de los casos permite una hiperactivación de las respuestas de defensa basales, y se acompaña a menudo de una respuesta hipersensible. Las respue defen res cualitativamente con las

a las proteínas relacionadas a la patogénesis (PR por sus siglas en ingles de eótidos y un repetido de leucinas” (NB-LRR por sus siglas en inglés) nombre dado por sus características estru

ína-proteína,

Un sitio de unión a nucleótidos (NB), que en otras proteínas es esencial para la unión de ATP o GTP. Además el NB es parte de un dominio más grande que permite una homología adicional entre las PRs y algunos inductores de muerte celular en eucariontes metazoan como APAF-1 y CED4 (en humanos y C. Elegans, respectivamente). Este dominio en

celulares del huésped (guardianes). En la infección, el patógeno provoca modificacioneslo cual es detectado por su guarda. Cualquier modificación en la proteína que pueestructura cuaternaria del guardian puede resultar en la detección del patógeno. Esta aguardaal., 2005) Cualquier componente proteico de un virus puede funcionar como un Avr determ

de la virulencia (por ejemplo, son requeridos para completar los niveles de crecimiento den huéspedes susceptibles. El reconocimiento de los genes R, desencadena una resistencia altamente efectiva, dcrecimiento del patsistema de defensa de la planta es activado a un cierto nivel (defensa basal) evitaextienda la enfermedad.

stas de sa activadas por los genes R son similaactivadas con los patógenos virulentos durante la infección.

1.2.1.2.2 Proteínas relacionadas a la patogénesis (PR) Los genes R codifican par

pathogenesis related). Las PR son del tipo de proteínas con “sitio de unión a nucl

cturales más importantes: Repetidos de leucina (LRR) que están involucrados en las interacciones prote

en las uniones ligando-receptor e interacciones proteína-carbohidrato.

9

conjunto es llamado dominio NB-ARC (NB por sitio de unión a nucleótidos, A por la

L N-terminal, IR), receptor

eractúa con moléculas derivadas de patogénos en respuestas iniciales de defensa en

e conformación en espiral (CC) (van der Biezen, 1998; Soosaar et al., 2005, Dangl y Jones; 2001)

Estas proteínas se han agrupado en 17 familias atendiendo a sus propiedades bioquímicas e biocontrol de

consideran enta cuando

un patógeno. Debido a que actúan de acuerdo al modelo de estudio y a las condiciones en l patógeno y

la planta. , PR9, PR10, PR11,

tina, la PR12 dad general s. esqueletos, as por citar

mover la expresión de moléculas involucradas en la morfogénesis de las plantas, por ejemplo, la activación de la

ue permiten .

1.2.1.2.3 Silenciamiento genético postranscripcional (PTGS). En 1985, Sanford y Johnston propusieron la teoría de la resistencia derivada del patógeno (PDR por sus siglas en ingles: pathogen derived resistance) y describieron una vía para generar resistencia genética, usando genes del patógeno.

homología con APAF de metazoan y RC por la activación de las proteínas R). as PRs pueden subdividirse de acuerdo a las características estructurales de la región

Tipo TIR-NB-LRR. Tienen homología con receptores Toll de la interleucina 1 (Tque intmamífero.

Tipo CC-NB-LRR. Tienen un dominio d

inmunológicas que les permiten funcionar como posibles mecanismos responsables de enfermedades de los vegetales. A excepción de la PR10, todas las PRs son de localización extracelular por lo que secomo primer contacto del patógeno con la planta. Su expresión generalmente incremdetectalas que se trabaja, no es sencillo detectar el papel que desempeñan en las relaciones de

Las proteínas pertenecientes a las familias PR2, PR3, PR4, PR6, PR7, PR8PR14 PR15, y PR16 poseen actividad enzimática. La PR5 es una proteína tipo taumaes del tipo tionina, la PR13 defensina, y las PR1 y PR17 no tienen una propiedeterminada, pero se ha visto que pueden activar o actuar en conjunto con las demás PRÉstas características bioquímicas les permiten atacar paredes celulares de bacterias, exoinactivar proteínas iniciadoras de infecciones, degradar mRNAs o sintetizar fitoalexinalgunas de sus funciones. Asimismo su actividad enzimática les permite pro

germinación mediante la degradación de paredes celulares de las capas de la semilla qque emerja la radícula (Nimchuk et al, 2003; Van Loon et al, 1999; Van Loon et al, 2006)

10

Los patógenos producen moléculas que son críticas y únicas para su proceso patogénico específico. hospedera, ejemplos de

ortado para muchos y diferentes virus de RNA de plantas en un amplio rango de

enominaron nsgénicas la

introducción de un transgen (en su caso genes flavonoides) resulta en una reducción de la expresión del gen homólogo. En los tejidos en donde se desencadena la cosupresión, los niveles de RNAm del

o. Las investigaciones en cosupresión

s promotoras (Lindbo y Dougherty, 2005). la expresión

de defensa adaptativo en todos los organismos eucariontes. Se ha establecido un modelo general y se han

anismos. En al (PTGS). madas entre 1999). Esta

positiva en ente de RNA inglés) y un

complejo inductor de silenciamiento de RNA (RISC, por sus siglas en inglés), se encarga de s moléculas

ta (Mlotshwa et al., 2002; Hammond et al., 2001; Hamilton y Baulcombe, 1999). Aunque el silenciamiento de genes se reportó inicialmente en plantas transgénicas que eran resistentes o que se recuperaban de la infección, este mecanismo no es exclusivo de plantas transgénicas, sin embargo ha sido utilizado como estrategia para combatir las infecciones virales en

Si estas moléculas se expresaran en formas modificadas o disfuncionales en la célulaestos productos génicos podrían actuar como inhibidores del patógeno. Numerosos PDR se han repespecies vegetales. En 1990 dos grupos Napoli et al. y Van der Krol et al., reportaron resultados que dcosupresión. En sus investigaciones demostraron que en algunas líneas de plantas tra

transgen y el homólogo se redujeron, aunque se desconocía el mecanismcosupresión de genes de plantas transgénicas han demostrado que ciertos ejemplos dese correlacionan con metilación y secuenciaLíneas iniciales de investigación permitieron reconocer la supresión o silenciamiento de de RNAm como defensa contra virus y patógenos. Investigaciones posteriores permitieron inferir que el silenciamiento es un mecanismo

identificado factores que se requieren para el silenciamiento de RNA en diferentes orgplantas el proceso fue denominado inicialmente silenciamiento genético postranscripcionEste proceso podría desencadenarse a partir de cadenas dobles de RNA (dsRNA), forel RNA viral hebra positiva (sentido) y negativa (antisentido) (Hamilton y Baulcombe,estructura se genera como intermediaria durante la replicación del virus de RNA de hebrala planta. Un complejo multicomponente en el que se incluye a la polimerasa dependiviral (RpRd), una helicasa, una enzima con dominio RNAsa (DICER, por sus siglas en

identificar y degradar al RNA en pequeños fragmentos de 21-27 nucleótidos (RNAi). Estapodrían ser la señal móvil encargada de amplificar el silenciamiento al resto de la plan

11

las plantas. Se puede inducir eficientemente el PTGS incorporando a la planta un fragmento de DNA

. La planta o obstante,

debido a la us disminuye paulatinamente sin que la

infección logre producir considerables daños en la planta hospedera.

1.2.1.3 Resistencia sistémica adquirida (SAR). de la planta

tencia a una te compatibles. Así, si se

nte eficiente ria.

lgunos virus con la reducción en número). Se caracteriza por el incremento de la expresión de genes R,

mico de una rimaria. La infección secundaria provoca una reacción local

ica. Además rante varias

ectado debe varios años

se pensó que el ácido salicílico (SA) era la señal sistémica. El SA juega un papel importante en el ido salicílico, e defensa y

Actualmente se cree que antes de que se produzca el SA en el tejido infectado, se producen otras señales que viajan hacia los tejidos distantes. La naturaleza química de esta señal aun no está clara. En conjunto, estas reacciones de defensa inducidas permiten detener la proliferación del patógeno y su diseminación desde el sitio de infección al resto de la planta. Además, permite a la planta

viral, en antisentido, como transgen (Ratcliff, et al.,1997; Ding et al., 2004). En 1993a, Lindbo et al., pudieron comprobar la eficiencia del PTGS frente al VJThospedera al entrar en contacto con el virus, puede traducir y replicar sus proteínas. Ninicialmente el nivel de transcrito derivado del transgen, así como el viral disminuyenformación del duplex de RNA. Así, la acumulación del vir

La resistencia sistémica adquirida está fundamentalmente destinada a proteger al resto activando genes de defensa en tejidos no infectados, además la planta muestra resissubsiguiente infección de un amplio rango de patógenos normalmenadquiere resistencia SAR provocada por una infección primaria con un virus es igualmepara contrarrestar una infección secundaria producida por un hongo o una bacteLa resistencia adquirida es medida por la reducción en diámetro de las lesiones (y en a

La efectividad de SAR puede evidenciarse experimentalmente al infectar el tejido sistéplanta sometida a una infección p(lesiones necróticas) muy disminuida, puesto que la planta presenta resistencia sistémla activación de los genes de defensa permite proteger a los tejidos sistémicos dusemanas después de la infección primaria. Uno de los aspectos interesantes del desarrollo de la reacción SAR, es que el tejido infenviar señales químicas al resto de la planta para que esta reacción se active. Durante

establecimiento de SAR ya que los tejidos resistentes contienen niveles elevados de ácademás el tratamiento de plantas con ácido salicílico induce la expresión de genes dresistencia.

12

desarrollar un estado de resistencia que le proporciona inmunidad durante varias semanas para una prescindible que la planta

detecte la presencia del patógeno (Glazebrook, et al. 1997, Hull 2002, Király, 2007).

e Ingeniería o (Nicotiana

tabacum var. Burley 49). A éstas se les introdujo el gen NIa del Virus del Jaspeado del Tabaco (VJT), para conferirles resistencia al mismo virus. En dicha investigación tal y como lo observaron

aron líneas eptibles

en plantas inmune no

recuperación ir un par de

semanas las hojas más jóvenes ya no mostraron síntomas. Además la concentración del virus en el es nula en la infección

o susceptible a otros potyvirus. despliegues s de tabaco

una proteína parecida a extensina, son objeto de estudio dentro del laboratorio, debido a las funciones de sus secuencias homólogas: resistencia sistémica adquirida, modificación de la pared celular ante heridas o infecciones respectivamente, procesos que pueden relacionarse con la infección y silenciamiento viral. Adicionalmente otro cDNA seleccionado y clasificado como 18, tiene una función en las plantas transgénicas recuperables que ofrece un reto por ahora.

segunda infección. Para que estas reacciones inducidas ocurran, es im

2. ANTECEDENTES. En una de las líneas del Laboratorio de Interacción Planta-Virus del Departamento dGenética del CINVESTAV Guanajuato se trabaja con plantas transgénicas de tabac

Lindbo et al, en 1993b con plantas de tabaco transgénicas en CP, se encontrtransgénicas con fenotipo susceptible, recuperable e inmune. Las plantas transgénicas suscal ser inoculadas con el VJT mostraron síntomas de infección tal y como se observasilvestres (B49) infectadas con el virus. Por el contario las plantas con el fenotipopresentaron síntomas al ser inoculadas con VJT. Las plantas con fenotipo de inicialmente mostraron los síntomas de la infección de VJT, sin embargo al trascurr

tejido disminuye a partir de la hoja inoculada hacia los niveles superiores de la planta ylas hojas que son asintomáticas (hacia el ápice). Una vez que se recupera la planta dees inmune a una nueva inoculación con VJT perAsimismo, se cuenta con tres cDNAs seleccionados de una colección obtenida de diferenciales (DD) entre hojas no retadas y hojas recuperadas de las plantas transgénicadescritas arriba (trabajos no publicados, Silva-Rosales). Dos cDNAs seleccionados, el 34, con homología a SAR8.2c y el 30, con homología a

13

2.1 Gen 34, homólogo a SAR8.2c. a de tabaco

e una homología de 98% de

o diferencial de una planta de

Determinaron que la familia contaba con más de 12 miembros. El gen SAR 8.2c, tiene 432 bp, el peso molecular de proteína madura resultante predicha oscila entre 7.5-7.7 kDa. Su marco abierto

a N terminal. ína, e idéntico en los 22 aminoácidos finales con los genes

solanáceas,

spuesta a la SAR8.2 se

expresan bajo la misma condición de la infección del TMV, además de otros inductores de SAR olucrados en ipersensible

activadores annuum, se ha

comprobado que familias de genes con las mismas características (CaSAR 8.2) desempeñan un papel co tico (Lee y Hwang, 2003). Esto da la pauta a buscar la función que tienen éstos genes, en tabaco ante situaciones de patogenicidad.

De la colección de cDNAs el gen corespondiente rotulado como 30 presenta una homología de 99% con la secuencia del gen CELP-3 (por sus siglas en ingles cystein-rich extensin-like protein). Como su nombre lo indica este gen CELP-3 pertenece a la familia de proteínas semejantes a extensina, ricas en cisteína. El dominio semejante a extensina rico en prolina de las CELPs, evoca a las

El gen 34 que se encuentra en la biblioteca de cDNAs, provenientes de una planttransgénica en proceso de recuperación de la infección del VJT, tienidentidad con la secuencia perteneciente al gen SAR8.2c (Alexander et al., 1992) En 1992 Alexander y col. identificaron la familia de los genes SAR 8.2; mediante escanede una biblioteca de cDNAs, pertenecientes a mRNAs de hojas no infectadastabaco inoculada con virus del mosaico del tabaco (TMV)

de lectura (ORF) tiene una secuencia que usualmente funciona como péptido señal, en lTiene un dominio C terminal rico en cisteSAR 8.2 a, b y d. Los miembros de la familia de genes 8.2, se encuentran en plantasgrupo que incluye las plantas de tabaco y chile. En 1961, Ross demostró por primera vez la inducción de la resistencia sistémica, en rehipersensibilidad de la infección del TMV, y tomando en cuenta que las proteínas

como el ácido salicílico (Ward, 1991), se ha sugerido que los genes SAR 8.2 están invel desarrollo del la resistencia sistémica adquirida (SAR) después de una respuesta hinicial a una infección. No se han hecho estudios concretos referentes a la participación de éstos genes, comode la respuesta ante infecciones virales. En otras especies como en Capsicum

mo marcadores moléculares de estrés biótico y abió

2.2 Gen 30, homólogo a una proteína parecida a extensina.

14

características estructurales de una clase de glicoproteínas ricas en hidroxiprolina; HRGPs por sus

de HRGPs: rupos están nes, lo que

. Por ende, getal. Al ser

parte esencial de la pared celular tienen gran importancia en el reconocimiento célula-célula. Además se ha encontrado que se expresan en zonas de diferenciación celular y en condiciones de

ación en la se expresan extensinas

se un aumento de su expresión ante les como la

En tabaco, se ha detectado el transcrito de una sola clase de extensina de un único tamaño, de iciones de estrés por

etileno, inducción de heridas e infección viral. Además se observó que de tres a cuatro copias del gen se encuentran en el genoma del tabaco, sin embargo solo un gen es activado en los distintos

).

resentan 11 posibles marcos abiertos de lectura abierta, los cuales codifican para 141 aminoácidos que

a pH 7. Al teícos, hay e infección,

alérgenos de polen y látex, así como con proteínas de tipo PR1 y PR2, entre otras. La cadena aminoácida pronosticada presenta el mayor grado de homología con una región del cromosoma 5 de Lycopersicon esculentum cv. Heinz (80% de similitud). En éste cromosoma se encuentran genes relacionado con la respuesta de resistencia a agentes patógenos. Además hay

iniciales en ingles. (Wu, et al, 1993) Las HRGPs son los principales componentes de la pared celular. Existen varios tiposextensinas, proteínas ricas en prolina (PRPs), proteínas ricas en glicina (GRPs). Los gdeterminados por la composición aminoácida de cada proteína codificada en sus geconlleva a que adquieran ciertas características estructurales que los identificandependiendo de cada clase de HRGP, pueden tener diversas funciones en la célula ve

crecimiento celular, de ahí la denominación de las extensinas, por su participextensibilidad de la célula, aunque se ha demostrado que no sólo las extensinas durante este fenómeno. Se han hecho estudios referentes a la relación que tienen lasante la infección patógena de hongos y bacterias, encontrándoel daño causado, sugiriendo su función como activación de defensas mecánicas talignificación de las células. (Cassab, 1998; Josè y Puigdomènech, 1993)

aproximadamente 1.35kb, éste fue detectado en raíz, hojas y tallos, bajo cond

tejidos o todos los genes activos producen transcritos de tamaño similar (Memelink, 1993

2.3 Gen 18, sin homología completa conocida Al realizar el análisis de la secuencia del cDNA clasificado como 18, se encontró que p

presentan un peso molecular de 15.81 kDa, punto isoeléctrico 8.95, y carga de 6.125tomar esta serie aminoácida y compararla con las del banco de dominios procoincidencias con regiones de secuencias de proteínas involucradas en procesos d

15

homología con otras proteínas de Arabidopsis thaliana, Vitis vinifera y Zea mays. Entre las proteínas % similitud), 4 y 48 % de ión en Vitis

s de resistencia a la proteólisis, y la sobrevivencia a pH bajo,

tanto en su secuencia de aminoácidos como en la actividad ribonucleasa, podríamos relacionar al cDNA 18 con las proteínas PR10.

del cDNA 18 neral con las esperadas en las PR10: pequeñas proteínas, por lo general ácidas, de

et al, 2004;

on el cDNA omólogos en

s DQ α del

e los genes del MCII en la respuesta

inmune en mamíferos, sólo que estas regiones se encuentran fuera del algún marco de lectura de la proteína predicha para el cDNA 18. La región es altamente similar, y aunque en mamíferos es

TIVO GENERAL. Determinar si los cDNAs 18, 30 y 34 expresados en la línea recuperable de N. tabacum a la in cción uperación de la infecc

4. OBJETIVOS PARTICULARES. I. Construir los vectores con las secuencias de los genes 18, 30 y 34, insertas en sentido y

en sentido-antisentido.

considerables de analizar se encuentra el alergeno del polen en Arabidopsis thaliana (56además del alérgeno Betv V de Medicago truncatula y de PR2 de Zea mays, con un 4homología respectivamente; así como con proteínas relacionadas con la maduracvinifera, que comparten característicacon las PRs quitinasas (3, 4, 8 y 11) y PR5. Debido a que las proteínas PR10 tienen similitud con ciertos alérgenos, como Betv I,

También cabe mencionar que las características fisicoquímicas de la proteína putativa coinciden en gepeso molecular de 15-19 kDa (Liu et al, 2006; Jun-Jun Liu et al, 2003; Chang-Jin ParkBufe et al, 1996). A nivel de nucleótidos, entre las secuencias que presentan algún grado de homología c18, tenemos que los nucleótidos iniciales de la secuencia del cDNA 18 tiene dominios h

un 100% a los encontrados en la región de la secuencia que codifica para los gene

complejo mayor de histocompatibilidad clase II (MCII). Resulta bastante interesante el qupuedan estar de alguna manera relacionados, debido al importante papel

posible que pertenezca a un marco de lectura para algún gen DQ, no es nuestro caso.

3. OBJE

fe del virus jaspeado del tabaco (VJT), están involucradas en el proceso de reción viral.

16

II. Transformar plantas de tabaco transgénico de la línea 184, utilizando Agrobacterium

III. es 18, 30 y 34, en las plantas de tabaco transgénico

IV. Analizar fenotipo de N. tabacum transformados, al inocularse con VJT

Si los cDNAs 18, 30 y 34 están involucrados en el fenómeno de recuperación de la infección viral expresado en plantas transgénicas de la línea 184, entonces la sobreexpresión o silenciamiento de lo dientes, afectará al fenotipo de recuperación.

homóloga en tiene el interés de silenciar o sobreexpresar el gen. En este caso al estar

onstruyendo una doble transgénica.

robacterium

insertar un Basados en

eñado vectores, llamados binarios, utilizados para introducir genes de interés a una planta, utilizando A. tumefaciens, como conductor. Los vectores binarios permiten la inserción de los genes en más de un sitio de clonación, así se pueden obtener vectores que sobreexpresen o silencien genes.

ción de los vectores se utilizó la cepa de E. coli JM109 crecida en medio Luria-Bertani (LB), con selección de las colonias por antibióticos. La cepa de A. tumefaciens, que fue utilizada para transformar las plantas de tabaco, correspondía a la cepa bacteriana pGV2260, la cual se creció en medio de levadura (YEB), con la correspondiente selección de colonias por antibióticos.

tumefaciens. Analizar la expresión de los gentransformadas, mediante Northern blots.

5. HIPÓTESIS

s genes correspon

6. ESTRATEGIA. Para sobreexpresar o silenciar un gen en una planta, se necesita insertar la secuencia la planta donde separtiendo de una planta transgénica, a la cual se le insertará un nuevo gen, estaremos c

Primero se requiere clonar los genes en un vector, reproducirlo e introducirlo a Ag

tumefaciens. A. tumefaciens, es una bacteria que de forma natural es capaz defragmento de DNA, del plásmido Ti, el cual es necesario para una exitosa infección. esta biotecnología se han dis

7. METODOLOGÍA. 7.1 Material Biológico.

Para la construcción y multiplica

17

Las plantas de tabaco utilizadas en el trabajo, se sembraron bajo condiciones asépticas en medio kanamicina,

e esta forma fueron seleccionadas. Fueron mantenidas en medio MS, hasta obtener plantas adultas.

ctor binario construido a partir del vector pCAMBIA1300 (Centro internacional de aplicación de biología molecular de agricultura, CAMBIA, Canberra, Australia http://www.cambia.org); el cual tiene las

tencia basta del repetido

de la secuencia blanco, y un intron ChsA (gen de la Chalcona sintasa) para estabilizar el fragmento del repetido invertido de la secuencia blanco. Asimismo cuenta con dos sitios múltiples de clonación:

Murashige-Skoog (MS). Las plantas transgénicas de la línea 184, tienen resistencia a por lo que d

7.2 Construcción de vectores

Se utilizó el plásmido binario pFGC5941 en las construcciones. pFGC5941 es un ve

siguientes características: Un gen de resistencia a kanamicina (kanR), para selección bacteriana, un gen de resis(bar), para selección de plantas, un promotor 35S de CaMV para dirigir la expresióninvertido

Mapa del vector pGC5941

Se clonaron los genes 18 (de 445 bp), 30 (de 348 bp), 34 (de 433 bp) entre los sitios BamHI y XbaI

):

itrogen®), el cual les confirió los sitios BamHI y XbaI. Por ello, para insertarlo en el vector pFGC5941 en un sentido, se digirieron los genes del vector PCR 2.1 TOPO, con las respectivas enzimas, una vez purificados se ligaron al vector pFGC5941 cortado con las mismas enzimas. Posteriormente la construcción se transformó por choque térmico y multiplicó en E. coli. Para verificar la presencia del

del plásmido binario pFGC5941. Asi se obtuvieron los primeros plásmidos en sentido (⇒

pFGC5941+18⇒, pFGC5941+30⇒ y pFGC5941+34⇒

Inicialmente los genes 18, 30 y 34, fueron clonados en el vector PCR 2.1 TOPO (Inv

18

inserto, se extrajo DNA plasmídico, mediante lisis alcalina basado en el método de Birnboim y Dolly iva de cada

co, mediante una midipreparación,

do (⇔), se

941+30⇒ y

41+34⇒ con el gen en sentido, pero esta vez entre los sitios AscI y SwaI. Para obtener los

plásmid

⇔ ⇔ ⇔

La ca HI y XbaI a

e cada gen. electroforesis en un gel

on el kit de

b 5941+18⇒,

De la misma

oli. También lisis alcalina

Birnboim y Dolly (1979); por último se realizó una digestión con la enzima XhoI. De una colonia positiva de cada construcción, se obtuvo mayor cantidad de

D ción, utilizando el kit de QUIAGEN siguiendo

las instrucciones del fabricante.

tumefaciens, ión fue exitosa, se verificó la presencia

de cada gen por PCR, utilizando los primers especificos para cada caso. Al confirmar la presencia del inserto en las células de A. tumefaciens, se utilizaron suspensiones celulares con cada una de las construcción para transformar plantas de tabaco por él método de transformación de explantes de hoja modificado de Horsch et al. 1985.

(1979), por último se realizó una digestión con la enzima XhoI. De una colonia positconstrucción, se obtuvo mayor cantidad de DNA plasmídi

utilizando el kit de QUIAGEN siguiendo las instrucciones del fabricante.

Posteriormente para obtener los plásmidos con las secuencias en sentido-antisenti

clonaron los genes en cada una de las construcciones pFGC5941+18⇒, pFGC5

pFGC59

os:

pFGC5941+18 , pFGC5941+30 y pFGC5941+34

lonación se llevó a cabo en dos pasos: . Mediante PCR, se agregaron los sitios de corte de las enzimas de restricción Bam

cada una de las secuencias de los genes, con los oligonucleótidos específicos dEl producto amplificado con los sitios de corte, se analizó mediante de agarosa 0.8%, y la banda correspondiente a cada gen fue purificada cpurificación GFX (Amersham-Biosciences), según las indicaciones del fabricante.

. Este DNA purificado se digirió y se ligó a las construcciones pFGC

pFGC5941+30⇒ y pFGC5941+34⇒, previamente cortadas con AscI y SwAI.

manera la construcción se transformó por choque térmico y multiplicó en E. c

para verificar la presencia del inserto, se extrajo DNA plasmídico, mediante basado en el método de

NA plasmídico, mediante una midiprepara

7.3 Transformación mediada por A. tumefaciens.

Una vez obtenidas las construcciones libres de E. coli se transformaron a células de A.

mediante electroporación. Para confirmar que la transformac

19

Se coinocularon 30 explantes (aproximadamente 0.5 cm ) de hojas de tabaco transgénico de la en medio aséptico,

+34⇒. Se

45 explantes con las construcciones pFGC5941+18⇔, pFGC5941+30⇔ y

nopurina 0.5 desarrollar

brotes. Y se pasaron a medio fresco en intervalos de 2 semanas. Una vez desarrollados los brotes se transfirieron a medio de enraizamiento (MS, Sacarosa 2%, kanamicina 50 mg/ml, fosfinotricina ó

jaron crecer por 4 semanas, para tener plantas de tabaco completamente diferenciadas. El desarrollo de las plantas fue en

c ras riodo de 16 hrs luz/ 8 hrs obscuridad.

NA y Northern blot. a analizar la

expresión de los genes insertados. g de tejido de hojas de cada una de las plantas analizadas. Se extrajo RNA total

Los geles se

ión U.V. Las hibridadas con sondas elaboradas a partir de cada uno de los cDNAs

(18, 30 y 34) escindidos de TOPO XL y marcados con [32P]. Las membranas con la marca radiactiva r digital tipo

Los tabacos transgénicos dobles, a los cuales se les extrajo RNA total (obtenidas en medio aséptico), se transfirieron a tierra. Primero se eliminó todo el medio MS en que crecieron in vitro y se colocaron en macetas con tierra, con un tiempo de adaptación a suelo de 8 días. En cámaras de

crecimiento de 27°C, fotoperiodo de 16 hrs luz/ 8 hrs obscuridad.

2

línea 184 (con el fenotipo de recuperación). Se usaron plantas adultas crecidas

con cada una de las construcciones pFGC5941+18⇒, pFGC5941+30⇒ y pFGC5941

coinocularon

pFGC5941+34⇔

Los explantes se mantuvieron en medio de inducción de callo (MS agar, BA bencil-amimg/L, kanamicina 150 mg/ml, fosfinotricina ó PPT 3mg/L y claforan 500mg/L) hasta

PPT 3mg/L y claforan 500mg/L). Al obtener plántulas con raíz, se de

áma de crecimiento de 27± 2 °C, fotope

7.4 Extracción de R

Una vez que se obtuvieron plantas de tabaco diferenciadas, se extrajo RNA total par

Se tomaron 150 mpor el método de TRIzol (Invitrogen®), según las indicaciones del fabricante.

Se corrió en un gel desnaturalizante 1.3%, 5 µg de cada uno de los RNAs obtenidos.

hicieron por triplicado. Los ácido nucleicos se transfirieron a una membrana de nylon (Hynbond N+) con radiacmembranas fueron después

se expusieron en una pantalla de fósforo para detectar la marca radiactiva en un detectoSTORM (Amersham-Biosciences)

7.5 Inoculación de plantas de tabaco

20

Una vez que los tabacos se adaptaron a las condiciones de invernadero en suelo, se inocularon con VJT, de forma mecánica y se monitoreo el desarrollo de síntomas.

.

confirmó por tión, con la enzima XhoI. La diferencia en el patrón de digestión indica el sentido del inserto

(Fig. 1)

8 RESULTADOS. 8.1 Construcción de vectores.

La presencia de los insertos de cada uno de los genes en el plásmido pFGC5941, se diges

Fig. 1 Patrón de digestión por XhoI de

rmación de

. En la figura 2, se puede ver una muestra representativa de los PCR en los que se verificó la presencia de los insertos en las colonias de A. tumefaciens. Para cada una de las amplificaciones se muestra su respectivo control positivo de amplificación, correspondiente a la amplificación de los genes a partir de DNA purificado.

las vectores construidos en el trabajo.

8.2 Transformación de plantas de tabaco, mediante el método de transfo

explantes de hoja. 8.2.1 PCR en colonia de las células de A. tumefaciens con los genes insertos

21

A B

Fig. 2 PCR en colonias de las células de A. tumefaciens, transformadas con l(445 bp), 30

os genes 18 (348 bp) y 34 (433 bp). El apartado A, muestra los PCR con las construcciones

con los genes en sentido (⇒) y el apartado B las construcciones con los genes en sentido-antisentido (⇔).

oculados. Los explantes de hoja fueron coinoculados con una suspensión de células de A.tumefaciens, tal como se describió anteriormente.

8.2.2 Explantes coin

Fig. 3. Explantes 2 semanas después de la coinoculación con células de A. tumefaciens. A y B explantes sin coinocular (A, medio MS sin PPT y B, medio MS con PPT). C, D, E corresponden a explantes coinoculados con las construcciones en sentido de los respectivos genes 18, 30 y 34.

22

Para las construcciones pFGC5941+18⇒, pFGC5941+30⇒ y pFGC5941+34⇒, se realizaron dos

ucciones en sentido-antisentido, se realizaron tres coinoculaciones, un total de 45 explantes por construcción. coinoculaciones, de 15 explantes cada vez. Para las constr

Fig. 4. Explantes de hojas de tabaco después de 6 semanas de coinoculación con la construcción pFGC5941+34⇔

dio inductor de callo, únicamente de tuvieron brotes viables para ser

de enra plantas a de plantas diferen sume abla:

Construcciones en A. tumefaciens

Explantes de hoja línea 184

Brotes viables

Explantes de hoja B49

Brotes viables

8.2.3 Aparición de brotes enraizados y desarrollo de plantas diferenciadas.

Después de mantener todos los explantes por 6 semanas en melos explantes transformados con las construcciones en sentido se obtransferidos a medioLa relación

izamiento y deciadas obtenid

sarrollaras, se re

diferenciaden la siguiente t

s.

18 sentido-antisentido 45 0 45 0 30 sentido-antisentido 45 0 45 0 34 sentido-antisentido 45 0 45 0 18 sentido 30 19 30 12 30 sentido 30 16 30 3 34 sentido 30 10 30 16 Control B49 - - 15 5 Control Línea 184 15 5 - - Tabla 1. Se muestra los explantes de hoja de tabaco con brotes viables, coinoculados con cada una de las construcciones a partir de los cuales se desarrollaron plantas diferenciadas.

23

8.3 Extracción de RNA y ensayo de Northern blot. na de las plantas diferenciadas, doble transgénicas,

ación medNumero de tabacos línea 184 Número de tabacos B49

Como paso preliminar, se extrajó RNA de cada uobtenidas de la transform iante A. tumefaciens.

Tabacos con la construcción

pFGC5941+18⇒ 13 6

pFGC5941+30⇒ 6 1

pFGC5941+34⇒ 8 7

Control B49 (tabaco sin transformar) - 2 Control Línea 184 (tabaco sin 2 - transformar) Tabla 2. Número de tabacos transformados y diferenciados a los que se les extrajó RNA por TRizol.

dad de RNA obtenido.

Posteriormente se prepararon geles desnaturalizantes con 5 µg de cada uno los RNAs, se

transfirieron a membranas de nylon, se hibridaron y se analizó la expresión de cada gen

El RNA se analizó en geles desnaturalizantes para verificar la calidad y canti

Fig. 5. Determinación de los niveles de expresión de los genes 18, 30 y 34 en las plantadoble transgénicas, mediante hibridación tipo Northern. Panel A lineas 1-3 expresión de

tres plantas transgénicas (184) transformadas con la construcción pFGC5941+34⇒,

expresión del gen 34, en dos plantas silvestres (B49) transformadas con la c

plantas transgénicas trans

s de tabaco l gen 34, en

lineas 4 y 5

onstrucción

pFGC5941+34⇒, sobreexpresión del gen 34, en la planta 5. B expresión del gen 18 en cuatro

formadas (1-4) con la construcción pFGC5941+18⇒, disminución de la

expresión del gen 18 en la planta 4. Y C, expresión del gen 30 en 2 plantas transgénicas

transformadas con la construcción pFGC5941+30⇒ (1,2). La línea rRNA corresponde al control de

carga. La línea 184 (-) corresponde a una planta transgénica línea 184 sin transformar y B49(-) a una planta silvestre sin transformar.

24

8.4 Inoculación de plantas de tabaco con VJT. adaptados a tierra, se inocularon mecánicamente con VJT. Los tabacos inoculados

corresponden a: ión Tabacos inoculados VJT Línea 184 Tabacos inoculados VJT B49

Los tabacos

ConstruccpFGC5941+18⇒ 7 6 pFGC5941+30⇒ 1 1 pFGC5941+34⇒ 3 7 Control B49 - 1 Control Línea 184 2 -

Tabla 3. Número de tabacos inoculados con Virus Jaspeado de Tabaco (VJT) con cada una de las construcciones. Los controles corresponden a plantas de tabaco sin transformar.

Los tabacos que prese ión fuerción Tabacos con sintomas de la

infección por VJT Línea 184 Tabacos con sintomas de la

fección por VJT B49

ntaron sintomas de la infecc on: Construc

inpFGC5941+18⇒ 1 5 pFGC5941+30⇒ 0 1

0 1 Control B49 - pFGC5941+34⇒

1 Control Línea 184 1 -

Tabla 4. Número de tabacos que presentaron síntomas de la infección del virus. Los controles corresponden a plantas de tabaco no transformadas inoculados con VJT.

25

Fig. 6. Síntomas en los tabacos transformados e inoculados con VJT. La fotografía A co

B y C plantas línea 184 transformadas con el gen 18. En B, se muestran síntomas de la C síntomas muy tenues. D, E y F corresponden a plantas B49 transformad

rresponde a la planta control B49 no transformada inoculada que desarrollo síntomas de la infección. Fotografía

infección, en as con los genes 18

(desconocido), 30 (homólogo a extensina) y 34 (homólogo a SAR 8.2c) respectivamente. Las plantas fu con VJT y presentaron sintomas de la infección. La fotografía G, muestra una

JT.

Inicialmente al realizar la construcción de los vectores, insertando los genes 18 (445 bp), 30 (348 robó que se XbaI). Sin waI), no fue de digestión

de la enzima XhoI de una u otra construcción, sentido y sentido-antisentido. Así, al digerir las contrucciones que contenían el plásmido en un sentido, se liberó un fragmento de poco mas de 1.5 kb, mientras que al digerir las construcciones que contenían el plásmido en sentido-antisentido, se liberaron dos fragmentos uno de aproximadamente 1.5 kb y uno de 2.0 kb, aproximadamente. La

eron inoculadasplanta B49 trasnformada con el gen 34 que no presentó síntomas al ser inoculada con V

9. DISCUSIÓN.

bp), 34 (433 bp) entre los sitios BamHI y XbaI del plásmido binario pFGC5941, se compencontraran en el plásmido, mediante digestión con las misma enzimas (BamHI yembargo al adicionar a la secuencia en el segundo sitio (entre las enzimas de AscI y Sposible liberar el fragmento. Por esta razón, se utilizó como punto de análisis el patrón

26

diferencia en estos cortes mostró que las construcciones no eran iguales y se prosiguió a trabajar

strucciones, tión de DNA fue posible, vó corte de rmadas, se

determinó en cada caso al amplificar cada gen, que efectivamente se encontraban dentro de las células. Una vez confirmado esto, se transformaron explantes de hojas y los resultados nos

strucciones

5941+18⇔,

spués de la

sentido, los on brotes de s explantes

coinoculados con células conteniendo las construcciones en sentido-antisentido, mostraban señales s tenían un

minuído y no se diferenciaban los brotes (Fig. 4) por lo tanto fue imposible transfirieron iones con el

rrollaron en ensayo de ación en los

941+30⇒ y

aciones de

nar que los resultados mostrados son en una sola repetición, por lo que para determinar si los cambios de expresión están dados por la introducción foránea del gen se requiere de un nuevo ensayo de Northern blot. Asimismo para determinar si la sobreexpresión o atenuación de los genes puede afectar en el proceso de recuperación de la infección del VJT, es necesario correlacionar la situación

con ellas, en la transformación de A. tumefaciens. Cuando se obtuvieron células de A. tumefaciens, transformadas con cada una de las conse trató de determinar que se encontraba el inserto, por el mismo método de digesplasmídico, como en el caso de las células E. coli transformadas, sin embargo esto noya que no se logró obtener DNA plasmídico y cuando se logró hacerlo, no se obserningún tipo en los plásmidos obtenidos. Entonces, por PCR de las colonias transfo

muestran que hubo gran diferencia de respuesta entre las dos series de con

pFGC5941+18⇒, pFGC5941+30⇒ y pFGC5941+34⇒ (en sentido) y pFGC

pFGC5941+30⇔ y pFGC5941+34⇔ (en antisentido). Al transcurrir 2 semanas de

coinoculación de los explantes de hojas con las células que tenían las construcciones enexplantes se mostraban turgentes (Fig. 3), en las posteriores semanas (4-6) desarrollarlos callos, los cuales podían manipularse fácilmente. Por otro lado la mayoría de lo

de muerte celular y los pocos explantes que lograron mantenerse por más semanacrecimiento dismanipularlos para transferirlos a medio de enraizamiento. Por esta razón únicamente sea medio de enraizamiento brotes de explantes que fueron inoculados con las contruccinserto en sentido. Posteriormente al transferir los brotes en medio de enraizamiento, no todos se desaplantas diferenciadas, de las que se desarrollaron, se extrajo RNA y se realizó unhibridación tipo Northern. Los resultados preliminares nos muestran que existe una vari

niveles de expresión de los genes de las construcciones pFGC5941+18⇒, pFGC5

pFGC5941+34⇒, en las plantas doble transgénicas. Es decir, se encuentran situ

sobreexpresión o atenuación de los genes en las plantas (Fig. 5). Cabe mencio

27

de expresión de cada una de las plantas de tabaco doble transgénicas, con su respuesta

la línea 184 atología en

o de la línea 184 transformado con el gen desconocido y en los 7 tabacos B49 que fueron

hora dobles transgénicos). Sin embargo los síntomas son muy tenues. En el resto de las plantas B49, no se muestra ningún tipo de síntoma de infección.

una planta inoculación o), sólo una resentan un

to distinto al observado en una planta silvestre sin transformar B49 (Fig. 6). Indicandonos que los genes al ser sobreexpresados pueden estar interviniendo en la recuperación de la infección viral.

artir de una ducción de los genes 18 (homología desconocida)

tido, podrían

Asimismo en los tabacos obtenidos transformados con las secuencias 18 (desconocida), 30 ga a la proteína SAR8.2c) en sentido,

los niveles de expresión de los transcritos de los genes 18, 30 y 34 son abatidos, disminuídos o aumentados. Aún cuando no fue posible obtener plantas con construcciones en sentido-antisentido, se puede hablar de plantas sobreexpesantes las cuales al asociarse con su respectivo fenotipo a la infección viral nos indicarán si fueron silenciados los genes insertados.

sintomatológica a la infección viral. Los síntomas de la infección por VJT en los tabacos control, es decir sin transformar, dey B49 aparecieron a los 5 días posteriores a la inoculación. Asimismo se muestra sintomun tabacinoculados. Al 7to día los síntomas comenzaron a ser visibles en los tabacos de la línea 184 (a

De las 6 plantas B49 transformadas con el gen 34 (homólogo a SAR8.2) únicamenteresultó infectada y las demás no mostraron diferencia fenotípica con sus controles de(inoculadas con agua). Y de las 7 plantas B49 transformadas con el gen 18 (desconocidno presentó síntomas, cabe mencionar que los síntomas observados en éstas plantas, pjaspeado un tan

10. CONCLUSIÓN.

Dentro del presente trabajo se generaron plantas de tabaco dobles transgénicas, a plínea de tabaco transgénica 184, con la introcDNAs 18, 30 (homólogo a extensina) y 34 (homólogo a SAR 8.2c). La transformación genética de tabaco con las construcciones en sentido y en antiseninterfierir en el desarrollo normal de la planta de tabaco.

(homologa a una proteína parecida a extensina) y 34 (homolo

28

11. PERSPECTIVAS. xpresión de

en, en cada planta para poder determinar si tienen un papel en la recuperación de la

, hacer una análisis de los transcritos, mediante Northern blot, una vez que se realice la

nte y una hipo expresante para cada uno de los tres genes para estudiar su implicación en la recuperación.

Pear J., Glascock C., Ward E., Goodman R.M. y Ryals J. 1992. A new multiple family inducible by Tobacco Mosaic Virus or salicylic acid in tobacco. Mol. Plant-

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Al tener los datos completos de la infección viral de VJT, se tiene que correlacionar la ecada ginfección. Asimismoinoculación. Seleccionar al menos una línea sobre expresa

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