Homogeneización y Diluciones
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PRÁCTICA 1: HOMOGENIZACIÓN Y DILUCIONES A medida que se ha avanzado en la estandarización de técnicas microbiológicas de alimentos, los diluyentes a utilizar para las diluciones de las muestras se han modificado buscando la condición que ofrezca mejor viabilidad de los microorganismos. Las primeras técnicas recomendaron agua, solución salina, solución de Ringer pero investigaciones demostraron que tenían efecto tóxico sobre las bacterias. Finalmente se recomendó la utilización de agua peptonada (ICMSF-1978), solución salina peptonada (ISO 1979) o el tampón de fosfatos (A.P.H.A. 1978). Equipos y materiales Licuadora Recipientes para licuadora, con 90 mL de agua peptonada al 0.1% Pipetas de 1 mL estériles Pipetas de 10 mL estériles Tubos con tapa rosca que contengan 9 mL de agua peptonada al 0.1% Cuchillas, espátulas y tijeras estériles. Procedimiento Para muestra sólida pesar 10 g en el recipiente homogenizador (vaso de licuadora, funda de stomacher, mortero), agregar 90 mL de agua de dilución y homogenizar máximo durante 2 minutos para alcanzar un total de 1500 a 2000 revoluciones en caso de usar licuadora, la homogenización se la realiza intermitentemente durante los dos minutos. Dejar en reposo por lo menos 1 minuto y proceder a preparar las siguientes diluciones, la dilución obtenida es 10 -1 . Tomar 1 mL de la dilución de 10 -1 y transferirlo a un tubo que contenga 9 mL de agua de dilución para obtener la dilución 10 -2 Con otra pipeta agitar esta dilución aspirando cuidadosamente 10 veces y transferir 1 mL a otro tubo que contenga 9 mL de agua de dilución para obtener la dilución 10 -3 Repetir estos pasos para obtener el número de diluciones deseadas. Sembrar antes de los 20 minutos de realizadas las diluciones en los medios respectivos. Preparación del Agua de dilución: 1. Agua peptonada (ICMSF): Peptona 1 g Agua destilada 1 litro Ajustar el pH a 7 + 1 2. Agua de dilución tampón de fosfatos (A.P.H.A.): a) Solución Stock A Potasio dehidrógeno fosfato 34 g
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Manual de Prácticas Microbiología de Alimentos Tomado de : Gaviria, Blanca C., Manual de Prácticas de Microbiología de Alimentos, 1997, Bogotá, Colombia, Carrera de Bacteriología PUJ.
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PRÁCTICA 1: HOMOGENIZACIÓN Y DILUCIONES A medida que se ha avanzado en la estandarización de técnicas microbiológicas de alimentos, los diluyentes a utilizar para las diluciones de las muestras se han modificado buscando la condición que ofrezca mejor viabilidad de los microorganismos. Las primeras técnicas recomendaron agua, solución salina, solución de Ringer pero investigaciones demostraron que tenían efecto tóxico sobre las bacterias. Finalmente se recomendó la utilización de agua peptonada (ICMSF-1978), solución salina peptonada (ISO 1979) o el tampón de fosfatos (A.P.H.A. 1978). Equipos y materiales Licuadora Recipientes para licuadora, con 90 mL de agua peptonada al 0.1% Pipetas de 1 mL estériles Pipetas de 10 mL estériles Tubos con tapa rosca que contengan 9 mL de agua peptonada al 0.1% Cuchillas, espátulas y tijeras estériles. Procedimiento
Para muestra sólida pesar 10 g en el recipiente homogenizador (vaso de licuadora, funda de stomacher, mortero), agregar 90 mL de agua de dilución y homogenizar máximo durante 2 minutos para alcanzar un total de 1500 a 2000 revoluciones en caso de usar licuadora, la homogenización se la realiza intermitentemente durante los dos minutos. Dejar en reposo por lo menos 1 minuto y proceder a preparar las siguientes diluciones, la dilución obtenida es 10-1.
Tomar 1 mL de la dilución de 10-1 y transferirlo a un tubo que contenga 9 mL de agua de dilución para obtener la dilución 10-2
Con otra pipeta agitar esta dilución aspirando cuidadosamente 10 veces y transferir 1 mL a otro tubo que contenga 9 mL de agua de dilución para obtener la dilución 10-3
Repetir estos pasos para obtener el número de diluciones deseadas. Sembrar antes de los 20 minutos de realizadas las diluciones en los medios respectivos. Preparación del Agua de dilución: 1. Agua peptonada (ICMSF):
Peptona 1 g Agua destilada 1 litro Ajustar el pH a 7 + 1
2. Agua de dilución tampón de fosfatos (A.P.H.A.): a) Solución Stock A Potasio dehidrógeno fosfato 34 g
Agua destilada 500 mL Ajustar pH a 7.2 con NaOH 1N y completar a 1 litro con agua destilada Dividir en alícuotas y autoclavar a 121°C durante 15 minutos. Almacenar en refrigeración. b) Solución Stock B Magnesio Sulfato. 7 H2O 50 g Agua destilada 1 litro c) Solución de uso Solución Stock A 1.25 mL Solución Stock B 5 mL Agua destilada 1 litro
Fuente: Gaviria, Blanca C., Manual de Prácticas de Microbiología de Alimentos, 1997, Bogotá, Colombia, Carrera de Bacteriología PUJ.
