Hematología y citoquímica de las células sanguíneas de Rhinella fernandezae (Anura- Bufonidae)...

7/24/2019 Hematologa y citoqumica de las clulas sanguneas de Rhinella fernandezae (Anura- Bufonidae) en Es.pdf

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Revista de Biologa Tropical

ISSN: 0034-7744

[email protected]

Universidad de Costa Rica

Costa Rica

Cabagna Zenklusen, Mariana C.; Lajmanovich, Rafael C.; Attademo, Andrs M.; Peltzer, Paola M.;

Junges, Celina M.; Fiorenza Biancucci, Gabriela; Bass, Agustn

Hematologa y citoqumica de las clulas sanguneas de Rhinella fernandezae (Anura: Bufonidae) en

Espinal y Delta-Islas del ro Paran, Argentina

Revista de Biologa Tropical, vol. 59, nm. 1, marzo, 2011, pp. 17-28

Universidad de Costa Rica

San Pedro de Montes de Oca, Costa Rica

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=44918841002

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17Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 59 (1): 17-28, March 2011

Hematologa y citoqumica de las clulas sanguneas deRhinella fernandezae

(Anura: Bufonidae) en Espinal y Delta-Islas del ro Paran, Argentina

Mariana C. Cabagna Zenklusen1,2, Rafael C. Lajmanovich1,3, Andrs M. Attademo1,3, Paola M.Peltzer1,3, Celina M. Junges1,3, Gabriela Fiorenza Biancucci1& Agustn Bass11. Ctedra de Ecotoxicologa, Escuela Superior de Sanidad Dr. Ramn Carrillo, Facultad de Bioqumica y Ciencias

Biolgicas, Paraje El Pozo s/n, Santa Fe, Argentina; [email protected], [email protected],[email protected]

2. Ctedra de Morfologa Normal, Facultad de Bioqumica y Ciencias Biolgicas, Paraje El Pozo s/n, Santa Fe,Argentina; [email protected]

3. Consejo Nacional de Investigaciones Cientficas y Tcnicas (CONICET), Paraje El Pozo s/n, Santa Fe, Argentina;

[email protected], [email protected], [email protected]

Recibido 12-V-2010. Corregido 15-VIII-2010. Aceptado 17-IX-2010.

Abstract: Hematology and blood cell cytochemistry of Rhinella fernandezae (Amphibia: Anura) from

Espinal and Delta-Islands of Paran River, Argentina. The description of amphibian hematology is scarceand most of these studies have been done in species from North America, Asia and Europe. With the purposeto obtain basic hematological information ofRhinella fernandezae, 23 blood samples from Santa Fe and EntreRos natural reserves were studied. Blood of each individual was extracted by cardiac puncture and hemogramswere carried out. Morphological and cytochemical description of blood cells were analyzed in slides and wereinspected for extra and intra cellular parasites. Five leucocytes types were observed, being lymphocytes thepredominant ones followed by basophiles. Heterophils and eosinophils were positive to PAS, Sudan B and per-oxidase. The erythrocytes and its precursors were negative for cytochemical reactions. Micronuclei and nuclearalterations frequencies were scarce. No significant differences (p>0.05) were observed between sexes neitherin hemograms nor in blood cells morphology. Microfilarias were the only hemoparasites found with a relativelow prevalence and infection intensity. The hematological characteristics studied were similar to those reported

for other amphibians, suggesting thatR. fernandezaeindividuals present optimal nutritional and immunologicalstatus. Rev. Biol. Trop. 59 (1): 17-28. Epub 2011 March 01.

Key words:Rhinella fernandezae, hematology parameters, blood cell morphology, citochemistry, bufonidae.

La descripcin de la hematologa de losanfibios anuros es escasa, a pesar de que estegrupo de vertebrados es diverso. La mayorade los trabajos existentes se relacionan conrecuentos celulares y la morfometra de loshemates (Alder & Huber 1923, Arvy 1947,Hutchinson & Szarski 1965, Atatr et al. 1998,Atatr et al.1999, Arkan et al.2003, Coppo et

al. 2005, Arserim & Mermer 2008, entre otros).Para la familia Bufonidae, se conocen valoresde referencia para algunas de sus especies enNorteamrica, Asia y Europa (El-Bakary et al.1995, Dnmez et al.2009, Gl & Tok 2009).

En Argentina, Varela & Sellares (1937a, 1937b,1938) describieron el cuadro hemtico de Rhi-nella arenarum, siendo ste el nico estudio decaracterizacin hematolgica para una especiede anuro nativa.

En anfibios, el componente leucocitario espropuesto para la evaluacin de los individuosexpuestos a situaciones de stress (Davis et al.

2008, Davis & Maerz 2008), como parmetroindicativo de poblaciones provenientes de sitioscontaminados (Cabagna et al.2005, Barni et al.2007) y como medida del efecto inmunomodu-lador de plaguicidas (Forson & Storfer 2006).


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Asimismo, las variaciones en la morfologaeritroctica se asocian con exposicin de ami-nas aromticas, metales y estrs (Krauter 1993,

Per et al. 1998, Chiesa et al. 2006, Barni etal.2007). Las alteraciones nucleares, como lapresencia de microncleos, son utilizadas comomarcadores de dao cromosmico (Bkaert etal. 2002, Huanga et al. 2007, Marques et al.2009). Por otro lado deben considerarse dis-tintos factores, como la variabilidad del cuadrohemtico a lo largo del ao y la edad de losindividuos, ya que caractersticas citolgicasnormales podran ser confundidas con procesospatolgicos o respuestas a modificaciones delambiente (Varela & Sellares 1937a, Arserim &Mermer 2008, Marques et al.2009). El objetivo

de este trabajo fue obtener datos hematolgicosy citoqumicos basales para Rhinella fernan-dezae, Gallardo 1957, especie ampliamentedistribuida en Uruguay, noreste de Argentina,sur de Brasil y Paraguay (IUCN 2009) y cuyaspoblaciones son frecuentes en los agroecosiste-mas argentinos (Peltzer et al.2007).

MATERIALES Y MTODOS

Los especmenes deR. fernandezae(n=17machos y n=6 hembras) fueron capturadosdurante los meses de enero 2004, 2006 y 2007en dos reas protegidas: la Reserva Natu-ral Parque General San Martn (314029S-602013 W- Paran, Entre Ros) y laReserva Ecolgica de la Ciudad Universitaria(313826 S-604022 W- Santa Fe, SantaFe). En ambas se encuentran representadoselementos florsticos de transicin de las eco-regiones Deltas e Islas del Ro Paran y el Espi-nal (Burkart et al. 1999). Climticamente secaracterizan por presentar temperaturas mediasanuales de 18C y precipitaciones mediasanuales de 1 000mm. Zoogeogrficamente, seencuentran incluidas en Dominio Subtropical(Subregin Guayano-Brasilera) representado

por el Distrito Mesopotmico con una menorinfluencia del Distrito Pampsico (Ringuelet1961). Estas localidades fueron consideradascomo sitios de referencia en estudios previosen los que se evalu el impacto de plaguicidas

en poblaciones de anuros (Lajmanovich etal. 2004, Cabagna et al. 2005), debido a que,desde su creacin, no estn relacionadas con

actividades agroindustriales.Los ejemplares fueron colocados en reci-

pientes plsticos opacos, con fondo hmedopara evitar la deshidratacin. Estos fuerontransportados al laboratorio y mantenidos a25C, en oscuridad para disminuir el estrs porla captura (USEPA 2002) hasta la obtencin delas muestras de sangre. Los animales fueronpesados (P, g) usando una balanza semianal-tica OHAUS GT 200-S (0.01g de precisin) ymedidos en longitud rostro-cloaca (LRC, cm),con un calibre milimtrico digital STRON-GER, (0.001mm de precisin). Con los datos

de peso y longitud se calcul el coeficiente defactor animal (FCA) segn la ecuacin (100*P/LRC3) de Bagenal & Tesch (1978).

Se extrajo sangre por puncin cardacausando jeringas estriles heparinizadas (15mmde longitud), en individuos no anestesiadospara evitar alteraciones en los recuentos celu-lares (Fudge 2000). Todos los animales fueronrestituidos a los sitios en los que fueron captu-rados, luego de comprobar su estado de saludmediante inspeccin externa.

Inmediatamente despus de la extraccin,se realizaron cuatro extendidos sanguneos paraevitar cambios celulares degenerativos. Poste-riormente, uno se colore con May Grunwald-Giemsa para la descripcin morfolgica de lasclulas sanguneas y bsqueda de parsitosextra- e intracelulares. Los tres restantes sereservaron para las coloraciones citoqumicas.

Luego de la homogeneizacin de la mues-tra en un tubo seco y limpio, se procedi ala realizacin del hemograma. El hematocri-to (Hto) se determin por centrifugacin a12000g durante 5 minutos, la concentracinde hemoglobina (Hb) por el mtodo de ciano-metahemoglobina de Drabkin y los recuentoscelulares en cmara de Neubauer utilizando la

solucin de Natt-Herrick como lquido dilutor(Fudge 2000). El clculo de los ndices hemati-mtricos, volumen corpuscular medio (VCM),hemoglobina corpuscular media (HCM) y con-centracin de hemoglobina corpuscular media


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(CHCM) fueron realizadas segn Wintrobe(Vives Corrons 2006).

Morfologa sangunea: En los extendi-dos coloreados con May Grunwald-Giemsa serealiz el recuento diferencial de leucocitos,considerando las caractersticas morfolgicasdescriptas por Varela & Sellares (1937a). Sedetermin la relacin heterfilos/linfocitos(H/L), propuesta como medida de los indivi-duos en repuesta al estrs (Davis et al.2008) yel ndice de lobularidad (IL=nmero de lbuloscontados/nmero de heterfilos contados) apartir de la clasificacin de los granulocitosheterfilos segn Arneth (Charipper 1928),para evaluar el grado de madurez leucocitario

(Garca Espinosa et al.1997). Con respecto ala morfologa de los hemates, se determinla frecuencia de macrocitos (MA), microcitos(MI), hemates policromatfilos (PO) e hipo-crmicos (HY). Se calcul la frecuencia deeritrocitos inmaduros, como medida indirectade la hematopoyesis, a travs de la cantidad deeritroblastos y PO (Marques et al.2009). Tam-bin se consignaron las alteraciones nuclearesque pudieran presentarse en los hemates:ncleo arrionado o escotado (KN) o mella-do (EN), presencia de lbulos (LN), micron-cleos (MN) y clulas binucleadas (BN), con lasque se calcul la frecuencia total de alteracio-

nes nucleares (FAN=KN+EN+LN+MN+BN).Todas las frecuencias fueron expresadas comoporcentajes (%) de hemates maduros.

Para la determinacin de parmetros mor-fomtricos (rea total, dimetros mximos ymnimos de clulas y ncleos) se tomaronmicrofotografas utilizando el objetivo de 40x,eligiendo campos microscpicos al azar. Lacaptura de imgenes se realiz por medio deuna cmara Olympus Camedia 5060 adapta-da a un microscopio de luz Arcano L1200B.Las mediciones se realizaron utilizando elprograma Image Pro Plus 3.0.01.00 (Media

Cybernetics, Silver Spring, MD, USA), en 40eritrocitos y un nmero comparable de leuco-citos y trombocitos elegidos al azar (Arkan etal.2003, Arserim &Mermer 2008).

Para evaluar las diferencias entre sexos,las variables correspondientes a hemograma ymorfologa sangunea fueron sometidas a unaprueba no paramtrica de Mann-Whitney, porno cumplirse con los supuestos de normali-dad (Prueba de Kolmogorov-Smirnorv). Unaprobabilidad inferior a 5% (p


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RESULTADOS

La longitud rostro-cloacal (LRC) prome-

dio registrada para los animales estudiados fue5.480.39cm en machos y 5.690.38cm enhembras. El peso fue 15.403.05g en machos y16.143.62g en hembras y el FCA, 9.341.58y 8.670.63, respectivamente. En el cuadro1 se presentan los valores medios, desvia-ciones estndar y rangos de los parmetroshematolgicos. No se observaron diferenciassignificativas (p>0.05) entre sexos. La relacinRGR/RGB fue de 1:114. Las caractersticasmorfomtricas de las clulas se exponen en elcuadro 2.

Morfologa sangunea: Con respecto alleucograma, se diferenciaron cinco tipos celu-lares: granulocitos heterfilos, eosinfilos y

basfilos, monocitos y linfocitos (Fig. 1). Estosltimos fueron los leucocitos ms abundantes,seguidos por los granulocitos basfilos. Larelacin heterfilos/linfocitos fue 0.49.

Los granulocitos heterfilos presentaroncitoplasma incoloro con finas granulacioneslilceas. El ncleo fue redondeado, escotadoo bilobulado, siendo infrecuente la presenciade tres o ms lbulos, determinando un ILde 1.090.67. Los granulocitos eosinfilostuvieron citoplasma levemente basfilo congranulaciones eosinfilas redondas de tamao

CUADRO 1Parmetros hematolgicos de R. fernandezae

TABLE 1Hematological parameters of R. fernandezae

Parmetros Valor medio DS Rango

Hto (%) 27.37 7.68 18-40

RGR (x1012/l) 0.505 0.13 0.25-0.68

Hb (g/dl) 9.18 2.80 3.76-14.35

VCM (fl) 535.48 65.14 434.78-678.90

HbCM (pg) 18.15 38.15 103-244.60

CHbCM 33.50 4.82 21.00-40.40

RT (x109/l) 4.81 5.14 1.00-15.00

RGB (x109/l) 4.50 1.66 1.70-7.30

FLR (%)HeterfilosEosinfilosBasfilosLinfocitosMonocitosBlastos

195

324112

13.404.30

22.2620.840.762.27

3-480-161-69

14-740-30-6

FLA (x109/l)HeterfilosEosinfilosBasfilosLinfocitosMonocitos

Blastos

0.790.191.341.710.01

0.05

0.180.040.280.280.01

0.02

0.14-3.500-0.70

0.07-4.890.05-4.90

0-0.19

0-0.31

Hto: Hematocrito, RGR: Recuento de hemates, Hb: Concentracin de hemoglobina, VCM: Volumen corpuscular medio,HbCM: Hemoglobina corpuscular media, CHbCM: Concentracin de hemoglobina corpuscular media, RT: Recuento detrombocitos, RGB: Recuento de leucocitos, FLR: Frmula leucocitaria relativa, FLA: Frmula leucocitaria absoluta. DS:Desviacin estandar.


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y cantidad variables. El ncleo fue redon-deado o escotado. Los granulocitos basfilosse reconocieron por su granulacin redonda,rojo-violcea, que en algunos casos fue tanabundante que no permiti visualizar el ncleo.En los pocos casos que se pudieron observar,el citoplasma fue incoloro a levemente acid-filo y el ncleo, redondeado. No se registra-ron precursores mieloides. La mayora de loslinfocitos fueron pequeos caracterizndosepor su escaso citoplasma basfilo y ncleoredondo, grande (relacin rea nuclear/reacelular 0.610.09), con cromatina condensada.Los monocitos se encontraron en baja cantidadpudindoselos diferenciar de los linfocitos porsu mayor tamao, cromatina laxa y citoplas-ma grisceo. Los trombocitos se observaroncomnmente en acmulos de clulas de tamaopequeo (cuadro 2) semejante a los linfocitos,y forma redonda o ahusada. Su citoplasma fueincoloro a acidfilo y el ncleo present cro-matina de aspecto laxo y homogneo.

Los hemates fueron elpticos con ncleo

central, con cromatina condensada en grumos.Fue rara la presencia de MA y MI (3.462.99),como as tambin de PO e HY (0.320.34) y deFAN (0.060.11). La frecuencia de eritrocitosinmaduros (eritroblastos y PO) fue baja, menor

a una clula por cada cien eritrocitos contados(0.240.34).

No se observaron diferencias significativas(U test, p>0.05) entre sexos, entre las variablescorrespondientes al hemograma y morfologasangunea.

Citoqumica: Debido a que se dificultla diferenciacin de heterfilos y eosinfilos,se decidi cuantificarlos en conjunto. Estosgranulocitos resultaron positivos para PAS,Sudan B y peroxidasa, siendo la mayora detipo 2+ y 3+. Los granulocitos basfilos fueronfuertemente positivos a la coloracin de PAS(la mayora de tipo 4+), se detect peroxidasaen el orden de trazas (puntaje


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Fig. 1. Clulas sanguneas de Rhinella fernandezae. (A)Hemates y granulocito heterfilo. (B)Eosinfilo. (C)Basfilos.(D)Linfocitos pequeo (izq.) y grande (der.). (E)Linfocito pequeo (flecha) y trombocitos. (F)Monocito. Tincin MayGrunwald Giemsa (bar 10).

Fig. 1.Rhinella fernandezaesblood cells. (A)Erythrocytes and heterophil granulocyte. (B)Eosinophil. (C)Basophils. (D)Small (left) and large (right) lymphocytes. (E)Small lymphocyte (arrow) and thrombocytes. (F)Monocyte. Stained withMay Grunwald Giemsa (bar 10)

citoqumicas para los tipos celulares observa-dos se resumen en el cuadro 3.

Hemoparsitos:Se hallaron microfilarias(Nematoda: Filaroidea, Fig. 2), cuya preva-lencia e intensidad de infeccin fueron bajas(4.35%, 0-1 por campo de 40x).

DISCUSIN

Para R. fernandezae, al igual que fuerasealado para una especie simptrica y co-genricaR. arenarum(Varela & Sellares 1937a,Cabagna et al. 2005), no se observaron dife-rencias entre sexos en el hemograma ni en la


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morfologa sangunea. Asimismo, los recuentoscelulares se encontraron dentro de los rangospublicados para otras especies de anuros dedistintas regiones del mundo (Glomski et al.1997, Wojtaszek & Adamowicz 2003). La rela-cin RGB/RGR fue 1:114 (rango 1:54-222). Sibien este parmetro es muy impreciso y pierde

validez frente a los recuentos celulares, cobraimportancia como estimador indirecto delnmero de leucocitos, cuando la nica muestradisponible es un extendido sanguneo. En otrosespecmenes de este gnero, el valor promedio

de esta relacin es de 1:103 (rango: 1:63-1:430,paraBufo bufoy Pseudepidalea viridis, respec-tivamente, Gl & Tok et al.2009).

Con respecto a los leucocitos, como enotras especies de anfibios, se observaron cincotipos celulares donde los linfocitos peque-os fueron los predominantes (42%), pero enun porcentaje menor que en otros bufnidos(72.3%, Anaxyrus fowleri, Davis & Durso2009). La realizacin de los recuentos totalesy relativos de los leucocitos infieren el estadoinmunolgico de los animales, y sus variacio-nes cuantitativas y morfolgicas, se puedenrelacionar con procesos inflamatorios, neopla-sias, malnutricin y estados de estrs (Campbel2004, Barni et al.2007). En este punto, la rela-cin H/L es un parmetro importante, ya que sise considera que la respuesta hematolgica alestrs se conserva a travs de los grupos taxo-nmicos, los cambios observados en mamfe-ros en esta relacin pueden extrapolarse a otrosvertebrados, como por ejemplo, los anfibios(Bennett & Harbottle 1968, Davis et al 2008).As, un incremento en la relacin H/L sumadaa un aumento en IL, servira para diferenciarheterofilias con linfopenias debidas a estrs

agudo (por ejemplo, ocasionado por la capturao toma de muestra) o de estados infecciososque pudieran originar estimulacin medular(heterofilias con presencia de heterfilos msinmaduros y por lo tanto menor IL).

CUADRO 3Puntaje de las reacciones citoqumicas

TABLE 3Score of cytochemical reactions

Tipo celular PAS Peroxidasa Sudam B

Eritrocitos 0 (Negativo) 0 (Negativo) 0 (Negativo)

H-E 32538 32146 30840

Basfilos 35536 47 0 (Negativo)

Linfocitos 4433 43 713

Monocitos 11074 0 (Negativo) 5087

Trombocitos 718 0 (Negativo) 0 (Negativo)

H-E: Heterfilos y eosinfilos. Promediodesviacin estndar.

Fig. 2. Microfilaria en extendido sanguineo de R.fernandezae. Tincin May Grunwald Giemsa (bar 10).

Fig. 2. Microfilaria in blood slides of R. fernandezae.Stained with May Grunwald Giemsa (bar 10).


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En general, la informacin sobre la carac-terizacin citoqumica de los leucocitos y trom-bocitos en anfibios es escasa y solo se consigna

la positividad o negatividad a las reacciones.Estudios realizados en distintos bufnidos,sealan la presencia de mucopolisacridos enleucocitos y trombocitos y actividad peroxid-sica en monocitos, granulocitos heterfilos yeosinfilos (Turner 1988), tambin en basfilosy trombocitos (Caxton-Martins 1978). En elcaso de R. fernandezae los trombocitos y lin-focitos mostraron una positividad variable a lareaccin de PAS mientras que los granulocitosfueron positivos. La importancia de la iden-tificacin de polisacridos radica en el hechoque su presencia est ntimamente ligada con

el abastecimiento de energa para la fagocitosis(Veiga et al.2000). La peroxidasa es una enzi-ma caracterstica de los grnulos azurfilos yjuega un importante papel en el mecanismobactericida oxgeno-dependiente (Styrt 1989).Como en otras especies de vertebrados, losresultados para lpidos son comparables conlos de peroxidasa (Garca Espinosa et al. 1997,Salakij et al.2004, 2006).

En anuros, la cantidad de eritrocitos porlitro (RGR) vara de 0.5 a 1.5x1012 (Glomskiet al.1997); en nuestro estudio fue 0.505x1012/litro, estando en el lmite inferior de ese rango.Esto podra deberse al perodo en que se realizla recoleccin de ejemplares (enero), sealadopor Varela y Sellares (1938) como uno de losmeses con menor recuento de hemates paraR. arenarum. Este patrn se repite en otrasespecies de anfibios, en el que se observan losmayores recuentos de eritrocitos en primavera,disminuyendo en los meses de verano, parallegar a los mnimos valores en otoo (Wojtas-zek & Adamowicz 2003, Arserim & Mermer2008). Por otra parte, si consideramos que lafrecuencia de eritrocitos inmaduros (eritroblas-tos y PO) representa la eritropoyesis (Allender& Fry 2008), podemos decir que los ejempla-

res de R. fernandezaeno se encuentran en unperodo de renovacin eritroctica ya que dichafrecuencia fue baja (0.240.34).

La morfologa y morfometra de los hema-tes fue semejante a la informada para otros

gneros de Rhinella (Gregory 2009). En estesentido, los eritrocitos de los anfibios son msgrandes que en otros vertebrados (Campbel

2004) y dentro de esta Clase, los de los urode-los son de mayores dimensiones respecto de losanuros, pero la cantidad es menor (Arkan et al.2003). A su vez, los eritrocitos de las especiesde anfibios terrestres son ms pequeos que losde las especies acuticas (Arserim & Mermer2008). Desde el punto de vista morfolgico, esnecesario evaluar la presencia de alteracionesen el tamao, color y forma de los eritrocitos yaque su frecuencia puede aumentar en casos deanemias, enfermedades crnicas, malnutricin(Campbel 2004), intoxicaciones (El Bakari etal.1995, Chiesa et al.2006) y ambientes con-

taminados (Barni et al. 2007). En el caso delos animales estudiados, segn los criterios deCampbel (2004) para la caracterizacin de lapoblacin eritroctica, se puede concluir quelos extendidos presentaron ligera anisocitosis(frecuencia de MA y MI 3.462.99), e isocro-masia (muy baja frecuencia de eritrocitos poli-cromatfilos e hipocrmicos, 0.320.34). Unaconsideracin a tener en cuenta es que no seobservaron eritroplstidos. Si bien existen espe-cies en las que es normal su presencia en bajacantidad, el aumento de su frecuencia en sangrese considera una adaptacin para aumentar lacaptacin de oxgeno (Wojtaszek & Adamowicz2003, Barni et al.2007).

En lo que respecta a la presencia de MNy alteraciones nucleares, fueron escasas enesta poca del ao y podran ser atribuidasa eventos espontneos (Al-Sabti & Metcalfe1995), ya que los ejemplares deR. fernandezaeprovenan de reas naturales protegidas, norelacionadas con actividades agroindustriales.Cabe resaltar, que el test de los microncleoses utilizado en peces y anfibios para determinarla posible genotoxicidad de sustancias en elmedio acutico (Grinfeld et al. 1986, Krauter1993, Al-Sabti & Metcalfe 1995). En el caso

de los peces silvestres, la determinacin dela frecuencia de alteraciones nucleares (FAN)sera una alternativa al ensayo de los MN(Guilherme et al. 2008). Si bien se proponendistintos mecanismos por los que se producen


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las alteraciones nucleares, no se sabe a cien-cia cierta cmo y porqu se generan. A pesarde esto, se ha propuesto que se consideren

como alteraciones celulares producidas comorespuesta a los agentes generadores de estrs(ava & Ergene-Gzkara 2003, Barni et al.2007). En anfibios adultos, ha sido utilizadocomo marcador de genotoxicidad en Pelo-phylax perezi (Rana perezi Seoane, 1885)expuestas a efluentes de minas (Marques et al.2009).

Los datos correspondientes al recuentode trombocitos para los anfibios son exiguosy gran parte referidos a especies de la familiaRanidae (Arserim & Mermer 2008).Varela &Sellares (1937a), Homtowska et al. (2002),

Wojtaszek & Adamowicz (2003), Campbel(2004) y Arserim & Mermer (2008) coincidenen la dificultad de cuantificar los trombocitosen anfibios, aves, peces y reptiles, ya sea por laimposibilidad para diferenciarlos de los linfoci-tos o porque tienden a destruirse o aglutinarse.Esto sera la causa de la gran variabilidad enlos datos obtenidos, adems de las variacionesentre los individuos estudiados.

Los anuros, al estar expuestos a numerososvectores hematfagos, estn infectados poruna gran diversidad de hemoparsitos intra-y extracelulares. Entre estos se cuentan lasmicrofilarias, halladas en este estudio y obser-vadas en distintos lugares del mundo (Walton1964a, 1964b, Levine & Nye 1977, Barta &Desser 1984, Desser 2001, Chutmongkonkul etal.2006, Mckenzie & Starks 2008). En Argen-tina se han hallado en el gneroLeptodactylus(Schurmans Stekhovek 1951) y en Hypsiboaspulchellus (Cabagna et al. datos no publica-dos). A pesar de que varias especies de filariaspueden infectar a anfibios, reptiles y aves, noson patognicas y slo las que son parsitosnaturales de mamferos pueden ser causantesde enfermedades zoonticas (Orihel & Eber-hard 1998). En lo que respecta a los anfibios,

la presencia de contaminantes podra reducirla inmunocompetencia del husped, lo quellevara a un incremento del parasitismo (Careyet al.1999, Marcogliese et al.2009). En estesentido, estudios llevados a cabo enLithobates

pipiens expuestas a mezclas de plaguicidassugieren que stos pueden alterar su sistemainmune y afectar su capacidad para hacer frente

a una infeccin parasitaria (Christin et al.2003,Gendron et al. 2003). Por otra parte, se haobservado que la alteracin del hbitat a travsde la conversin de bosques en pasturas puedeimpactar a abundancia de los parsitos de losanfibios y de sus vectores (McKenzie 2007).

Finalmente, todas las caractersticas hema-tolgicas de R. fernandezae estudiadas sonsemejantes a los valores de referencia reporta-dos para otros anfibios, pudindose inferir quelos individuos analizados, se encuentran en unbuen estado nutricional e inmunolgico. Porotra parte, a pesar que la evaluacin hemato-

lgica puede ser compleja, ya sea por dificul-tades en la manipulacin de los animales, lasrestricciones que implican el escaso volumende muestra y la posibilidad de la contaminacincon linfa, es uno de los mtodos ms sencillosy menos invasivos que permiten la deteccinde cambios fisiolgicos y patolgicos de laspoblaciones silvestres, relacionados con facto-res ambientales (Artacho et al.2007, Barni etal.2007, Davis et al.2008).

RESUMEN

La descripcin de la hematologa de los anfibiosanuros es escasa, habindose realizado la mayora de lostrabajos en especies de Norteamrica, Asia y Europa. Conel propsito de obtener datos hematolgicos paraRhinella

fernandezae, fueron estudiados 23 especmenes provenien-tes de zonas protegidas de las provincias de Santa Fe yEntre Ros. Se les extrajo sangre por puncin cardaca y serealizaron hemogramas. En los extendidos sanguneos, seefectuaron la descripcin morfolgica y citoqumica de lasclulas sanguneas y bsqueda de parsitos. Se observaroncinco tipos de leucocitos, donde predominaron los linfoci-tos pequeos. Heterfilos y eosinfilos resultaron positivospara PAS, Sudan B y peroxidasa; contrariamente, los eri-trocitos y sus precursores fueron negativos. Los puntajes delas reacciones citoqumicas fueron variables para basfilos,linfocitos, monocitos y trombocitos. Las frecuencias de

microncleos y de alteraciones nucleares fueron escasas.No se observaron diferencias significativas (p>0.05) entresexos en el hemograma ni en la morfologa sangunea. Losnicos hemoparsitos encontrados fueron microfilarias(Nematoda: Filaroidea), cuya prevalencia e intensidad deinfeccin fueron bajas. Las caractersticas hematolgicas


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estudiadas fueron semejantes a los valores reportados paraotros anfibios, pudiendo inferir que los individuos de R.

fernandezae estudiados se encuentran en un buen estado

nutricional e inmunolgico.

Palabras clave:Rhinella fernandezae, parmetros hemato-lgicos, morfologa de las clulas sanguneas, citoqumica,bufonidae.

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Hematología y citoquímica de las células sanguíneas de Rhinella fernandezae (Anura- Bufonidae)...

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