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I Conferencia Nacional de BiotecnologíaLima, 12 y 13 de Mayo 2009
Perspectivas de la Biotecnología Aplicada a los Recursos Hidrobiológicos del Perú
APLICACIONES EN ACUICULTURA
Susana Sirvas Cornejo, PhD
Aspectos a saber para una acuicultura razonada:
• Rasgos de vida, reproducción y crecimiento de la especie a cultivar.
• Genética de la especie.
• Nutrición en los diferentes estadíos de desarrollo (Requerimientos nutricionales).
• Enfermedades potenciales de la especie.
• Condiciones del medio de cultivo.
Desconocimiento de cualquiera de estos aspectos podría conducir a un mal manejo de la especie.
EFECTO DE DIETAS MICROENCAPSULADAS SUPLEMENTADAS CON UNA BACTERIA
GENETICAMENTE MODIFICADA SOBRE EL DESARROLLO DE POSTALRVAS DE
Fenneropenaeus indicus
Sirvas S., Latchford J. W., y Jones D. A.
Journal of Aquaculture Nutrition, 2007, 13, p. 10 -16
Financiamiento:
- Overseas Development Administration – ODA (British Council)- Recursos propios
School of Ocean Sciences - SOSUniversity of Wales, Bangor, Reino Unido de La Gran Bretaña
INTRODUCCION
- Lovett, D.L. & Felder, D.L. (1990a) Ontogenetic change in
digestive enzyme activity in larval and postlarval white shrimp Penaeus setiferus (Crustacea, Decapoda, Penaeidae). Biol. Bull., 178: 144-159.
- Lovett, D.L. & Felder, D.L. (1990c) Ontogenetic changes in
enzyme distribution and midgut function in developmental stages of Penaeus setiferus (Crustacea, Decapoda; Penaeidae). Biol. Bull. Woods Hole, 178: 160-174.
- Jones D. A. et al. (1993) The Potential for Replacement of Live
Feeds in Larval Culture. Journal of World Aquaculture Society, Nº 2, 24: 199 – 210.
- Kolkovsky et al. (1990) The use of exogenous digestive enzymes to
improve microdiets for gilthead seabream (Sparus aurata) larval rearing. International Symposium on Development and Aquaculture of MarineLarvae held in Bergen, Norway, 12 – 15 August 1990.
- Munilla-Moran et al.(1990) The role of exogenous enzymes in
digestion in culture turbot larvae (Scophthalmus maximus L.). Aquaculture,88:337-350
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA EN DIFERENTES ESTADIOS DE DESARROLLO LARVAL Y POSTLARVAL EN ESPECIES DE PECES Y
CRUSTACEOS.
ANTECEDENTESPROBLEMAS
- Mortalidad alta
- Tasa de crecimiento baja
CAUSAS
- Indigestibilidad
del alimento
HIPOTESISUn suplemento de enzimas digestivas
microbianas en la dieta incrementaría
la digestibilidad de la misma en
postlarvas de camarón.
Los camarones requieren enzimas digestivas en
estadíos tempranos de desarrollo:
principalmenteProteasas del tipo
tripsina
Aeromonas hydrophila (PERO…potencialmente patógena)
Aislar sólo el gen de proteasa de A.h. Pm
La Mancha
Negra
Propuesta: Uso de cepas bacterianas productoras de proteasastipo tripsina.
¿Cuándo clonar?
Cuando otros métodos no representan la mejor estrategia de solución.
Objetivo General
MEDIR EL EFECTO DE DIETASSUPLEMENTADAS CON UNA CEPA
BACTERIANA GM, EN EL DESARROLLO Y SUPERVIVENCIA DE
POSTLARVAS DE CAMARON.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Identificación de la cepa donadora (API 20 NE)
2. Clonación y expresión del gen de proteasa de la cepa donadora en Escherichia coli XL1-Blue (Contiene parte del gen de la β-galactosidasa, Bullock,1977).
3. Perfil de proteínas y ensayos enzimáticos en cepa donadora y en la clona productora de proteasa.
4. Secuenciado del gen de proteasa.
5. Preparación de dietas microencapsuladas suplementadas con la cepa productora de proteasa, y bioensayos con postlarvas de Fenneropenaeus indicus.
MATERIALES Y METODOSMATERIALES
Materiales para Clonación
Cepas
bacterianas : Aeromonas hydrophila Pm (c. donadora)
Escherichia coli XL1 Blue (c. receptora)
Plasmidios : pUC19, pP635
Enzimas : Sau3AI, HindIII, PstI, BamHI
proteinasa K, fosfatasa alcalina, ligasa T4
Medios
de cultivo : Caldo y agar nutritivo, caldo LB, caldo y
agar LB-TET-AMP, agar Leche,
agar TET-AMP-X-GAL-IPTG
MATERIALES …continuación
Materiales para Secuenciado
Clona E. coli XL1p635 (conteniendo gen proteasa)
Plasmidio pP635
Primer M13 (forward)
Primer M13 (reverse)
Desoxinucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Didesoxinucleótidos (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP)
Polimerasa T7
Celda de electroforesis GT Sequi-Gen (BIO RAD)
Acrilamida / bisacrilamida
Papel hiper fotográfico, soluciones de revelado
MATERIALES Y METODOS
MATERIALES Y METODOS
Materiales para Bioensayos
Dieta CD2 : comercial Frippak CD2 (INVE)
Dieta 2 : CD2 reencapsulada
Dieta XL1 : Dieta 2 + E. coli XL1Blue (no proteasa)
Dieta 635 : XL1 + E. coli XL1p635 (proteasa)
Dieta 7 : XL1 + E. coli XL1p7 (lipasa)
Microscopio
300 postlarvas de F. indicus (PL1)
15 recipientes de 5 L c/u
MATERIALES …continuación
METODOS
Para Clonación
Extracción de ADN Cromosomal : Sambrook et al. (1989)
Extracción de ADN Plasmídico : Birnboim y Doly (1979)
Digestión de ADN Cromosomal : Sambrook et al. (1989)
Unión ADN cromosomal y plasmidio
(Ligation) : King (1986)
Transformación : Sambrook et al. (1989)
Prueba de Alfa complementación : Sambrook et al. (1989)
Electroforesis : Sambrook et al. (1989)
Para Secuenciado : Sanger et al. (1977)
Análisis de la secuencia del gen : PC, Genetic Computing
Group (GCG) paquete
SEQNET, Daresbury,
England
MATERIALES Y METODOS
Para Bioensayos
Se llevaron a cabo 5 tratamientos, cada uno por triplicado,
colocando 20 PL1 en cada recipiente.
Temperatura del agua : 28 °C
pH : 8.0 – 8.3
Salinidad : 3.3 %
Alimentación : 3 veces al día (15 % biomasa)
Longitud total : cada 2 días
Supervivencia : monitoreada cada 2 días
El tamaño de microcápsulas se analizó con un ANVA y con la prueba de Tukey Kramer. El proceso de disolución de las mismas, con ANVA y con la prueba de Scheffe.
El desarrollo y la supervivencia se analizaron con ANVA , y Tukey Kramer.
3. MATERIALES Y METODOSMETODOS …continuación
Vector Fragmentos de ADN del organismo donador
Construcción de moléculas de ADN recombinanteCada una contieneun fragmento diferente
Se introducen en una bacteria receptora
Se cultivaen placa
Cada colonia contiene múltiples copiasde sólo una molécula de ADN recombinante
CONSTRUCCIÓN
DE MOLÉCULAS
DE ADN
RECOMBINANTE
RESULTADOS
LB-AMP-TET-XGAL-IPTG
MEDIO DE CULTIVO SELECTIVO PARA IDENTIFICACION DE CLONAS:
Expresión de β-galactosidasa
RESULTADOS
PRUEBA DE ALFA-COMPLEMENTACION
Las
colonias
blancas
son
clonas,
las
azules,
no lo son.
RESULTADOS
PRUEBA DE PROTEASA A.h.Pm 635
XL1-Blue
Halo de degradación
de lasproteínasde la leche.
RESULTADOS
AGAR LECHE
PERFILES DE PROTEINAS
CELULARES Y EXTRACELULARES
RESULTADOS
ACTIVIDAD ENZIMATICA
La actividad de proteolítica
(trypsina) fue mayor en las clonas
que en la cepa donadora:
A.hydrophila Pm: 1.7156 unid./mg E. coli XL1pP635: 2.4950 unid./mg.
RESULTADOS
Secuencia de nucleótidos delinserto en el plasmidio pUC19
Marco de lectura
abierto (ORF) desde posición
371 hastaposición 886.
60
961
ANALISIS DE LA SECUENCIA DE ADN DEL GEN DE PROTEASA EN EL PLASMIDIO pP635
SEQNET - GRUPO DE COMPUTACION GENETICA - GCG
DARESBURY – REINO UNIDO
FRAMES.- Determinó marcos de lectura abiertos (ORF)
TRANSLATE.- Determinó la secuencia de aminoácidos
BESTFIT.- Comparó la secuencia con otras secuencias de
las bases de datos
DIAGRAMA DE ESTRUCTURA DE PEPTIDOS.-
Determinó la afinidad por el agua de la molécula. Identificó
sitios de glicosilación
MAP.- Determinó lugares de corte para enzimas de restricción
RESULTADOS
PLASMIDIO pP635
RESULTADOS
Nombres FAO:
Español: Langostino blanco de la IndiaFrancés: Crevette royale des IndesInglés: Indian white shrimpNombre local: Kiri issaTamaño: Máximo 18 cm en machos y 23 cm en hembras.
Fenneropenaeus indicus
BIOENS
AYOS
4. RESULTADOS DE LOS
FORMULACIÓN DE LAS DIETAS
CD2 : Dieta ME comercial Frippak CD2D2 : 5 g CD2 + 5 g Hb + 50 mL H2OXL1 : 5 g CD2 + 6 g Hb + 50 mL H2O +1 % cepa XL1635 : 5 g CD2 + 6 g Hb + 50 mL H2O +1 % cepa 6357 : 5 g CD2 + 6 g Hb + 50 mL H2O +1 % cepa 7
Donde: Hb (hemoglobina), XL1 (cepa E. coli XL1Blue pUC19), 635 (cepa E. coli XL1pP635, productora de proteasa del tipo tripsina), y 7 (cepa E. coli
XL1p7,productora de lipasa)
MICROCAPSULAS CONTENIENDO LA CEPA E. coli XL1pP635,PRODUCTORA DE TRIPSINA, ANTES DE SER DIGERIDAS PORLA CEPA.
MICROCAPSULASDESPUES DE SERDIGERIDAS POR LA CEPA E. coli XL1pP635.
RESULTADOS
MICROCAPSULAS
DE HEMOGLOBINA
EN PROCESO DE
DIGESTION
RESULTADOS
DIETAS MICRO -ENCAPSULADASEN SOLUCION.
POSTLARVA DE Fenneropenaeus indicus DESPUES DEINGERIR LADIETA 635.
RESULTADOS
EFECTO DE CINCO DIETAS MICROENCAPSULADAS EN EL DESARROLLO DE POSTLARVAS DE Fenneropenaeus indicus.
CD2 : SIN ENZIMA140 µm
D2 : SIN CEPA NI ENZIMA
218 µm
XL1 : CON CEPA SIN
ENZIMA
218 µm
635 : PROTEASA(TRIPSINA)218 µm
7 : LIPASA218 µm
635
CD2
7
XL1, D2
RESULTADOS
EFECTO DE CINCO DIETAS MICROENCAPSULADAS EN LA SUPERVIVENCIA DE POSTLARVAS DE
Fenneropenaeus indicus.
DIETA % SUPERVIVENCIA
CD2 (CONTROL)
D2 (SIN CEPA)
XL1 (CON CEPA SIN PROTEASA)
635 (CON CEPA Y CON PROTEASA)
7 (CON CEPA Y LIPASA)
83.3376.6755.0083.3371.67
RESULTADOS
CONSIDERACIONES DE BIOSEGURIDAD
En caso de un posible escape de la cepa GM al medio:
• Cuando la cepa ingresa al estómago del camarón, las condiciones para su supervivencia no so favorables, ya que el pH del estómago del camarón es ácido (5.0-7.0) (Dall et al., 1990), y esta cepa no puede desarrollar a un pH de 5 o menos (Sirvas, 1999).
• La cepa receptora o huésped (E. coli XL1-Blue), había sido probada ser no patógena para seres humanos (Bullock et al. 1987).
• Trabajos posteriores mostraron que la cepa GM no se hallaba presente en el medio de cultivo de los camarones, luego de ser alimentados con las dietas suplementadas.
Malecón de La Marina, Miraflores, Lima
GRACIAS