Hemoderivados (V): Productos de origen recombinante
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Hemoderivados (V): Productos de origen recombinante
XVII Curso de Introducción a la XVII Curso de Introducción a la farmacoterapia con hemoderivados
H. Vall d´Hebron, 22 - 25 Abril 2013
Soledad RuizMarketing Manager BioPharma & Vacunas
Baxter
Es la técnica mediante la cual se aislan y
transfieren secuencias de ADN altamente
específicas (genes) de un organismo y se
¿En qué consiste la tecnología recombinante?
específicas (genes) de un organismo y se
recombinan con el ADN de otro
Productos biológicos versus productos sintéticos convencionales
FVIII: Glicoproteína con 6 dominios
Gen Factor VIII localizado en cromosoma X (Xq28)2,351 aminoácidosMW 270,000 Dalton
Aspirina
Ibuprofeno
Producto Origen Indicación
FVIIIPlasmático
RecombinanteHemofilia A
FVIII+FVW PlasmáticoEnfermedad de von Willebrand
Hemofilia A
FIXPlasmático
RecombinanteHemofilia B
Complejo protrombina
Productos e indicaciones
Complejo protrombina activado
Feiba®Plasmático Hemofilia con inhibidor
FVII activadoNovoseven®
Recombinante
Hemofilia con inhibidorHemofilia adquiridaDéficit FVIITrombastenia de Glanzmann con anticuerpos anti-plaqueta
FXIIIPlasmáticoRecombinante
Déficit congénito de FXIII
April 2008 mark the 55th anniversary of Dr. James Watson's and Dr.
1962
April 2008 mark the 55th anniversary of Dr. James Watson's and Dr. Francis Crick's discovery of the double helix. In March of 1953, after many years of attempting to understand and elucidate the DNA structure they proposed the complementary double-helical configuration. Subsequently, Dr. Watson, Dr. Crick and Dr. Maurice Wilkins received the Nobel Prize in 1962 for "their discoveries of the molecular structure of nucleic acids and its significance for information transfer in living material.”
1984
Técnica de hibridomas para la elaboración de anticuerpos elaboración de anticuerpos monoclonales (Köler y Milstein 1975)
¿En qué consiste la tecnología recombinante?
- Se inicia al aislar el gen de interés
- Se obtiene un vector (plásmido), es decir un fragmento de DNA con capacidad para crecer de una forma independiente
- El gen se inserta en el vector, y queda integrado en él: plásmido recombinante (DNA recombinante)
¿En qué consiste la tecnología recombinante?
- Se inicia al aislar el gen de interés- Se obtiene un vector (plásmido), es decir un
fragmento de DNA con capacidad para crecer de una forma independiente
- El gen se inserta en el vector, y queda integrado en él: plásmido recombinante (DNA integrado en él: plásmido recombinante (DNA recombinante)
- Se clona para obtener cantidades suficientes de DNA
- Se inserta en una célula huésped que sintetizará la proteína extraña (a ella) a partir de este DNA recombinante
Transferencia del gen de FVIII (y FvW) en la célula de mamífero
Molécula ADN
Gen FvW
Cadena especial de ADN(Plásmido)
Gen Factor VIII
Célula huésped
Núcleo
Plásmido se úne al ADN de la célula huésped
Plásmido
•Desnaturalización y centrifugación
•Extracción del RNA
Precipitación y extracción •Precipitación y extracción del DNA
Estructura del FVIII humano
COOH(Carboxl-Terminal)BPéptido de alto peso molecular
(Amino-Terminal) NH2A1 A2
Punto de escisión proteolítica
Cadena pesada
COOHPéptido de bajo peso molecular A3 C1 C2
80 kd
90 kd
Metal++
Cadena ligera
Factor VIII se activa in vivo mediante la escisión del dominio B
Péptido de alto peso molecular(Amino-Terminal) NH2
A1 A2
Punto de escisión proteolítica
COOH(Carboxl-Terminal)B
COOHPéptido de bajo peso molecular A3 C1 C2
80 kd
90 kd
Metal++
Las funciones del dominio B
• No función hemostática
• Papel en el transporte intracelular
• Favorece la secreción de factor VIII
COOH(Carboxl-Terminal)B
Dorner et al. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87:7429-32 ; Pipe et al. JBC 1998; 273: 8537-8544 ; Kaufman et al. Blood Coagul
Fibrinolysis;1997 Dec;8 Suppl2:S3-14 ; Moussalli et al. JBC 1999; 274: 32539-32542 ; Pipe SW. Haemophilia 2009; 1–10
• Control en el plegamiento de la proteína de factor VIII
– Interacción con las proteínas chaperonas
• Revisiones recientes sobre las funciones del dominio B, destacan diferentes vías por las que la deleción del dominio B podría afectar a la actividad de FVIII en sangre
Transferencia del gen de FVIII (y FvW) en la célula de mamífero
Molécula ADN
Gen FvW
Cadena especial de ADN(Plásmido)
Gen Factor VIII
Célula huésped
Núcleo
Plásmido se úne al ADN de la célula huésped
Plásmido
CHO: Chinese Hámster Ovary cells (Células de Ovario de Hámster Chino)BHK: Baby Hámster Kidney cells (Células de riñón fetal de hámster)
1er Paso: Desarrollo de una línea celular mamífera
Para sintetizar moléculas biológicas complejas, como el FVIII humano, son necesarios sistemas celulares biológicos
Línea Celular de Ovario de Hámster Chino (CHO)
• Línea celular ampliamente estudiada y bien caracterizada (no procedente de
línea celular tumoral)
• Se utiliza para producir múltiples proteínas recombinantes:
– EPO (anemia), Interferon-β1a (esclerosis múltiple), folitropina-ß (infertilidad),
Dnasa (fibrosis quística)
Koplove. Ann Hematol 1994; 68: S15-S20 Goochee et al. Biotechnology 1991; 9:1347-1355 Hotchkiss et al. Thromb Haemost 1988; 60: 255-61
• Capaz de realizar todas las modificaciones postranslacionales y
postransduccionales del Factor VIII
• Resistente a infección por la mayoría de virus humanos
(Coronavirus, Sarampión, Influenza, Herpes, Rhino viruses...etc.)
• Posibilidad de producción de grandes volúmenes a gran escala
La selección del clon celular productor de FVIII se basa en ciertos criterios clave
GD 7/8 GE 5/6 GD 8/6
... 600 clones
Programa de selección de clones (Tests)
• Homogeneidad de la población
• Producción robusta de FVIII y FvW
• Perfil de Western Blot
Nutrientes necesarios para mantener las células vivas:
Azúcares
Sales
Aminoácidos
Vitaminas
Selección del Medio de Cultivo Celular
Aditivos que ayudan al crecimiento celular:
Suero ternera fetal 1950s
Insulina, albúmina, aprotinina, transferrina (bovina) 1990s
Albúmina humana e Insulina recombinante finales 1990s
Medio vegetal, sin proteínas humanas (ADVATE) 2004
Evolución
Características de los concentrados actuales de FVI IIr
Utilización de proteínas derivadas de plasma humano
Biosíntesis en cultivo
celularPurificación Formulación
PrimeraPresente Presente Presente
GeneraciónPresente Presente Presente
Segunda Generación
Presente Presente Ausente
TerceraGeneracion AusenteAusente AusenteAusente AusenteAusente
Desarrollo de:
-Bancos Celulares Maestros (“Master Cell Bank“) y
-Bancos Celulares de Trabajo (“Working Cell Bank“)
Minus 135°C
Células CHO idénticascon gen de FVIII insertado en sus genomas
Cada fermentación comienza con la reanimación de las células procedentes del Working Cell Bank
1 ml (congelado)
70 ml Incubación (37°C)
Viales del Working Cell Bank para comenzar el cultivo celular
*Las fotografías presentadas se tomaron en la planta de Baxter para la fabricación de ADVATE (Neuchatel, Suiza)
Proceso de fermentación FVIII
• Los cultivos celulares crecen en las botellas rotatorias
• Al llegar a una densidad determinada, se aúnan y se utilizan para comenzar la fermentación en biorreactores
• 3 pasos de fermentación en biorreactores:
1. Biorreactor 40 l
2. Biorreactor 320 l
3. Biorreactores 2500 l (2 X)
Biorreactores
Biorreactor
40 L.Tanque con
Medio no celular
3000 L.
Biorreactor
320 L.
2 x Biorreactores
2500 L.
Proceso de Fermentación CHEMOSTAT
Medio Fresco Sobrenadante
- Densidad celular- Viabilidad celular- pH- Gasto de oxígeno- Mezclado / agitación
Medio Fresco estéril
Sobrenadante celular
cosechado continuamente
BIORREACTOR en modo
Chemostat
Monitorización constante de:
Den
sida
d de
cél
ulas
[OD
] Extracción del sobrenadante celular con factor VIII recombinante
c
Alimentación por perfusión continua
Tiempo [días]
Den
sida
d de
cél
ulas
[OD
]
1 2 3 4 5 6 180
a
b
a fase de latencia b fase logarítmica c fase estacionaria
Fase de crecimiento
Proceso de Cultivo Celular continuo y estable
Den
sid
ad C
elu
lar
Tiempo
Den
sid
ad C
elu
lar
Proceso de Alimentación por lotes Proceso Chemostat
El proceso de fabricación de FVIIIr consiste en 3 pasos principales:
1. Biosíntesis de FVIII en cultivo celular en biorreactores
2. Purificación de FVIIIr mediante distintos pasos cromatográficos2. Purificación de FVIIIr mediante distintos pasos cromatográficos
3. Formulación final, llenado y liofilización
Purificación de FVIIIr mediante cromatografía (Inmunoafinidad y cromatografía de intercambio iónico)
Cromatografía de inmunoafinidad / Ligandos sintéticos
Cromatografía de intercambio catiónico
Proceso Purificación
Línea celular de hibridoma para la producción de anticuerpos monoclonales anti-FVIII adaptada a un medio vegetal libre de proteínas
FVIII
Inactivación viral
Cromatografía de intercambio aniónico
Tratamiento solvente/detergente S/D (TNBP+TritonX-100/Tween 80)
(NF)
El eluído es congelado y almacenado a –80ºC
Para la formulación final, llenado y liofilización
Características de los actuales concentrados de FV IIIr
Utilización de material derivado de plasma humano
Biosíntesis en cultivo celular Purificación Formulación
Primera Presente Presente Presente
Primera Generación
Presente Presente Presente
SegundaGeneración
Presente Presente Ausente
TerceraGeneracion AusenteAusente AusenteAusente AusenteAusente
LÍNEA CELULAR CHO BHK CHO CHO
MOLÉCULA FVIII FVIII COMPLETO FVIII COMPLETO BDD-FVIII FVIII COMPLETO
UTILIZACIÓN DE ALBÚMINA
SI SI NO NO
INACTIVACIÓN Y
RECOMBINATETM
3ª GENERACIÓN2ª GENERACIÓN1ª GENERACIÓN
FACTOR VIII
INACTIVACIÓN Y ELIMINACIÓN VIRAL
CROMATOGRAFÍA SD SD + NF SD
CROMATOGRAFÍA
1. Cromatografíade intercambio iónico
2. Cromatografía inmunoafinidad
1. Cromatografíade intercambio iónico
2. Cromatografía inmunoafinidad
1. Cromatografíade intercambio iónico
2. Cromatografía con ligandossintéticos (químicos)
1. Cromatografíade intercambio iónico
2. Cromatografía inmunoafinidad
EXCIPIENTES
AminoácidosAlbúmina
Cloruro sódico
SacarosaAminoácidos
Cloruro Sódico
SacarosaAminoácidos
Cloruro Sódico
TrehalosaManitol
AminoácidosCloruro Sódico
Ovario de hamster chino
Cromatografía y nanofiltración
No presencia de albúmina
nanofiltración
1.Cromatografía de intercambio iónico
2.Cromatografía de inmunoafinidad por anticuerpos monoclonales murinos
Aminoácidos, sacarosa y Tween 80
FVIIa Plasmático y FVIIa Recombinante (rVIIa)
• Estructura protéica idéntica (aminoácidos, péptidos).
• Igual estructura de hidratos de carbono. • Igual estructura de hidratos de carbono.
• Propiedades ezimáticas idénticas.
Indicaciones del rFVIIa
• Registros: EU (96), USA (99), Japón (00)
• Hemofilia congénita con inhibidor
• Hemofilia adquirida• Hemofilia adquirida
• Déficit congénito de factor VII
• Trombastenia de Glanzmann
Próximos factores recombinantes en el mercado
Factor IX recombinante (FIXr)MOLÉCULA COMPLETATERCERA GENERACIÓN
BAXTER
Factor VIII recombinante (FVIIIr)DOMINIO B TRUNCADOTERCERA GENERACIÓN
NOVO-NORDISK
Factor VIII recombinante (FVIIIr)MOLÉCULA COMPLETATERCERA GENERACIÓN
BAYER
Factor VIII recombinante (FVIIIhr)TERCERA GENERACIÓN
OCTAPHARMA
Factor XIII recombinante (FXIIIr) TERCERA GENERACIÓN NOVO-NORDISK
Factor VIII recombinante (FVIIIhr)TERCERA GENERACIÓN
CÉLULAS HUMANASOCTAPHARMA
Factor VII recombinante activado (aFVIIr)
TERCERA GENERACIÓN BAXTER
Factor von Willebrandrecombinante (FvWr)
TERCERA GENERACIÓN BAXTER
Factor VIII recombinante porcino (OBI-1)
Molécula de FVIII porcina de origen recombinante
BAXTER
CRITERIOS DE UTILIZACIÓN DE LOS FACTORES ANTIHEMOFÍLICOS
(Fundación Victoria Eugenia, 2006)
Dado su perfil de eficacia y seguridad se recomienda el paso progresivodel tratamiento de la hemofilia a concentrados de FVIII o FIX de origenrecombinante, en modalidades terapéuticas habituales (a demanda,profilaxis primaria, profilaxis secundaria)
“Es particularmente importante, en temas de seguridad, que no creemos unasituación en la que pudiera peligrar la disponibilidad de derivados de plasma paraaquellos que lo necesiten”
(Goldfard B. National Hemophilia Foundation, Hemacare 2007; 12:15-22)
Inhibidores: Estudio RODIN
OBJ: Evaluar si el tipo de FVIII y el intercambio de productos puede estar asociado al incremento de inhibidores en PUPs con HAG
MET: Recogida retrospectiva de 75 DEsen 574 ptes HAG nacidos entre 2000-20102000-2010
RESULTADOS:
1. FVIIIr y FVIIIdp confieren igual riesgo de desarrollo de inhibidores
2. Contenido FvW y cambio entre productos no estuvo asociado con riesgo de desarrollo de inhibidor
3. Inesperadamente, los FVIIIr de 2ª gen se asociaron a un riesgo aumentado (60%), comparando con 3ª gen
Coste:
Eficiencia
• Reducción de hemorragias en 99,4% en la mediana de la TAH
• La profilaxis individualizada (pK) con FVIII 3ª gen de molécula completa redujo nº sangrados incluso en dosificación cada 3 días
• 42% de los pts tuvieron CERO sangrados/año
• Adherencia a profilaxis es aún problema
• Lindvall K,et al. Haemophilia 2006; 12: 47-51.
• Duncan N, et al . Haemophilia 2010; 16: 247-55.
Adherencia
• Personalización de la profilaxis para cada tipo de paciente, e infusiones menos frecuentes pueden mejorarla
¿Siguientes pasos en el tratamiento de la hemofilia?
� Infusiones IV de factor menos frecuentes
� Tratamiento sin infusiones IV
¿Siguientes pasos en el tratamiento de la hemofilia?
� Infusiones IV de factor menos frecuentes:
– Desarrollo de cocentrados de Factor VIII de más larga duración:
• Unión a proteínas de fusión: IgG o albúmina
Hace a la molécula más resistente a la acción de la trombina, manteniéndose activo más tiempoactivo más tiempo
• Unión a otras moléculas: PEG/ PSA/PEGlip
Para disminuir la velocidad de inactivación por parte de la trombina, y aumentar el tiempo que la molécula permanece activa (ABC) -- PEG
Para conservar la función con un aumento de la estabilidad
• Combinación de FVIII pegilado o polisializado con FvW
• Modificación de aminoácidos: Análogos, rFVIII variante
Prolonga la vida media, por ej. aumentando unión a plaquetas
¿Siguientes pasos en el tratamiento de la hemofilia?
FVIII:
�Vida media corta
�No atraviesa piel ni pulmón
�Se destruye en el tracto GI
�Genera inhibidores si se administra por vía no IV
� Tratamiento sin infusiones IV:
– Moléculas sintéticas– Restauran la capacidad de generación de trombina po r la vía
extrínseca (por ejemplo, bloqueando los inhibidores de la coagulación, inhibidores del TFPI)
– Fucoide como tto adyuvante del FVIII en profilaxis
Tratamiento vía oral
La tecnología recombinante:
� Permite generar proteínas para uso terapéutico no procedente de
donaciones
� No está sujeto al abastecimiento y disponibilidad de plasma
CONCLUSIONES
� No está sujeto al abastecimiento y disponibilidad de plasma
� Minimiza el riesgo de transmisión de virus humanos
� Tiene un perfil de seguridad específico
� La fuente de partida es única, sistematizada y bien caracterizada
� Es un proceso industrial técnicamente exigente y regulado
La tecnología recombinante :
� Supone un incremento potencial en el nivel de seguridad de los
hemoderivados, aunque no deben obviarse las medidas de
CONCLUSIONES
hemoderivados, aunque no deben obviarse las medidas de
seguridad implementadas en los productos plasmáticos
� Abre el camino a nuevas generaciones de proteínas
terapéuticas